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1. (WO2019001602) METHOD FOR THE TARGETED IDENTIFICATION OF HIGHLY-EFFICIENT "SMALL INTERFERING RNAS" "ERNAS" FOR USE IN PLANTS AND OTHER TARGET ORGANISMS
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METHODE ZUR GEZIELTEN IDENTIFIZIERUNG HOCHEFFIZIENTER "SMALL INTERFERING RNAS "ERNAS" ZUR ANWENDUNG IN PFLANZEN UND ANDEREN ZIELORGANISMEN

RNA Interferenz, RNA interference (RNAi) oder auch RNA silencing, ist eine Technologie, die in Zellen praktisch aller Organismen (am besten charakterisiert in höheren Eukaryonten) zum Abschalten (silencing) oder zur Modulation der Genexpression eingesetzt werden kann (Kim und Rossi, 2008; Carthew und Sontheimer, 2009). Dabei nutzt man zelluläre Funktionen, um über die Aktivität kleiner Ribonukleinsäuremoleküle (small RNAs, sRNAs) die Funktion von sog. target Ribonukleinsäuremolekülen (target RNAs) zu inaktivieren oder zu modulieren. Die target RNAs können dabei pathogenen aber auch zellulären Ursprungs sein.

RNAi beruht auf einem evolutionär konservierten Verteidigungsmechanismus (defense mechanism) der Zelle. So ist RNAi z.B. bei Insekten und Pflanzen eine Hauptkomponente der Immunantwort gegen Pathogene (Ding, 2010; Zvereva und Pooggin, 2012; Gammon und Mello, 2015). In der Zelle wird RNAi durch Ribonukleinsäuremoleküle ausgelöst, die doppelsträngig sind oder doppelsträngige Bereiche aufweisen (double-stranded, ds RNAs). Am besten untersucht ist dies bei viralen Infektionen: RNAi-auslösende ds RNAs stammen dabei aus strukturierten Regionen viraler messenger RNAs (mRNAs), aus viralen RNA Genomen oder aus viralen ds RNA Replikationsintermediaten. Ds RNAs werden in der Zelle als sog. pathogen-associated molecular pattern (PAMP) und damit als ,fremd' wahrgenommen. Detektoren von dsRNAs sind dabei u.a. zelluläre Enzyme, die zur Familie der Typ III Ribonukleasen gehören und als Dicer oder Dicer-like proteins (DCLs) bezeichnet werden (Alyari und Ding, 2009; Fukudome und Fukuhara, 2017; Song und Rossi, 2017). Bei der antiviralen RNAi Immunantwort der Pflanze haben die ursprünglich aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (At) charakterisierten DCL2 und DCL4 hierbei eine zentrale Rolle (Bouche et al., 2006; Deleris et al., 2006; Parent et al., 2015). DCL2 und DCL4 binden ds RNAs und prozessieren diese durch endonukleolytische Spaltung zu sog. small interfering RNAs (siRNAs). SiRNAs sind 5'-phosphorylierte ds RNAs (RNA-Duplexe), die Längen von 20-24 Nukleotiden (nt) aufweisen und am 3'-Ende einen 2 nt-langen Überhang (overhang) haben (Bernstein et al. 2001; Elbashir et al. 2001a, Elbashir et al., 2001b; Martinez et al., 2002). Antivirale Wirksamkeit haben insbesondere die siRNAs, die eine Länge von 21nt oder 22 nt aufweisen und von DCL4 bzw. DCL2 generiert werden (Deleris et al., 2006). Die siRNAs werden nach der Generierung durch die DCLs in sog. RNA-induced silencing complexes (RISC) eingebaut. Dabei wird der RNA-Duplex aufgewunden und ein Strang, der passenger Strand, entfernt und abgebaut. Der andere Strang des siRNA Duplex, der guide Strand, wird von den sogenannten Argonaute (AGO)-Proteinen gebunden; diese sind eine Hauptkomponente der RISC (Hammond et al., 2001; Meister, 2013; Kobayashi und Tomari, 2016). In At sind 10 verschiedene AGO bekannt; sie

haben unterschiedliche Funktionen, die z.T. noch nicht vollständig geklärt sind (Vaucheret, 2008). Für AGOl und AG02, aber auch für AG03, AG05 und AG07, wurde gezeigt, dass sie in der antiviralen Irrtmunantwort der Pflanze involviert sind (Carbonell und Carrington, 2015). Die verschiedenen AGO-Proteine haben dabei verschiedene Bindungsprioritäten für siRNA guide Strands. So bindet z.B. AGOl mit hoher Priorität RNAs, die ein 5' -ständiges U-Nukleotid enthalten, während AG02 priorisiert RNAs mit einem 5'A-Nukleotid binden (Mi et al. 2008, Takeda et al., 2008, Schuck et al., 2013). Nach Bindung des siRNA guide Strands durch AGO-Proteine werden die entsprechenden RISC an die target RNA herangeführt. Eine wesentliche Rolle spielt dabei die Sequenzkomplementarität der siRNA guide Strands zu den target RNAs (Liu et al., 2014); es scheint aber auch noch weitere Kriterien zu geben, die bisher noch nicht vollständig charakterisiert sind (siehe unten). Unter natürlichen Umständen handelt es sich bei den target RNAs um RNA-Moleküle, die ursprünglich von den DCLs als PAMPS erkannt und zu siRNAs prozessiert wurden (sog.„kognate RNAs"). Bei viralen Infektionen sind dies entsprechend virale mRNAs oder virale Genome. Nach Assoziation des AGO/RISC an die zum siRNA guide Strand komplementären Regionen der kognaten RNA, dies können kodierende als auch nicht kodierende Regionen (untranslatierte Regionen) sein, kommt es zu einer durch das AGO-Protein katalysierten endonukleolytischen Spaltung der RNA („slicing"); diese erfolgt etwa in der Mitte des siRNA guide Strands (Elbashir et al., 2001b; Elbashir et al., 2001c; Wang et al., 2008). Alternativ gibt es Hinweise darauf, dass an target RNAs assoziierte siRNA-haltige AGO/RISC die Translation dieser RNAs inhibieren (Brodersen et al., 2008; Iwakawa und Tomari, 2013). Ergebnis der Aktivität dieser „primären siRNAs" im RNAi Prozess ist entsprechend eine temporäre Hemmung der Genexpression. Dabei werden target RNAs gespalten und abgebaut bzw. die Synthese der durch diese RNAs kodierten Proteine gehemmt. Resultat des gegen Pathogene gerichteten RNAi ist somit eine Hemmung der Genexpression bzw. der Vermehrung des Pathogens (Zvereva und Pooggin, 2012). Beim antiviralen RNAi in der Pflanze existiert noch ein weiterer Mechanismus, der die Immunantwort nochmals deutlich verstärken kann. So existieren in Pflanzenzellen sogenannte RNA-abhängige RNA Polymerasen (RDR). Diese können beispielsweise die durch die AGO-Aktivität entstandenen Abbauprodukte der target RNAs als Matrizen (templates) erkennen und darauf neue ds RNAs synthetisieren. Diese ds RNAs werden wiederum durch DCLs erkannt und prozessiert und es entstehen weitere, sog.„sekundäre siRNAs" (Wang et al., 2010; Wang et al., 2011). Primäre als auch sekundäre siRNAs werden durch die Plasmodesmata der Pflanzenzellen bzw. das Phloem über bisher nicht vollständig geklärte Mechanismen in den kompletten Pflanzenorganismus transportiert (Mermigka et al., 2016). Durch die graduelle Akkumulation von siRNAs kann entsprechend die antivirale RNAi-Antwort sowohl lokal als auch systemisch wirksam werden (Abb. 1).

Genutzt wird RNAi für den künstlichen„knock down" der Genexpression. Dazu werden siRNAs oder andere verwandte kleine RNAs wie micro RNAs (miRNAs) in die Zelle eingebracht, um damit bestimmte target RNAs in ihrer Funktion zu beeinflussen (McManus und Sharp, 2002; Schwab et al., 2006). Im einfachsten Fall kann mit dieser Methode, wie oben geschildert, die Genexpression unterdrückt werden (PTGS, post transcriptional regulation of gene expression). PTGS einer bestimmten mRNA kann wiederum die Genexpression an anderer Stelle begünstigen oder inhibieren; insofern können durch monovalenten und/oder multivalenten RNAi auch komplexe Genexpressionsmuster in der Zelle beeinflusst werden. Neben genomweiten Untersuchungen von Genfunktionen in der Grundlagenforschung wird RNAi in der Pflanze entsprechend auch bei vielen Anwendungen eingesetzt. So konnten über die Anwendung von RNAi Kulturpflanzen entwickelt werden, deren Ernährungswert z.B. über Regulierung der Biomasse, des Gehalts an Toxinen, Mineralien, Vitaminen, Aminosäuren, Fettsäuren, Ballaststoffe, Allergene usw. verbessert wurde. Zudem konnten Pflanzen erzeugt werden, die eine höhere Resistenz gegenüber abiotischem Stress (z.B. Trockenheit, Salzgehalt der Erde usw.) aber auch biotischem Stress (Infektion oder Schädigung durch Pathogene) aufweisen (Saurabh et al., 2014). Letzterer Aspekt wird im Folgenden detaillierter dargestellt.

