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1. (WO2019004610) COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HEARING LOSS, CONTAINING VITIS VINIFERA LEAF EXTRACT AS ACTIVE INGREDIENT
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명세서

발명의 명칭

기술분야

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배경기술

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산업상 이용가능성

96   97   98  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

도면

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명세서

발명의 명칭 : 적포도잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물

기술분야

[1]
본 발명은 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 적포도잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
[2]

배경기술

[3]
청각소실(난청)은 전 인구의 약 15-20%가 가지고 있는 아주 흔한 질환이다. 현대사회의 환경오염과 고령화로 인해 난청인구는 더욱 증가하는 추세이며, 청각 장애는 영구적이므로 발생하기 전에 예방을 하는 것이 매우 중요하다.
[4]
난청은 대부분이 돌발성, 약물성(항생제, 항암제), 소음성, 외상성, 노인성, 선천성 등의 환경적 요인과 유전적 요인들에 의해 형성되며, 주로 청각세포의 손상 및 죽음과 같은 특징을 보이는 감각신경성 난청에 의해 발생한다. 감각신경성 난청의 치료를 위해 내이유모세표(inner ear hair cell) 재생, 유모세포의 증식(proliferation)과 분화(differentiation)에 관여하는 신호경로 기전들이 많이 밝혀졌으며 유전자치료(Gene editing) 혹은 세포이식(cell transplantation) 등의 기술이 개발되면서 최근 수년간 유모세포재생 연구에 큰 진전을 이루어 내고 있으나, 아직까지 명확한 난청 억제 및 예방에 관한 기전이나 예방 및 치료제 개발은 미미한 실정이다( Hanyang Med Rev, vol 35(2); May 2015).
[5]
사회가 산업화되면서 최근에는 소음으로 인한 난청인구 역시 급격히 증가하고 있다. 소음환경에서 일하는 근로자나 군인 같은 직업적 소음성 난청뿐만 아니라 문화 및 여가생활에 의한 소음성 난청도 증가하고 있다. 우리나라 산업재해법에 따르면 환경소음 90 dBA 이상에 노출될 경우 청각에 손상을 줄 수 있는 것으로 되어있다. 미국 직업 안전 위생 관리국(Occupational Safety and Health Administration, OSHA)에서는 85 dBA를 기준으로 그 이상의 소음환경에 대해서는 소음관리를 실시하고 있다. 인간의 청각기관은 75 dBA 이상의 소음에서는 영향을 받는 것으로 보고되기도 했다. 75 dBA의 소음은 차들이 다니는 도로변의 소음정도이므로 산업사회에서는 모든 사람들이 청각기관에 해로운 정도의 소음속에서 생활하는 것으로 볼 수 있다.
[6]
환경소음 외에 청소년의 경우 MP3 사용 등을 포함한 여가생활에서도 큰 소리에 노출되는 경우가 많아 최근 소음성 난청은 다양한 연령대에서 나타나고 있다. 젊은 시절의 소음성 난청은 결국 40대부터 보청기를 사용해야만 대화가 가능할 정도로 청력을 손상시키며, 노화가 병행되었을 때는 점점 더 난청의 정도가 심해지게 된다. 보청기 등의 보조도구도 난청의 정도가 심해질수록 그 효과가 떨어지기 때문에 고심도의 청각손상은 결국 의사소통에 심각한 문제를 발생시키게 된다. 즉, 현재의 소음성 난청을 경험하는 젊은 세대가 노인이 되었을 때는 난청의 정도가 더 심해지게 되고, 난청은 노인부터 젊은이들까지 다양한 세대의 삶의 질을 결정짓는데 중요한 영향을 미친다.
[7]
최근, 난청의 예방 및 치료에 효과적인 물질을 찾기 위한 연구로서, 항산화제, N-메틸-D-아스파테이트(Nmethyl-D-aspartate, NMDA) 길항제, 세포사멸 억제제, 성장인자 등에 대한 전임상 연구가 보고되고 있으나, 임상실험으로 진행하기에는 한계가 있음이 나타났다(Prasher D., Lancet, 352, pp1240-1242, 1998). 현재까지 소음성 난청의 예방 및 치료와 관련하여 승인된 약물은 없으며, 학계에 보고된 바로는 전임상 단계에서의 연구와 임상 단계에서의 Mg, NAC (N-acetylcysteine, NAC) 그리고 엡셀렌(Ebselen)의 약물만이 보고되어 있다(Meister A., Pharmacol. Ther., 51, pp155-194, 1991; Attias J. et al., Am. J. Otolaryngol., 15, pp26-32, 1994; Yamasoba T. et al., Neurosci. Lett., 380, pp234-238, 2005).
[8]
한편, 포도잎 추출물이 항산화 효과를 가진다는 것은 개시되어 있으나, 난청 예방 효과를 가진다는 것은 알려져 있지 않다(대한민국공개특허 제10-2010-0114349호).
[9]
이에, 본 발명자들은 안전성이 우수한 천연물을 이용하여 소음에 의해 유발되는 난청을 예방 및 치료하고자 예의 노력한 결과, 적포도잎 추출물이 소음 등으로 인한 청력역치의 상승을 효과적으로 억제하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
[10]
[11]
발명의 요약
[12]
본 발명의 목적은 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
[13]
본 발명의 다른 목적은 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)을 유효성분으로 포함하는 난청 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
[14]
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[15]
본 발명은 또한, 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)을 유효성분으로 포함하는 난청 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[16]

