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1. (WO2019000147) TUD RNA EFFECTIVELY INHIBITING EXPRESSION OF HUMAN MIR-148A, MIR-152 AND MIR-185 AND USE THEREOF
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说明书

发明名称:一种有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的

Tud RNA及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种 Tud

RNA, 特别涉及一种有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA 及其应用。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA,大小 一般在 22-25 nt之间, miRNA广泛分布于植物、动物和多细胞生物中,并且能发 挥重要的调节作用,而在人类 miRNA的研究中,发现 miRNA在正常组织和肿瘤 组织中的表达有着显著差异,有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达,有些则在 肿瘤组织中有高表达,这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。

[0003] miR- 148a是近几年研究得较多的一种 microRNA。据报道, miR-148a与外源性 物质代谢、细胞凋亡、多种癌症的发生、发展和表观遗传等都密切有关; miR-1 52是一种具有多功能的 miRNA, 研究发现 miR- 152与甲基化相关,如与甲基转移 酶 DNMT1含量和酶活性相关, miR-152可被子宫内膜癌 DNA甲基化变为沉默基 因,并且其与多种癌症的发生发展相关,它是一种肿瘤抑制 microRNA, 与子痫 前期、滋养细胞肿瘤、膀胱癌、胃肠癌、卵巢癌等诸多疾病相关; miR-185是一 个长度为 22nt的 miRNA, 定位于人染色体 22ql l.21,在结肠癌、胃癌、食管癌、 肺癌、肝癌等肿瘤的发生和侵袭等方面作为一个抑癌基因发挥重要作用,另外 它一种甲基化相关的抑瘤性 miRNA, 可通过直接靶向 DNMT1的表达而影响全基 因组的甲基化水平,进而调控某些基因的甲基化修饰状态,影响基因表达。通 过控制 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185的表达,同吋与其他药物协同作用,能为 治疗癌症提供新的表观遗传思路。

技术问题

[0004] MiRNA的功能研究主要通过 miRNA干扰和过表达技术完成。现有 miRNA干扰

技术中, anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术,其干扰效果不能稳定保持,而 m iRNA sponge效果远未达到最优,现有技术缺乏一种干扰效果好且能实现长期稳 定干扰的技术。

[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段,其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附,达到抑制 miRNA的目的。由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构,因此其够抵抗胞内核酸酶的降解,能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种有效抑制人 miR- 148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达 的 Tud RNA的应用。

[0008] 本发明的再一目的在于提供一种含有上述 Tud RNA的重组载体。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现:

[0010] 一种有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA,编码所述的抑 制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA的 DNA序列如下所示:

[0011] 5'- ggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacg tgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgta ctatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3'°

[0012] 所述的有效抑制人 miR- 148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA的应用,该应 用包括将所述的 Tud RNA构建于慢病毒载体上,得到含有所述 Tud RNA的重组载 体;将含有所述 Tud

RNA的重组载体作用于 16HBE细胞,达到抑制 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185表 达的目的;

[0013] 所述慢病毒载体为 pGLV3/Hl/GFP+Puro (pGLV3) 慢病毒穿梭载体;

[0014] 所述的含有所述 Tud RNA的重组载体的制备方法,包含以下步骤:

[0015] ( 1) 设计含有抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA的 DNA序 歹 |J,如下所示:

[0016] 5,- ggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacg tgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgta ctatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3';

[0017] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上,合成以下正义链(F) 及反义链(R ) DNA序歹 'J :

[0018] Tud-148a-152-185正义链:

[0019] 5'- GATCCggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaaccca aagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaa gtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccacctttttG -3,;

[0020] Tud-148a-152-185反义链:

[0021] 5'- AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgtgtttcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaagacagatagtacgt gactttgctggtctcctagatttcggtcggggagttgtattctgtgaccagaatacttgtgtttcaagaagatcatcacgtgacttt gggttcaagacagatagtacgtgactttgctggtctcctagatttcggtcggggagttgatgatcctagcgccG -3'°

[0022] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC , 与 BamHI酶切后形成的粘端互补;反义 链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补;

[0023] (2) 将等量的正义链和反义链 DNA混合,进行退火,以形成 DNA双链,得到 Tud RNA模板;

[0024] (3) 将 pGLV3载体用 BamHI和 EcoRI双酶切,得到线性化的 pGLV3载体;

[0025] (4) 将步骤 (2)中的 Tud RNA模版和步骤 (3)中线性化的 pGLV3载体进行连接, 得到重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-185 ;

[0026] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-185与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV- G共转染至 293T细胞,收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒,可用于 转染目的细胞。

发明的有益效果

有益效果

[0027] 本发明所述抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR- 185表达的 Tud RNA能有效抑制 人 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185的表达。将所述抑制人 miR-148a、 miR-152和 mi R-185表达的 Tud RNA构建于慢病毒载体上,不仅可有效作用于分裂及非分裂状 态的细胞,也适用于体内及体外研究。

对附图的简要说明

附图说明

[0028] 图 1为 pGLV3载体的结构图;图 2各组细胞的 miRNA表达水平,其中, a.

miR- 148a的表达情况, b. miR- 152的表达情况, c. miR- 185的表达情况。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0029] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不 限于此。