Wie bereits dargestellt, ist RNAi eine entscheidende Komponente des pflanzlichen Immunsystems und Infektionen durch Pathogene können durch Induktion der Synthese primärer und sekundärer siRNAs gegen Pathogen-target RNAs bekämpft werden. So kann über künstliche Expression von siRNAs, die gegen virale RNAs gerichtet sind, eine Pflanze gegen das betreffende Virus geschützt werden. Dies gilt für Viren mit einem RNA Genom, jedoch auch für Viren mit einem DNA Genom (Khalid et al., 2017) oder Pflanzen-infizierende Bakterien, deren mRNAs durch RNAi attackiert werden können. Des Weiteren sind Anwendungen gegen weitere Pflanzenpathogene und -parasiten bekannt, die, gemeinsam mit den Maßnahmen gegen Viren und Bakterien unter dem Begriff host-induced gene silencing (HIGS) zusammenfasst werden. So können in einer Nutzpflanze auch siRNAs exprimiert werden, die gegen mRNAs von pflanzenschädigenden Insekten, Würmern oder Pilzen gerichtet sind (Price und Gatehouse, 2008; Nowara et al., 2010; Banerjee et al., 2017). In ähnlicher Form kann RNAi auch gegen parasitäre Pflanzen eingesetzt werden (Tomilov et al., 2008; Bandaranayake und Yoder, 2013). Während bei viralen und bakteriellen Infektionen RNAi direkt im Organismus der Wirtspflanze aktiv ist, werden in den letzteren Fällen die exprimierten siRNAs auf das Pathogen bzw. den Parasiten übertragen - im einfachsten Fall über die Aufnahme der Pflanze als Nahrung (z.B. bei Insekten und Würmern) (s.o.). Die technischen Möglichkeiten von HIGS sind in den letzten Jahren deutlich erweitert worden, nachdem es möglich geworden ist, siRNAs oder andere sRNAs deutlich billiger herzustellen und über Sprayverfahren einzusetzen (Dalakouras et al., 2016).

Ziel von HIGS ist in jedem Fall die Schädigung oder Abtötung des Pathogens und damit der Schutz der Pflanze. Die Technologie birgt allerdings Risiken. So besteht die Möglichkeit, dass RNAi neben der eigentlichen target RNA noch weitere RNAs attackiert. Man spricht in diesem Falle von off-target effects (Jackson und Linsley, 2004; Senthil-Kumar und Mysore, 2011). Dies kann z.B. dann der Fall sein, wenn die off-target RNAs ähnliche Sequenz- oder Strukturkompositionen wie die eigentlichen target RNAs aufweisen (Jackson et al., 2006; Kamola et al., 2015). Die Problematik von off-target effects ist besonders evident bei HIGS gegen Pflanzen-befallende komplexe Organismen wie Pilze oder Parasiten, wo es von großer Wichtigkeit ist, ausschließlich deren target RNAs anzugreifen, nicht aber die target RNAs verwandter Arten.

In den Zellen der meisten eukaryotischen Organismen kann RNAi über verschiedene Techniken induziert werden. So können ds RNAs, einzelne siRNAs, miRNAs oder andere sRNAs entweder transient in die Pflanze eingebracht oder transgen exprimiert werden. Bei Pflanzen sind Transgene bereits seit ca. zwei Jahrzehnten etabliert. Verschiedenste transgene Pflanzenspezies, auch Kulturpflanzen, sind bereits in der Anwendung (Herrera-Estrella et al., 2005; Kamthan et al., 2016). Die Herstellung von Transgenen ist jedoch aufwendig und langwierig. Zudem ist die Nutzung transgener Pflanzen umstritten und in vielen Ländern, z.B. in der EU, in der landwirtschaftlichen Anwendung verboten (Lucht, 2015). Problematisch ist insbesondere der Einsatz von transgenen Pflanzen, die eine Immunität gegen Pathogene aufweisen sollen: So wurde in vielen Anwendungen deutlich, dass durch den evolutionären Druck, den die Verwendung transgener Pathogen-resistenter Pflanzen erzeugt, in relativ kurzer Zeit, neue resistente Pathogene entstehen (Simon-Mateo und Garcia, 2006; Lin et al., 2009; Tabashnik et al., 2013; Kung et al, 2015). Bei transgenen Pflanzen liegt somit eine ähnliche Problematik vor wie bei traditionell über Züchtung gewonnenen Pathogenresistenten Pflanzen.

Für das langfristige Management von Pflanzenkrankheiten hat sich mittlerweile die Erkenntnis durchgesetzt, dass neue Verfahren entwickelt werden müssen, die effizient antipathogen wirksam sind und die weder langwierige Züchtung noch den Einsatz transgener Methoden erfordern. Diese Verfahren sollten zudem ökologisch vertretbar sein und schnell adaptierbar auf neu entstehende (new emerging) oder weiterverbreitete Pathogene sein.

Lösungsmöglichkeiten bietet der bereits erwähnte transiente Einsatz von RNAi. Jedoch ist das transiente Einbringen von Nukleinsäuren und speziell von sensiblen RNA Molekülen in die Pflanze, insbesondere aufgrund der rigiden pflanzlichen Zellwände, ein erhebliches technisches Problem. Hier sind seit Langem unterschiedlichste Verfahren in der Erprobung. Praktiken aus der

Grundlagenforschung wie biolistische Verfahren (über eine sog. gene gun) oder das Einbringen von Nukleinsäuren durch Fremdorganismen (Vektoren) wie Viren oder Agrobakterien sind aus ökonomischen oder Sicherheitsgründen für die landwirtschaftliche Pflanzenproduktion nicht geeignet. Der Einsatz von Viren bedeutet immer ein latentes Sicherheitsproblem, allein durch die reale Möglichkeit von Rekombinationsereignissen viraler und zellulärer RNAs (Bujarski, 2013). Bei DNA Viren und Agrobakterien besteht zudem das Risiko, dass Teile des Vektorgenoms in das Pflanzengenom eingebaut werden können (Harper et al., 2002; Ulker et al., 2008). Erst seit kurzem gibt es Ansätze, die einen effizienten, nicht-transgenen Einsatz von RNA möglich erscheinen lassen. Dies hängt zum einen damit zusammen, dass in den letzten etwa 5 Jahren Verfahren entwickelt wurden, die eine Herstellung von ds RNA im Gramm- oder sogar Kilogramm-Maßstab erlauben (Robinson et al., 2014). So wurde der Preis von einem Gramm ds RNA, das etwa für den Einsatz auf einem kleinen Feld von Kulturpflanzen benötigt wird, von über 100.000 US$ auf nunmehr 2 US$ gesenkt (Le Page, 2017). Zudem gibt es Hinweise darauf, dass ds RNA, produziert in E. coli und auf Pflanzenblätter aufgebracht dort auch aufgenommen und wirksam werden kann (Tenllado et al., 2003). Besonders effizient wird dieser Prozess durch die Verpackung der ds RNAs in ökologisch vollständig abbaubare Nanopartikel (Mitter et al., 2017).

