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1. (WO2019001602) METHOD FOR THE TARGETED IDENTIFICATION OF HIGHLY-EFFICIENT "SMALL INTERFERING RNAS" "ERNAS" FOR USE IN PLANTS AND OTHER TARGET ORGANISMS
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Patentansprüche

1. * Methode zur gezielten Identifizierung hoch effizienter small interfering RNAs (eRNAs) unterschiedlicher Länge, gekennzeichnet dadurch, dass

a) eine RNA, die als target für RNA silencing (RNAi) ausgewählt wurde, durch in vitro Transkription hergestellt und in zytoplasmatischen Extrakten von Pflanzenzellen durch die endogenen Dicer-like proteins (DCL) zu small interfering RNAs (siRNAS) umgesetzt wird;

b) wobei aus der eingesetzten RNA ein DCL-generierter siRNA pool gebildet und die in diesem pool enthaltenen siRNAs durch RNA seq. Analyse ermittelt werden; c) dem zytoplasmatischen Pflanzenzellextrakt eine über in vitro Transkription synthetisierte messenger RNA (mRNA) eines Argonaute (AGO)-Proteins zugefügt wird, wobei die mRNA so aufgebaut ist, dass sie für das betreffende AGO-Protein mit einem tag kodiert;

d) über in vitro Translation AGO-Proteinmoleküle gebildet werden, welche RNA-induced silencing complexes (RISC) Komplexe mit den vorliegenden DCL-generierten siRNAs bilden;

e) über den tag siRNA-beladene AGO/RISC aus dem BYL immunopräzipitiert und die gebundenen siRNA guide-strands durch RNA seq-Analyse ermittelt;

f) über den Abgleich der RNA seq. Daten mit Spaltprodukten, die in einem Slicer-Assay mit dem siRNA pool aus der target RNA bevorzugt generiert werden, solche siRNAs ermittelt werden, die einerseits in AGO/RISC angereichert sind und andererseits effizient spalten ; g) anschließend synthetisch hergestellt und in einem weiteren Slicer-Assay mit markierter target RNA auf ihre Funktionalität getestet und

h) so ermittelte eRNAs transgen oder transient einzeln oder in Kombination angewendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Identifizierung von eRNAs kodierenden oder nicht kodierenden RNAs, gekennzeichnet dadurch, dass diese eRNAs, einzeln, oder in Kombination eingesetzt, im zellulären RNA Interferenz/silencing (RNAi)-Prozess hocheffizient ohne off-target Effekt target RNAs inaktivieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, dass ein zytoplasmatischer Extrakt aus Pflanzenzellen zur Durchführung von DCL-Assays, AGO-IPs, die RNA-Sequenzierung DCL-generierter und AGO-assoziierter siRNAs sowie zur Durchführung von Slicer-Assays eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, dass ein zytoplasmatischer Extrakt aus Nicotiana tabacum BY2-Zellen (BYL) zur Durchführung von DCL-Assays, AGO-IPs, die RNA-Sequenzierung DCL-generierter und AGO-assoziierter siRNAs sowie zur Durchführung von Slicer-Assays eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, dass Argonaute(AGO)-Proteine verschiedener Organismen und/oder verschiedene AGO-Proteine eines Organismus verwendet werden zwecks gezielter Spezifikation von eRNA Aktivitäten auf target RNAs im Zielorganismus.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass dieses für target RNAs aller Formen von Organismen einsetzbar ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass dieses für target RNAs aller Formen von Viroiden, Virusoiden, Viren, Prokaryonten und Eukaryonten einsetzbar ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass dieses für target RNAs aller Formen pflanzenpathogener Organismen einsetzbar ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass dieses für target RNAs aller Formen pflanzenpathogener Viroide, Virusoide, Viren, Bakterien, Oomyceten, Pilze, Nematoden, Insekten und parasitärer Pflanzen einsetzbar ist.

10. Hoch effiziente small interfering RNAs (eRNAs) nach Anspruch 1 zur transienten oder transgenen Anwendung in Zellen oder kompletten Organismen.

11. Transiente oder transgene Anwendung mehrerer eRNAs nach Anspruch 10 in Form von ds RNAs, die überwiegend aus eRNA-Sequenzen bestehen.

12. Transiente oder transgene Anwendung von eRNAs nach Ansprüchen 10 und 11 zum effizienten Gen-Knockdown, z.B. zur Untersuchung von Gen-Funktionen

13. Transiente oder transgene Anwendung von eRNAs nach Ansprüchen 10 und 11 zur Verbesserung von Stressresistenz, Wachstums- und/oder Verbrauchereigenschaften von Nutzorganismen.

14. Tcansiente oder transgene Anwendung von eRNAs nach Ansprüchen 10 und 11 zur Verbesserung von Stressresistenz, Wachstums- und/oder Verbrauchereigenschaften von Nutzpflanzen.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche, welches für eine temporäre oder lebenslange Protektion von Zielorganismen mit RNAi Immunsystem gegen Pathogene mit einem RNAi Immunsystem eingesetzt werden kann, wobei die Protektion durch host induced gene silencing (HIGS) erfolgen kann.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche, welches für eine temporäre oder lebenslange Protektion von Pflanzen gegen pathogene Viroide, Virusoide, Viren, Bakterien, Oomyceten, Pilze, Nematoden, Insekten und andere, parasitäre Pflanzen, eingesetzt werden kann, wobei die Protektion durch host induced gene silencing (HIGS) erfolgen kann.