도면의 간단한 설명

[17]
도 1은 난청 마우스 모델을 이용한 인비보 (in-vivo) 실험에 대한 개략도이다.
[18]
도 2는 적포도 잎 건조 추출물 처리에 따른 청력 역치의 변화를 관찰하기 위하여 ABR(청성뇌간반응)을 측정한 결과이다.
[19]
도 3은 와우 내 나선 신경절에서 적포도 잎 건조 추출물의 항산화 효과를 관찰하기 위하여 면역염색을 수행한 결과이다.
[20]
도 4는 와우 내 청각유모세포에서 적포도잎 건조 추출물의 항산화 효과를 관찰하기 위하여 면역염색을 수행한 결과이다.
[21]
도 5는 적포도잎 건조 추출물을 처리한 청각세포주의 세포독성을 확인하기 위하여 WST-1 어세이를 수행한 결과이다.
[22]
도 6은 적포도잎 건조 추출물을 처리한 청각세포 내 항산화 효소의 mRNA 발현을 관찰하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응법(quantitative real-time PCR)을 실시한 결과이다.
[23]
도 7은 적포도잎 건조 추출물을 처리한 청각세포 내 항산화 효소의 단백질 발현을 관찰하기 위하여 웨스턴 블랏(western blot)을 실시한 결과이다.
[24]
도 8은 적포도잎 건조 추출물에 은행엽추출물을 병용하여 처리한 경우의 청력 역치의 변화를 관찰하기 위하여 ABR(청성뇌간반응)을 측정한 결과이다.
[25]
[26]
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
[27]
본 발명에서는 난청 마우스 모델을 확립한 후, 적포도잎 추출물을 처리하여 소음 노출에 의한 청각기능 및 형태학적 분석을 수행한 결과, 적포도잎 추출물을 처리한 마우스 모델은 적포도잎 추출물을 처리하지 않은 마우스 모델에 비해 청력 역치가 유의하게 감소하고, 와우 내 나선 신경절 및 청각유모세포에서 항산화효소가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 적포도잎 추출물을 처리한 청각세포주에 과산화수소를 처리하였을 때, 적포도잎 추출물을 처리하지 않았을 때에 비해 세포독성 및 사멸이 억제되고, 카탈라아제(catalase), 슈퍼옥시드 디스무타아제2(SOD2)의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 즉, 적포도잎 추출물은 소음성 난청에 예방 또는 치료 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 적포도 잎 건조 추출물을 처리한 세포주는 활성산소에 의한 세포독성 및 사멸이 억제된다는 것을 확인하였다.
[28]
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[29]
본 발명의 용어 “추출물”이란, 적포도 잎으로부터 분리하여 얻은 물질을 의미한다.
[30]
본 발명에 있어서, 상기 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)은 적포도잎을 물, C1∼C4의 알콜 및 물과 C1∼C4의 알콜과의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 적포도잎 추출물은 물을 용매로 추출하여 수득하는 것을 특징으로 한다.
[31]
상기 혼합용매는 바람직하게는 약 70% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다. 추출은 당 분야에 알려진 추출방법, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추출 온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으며, 예를 들어, 20℃ 내지 100℃ 등에서 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 추출시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출시간을 채택할 수 있으며, 이에 국한되지 않으나, 약 1시간 내지 10 일의 범위에서 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 추출은 실온에서 약 2일씩 2∼3회 상기한 추출용매로 추출함으로써 수행될 수 있다.
[32]
본 발명의 적포도잎 건조 추출물은 폴리페놀을 유효성분으로 함유하고 있다.
[33]
본 발명의 용어 “폴리페놀”은 방향족 히드록시기를 2개 이상 가진 화합물로써 생체 내에서 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA의 보호나 세포구성 단백질 및 효소를 보호하는 항산화 능력이 커서 다양한 질병에 대한 위험도를 낮춘다. 또한, 이미 널리 알려진 항산화 효과 이외에도 순환부전으로 일어날 수 있는 증상의 개선에 효과적인 제제이다. 혈관에 작용하여 혈관벽의 탄력성을 높이고 모세혈관투과성을 조절하여 순환작용을 촉진하므로 하지정맥부전으로 인한 부기 및 불편함을 없애주는 데 효과적이라 알려져 있다.
[34]
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 고려홍삼추출물, 은행엽추출물 및 레스베라트롤(resveratrol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[35]
본 발명에 있어서, 상기 난청은 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하고, 상기 감각신경성 난청은 소음성 난청(noise-induced hearing loss), 이독성 난청, 돌발성 난청 및 노화성 난청으로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
[36]