Die derzeit verwendeten Methoden von RNAi haben noch erhebliche Anwendungsnachteile. Diese liegen insbesondere bei eingesetzten siRNAs, die entweder ineffizient sind oder off-target effects zeigen. Weltweit wurden bereits verschiedenste Anwendungen mit einzelnen siRNAs oder auch siRNA pools (gemeinsame Anwendung einer Fülle verschiedener siRNAs) in Pflanzen durchgeführt. Die dabei verwendeten siRNAs wurden meist über sehr einfache in silico Vorhersagen vorgeschlagen, z.B. im Hinblick auf eine Komplementarität zu konservierten Bereichen einer target RNA, und dann bezüglich ihrer Wirkung in empirischen Untersuchungen („try and error") getestet. Entsprechend war bisher nicht nachgewiesen, ob bzw. inwieweit diese siRNAs tatsächlich in optimalster Weise und damit auch spezifisch auf der avisierten target RNA wirken. Assoziiert waren beim Einsatz antipathogener siRNAs entsprechend häufig Beobachtungen, dass die Schutzwirkung nur kurz war und/oder dass off-target Effekte auftraten (Qu et al., 2007; Kung et al., 2012; Casacuberta et al., 2015. Andere Formen der Applikation verwenden künstliche ds RNA Moleküle (Robinson et al., 2014). Diese ds RNAs bestehen entweder aus komplett komplementären Sequenzen von mehreren hundert Nukleotiden der target RNAs oder aber aus entsprechend komplementären Sequenzen, die durch einen ,spacer' verbunden sind (sog. ,hairpin' Molekülen). Nach Eintritt in die Pflanzenzelle werden diese ds RNAs durch die DCLs in eine Vielzahl (einen pool) unterschiedlichster siRNAs prozessiert. Antipathogene ds RNAs zeigen in der Regel gute Wirksamkeit; allerdings ist hier die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationsereignissen und off-target effects, die einen schädigenden Effekt auf den Wirtsorganismus haben können, besonders hoch. Entsprechend wird die Verwendung von ds RNAs, bei deren Verwendung nicht näher charakterisierte siRNAs generiert werden können, ebenfalls als problematisch anzusehen (Duan et al., 2012; Dalakouras et al., 2016).

Es stellt sich somit die Aufgabe, RNAi mit siRNAs oder siRNA-kodierenden ds RNAs durchzuführen, die eine nachgewiesen hohe Spezifität haben. Auf diese Weise wird eine hohe Wirksamkeit erreicht und die Wahrscheinlichkeit von off-target effects minimiert.

Erfindungsgemäß wurde ein experimentelles in vitro System etabliert und optimiert, dessen wesentlicher Bestandteil ein Extrakt aus dem Zytoplasma von Tabakzellen (BY-2 Zellen aus Nicotiana tabacum, Nt) ist. Diese Extraktform wurde ursprünglich von Komoda et al. publiziert ( Komoda et al., 2004). In dem erfindungsgemäßen System werden in Kultur gezogene Tabakzellen über biochemische Verfahren aufgeschlossen und das Zytoplasma der Zellen (BY2-Lysat oder BYL) in evakuolisierter Form (frei von Bestandteilen der pflanzlichen Vakuolen) gewonnen (Komoda et al., 2004). In diesem System werden zum einen mRNAs in dem Extrakt in vitro d.h. im Eppendorf-tube (Reagenzglas) translatiert. Dies ermöglicht es, Proteine freier Wahl in den Extrakten herzustellen. Weiterhin kann die Inhibition der Translation von mRNAs mittels der mRNA kodierter Reporterproteine, z.B. Firefly Luciferase gemessen werden. Zum zweiten kann der komplette Replikationsprozess von RNA Viren (Viren mit einem (+)RNA Genom) in vitro reproduziert werden (Komoda et al., 2004; Gursinsky et al., 2009). Zum dritten kann der RNA silencing (RNAi) Prozess im Reagenzglas nachgestellt werden (Iki et al., 2010; Schuck et al., 2013).

Dieser dritte Aspekt ist wesentlicher Bestandteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und im Folgenden detailliert dargestellt.

In BYL sind alle DCL-Proteine aktiv, die ds RNA in 21, 22 und 24 nt siRNAs prozessieren können. Entsprechend können mRNAs oder ds RNAs, die zuvor über Standardverfahren (in vitro Transkription) hergestellt wurden, in den BYL eingesetzt werden, und die RNAs werden dann entsprechend durch die endogenen DCLs zu siRNAs prozessiert.

Bei Zugabe von mRNAs, die für die AGO-Proteine kodieren, können AGO-Proteine eigener Wahl durch in vitro Translation generiert werden. Durch Einsatz leicht modifizierter AGO- mRNAs, können die betreffenden AGO-Proteine mit einem tag, einer kurzen Peptidsequenz bspw. ein FLAG-tag aus dem Protein Flagellin, z.B. am N-Terminus des Proteins, hergestellt werden. Auf diese Weise lassen sich die AGO-Proteine so darstellen, dass sie anschließend mit einem Antikörper gegen das tag, z.B. einen Anti-FLAG-tag Antikörper, über ein Standardverfahren aus dem Extrakt herausextrahiert (immunopräzipitiert) werden können. Entscheidend bei diesem Verfahren ist, dass die im BYL auf beschriebene Weise hergestellten AGO-Proteine funktionell aktiv sind, d.h. sie können siRNA oder andere sRNA Duplexe erkennen und die betreffenden guide Strands binden. Darüber hinaus bilden die AGO- Proteine funktionelle RISC Komplexe und sind in der Lage, über guide Strands assoziierte RNA-targets endonukleolytisch zu spalten {slicing) bzw. deren Translation zu blockieren. Ein weiterer entscheidender Aspekt ist, dass die betreffenden in vitro hergestellten AGO/RISC mit verschiedensten siRNAs beladen (programmiert) werden können, z.B. einem siRNA pool, der nach Zufügen einer target RNA in den BYL durch die endogenen DCL erzeugt wurde. Alternativ kann aber auch während der Translation des entsprechenden AGO-Proteins ein einzelner, synthetischer siRNA Duplex in hoher Konzentration zugesetzt werden. Der guide Strand dieser einzelnen siRNA wird dann bevorzugt in den generierten AGO/RISC eingebaut. In einem weiteren Schritt wird die target RNA zu dem BYL zugegeben. Somit können nun entweder die Aktivitäten eines siRNA pools oder aber einer einzelnen siRNA bezüglich ihrer Fähigkkeiten zum AGO-katalysierten slicing oder zur Translationsinhibition einer target RNA in vitro getestet werden.

Erfindungsgemäß werden

1. Über einen im Folgenden als DCL-Assay bezeichneten Ansatz die endogenen DCL-Aktivitäten des BYL genutzt um, aus einer beliebigen RNA, die ds Bereiche enthält, siRNAs zu generieren.

2. Durch in vitro Translation können AGO-Proteine eigener Wahl (z.B. die zehn verschiedenen bekannten AGO-Proteine aus At) hergestellt werden. Auch mit tag sind die AGO-Proteine funktionell, d.h. sie können sRNA guide Strands binden und aktive RISC Komplexe bilden.

3. Die in vitro translatierten AGO-Proteine können mit bereits im Extrakt vorliegenden/bereits aus RNA-Substraten über die endogenen DCLs generierten siRNAs (einem siRNA pool) beladen werden. Zwecks Identifizierung einzelner AGO-assoziierte siRNAs, können die RISC Komplexe über den AGO-assoziierten tag aus den Extrakten präpariert/immunopräzipitiert werden. Dieses Verfahren wird nachfolgend als AGO-IP bezeichnet.

4. Alternativ zu den unter Ziffer 2 und 3 beschriebenen Verfahren kann bereits während der in vitro Translation des betreffenden AGO-Proteins eine synthetische siRNA hinzugefügt werden und das so generierte AGO-Protein damit präferenziell mit dieser siRNA beladen/programmiert werden.

5. Fügt man den gemäß Ziffer 3 und 4 behandelten experimentellen Systemen eine target RNA hinzu, so kann die Aktivität der entsprechend generierten AGO/RISC auf dieser target RNA untersucht werde. Die verwendete target RNA wird dazu entweder radioaktiv markiert oder sie enthält ein Reportergen. In diesem, im Folgenden als Slicer-Assay bezeichneten Verfahren, kann man entsprechend die Spaltung der target RNA verfolgen und deren

Effizienz auch quantifizieren. Alternativ kann die Inhibition der Translation des Reportergens bestimmt bzw. auch quantifiziert werden.

Mit dem BYL System wurde gezeigt, dass bei Durchführung von Slicer-Assays mit einem siRNA pool (Ansatz 3.) und viralen target RNAs überraschenderweise nur eine sehr begrenzte Anzahl von Spaltprodukten entsteht (Abb. 6). Dies offenbarte, dass von mehreren hundert- oder tausend siRNAs, die aus einer ds RNA durch die DCLs generiert werden und einen siRNA pool bilden, nur sehr wenige tatsächlich auf der target RNA aktiv sind.

Weiterhin konnte gezeigt werden:

(i) Dass die DCL aus einer bestimmten viralen RNA nur eine bestimmte Zahl von siRNAs, davon einige mit hoher Präferenz, generieren (Abb. 2).