[0030] 实施例一有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA的设计与 合成

[0031] 根据 TuD RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185的序 列信息,设计出同吋针对 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185的 TuD RNA寡核苷酸序 歹 |J,其序列为 5' - ggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacg tgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgta ctatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3'° 委托上海 生工合成。

[0032] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上,设计以下正义链(F) 及反义链(R

) DNA序歹 'J :

[0033] Tud-148a-152-185正义链:

[0034] 5'-

GATCCggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaaccca aagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaa gtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccacctttttG -3,;

[0035] Tud-148a-152-185反义链:

[0036] 5'- AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgtgtttcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaagacagatagtacgt gactttgctggtctcctagatttcggtcggggagttgtattctgtgaccagaatacttgtgtttcaagaagatcatcacgtgacttt gggttcaagacagatagtacgtgactttgctggtctcctagatttcggtcggggagttgatgatcctagcgccG -3'°

[0037] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC , 与 BamHI酶切后形成的粘端互补;反义 链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补。

[0038] (2) 将等量的正义链(10 μΜ, 5 μΐ) 和反义链(10 μΜ, 5 μΐ) DNA混合,加 入 90 μ1 (1(1Η2Ο,在 PCR仪上按照如下程序进行退火处理: 95°C 5 min,然后以每 秒下降 O.rC的速率降至 25°C进行退火,最后 4°C保存备用。将退火后所得 Tud RNA模板溶液稀释 5倍,使其终浓度为 200 nM,用于连接反应。

[0039] (3) 将 pGLV3载体(吉玛基因股份有限公司)用 BamH I和 EcoR I双酶切,进 行载体的线性化处理,酶切条件如下所述:将 pGLV3载体(10μ 、 BamH I内 切酶(5 L, Fermentas)、 EcoR I内切酶(5 L, Fermentas)、 FastDigest buffer(8(VL , TOYOBO)混匀,置于 37°C反应 1小吋,用凝胶回试剂盒(Axygen)回收线性 载体片段,将其浓度稀释至 50ng^L。

[0040] (4) 将线性化的 pGLV3载体 1 μ1、经退火处理的 Tud RNA模版 1μ1、 Τ4 DNA 连接酶(NEB) 、 1μ1、 10xT4连接缓冲液(NEB) 2μ1、去离子水 15 μΓ混匀, 于 4°C连接过夜。取连接产物 5 μ1转化大肠杆菌 ToplO感受态细胞,在含有 10(Vg/ml氨苄青霉素的 LB平板上于 30°C培养过夜。挑选长出的单克隆在含有 100 μ§/ηι1氨苄青霉素的 LB液体培养基中于 30°C培养过夜,用质粒抽提试剂盒 (Omega

bio-tek) 纯化质粒,经测序验证后大量制备重组质粒 pGLV3-Tud-148a-152-185。

[0041] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-185与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV- G共转染至 293T细胞,收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒,可用于

转染目的细胞。

[0042] 实施例二慢病毒转导 16HBE细胞

[0043] 接种 16HBE细胞于 6孔板中,每孔 1000000个细胞, 12h后细胞密度约为 50% ,分别取病毒液,用 DMEM完全培养基 10倍稀释病毒,再加入聚凝胺

(polybrene)至终浓度为 8 g/mL。去除 6孔板中的培养基,加入含病毒的 DMEM 完全培养基(含 10%胎牛血清), 24h后弃去含病毒的 DMEM完全培养基,更换新 鲜的 DMEM完全培养基, 24h后用 0.5 g/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。筛选 10d, 每隔 3d更换培养基一次,并不断的增加嘌呤霉素的浓度至 1.0 g/ml。筛 选获得的细胞株命名为 TuD- 148a- 152- 185细胞株。

[0044] 实施例三荧光定量 PCR检测 miRNA的表达水平变化

[0045] 分别接种正常 16HBE细胞、 TuD-148a-152-185细胞至 6孔板(每孔约 300000个 ) ,培养细胞约 24 h后至融合度 80%。用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取这 些细胞的 miRNA,然后用 S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer

set、 S-Poly(T) hsa-miR-152 qPCR-assay primer set和 S-Poly(T) hsa-miR-185 qPCR-assay primer

set试剂盒对 miRNA进行逆转录和加尾,得到相应的 cDNA。取 2种细胞的 cDNA 各 2 μί为模板,荧光定量 PCR检测 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达水平的变化 ,实验重复 3次,每孔设置 3个平行样,以 snord 44作为内参。结果如图 2所示,可 以看到与 TuD- 148a- 152- 185细胞的 miR- 148a的表达水平比 16HBE细胞低 60%, mi R- 152的表达水平比 16HBE细胞低 62%, miR- 185的表达水平比 16HBE细胞低 59% 。差异有统计学意义(/?<0.01) ,说明 TuD-148a-152-185细胞株构建成功。

工业实用性

[0046] 本发明所述抑制人 miR-148a、 miR-152和miR-185表达的Tud RNA能有效抑制 人 miR-148a、 miR- 152和 miR- 185的表达。将所述抑制人 miR-148a、 miR-152和 mi R-185表达的 Tud RNA构建于慢病毒载体上,不仅可有效作用于分裂及非分裂状 态的细胞,也适用于体内及体外研究。