본 발명의 용어 "난청(hearing loss)"이란 외이, 중이 및 신경전달경로 중 어느 부분의 이상으로 청력이 감소된 상태를 말하며, 전음성 난청(conductive hearing loss) 및 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)을 포함한다. 바람직하게 본 발명에서 난청은 소음, 약물, 노화, 외상, 바이러스 등의 다양한 원인에 의해 발생하는 전음성 난청 및 다양한 소음에 의해 달팽이관과 청신경이 손상된 증상을 나타내는 소음성 난청(Noise induced hearing loss, NIHL)을 포함하는 감각신경성 난청을 포함한다.
[37]
상기 소음성 난청은 음향외상성 난청(Acoustic Trauma Hearing loss), 단시간의 소음으로 인한 일시적 역치 상승(Temporary threshold shift, TTS) 및 장시간의 소음으로 인한 영구적 역치 상승(Permanent threshold shift, PTS)을 모두 포함한다.
[38]
본 발명의 적포도잎 추출물 또는 폴리페놀은 소음 등으로 인한 청력 역치의 상승을 효과적으로 억제시킴으로써, 난청, 특히 음향 외상성, 일시적 또는 영구적 소음성 난청을 억제할 수 있다.
[39]
일 양태에서, 본 발명의 적포도잎 건조 추출물은 동결건조하여 분말형태로 사용 및 보관하였다. 상기 파우더는 물에 녹여서 80mg/kg의 농도로 각 마우스에 투여한 후 소음 노출에 따른 청량 역치를 청성뇌간반응(ABR) 검사를 수행하였고, 그 결과, 적포도잎 건조 추출물을 처리한 마우스는 대조군에 비해 청력 역치가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 2). 또한, 소음에 노출시켰을 때, 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 와우 내 나선 신경절 및 와우 내 청각유모세포의 항산화효소 발현을 관찰한 결과 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군에서 항산화효소의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).
[40]
본 발명의 일 양태에서는 소음에 의한 난청유발 과정에서 나타나는 산화 스트레스에 의해 발생하는 활성산소종(ROS)을 생성하기 위하여 적포도잎 건조 추출물을 5μg/ml, 15μg/ml, 30μg/ml 및 45μg/ml의 농도로 전처리한 청각세포주에 과산화수소(H 2O 2)를 처리하여 한 후, 청각세포주의 세포독성 및 사멸효과를 관찰한 결과, 세포독성 및 사멸이 억제되는 것을 관찰하였다(도 5). 또한, 카탈라아제(catalase) 및 슈퍼옥시드 디스무타아제2(SOD2)의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 6 및 도7).
[41]
본 발명의 일 양태에서는 본 발명의 적포도잎 건조 추출물 또는 은행엽추출물을 각각 투여하는 대조군과 상기 두 추출물 (적포도잎 건조 추출물 60mg/kg, 은행엽추출물 3.5mg/kg)을 병용하여 투여한 실험군에서 소음 노출에 따른 청량 역치를 청성뇌간반응(ABR) 검사를 수행하였고, 그 결과, 적포도잎 건조 추출물에 은행엽추출물을 병용하여 처리한 마우스는 대조군에 비해 청력 역치가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
[42]
상기와 같이 본 발명의 적포도잎 추출물은 청각 역치를 크게 감소시키고, 와우 내 나선 신경절 및 청각유모세포에서 항산화 효소의 발현을 증가시키며, 세포의 세포독성 및 사멸을 억제하므로, 난청의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
[43]
본 발명의 용어 “활성 산소”란 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단백질의 산화 등을 유발하여 세포 내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 된다.
[44]
산소와 관련된 인체 내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다.
[45]
본 발명은 다른 관점에서, 적포도잎 추출물을 포함하는 약학 조성물을 이용하여 난청을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
[46]
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
[47]
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
[48]
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함한다.
[49]
본 발명의 약학적 조성물이 경구용 고형 제제로 제제화된 경우 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토즈, 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
[50]
본 발명의 약학적 조성물이 경구용 액상 제제화된 경우 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
[51]
본 발명의 약학적 조성물이 비경구용 제제화된 경우 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
[52]
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
[53]
본 발명의 약학적 조성물에 함유되는 적포도잎 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 적포도잎 추출물은 1일 1 내지 2000mg/kg으로, 바람직하게는 10 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