(ii) Dass von den DCL-generierten siRNAs wiederum nur eine bestimmte Anzahl in AGOl/RISC bzw. AG02/RISC angereichert werden (Abb. 3 und 4). AGOl/RISC und AG02/RISC wurden hierbei als Beispiele antiviral wirksamer AGO/RISC genutzt.

(iii) Dass von den in den AGOl/RISC bzw. AG02/RISC eingebauten siRNA guide Strands wiederum nur eine Minorität aktiv ist (Abb. 7).

Die mittels des erfindungsmäßigen Verfahrens erhaltenen Daten indizieren damit, dass

a) verschiedene Bereiche einer target RNAs unterschiedliche Zugänglichkeiten (Substratpräferenzen) für die DCLs aufweisen

b) die Effizienz des Einbaus von siRNA guide Strands in die AGO/RISC nicht, wie bisher angenommen, ausschließlich durch die 5'Nukleotide der RNAs bestimmt wird

c) verschiedene Bereiche einer target RNA wiederum unterschiedliche Zugänglichkeiten (Substratpräferenzen) für die siRNA-beladenen AGO/RISC aufweisen

Zusammenfassend kann nochmals festgestellt werden, dass von einer Vielzahl von siRNAs, die von DCLs aus einer target RNA prozessiert werden bzw. die von AGO/RISC eingebaut werden, lediglich eine kleine Anzahl im RNAi Prozess auf der target RNA effizient aktiv ist.

Die Tatsache, dass nur eine kleine Minorität der aus einer ds target RNA generierten siRNAs in AGO/RISC aktiv ist, stellt die Aufgabe, ein Verfahren zu entwickeln, das in der Lage ist, exakt solche siRNAs, die im Folgenden als hocheffiziente siRNAs, cRNAs, bezeichnet werden sollen, zielgerichtet zu ermitteln. Alle derzeit verwendeten Verfahren zur Ermittlung von RNAi-gängigen siRNAs beruhen auf empirischen Studien oder auf in silico Vorhersagen, die praktisch ausschließlich die

Sequenzhomologien von siRNA guide Strands und target RNAs berücksichtigen, damit also keine der oben beschriebenen essenziellen Aspekte wie Einbaurate in AGO/RISC und Aktivität in AGO/RISC berücksichtigen. Die Aufgabe, effektiv wirksame «RNAs identifizierbar zu machen, ergibt sich aus der oben beschriebenen Notwendigkeit, die Anzahl der bei einem RNAi Ansatz eingesetzten siRNAs so gering wie möglich zu halten um die Wahrscheinlichkeiten von

a) Rekombinationsereignissen und

b) off-target Effekten so gering wie möglich zu halten.

Durch den Einsatz von effektiv wirksamen «RNAs ergeben sich zudem folgende, weitere Anwendungsvorteile:

(i) Durch die Kombinierbarkeit verschiedener «RNAs bzw. von eRNAs, die in verschiedene AGO/RISC Komplexe eingebaut werden, kann die Spezifität des RNAi maximal gesteigert werden.

(ii) Bei Pathogenen, die neu auftreten, kann eine RNAi Immunantwort durch eine Neukombination von anti-pathogenen «RNAs schnell und spezifisch angepasst werden.

(iii) Durch eine ökonomische Produktion von cRNAs sollte sich die Akzeptanz des Einsatzes von RNAi in der Pflanzenproduktion deutlich erhöhen und der Einsatz transgener Ansätze in der Pflanzenzucht deutlich vermindern lassen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden siRNAs identifiziert, die in oder außerhalb der Pflanze hocheffizient target RNAs erkennen und inaktivieren können. Ein Beispiel für den Einsatz dieser Technologie ist die Erzeugung von Pflanzen, die temporär oder lebenslang gegen den Befall von Pathogenen wie Viren geschützt sind. Andere umfassen die Erzeugung von Pflanzen die temporär oder lebenslang gegen den Befall von Pathogenen wie Bakterien, Würmern, Pilzen, Insekten und parasitären Pflanzen geschützt sind. Wiederum andere umfassen die Erzeugung von Pflanzen die temporär oder lebenslang verbesserte Wachstums- und Verbrauchereigenschaften aufweisen.

Erfindungsgemäß wird das Verfahren wie folgt durchgeführt:

1. Eine RNA, die als target für RNAi ausgewählt wurde, wird durch in vitro Transkription hergestellt und in BYL durch die endogenen DCL zu siRNAs umgesetzt (DCL-Assay). Bei dieser RNA kann es sich um eine mRNA beliebiger Art (d.h. aus Organismen beliebiger Art), eine genomische virale RNA, oder aber ein virales ds RNA Replikationsintermediat handeln.

Aus der betreffenden RNA entsteht ein DCL-generierter siRNA pool. Die in diesem pool enthaltenen siRNA können durch sog. new generation sequencing, im Folgenden RNA seq. Analyse genannt, ermittelt werden.

Dem BYL wird die wiederum über in vitro Transkription synthetisierte mRNA eines AGO-Proteins zugefügt. Die mRNA ist so aufgebaut, dass sie für das AGO-Protein mit einem tag kodiert.

Über in vitro Translation entstehen AGO-Proteinmoleküle mit tag. Diese AGO Moleküle bilden RISC Komplexe. Diese werden mit den vorliegenden DCL-generierten siRNAs beladen/programmiert. Die Beladung richtet sich nach der Verfügbarkeit der durch die DCL-Aktivität entstandenen siRNAs bzw. nach bekannten und bisher unbekannten Beladungsprioritäten der betreffenden AGO/RISC.

Über den tag werden siRNA-beladene AGO/RISC aus den BYL immunopräzipitiert (AGO-IP). Die gebundenen siRNA guide-strands werden durch RNA seq. Analyse ermittelt.

Es werden solche siRNAs, die besonders stark in AGO/RISC angereichert sind, durch die RNA seq. Analyse identifiziert.

Die Schritte (1) und (2) werden in einem Parallelansatz wiederholt. In diesen Ansatz wird dann die target RNA (markiert) eingesetzt und die Spaltung in einem Slicer-Assay über Detektion der Spaltprodukte gemessen.

Es entstehen bei der RNAi-mediierten Umsetzung einer target RNA aufgrund der nur begrenzten Zahl funktioneller siRNA aus einem siRNA pool nur eine begrenzte Zahl an Spaltprodukten. Über Korrelation der Größe der entstandenen Spaltprodukte und der in (1-3) erhaltenen RNA seq. Daten lassen sich entsprechend siRNAs ermitteln, die einerseits in AGO/RISC hochangereichert und andererseits, über eine gegebene Zugänglichkeit der target RNA für die entsprechenden AGO/RISC, hochaktiv sind.

So ermittelte siRNA-Kandidaten werden synthetisch hergestellt und ihre Funktionalität wiederum in einem Slicer-Assay mit markierter target RNA getestet.

Die so ermittelten eRNAs können dann transgen oder transient angewendet werden. Entsprechend der im Slicer-Assay ermittelten Effizienz der «RNAs, werden diese einzeln oder in Kombination eingesetzt. In Kombination bedeutet, dass entweder verschiedene einzelne siRNAs kombiniert und eingesetzt werden oder dass ds RNAs generiert und eingesetzt werden, von denen erwartet werden kann, dass sie in der Pflanze zu eRNAs prozessiert werden.

Mit den behandelten („eRNA-vakzinierten") Pflanzen werden Virusbeslastungstests durchgeführt, um ihre Wirksamkeit in einem proof of concept abzusichern.

Das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren wird durch nachfolgende Ariwendungsbeispiele näher beschrieben.

Anwendungsbeispiel: Identifizierung von eRNAs des Tomato bushystunt virus (TBSV)

Das Tomato bushy stunt Virus (TBSV) ist ein (+)RNA Virus der Familie Tombusviridae (White und Nagy, 2004). Die meisten Pflanzen-infizierenden Viren sind (+)RNA Viren. Bei diesen Viren ist das Genom eine (+)RNA; es agiert nach Eintritt in die Wirtszelle direkt als mRNA. Die durch Translation generierten viralen Proteine, darunter die virale RNA-abhängige RNA Polymerase, bilden einen Replikationskomplex, der in einem zweistufigen Prozess über ein (-)RNA Intermediat neue Progenie (+)RNA Moleküle generiert (Gunawardene et al., 2017). Das dabei entstehende Replikationsintermediat ist ds RNA. TBSV wurde hier als Modellvirus verwendet.

DCL-Assay

genomische (+)TBSV RNA und (-)TBSV RNA wurden durch in vitro Transkription hergestellt, (ds)TBSV RNA wurde durch annealing äquimolarer Mengen der (+)TBSV RNA und (-)TBSV RNA hergestellt

BYL wurde mit (+JTBSV RNA oder (ds)TBSV RNA unter Translationsbedingungen 2 h inkubiert (50% BYL, ATP, GTP, Kreatin-P, Kreatin-Kinase, 25°C)

Die Gesamt-RNA wurde aus den Ansätzen isoliert (Proteinase-K-Umsetzung, Phenol- Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung)

Die Gesamt-RNA wurde durch eine RNA seq. Analyse (lllumina) charakterisiert

Aus den TBSV RNAs wurde durch die DCL-Aktivität in den BYL siRNA pools produziert. Die durchgeführte RNA seq. Analyse zeigte die Anreicherung von siRNA Spezies an, die entsprechend der Substratpräferenz der im BYL enthaltenen DCL aus genomischer (+)TBSV RNA oder (ds)TBSV RNA generiert werden (Abb. 2)

AGO-IP

AGOl mRNA (aus Arabidopsis thaliana, At, oder Nicotiana tabacum, Nt) bzw. AG02 mRNA (aus Arabidopsis thaliana, At oder Nicotiana benthamiana, Nb), jeweils mit Sequenz für N- terminalen FLAG-rag wurden in BYL 2 h translatiert. Die Translation wurde in Gegenwart von (+)TBSV RNA oder (ds)TBSV RNA durchgeführt, um eine Beladung der AGO/RISC im Moment

ihrer Entstehung mit dem aus den TBSV RNAs durch die DCLs generierten siRNA pools zu ermöglichen.

Die Reaktion wurde durch Zugabe von Anti-FLAG M2 Affinitätsgel (Anti-FLAG-Antikörper an Agarose gekoppelt) gestoppt und eine Immunopräzipitation über Nacht bei 4°C durchgeführt Nicht gebundene Proteine und RNAs wurden durch mehrere Waschschritte entfernt Die Gesamt-RNA wurde aus den Ansätzen isoliert (Proteinase-K-Umsetzung, Phenol- Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung)

Die Gesamt-RNA wurde durch eine RNA seq. Analyse (llluma) charakterisiert

Die AGO Proteine wurden durch in vitro Translation generiert; gleichzeitig prozessierten die BYL-eigenen DCLs die viralen RNA zu vsiRNAs. SiRNA-Duplexe mit hoher Affinität zu AGO-Proteinen wurden in AGOl/RISC oder AG02/RISC eingebaut; ein Strang (guide Strand) verblieb im RISC, der andere Strang (passenger Strand) wurde entfernt. Durch Immunopräzipitation und anschließendes RNA seq. Analyse wurden die in AGOl oder AG02 RISC speziell angereicherten siRNA guide-strands identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zum Verteilungsmuster der siRNAs (bezogen auf das TBSV Gesamtgenom) nach DCL-Assay (Abb. 2), in den AGOl/RISC und AG02/RISC andere Verteilungsmuster erhalten werden (Abb. 3; Abb. 4). Damit konnte eine spezifische Anreicherung von siRNAs in den AGO/RISC im Vergleich zum ursprünglichen siRNA pool erreicht werden. Die Anreicherung folgte dabei im Wesentlichen nach den durch Mi et al. (2008) publizierten Prioritäten - d.h. in AGOl/RISC wurden präferenziell siRNAs mit einem 5'-U, in AG02 wurden präferenziell siRNAs mit einem 5'-A angereichert (Abb. 5).

Slicer-Assay mit siRNA pool

Das TBSV Genom oder ein zu testender Teilbereich des TBSV Genoms (s. Abb. 6) wurde einzel-oder doppelsträngig (unmarkiert) durch in vitro Transkription hergestellt

Z\iAG02-mRNA wurde in BYL in Gegenwart der entsprechenden TBSV RNA translatiert (2 h Inkubation). Die dabei entstehenden AGO/RISC Komplexe wurden dabei im Moment der Entstehung mit den durch die DCL-Aktivität im gleichen Extrakt entstandenen siRNAs beladen/programmiert

- Anschließend wurde die identische, diesmal aber markierte, einzelsträngige TBSV RNA als target für die entsprechend siRNA-beladenen RISC zugegeben und die Inkubation für 20 Minuten fortgesetzt

Die Gesamt-RNA wurde aus den Ansätzen isoliert (Proteinase-K-Umsetzung, Phenol- Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung)

 hier deutlich, dass hohe Akkumulationsraten von siRNA guide Strands (angezeigt durch die heat map in Abb. 8) in AGO/RISC nicht notwendigerweise eRNAs anzeigten (siehe oben). Entsprechend würden die Akkumulationsraten in den RNA seq. Analysen hier mit dem Ergebnis des Slicer-Assays mit dem RNA pool (Abb. 6) abgeglichen. Die Größe der Spaltprodukte der viralen RNA erlaubte Rückschlüsse auf die jeweiligen involvierten siRNAs. So wurde in der gezeigten Anwendung in Abb. 6 und 8 beispielsweise mehrere 200 nt lange, dominante Spaltprodukte ermittelt, die aus dem untersuchten TBSV Genombereich nach Umsetzung mit dem siRNA pool entstanden. Nach Korrelation mit den RNA seq. Daten wurde klar, dass tatsächlich eine hohe Akkumulation von siRNAs in AG02/RISC erfolgt, für die vermutet werden konnte, dass sie die Spaltung der TBSV RNA zu 200 nt langen Spaltprodukten verursachen. Diese siRNAs (207m, 209m 221m, 228m) wurden synthetisch hergestellt und im Slicer-Assay mit AG02/RISC und dem entsprechenden TBSV RNA Genombereich (markiert eingesetzt) getestet (Assay vergleichbar zu Abb. 7). Um nochmals die Effizienz dieser siRNAs zu überprüfen, wurde der Slicer-Assay zudem unter veränderten Bedingungen durchgeführt. Hierbei wurde die Quantität der getesteten siRNAs deutlich reduziert und zudem ein 10-facher molarer Überschuss einer unspezifischen Kontroll-siRNA zugegeben. Zusätzlich wurde ein Mix verschiedener siRNAs eingesetzt.

Es konnte gezeigt werden, dass die Korrelation der RNA seq. Analyse mit dem in Abb. 6 und 8 gezeigten Slicer-Assay mit dem siRNA pool, die direkte Identifizierung von eRNAs ermöglicht: Praktisch alle so identifizierten iRNAs zeigten eine extrem hohe slicing Effizienz; über den Kompetitionsansatz wurde siRNA 209m als effizienteste anti-TBSV siRNA identifiziert. In enger Übereinstimmung mit den Daten aus Slicer-Assay (1) wurde nochmals deutlich, dass die Höhe der mit den RNA seq. Analysen bestimmbaren Akkumulationsraten von siRNAs in AGO/RISC keine Rückschlüsse auf die letztendliche Effizienz der jeweiligen siRNAs zulässt. In der ausgeführten Kombination sind beide Verfahren jedoch optimal aussagekräftig. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von eRNAs beruht somit auf der Korrelation von Daten, die zum einen aus der RNA seq. Analyse von AGO-IPs und zum anderen aus Slicer-Assays mit den jeweiligen AGO Proteinen gewonnen werden. Als Ausgangsmaterial wird in beiden Fällen jeweils ein pool DCL-generierter siRNAs einer target RNA eingesetzt.

Die Aktivität von eR As beruht somit auf folgenden, wesentlichen Eigenschaften: Zum einen werden diese RNA-Moleküle mit hoher Wahrscheinlichkeit in AGO/RISC eingebaut; zum anderen ist die target RNA für die entsprechenden eRNA-haltigen AGO/RISC besonders gut zugänglich. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Identifizierung von eRNAs über ein kombiniertes Screening auf exakt diese Eigenschaften: Die Einbaurate in AGO/RISC wird über die AGO-IP

getestet; die Zugänglichkeit der target RNA für die entsprechenden AGO/RISC wird durch die Slicer-Assays getestet.

Anwendungsbeispiele für die Verwendung von cRNAs zur Generierung von Pflanzen, die gegen Infektionen durch das Tomato bushy stunt virus geschützt sind.