[54]
본 발명은 또 다른 관점에서, 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)을 유효성분으로 포함하는 난청 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[55]
본 발명에 있어서, 상기 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)은 적포도잎을 물, C1∼C4의 알콜 및 물과 C1∼C4의 알콜과의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 할 수 있다.
[56]
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 고려홍삼추출물, 은행엽추출물 및 레스베라트롤(resveratrol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[57]
본 발명에 있어서, 상기 난청은 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하고, 상기 감각신경성 난청은 소음성 난청(noise-induced hearing loss), 이독성 난청, 돌발성 난청 및 노화성 난청으로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
[58]
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
[59]
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
[60]
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
[61]
본 발명의 식품 조성물은 난청, 특히 소음성 난청의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 조성물 총 중량에 대하여 적포도잎 추출물을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량% 포함할 수 있다.
[62]
또한, 본 발명의 식품 조성물은 난청의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
[63]
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 적포도잎 추출물 또는 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
[64]
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 적포도잎 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 적포도잎 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
[65]
환 형태의 건강기능식품은 적포도잎 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
[66]
과립형태의 건강기능식품은 적포도잎 추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호(1680μm), 14호(1410μm) 및 45호(350μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0% 이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0% 이하일 수 있다.
[67]
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다(대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5개정판, p33-48, 1989).
[68]
[69]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[70]
[71]
실시예 1: 인비보(in-vivo) 실험-소음성 난청 마우스 모델을 이용하여 청력기관 기능 분석을 통한 난청 예방 효과 확인
[72]
총 24마리 7주령 수컷 Balb/c 마우스에 청성뇌간반응(Auditory brainstem response; ABR) 검사를 시행하여 선천적 비정상 청력을 가진 마우스는 배제하였다.
[73]
소음 노출전 유럽종 적포도잎 건조 추출물(vitis vinifera leaf dry extract)을 80mg/kg의 농도로 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군으로 각각 12마리씩 분류하였다. 실험군은 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 1일 1회 7일간 복강투여 하였다. 투여 후 white noise 100dB의 소음에 50분 동안 노출시켜 소음성 난청을 유발하였다.
[74]
유럽종 적포도잎 건조 추출물을 7일간 투여한 뒤, 소음성 난청에 대한 청각기능 분석을 위하여 청성뇌간반응 검사를 수행하였다. TDT ABR 기기를 이용하여 8 kHz, 16 kHz, 32 kHz의 tone burst음을 주어 wave V의 파형이 나오는 최소자극음 크기(dB)를 청력역치로 판정하며, 소음 노출전 약물투여한 실험군과 대조군의 청력을 측정하여 소음성 난청 예방효과를 비교 분석하였다.
[75]
그 결과, 실험군과 대조군 모두 소음 노출 후 1일, 7일, 14일에서 청력 역치가 증가하는 결과를 보였다. 그러나 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 전처리한 실험군은 대조군에 비해 청력 역치가 유의하게 감소되어 있음을 관찰하였다(도 2). 따라서, 유럽종 적포도잎 건조 추출물이 소음에 의한 청력 감소를 예방한다는 것을 알 수 있다.