1) Generierung transgener gRNA-exprimierender Pflanzen, die gegen Infektionen durch das Tomato bushy stunt virus geschützt sind. Mit aktueller (state of the art) Technologie (Prado et al., 2014; Cillo and Palukaitis, 2014; siehe auch Anwendung (2)) wurden transgene Solanum lycopersicum (Sl) Tomatenpflanzen generiert, die in persistenter Form identifizierte anti-TBSV eRNAs (209m, 221m, 3243m und 3939m) exprimieren. In Kontrollexperimenten wurde die Expression der siRNAs sichergestellt. So hergestellte Sl Pflanzen wurden über verschiedene Verfahren, wie TB5\/-exprimierende Agrobakterien (siehe unten) oder rub-in inokuliertem TBSV belastet. Die Virusreplikation in den Pflanzen wurde durch RT-PCR Verfahren überprüft. Im Gegensatz zu Kontrollpflanzen, die nicht antiviral-wirkende siRNAs exprimierten, konnte bei den cRNA-behandelten Pflanzen eine vollständige und langfristig auch gegen mehrfach folgende Belastungen erhaltene Protektion gegen das Virus demonstriert werden. D.h. das Virus wurde 1-2 Wochen nach challenge aus den Pflanzen entfernt (Nachweis über RT-PCR nicht mehr möglich). Die Generierung transgener Pflanzen diente als Kontrolle (proof of concept), dass der hier erfindungsgemäß etablierte «RNA Ansatz funktionell ist.

2) Transienter Schutz von Pflanzen durch «RNAs gegen Infektionen durch das Tomato bushy stunt virus. Transiente Anwendungen erfolgten über verschiedene Verfahren.

(i) In Form von artificial microRNAs (amiR) Intermediaten.

Über Agrobakterien wurden eRNAs in Form von amiRs in Nicotiana benthamiana (Nb) Tabakpflanzen exprimiert. Dazu wurden die siRNA Sequenzen in die precursor-Struktur von At miR390a anstelle der miRNA-Sequenzen integriert (Vektor pMDC32B-AtMIR390a-B/c, Carboneil et al., 2014) (Abb. 9). Die Expression der siRNAs erfolgt durch den CaMV 2x 35S- Promotor und nos-Terminator. Die pMDC32B-asiRNA-Konstrukte sowie Kontroll-Konstrukte (enthielten unspezifische siRNAs) wurden jeweils in Agrobakterium tumefaciens (GV3101) transformiert. 4-6 Wochen alte Nb Pflanzen wurden mit den transformierten Agrobakterien infiltriert (je 2 Blätter pro Pflanze, ca. 1 ml Agrobakterien-Suspension). In

Kpntrollexperimenten (Northern blots) wurde die Expression der jeweiligen siRNAs in den betreffenden Pflanzen sichergestellt. Die Pflanzen wurden nach der Inokulation für ca. 48 h wachsen gelassen (14 h Licht bei 23°C, 10 h dunkel bei 21°C). Parallel dazu wurde ein Plasmid (pBGW-TBSV-Ribl: 35S-TBSV-cDNA-HDV-Ribozym), das das TBSV RNA Genom kodiert bzw. als Kontrolle ein mCherry (Reportergen)-kodierendes Plasmid (pBGW-mCherry) in Agrobakterien transformiert. Die TBSV-exprimierenden Agrobakterien wurden dann 1:1000 mit mCherry-exprimierenden Agrobakterien verdünnt und die Agrobakterien-Mischung in die vorbehandelten Blätter (mit amiRNA-Expression) inokuliert: 200 μΙ je Pflanze (4 Inokulationsstellen mit 50 μΙ, je 2 pro Blatt). Die Mb-Pflanzen wurden anschließend wieder unter gleichen Bedingungen wachsen gelassen (14 h Licht bei 23°C, 10 h dunkel bei 21°C) und bis zu 40 Tage nach der Inokulation auf Symptombildung hin untersucht (Abb. 10). In einer Reihe unabhängiger Infektionsexperimenten mit Mb-Pflanzen wurde eine hohe und statistisch hoch signifikante protektive Wirkung der zuvor über das erfinderische Verfahren identifizierten eRNAs gegen eine massive, nachfolgende TBSV Infektion festgestellt (Abb. 11-13). So konnte festgestellt werden, dass bereits durch die Behandlung mit einzelnen eRNAs wie 209m eine Protektion von bis zu 90% der Pflanzen erreicht wurde: Während 100% der Kontrollpflanzen aufgrund der Virusinfektion über die Versuchszeit von 35 Tagen abstarben oder eine schwere Nekrose zeigten, war dies bei 90% der mit eRNAs behandelten Pflanzen nicht der Fall. D.h. durch die entsprechende Behandlung mit der siRNA 209m wurde ein dauerhafter Schutz der Pflanzen (über die komplette Versuchszeit) gegen eine TBSV Infektion erzielt. 209m, wie auch andere eRNAs war dabei sowohl in AGOl-kompatibler-(mit 5'U), als auch in AG02-kompatibler Form (mit 5Ά) protektiv. Bei den übrigen, nicht protegierten Pflanzen war die Infektion deutlich verzögert, d.h. erste Symptome der Virusinfektion waren erst nach durchschnittlich ca. 20 Tagen zu beobachten, während dies bereits nach ca. 9 Tagen bei den Kontrollpflanzen der Fall war (Abb. 13). Durch Herstellung und Anwendung eines Mixes verschiedener eRNAs (bestehend aus siRNAs 179m, 186m, 207m, 209m, 221m, 228m und 238m) konnte die Protektion gegenüber einer einzelnen eRNA nicht erhöht werden - dies hing wahrscheinlich mit einer geringeren Verfügbarkeit der einzelnen eRNAs in dem verwendeten Mix zusammen - allerdings konnte die Protektion bei den am Ende nicht geschützten Pflanzen auf durchschnittlich ca. 25 Tage verlängert werden. Zudem ist bei Einsatz eines siRNA-Mixes die Wahrscheinlichkeit des Auftretens resistenter Virusvarianten deutlich vermindert. Als weitere wichtiges Ergebnis wurde gezeigt, dass die Protektivität einzelner eRNAs exakt mit deren Effizienz im in vitro Slicer-Assay korrelierte. So zeigten beispielsweise die beiden siRNAs 3701m und 3722m keine Slicer

Aktivität mit AG02 bzw. AGOl (Abb. 7), und sie hatten auch keine protektive Wirkung. Die siRNAs 179m, 3243m und 3939m zeigten dagegen eine Slicer Aktivität, die aber im Vergleich zu 209m schwächer war; entsprechend hatten diese fRNAs eine protektive Wirkung, die jedoch schlechter ausgeprägt war als jene von 209m (Abb. 13). Die Protektivität der jeweiligen cRNAs in planta korrelierte somit eng mit der Slicer Aktivität der jeweiligen AGO/RISC im in vitro Slicer-Assay.

(ii) In Form eRNA-kodierender ds RNAs.

Es wurden Plasmidkonstrukte hergestellt, die einen Promoter (z.B. den 17 Promoter) vor einer integrierten cRNA-kodierenden cDNA enthielten. Die cDNA bestand dabei aus zwei Sequenzabfolgen mehrerer «RNAs sowie einem spacer (z.B. dem DNA template des Introns der Pyruvat orthophosphatdikinase mRNA). Die cDNAs waren dabei so aufgebaut, dass die Sequenzabfolge mehrerer (i.d.R. >5) .RNAs unmittelbar nach dem T7 Promoter begann. Auf die Sequenz einer «RNA folgte unmittelbar die Sequenz der nächsten eRNA usw. Am Ende der zweiten Sequenzabfolge kodierte die cDNA für einen Transkriptionsterminator, z.B. den 17 Terminator. Die Transkription der cDNA, z.B. über die T7 RNA Polymerase, erzeugte dementsprechend eine ds hairpin RNA, die aus einem ds Bereich bestand, der ausschließlich die ausgewählten «RNAs kodierte. Der ds Bereich wurde unterbrochen durch einen weitgehend dsRNA-freien loop. Die «RNA- kodierenden Bereiche wurden dabei so organisiert, dass sie entweder für 21 nt siRNAs oder aber 22 nt siRNAs kodierten. Andere Plasmidvarianten enthielten «RNA kodierende Bereiche, die ausschließlich eRNAs mit einem 5'U oder 5Ά kodierten. Auf diese Weise wurden ds RNA hairpins erzeugt, die, nach Aufnahme durch die Pflanze, entweder vorwiegend von DCL4 (erzeugt 21 nt siRNAs) oder DCL2 (erzeugt 22 nt siRNAs) prozessiert werden. Alternativ wurden .RNA-kodierende ds RNAs generiert, in deren Fällen, nach Aufnahme durch die Pflanze und Prozessierung durch DCLs, die resultierenden siRNA guide Strands bevorzugt in AGOl/RISC bzw. AG02/RISC integriert wurden.