[76]
[77]
실시예 2: 인비보(in-vivo) 실험-소음성 난청 마우스 모델을 이용하여 형태분석을 통한 난청 예방 효과 확인
[78]
실시예 1의 마우스를 이용하여 소음에 노출시켰을 때, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 와우 내 나선 신경절의 항산화효소 발현을 면역염색 분석을 통하여 관찰한 결과, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군에서 항산화효소가 유의하게 발현이 증가하는 것을 관찰하였다(도 3).
[79]
또한, 유럽종 적포도잎 건조 추출물를 처리한 군과 처리하지 않은 군의 와우 내 청각유모세포의 항산화효소 발현을 면역염색 분석을 통하여 관찰한 결과, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군에서 항산화효소가 유의하게 발현이 증가하는 것을 관찰하였다(도 4).
[80]
따라서, 유럽종 적포도잎 건조 추출물이 소음에 의한 난청을 예방한다는 것을 알 수 있다.
[81]
[82]
실시예 3: 인비트로(in-vitro) 실험- 적포도잎 건조 추출물에 의한 청각세포의 세포사멸
[83]
인-비트로(in-vitro) 세포 실험을 위하여, 청각 유전자들을 발현하는 청각세포주(HEI-OC1; House-Ear Institute-organ of Corti 1)를 배양하였다.
[84]
세포사멸을 평가하기 위하여, 상기 청각세포주에 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 5μg/ml, 15μg/ml, 30μg/ml 및 45μg/ml의 농도로 전처리한 군과 처리하지 않은 군으로 분류하였다. 이후 상기 청각세포주에 과산화수소(H2O2)를 처리한 후 과산화수소에 의한 세포독성 및 사멸효과를 WST-1 어세이를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 전처리한 군의 청각세포주의 세포독성 및 사멸이 억제되는 것을 관찰하였고, 특히, 15μg/ml의 농도의 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리하였을 때, 청각세포주의 세포독성 및 사멸이 억제되는 것을 확인하였다(도 5).
[85]
[86]
실시예 4: 인비트로(in-vitro) 실험- 적포도잎 건조 추출물의 항산화 작용
[87]
유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리한 청각세포 내의 항산화 현상을 관찰하기 위하여, 실시예 3의 세포주를 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 5μg/ml, 15μg/ml, 30μg/ml 및 45μg/ml의 농도로 전처리한 군과 처리하지 않은 군으로 분류한 후, 과산화수소를 처리하였다. 이 후, 카탈라아제(catalase) 및 슈퍼옥시드 디스무타아제2(SOD2) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot) 및 실시간 중합효소연쇄반응법(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.
[88]
그 결과, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 처리한 군에서 카탈라아제(catalase) 및 슈퍼옥시드 디스무타아제2(SOD2)의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되는 것을 관찰하였고, 특히, 유럽종 적포도잎 건조 추출물을 15μg/ml 및 30μg/ml의 농도로 처리하였을 때, mRNA 및 단백질 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7).
[89]
청각세포주 및 소음성 난청 유도 동물을 이용한 실험 결과를 통하여, 유럽종 적포도잎 건조 추출물이 난청을 예방하고 치료하는 데 유용하게 이용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[90]
[91]
실시예 5: 인비보(in-vivo) 실험-적포도잎추출물에 은행엽추출물을 병용한 경우, 소음성 난청 마우스 모델을 이용하여 청력기관 기능 분석을 통한 난청 예방 효과 확인
[92]
실시예1의 마우스를 이용하여 소음에 노출하였을 때, 소음 노출전 유럽종 적포도잎 건조 추출물(vitis vinifera leaf dry extract)과 은행엽추출물을 각각 투여한 대조군과 상기 두 추출물(적포도잎 건조 추출물 60mg/kg, 은행엽추출물 3.5mg/kg)을 병용하여 투여하는 실험군으로 각각 12마리를 분류하였다. 실험군은 1일 1회 적포도잎 건조 추출물 60mg/kg, 은행엽추출물 3.5mg/kg을 병용하여 7일간 복강투여 하였다. 투여 후 white noise 100dB의 소음에 50분 동안 노출시켜 소음성 난청을 유발하였다.
[93]
유럽종 적포도잎 건조 추출물을 7일간 투여한 뒤, 소음성 난청에 대한 청각기능 분석을 위하여 청성뇌간반응 검사를 수행하였다. TDT ABR 기기를 이용한 8 kHz, 16 kHz, 32 kHz의 tone burst음 조건에서, 실험군과 대조군의 청력을 측정하여 소음성 난청 예방효과를 비교 분석하였다.
[94]
그 결과, 실험군과 대조군 모두 소음 노출 후 1일, 7일, 14일에서 청력 역치가 증가하는 결과를 보였다. 그러나 상기 병용한 추출물을 전처리한 실험군은 대조군에 비해 청력 역치의 증가 정도가 유의하게 감소하였음을 관찰하였다(도 8). 따라서, 유럽종 적포도잎 건조 추출물에 은행엽추출물을 병용하는 경우에 각각을 투여한 경우보다 소음에 의한 청력 감소를 예방한다는 것을 알 수 있다.
[95]