Die jeweiligen ds RNA hairpins wurden zunächst über in vitro Transkription hergestellt und die korrekte Prozessierung in die jeweiligen «RNAs bzw. deren Einbau in die jeweiligen AGO/RISC im BYL in vitro System (siehe oben) überprüft. Mit dsRNAs, die in der genannten Weise aus den siRNA-Sequenzen von 179m, 209m, 221m, 3243m und 3939m zusammengesetzt waren (eine Variante mit 5'U bei allen siRNAs, eine Variante mit 5Ά), konnte so gezeigt werden, dass das oben ausgeführte Konstruktionsschema der oben ausgeführten Transkriptionsplasmide für die jeweiligen dsRNA hairpins in der Tat zur G.enerierung der gewünschten eRNAs führte. Somit konnte auch generell demonstriert werden, dass es möglich ist eRNA-spezifische ds RNAs herzustellen. Die jeweiligen eRNA-kodierenden hairpin ds RNAs wurden anschließend in f. coli Stamm HT115 hergestellt. Dieser Stamm ist RNase lll-defizient und exprimiert die T7 RNA Polymerase. Die Expression der RNA konnte über Induktion durch IPTG (Isopropyl ß-D-l-thiogalactopyranoside) induziert und die RNA über lonenaustauschchromatographie aus den Bakterienzellen gereinigt werden (Nwokeoji et al., 2017). Mit der gereinigten RNA, die in entweder in Nanopartikel verpackt wurde, oder, alternativ, mit dem komplettem ds RNA-haltigen E. co//-Extrakt, wurden nach publizierten Protokollen (Tenllado et al, 2003; Mitter et al., 2017) die Blätter von Mb-Pflanzen behandelt und die Pflanzen entsprechend den oben beschriebenen Mustern anschließend mit TBSV belastet. Mit beiden Behandlungsmethoden, basierend auf eRNA-kodierenden hairpin ds RNAs wurde ein ähnlich effizienter Schutz der Pflanzen gegen TBSV erreicht, wie dies mit Agrobakterien-exprimierten eRNAs möglich war. Als außerordentlich effektiv erwies sich dabei

(a) die flexible Kombinierbarkeit mehrerer eRNAs,

b) die flexible Kombinierbarkeit von 21 und 22 nt eRNAs,

c) die flexible Kombinierbarkeit AGOl und AG02 inkorporierender eRNAs. Mit diesen Experimenten wurde der proof of concept erbracht, dass ein sehr kostengünstiger und nicht-transgener Einsatz von eRNAs möglich ist.

(iii) In Form a ufge rein igte r eRNAs.

Mit einem völlig neu entwickelten Verfahren konnten eRNAs in Hefe hergestellt und gereinigt werden. In Hefe des Typs Kluyveromyces lactis können Fremdproteine (Arnold et al., 2012) aber auch ds RNAs hergestellt werden. Letzteres ist möglich weil K. lactis RNAi defizient ist, d.h. weder DCLs, noch AGO oder RDR Proteine selbst exprimiert (Drinnenberg et al., 2009). Über ein zuvor entwickeltes Verfahren (Krijger et al., 2012) wurden K. lactis Stämme hergestellt, die entweder DCL4 (aus At) den DCL4 Ko-faktor DRB4 (aus At) oder, alternativ, DCL2 (aus At) exprimieren. Zusätzlich exprimierten diese Hefestämme die oben beschriebenen ds RNA hairpins. Die dabei verwendeten Plasmide ähnelten den oben beschriebenen T7-Transkriptionsplasmiden, außer dass der T7-Promoter durch den K. lactis PLAC4 Promoter und der Terminator durch den K. lactis TT Terminator ersetzt wurden. Der PLAC4 Promoter erlaubt eine induzierte Expression über die Zugabe von Lactose in das Hefe-Wachstumsmedium. Die Funktionsweise der generierten Stämme wurde durch Nachweis der Expression von DCL4, DRB4 bzw. DCL2 in der Hefe geführt, der Nachweis der korrekten

Prozessierung der eRNA-kodierender ds RNAs in die gewünschten siRNAs erfolgte wiederum mit den BYL. In der Hefe wurden die jeweiligen exprimierten cRNA-kodierenden ds RNAs durch die vorliegenden DCLs in die eRNAs prozessiert, und die eRNAs wurden aus den Hefezellen mit chromatographischen Verfahren gereinigt. In gereinigter Form eingesetzt oder wiederum verpackt mit Nanopartikeln wurden Protektionsexperimente mit Nb Pflanzen und TBSV Belastung durchgeführt, und es konnte wiederum ein nachhaltiger Schutz der Pflanzen gegen das Virus nachgewiesen werden. Mit diesen Experimenten konnte entsprechend der proof of concept erbracht werden, dass auch mit gereinigten eRNAs der wirksame Einsatz von RNAi in nicht-transgenen Anwendungen möglich ist.

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Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1 Antivirales RNA silencing

Doppelsträngige (ds) virale RNA wird im Zytoplasma der infizierten Zelle durch Dicer-like proteins (DCL) detektiert und zu small interfering RNAs (siRNAs) prozessiert. Diese siRNAs werden in RNA-induced silencing complexes (RISC) eingebaut. Dabei wird der siRNA-Duplex aufgewunden und ein Strang (guide Strand) vom Argonaut (AGO)-Protein, der Hauptkomponente des RISC, gebunden. Der andere Strang des Duplex (passenger Strand) wird entfernt und abgebaut. Virale RNAs, die komplementäre Sequenzen zur siRNA aufweisen, werden vom beladenen RISC erkannt und durch AGO-katalysierte endonukleolytische Spaltung zerstört. Von den 10 verschiedenen AGO-Proteinen, die in Arabidopsis thaliana identifiziert wurden, haben insbesondere AGOl und AG02 eine antiviralen Aktivität. Die antivirale Immunantwort kann durch pflanzliche RNA-abhängige RNA Polymerasen (RDR) deutlich verstärkt werden. Diese Enzyme können die Abbauprodukte der viralen RNA als Matrize nutzen, um neue ds RNAs herzustellen. Diese werden erneut durch DCLs detektiert und zu sekundären siRNAs prozessiert.

Abb. 2 Generierung von TBSV-siRNAs durch DCL-Aktivitäten in BYL

Genomische (+)TBSV-RNA oder (ds)TBSV-RNA wurde in BYL inkubiert und durch die BYL-eigenen DCLs zu siRNAs prozessiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels RNA-Seq-Analyse (lllumina) charakterisiert. Gezeigt ist hier die relative Häufigkeit sequenzierter 21 nt vsiRNA-Spezies, deren Sequenz entweder der (+)TBSV-RNA entsprach (grün), oder mit der (-)TBSV-RNA identisch war (rot). Die im Diagramm dargestellten Signale entsprechen der Position des 5'-Nukleotids einer siRNA auf dem (+)TBSV-Genom, besonders häufig auftretende siRNAs wurden nummeriert.

Abb. 3 Anreicherung AGO-assoziierter siRNAs

Genomische (+)TBSV-RNA in BYL zu siRNAs prozessiert. Im gleichen Ansatz wurde parallel dazu entweder AGOl- oder AG02-Protein mit N-terminalem FLAG-iog durch in v/fro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Anschließend wurden die mit TBSV-siRNAs beladenen AGO/RISC durch eine Immunopräzipitation mit Hilfe eines Anti-FLAG-Antikörpers isoliert. Die siRNAs wurden aus den Komplexen gereinigt und mittels RNA-Seq-Analyse (lllumina) charakterisiert. Dargestellt ist hier die relative Häufigkeit sequenzierter 21 nt vsiRNA-Spezies (siehe Abb. 2).

Abb. 4 Anreicherung AGO-assoziierter siRNAs

(ds)TBSV-RNA wurde in BYL zu siRNAs prozessiert. Im gleichen Ansatz wurde parallel dazu entweder AGOl- oder AG02-Protein mit N-terminalem FLAG-rap durch in v/rro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Anschließend wurden die mit TBSV-siRNAs beladenen AGO/RISC durch eine Immunopräzipitation mit Hilfe eines Anti-FLAG-Antikörpers isoliert. Die siRNAs wurden aus den Komplexen gereinigt und mittels RNA-Seq-Analyse (lllumina) charakterisiert. Dargestellt ist hier die relative Häufigkeit sequenzierter 21 nt vsiRNA-Spezies (siehe Abb. 2).