산업상 이용가능성

[96]
본 발명의 추출물(vitis vinifera leaf extract)를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물은 소음 등으로 인한 와우 내 청각 유모세포 및 나선 신경절 세포의 손상을 보호하고, 청신경에서 측정되는 청력역치를 효과적으로 감소시키므로, 난청의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
[97]
[98]
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

청구범위

[청구항 1]
적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)를 유효성분으로 함유하는 난청 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)은 적포도잎을 물, C1∼C4의 알콜 및 물과 C1∼C4의 알콜과의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 고려홍삼추출물, 은행엽추출물 및 레스베라트롤(resveratrol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 난청은 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
[청구항 5]
제4항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 소음성 난청(noise-induced hearing loss), 이독성 난청, 돌발성 난청 및 노화성 난청으로 구성된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
[청구항 6]
적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)을 유효성분으로 포함하는 난청 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[청구항 7]
제6항에 있어서, 상기 적포도잎 추출물(vitis vinifera leaf extract)은 적포도잎을 물, C1∼C4의 알콜 및 물과 C1∼C4의 알콜과의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
[청구항 8]
제6항에 있어서, 고려홍삼추출물, 은행엽추출물 및 레스베라트롤(resveratrol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
[청구항 9]
제6항에 있어서, 상기 난청은 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
[청구항 10]
제9항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 소음성 난청(noise-induced hearing loss), 이독성 난청, 돌발성 난청 및 노화성 난청으로 구성된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.

도면

[도1]   [규칙 제91조에 의한 정정21.06.2018] 

[도2]   [규칙 제91조에 의한 정정21.06.2018] 

[도3]   [규칙 제91조에 의한 정정21.06.2018] 

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]   [규칙 제91조에 의한 정정21.06.2018] 

[도8]   [규칙 제91조에 의한 정정21.06.2018]