Abb. 5 Eigenschaften der durch BYL-DCLs generierten und AGO-assoziierten vsiRNAs

Dargestellt ist die relative Häufigkeit der vier Nukleotide A, C, G und U im TBSV-Genom sowie an der 5'-Position der siRNAs, die durch BYL-eigene DCLs generiert bzw. anschließend durch AGP-IP isoliert wurden. In den AGOl-IPs wurden siRNAs angereichert, die ein 5'-U aufweisen, in AG02-IPs dagegen siRNAs mit einem 5'-A.

Abb. 6 Slicer-Assay mit siRNA pool

Ein Bereich des (+)TBSV-Genoms (Fragment A) wurde zu BYL gegeben und durch die BYL-eigenen DCLs zu siRNAs prozessiert. Im gleichen Ansatz wurde parallel dazu durch in v/rro-Translation AG02-Protein generiert und mit den gebildeten TBSV-siRNAs beladen. Anschließend wurde das gleiche TBSV-Fragment, diesmal radioaktiv markiert, als Target für die so programmierten RISC zugegeben und inkubiert. Um die Spaltung der Target-RNA nachzuweisen, wurde Gesamt-RNA aus den Ansätzen isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie analysiert. Die Hauptspaltprodukte sind in der Abbildung mit einem Stern gekennzeichnet.

Abb. 7 Slicer-Assay mit ausgewählten TBSV-siRNAs (1)

Ausgewählte 21 nt siRNAs, deren guide Strands in AGO-IPs angereichert waren, wurden im Slicer-Assay mit genomischer (+)TBSV-RNA getestet. Dazu wurde AGOl-Protein in BYL mittels in vitro-Translation generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der zu testenden, synthetischen siRNA-Oligonukleotide durchgeführt, sodass es zum Einbau der gewünschten siRNAs in den AGO/RISC kam. Danach wurde radioaktiv markierte (+)TBSV-RNA als Target zugegeben und inkubiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Dabei erwiesen sich einige siRNAs als aktiv (z.B. siRNA179m, siRNA186m), in anderen Fällen (z.B. siRNA3722m, siRNA3722) konnten keine Spaltfragmente detektiert werden

Abb. 8 Slicer-Assay mit ausgewählten TBSV-siRNAs (2)

Durch Abgleich der Spaltprodukte aus dem Slicer-assay mit siRNA pool (Abb. 6) mit den RNA-Seq-Daten wurde die Anzahl der siRNA-Kandidaten, die für beobachteten Spaltfragmente verantwortlich sein könnten, deutlich eingeschränkt. Die oben dargestellte heat map zeigt die relative Häufigkeit von (-)vsiRNAs, die aus dem relavanten Bereich des TBSV-Genoms (einzel- oder doppelsträngig) generiert wurden und deren Anreicherung in der AGO-IP. Die Häufigkeit einer siRNA ist durch die farbige Darstellung der Position ihres 5'-Nukleotids von schwarz (keine siRNA bzw. geringe Anzahl) über grün (mittlere Anzahl) zu rot (hohe Anzahl) angegeben. Die siRNAs 207m, 209m, 221m und 228m wurden für weitere Analysen ausgewählt, da sie in der AG02-IP mit (+)TBSV-RNA und/oder (ds)TBSV-RNA detektiert wurden (grüne Pfeile unter der heat map) und ihre Position zur geschätzten Größe der Spaltfragmenten passt. Diese siRNAs wurden als synthetische Oligonukleotide in einen Slicer-Assay mit TBSV-Fragment A eingesetzt (s. Abb. 7), parallel dazu wurde der Slicer-Assay mit den aus (+)TBSV-Fragment A bzw. (ds)TBSV-Fragment A erzeugten siRNA pools durchgeführt (s. Abb. 6). Dabei zeigte sich, dass alle getesteten siRNAs aktiv waren und dass die durch siRNA209m und siRNA221m erzeugten Spaltfragmente jeweils einem durch den siRNA pool verursachten Spaltfragment entsprachen (linkes Gelbild). Um zu ermitteln, welche der bisher aus TBSV-Fragment A identifizierten siRNAs am effizientesten agiert, wurde der Slicer-Assay unter veränderten Bedingungen wiederholt. Die Menge an siRNA-Oligonukleotiden wurde auf 10% reduziert und 10-facher Überschuss unspezifische Kompetitor-siRNA zugegeben. Außerdem kam ein Mix der verschiedenen siRNAs zum Einsatz (rechtes Gelbild). Mit diesem Experiment konnte siRNA209m als effizienteste der getesteten siRNAs identifiziert werden.

Abb. 9 System zur Expression von siRNAs als artificial microRNAs

Die Expression von TBSV-siRNAs in Nicotiana benthamiana erfolgte in Form von artificial microRNAs (amiRNA) mit Hilfe eines von Carbonell et al. (2014) entwickelten Systems (Plasmid pMDC32B-AtMIR390a-B/c). Dabei werden die zu exprimierenden siRNA-Sequenzen so in die precursor-Struktur der Arabidopsis thaliana microRNA390a integriert, dass exakt die Sequenzen des miRNA guide Strands (blau hervorgehoben) und des passenger Strands (miRNA*, grün hervorgehoben) ersetzt werden. Die Expression erfolgt unter Kontrolle eines CaMV 2x35S-Promotors und eines nos-Terminators. Nach Transkription in der Pflanzenzelle wird die siRNA durch Dicer-like 1 (DCLl) aus dem primären Transkript ausgeschnitten und in AGO/RISC eingebaut.

Abb. 10 TBSV-Infektionsexperiment mit siRNA-exprimierenden N. benthamiana-Pf\amen

Je zwei Blätter von 4-6 Wochen alten N. benthamiana-Pfianzen wurden mit Agrobakterium rume/oc/ens-Kulturen infiltriert, welche siRNA-codierende Plasmide (s. Abb. 9) enthielten. In dem hier gezeigten Beispiel erhielten die Kontrollpflanzen einen Mix aus Agrobakterien, die zwei verschiedene Kontroll-siRNAs (nicht TBSV-spezifisch) exprimierten, während die Testpflanzen einen Mix aus Agrobakterien erhielten, welche die TBSV-siRNAs 179m, 186m, 207m, 209m, 221m, 228m und 238m exprimierten. Zwei Tage später wurden die gleichen Blätter mit Agrobakterien infiltriert, die die genomische TBSV-RNA unter Kontrolle eines 35S-Promotors exprimierten. Durch Fusion mit einer HDV-Ribozym-Sequenz (rib) wurde sichergestellt, dass nach Transkription eine infektiöse genomische TBSV-RNA mit korrektem 3'-Ende entsteht. Diese zweite Infiltration erfolgte innerhalb des Bereiches der ersten Infiltration. Anschließend wurden die Pflanzen mindestens 5 Wochen lang beobachtet um die Ausbildung der typischen Symptome einer TBSV-Infektion zu dokumentieren.

Abb. 11 Infektionsexperiment, Beispiel 1

6 Pflanzen, welche unspezifische Kontroll-siRNAs exprimierten, zeigten spätestens 15 Tage nach Infiltration mit TBSV-RNA-exprimierenden Agrobakterien (15 d.p.i.) deutliche Symptome einer viralen Infektion. Von den 6 Pflanzen, die einen Mix aus TBSV-siRNAs exprimierten, zeigte nur eine Symptome.

Abb. 12 Infektionsexperiment, Beispiel 2

16 Pflanzen, welche unspezifische Kontroll-siRNAs exprimierten, zeigten spätestens 13 Tage nach Infiltration mit TBSV-RNA-exprimierenden Agrobakterien (13 d.p.i.) deutliche Symptome einer viralen Infektion. Von den 16 Pflanzen, die einen Mix aus TBSV-siRNAs exprimierten, zeigten nur zwei Symptome, diese traten zudem deutlich später auf als bei den Kontrollpflanzen.

Abb. 13 Zusammenfassung der Ergebnisse mit N. benthamiana Pflanzen, die mit verschiedenen siRNAs behandelt und mit TBSV infiziert (belastet) wurden.

Angegeben sind die jeweiligen siRNAs, die über amiRNA und Agrobakterieninfektion exprimiert wurden; diese sind im Text beschrieben. Die siRNA gf698 ist gegen die mRNA des green fluorescent protein (GFP) gerichtet und wurde als Kontrolle eingesetzt. Die Art des 5'Nukleotids der jeweiligen siRNAs ist angegeben. Ebenso ist angegeben, wieviele der jeweils in den Experimenten eingesetzten Pflanzen nach Belastung mit TBSV (über TBSV-RNA-exprimierende Agrobakterien) Symptom-frei

blieben (auch in %) und wann die ersten Symptome bei den nicht geschützten Pflanzen zu beobachten waren.