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1. (WO2019000147) TUD RNA EFFECTIVELY INHIBITING EXPRESSION OF HUMAN MIR-148A, MIR-152 AND MIR-185 AND USE THEREOF
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权利要求书

一种有效抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA,其特 征在于:编码所述 Tud RNA的 DNA序列如下所示:

5'-ggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaac ccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatct aggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaaga tgatcctagcgccaccttttt -3,。

权利要求 1所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185功能 研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185有关疾病的靶 向治疗药物中的应用。

根据权利要求 2所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185有关疾病 的靶向治疗药物中的应用,其特征在于该应用包括将权利要求 1中所 述的 DNA序列构建于慢病毒载体上,得到含有权利要求 1中所述 DNA 序列的重组载体。

根据权利要求 3所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185有关疾病 的靶向治疗药物中的应用,其特征在于:所述慢病毒载体为 PGLV3慢 病毒穿梭载体。

根据权利要求 4所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-185有关疾病 的靶向治疗药物中的应用,其特征在于:

所述的含有权利要求 1中所述 DNA序列的重组载体的制备方法,包含 以下步骤:

( 1) 设计含有抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-185表达的 Tud RNA 的 DNA序歹 ij,如下所示:

5,-

ggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaac ccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgaccgaaatct aggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaaga tgatcctagcgccaccttttt -3,;

为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上,合成以下正义链及反义链 D NA序列:

Tud-148a-152-185正义链:

5'- GATCCggcgctaggatcatcaactccccgaccgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatct gtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaactccccgac cgaaatctaggagaccagcaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaa acacaagatgatcctagcgccacctttttG -3';

Tud-148a-152-185反义链:

5'- AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgtgtttcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaaga cagatagtacgtgactttgctggtctcctagatttcggtcggggagttgtattctgtgaccagaatacttgtgtt tcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaagacagatagtacgtgactttgctggtctcctagatttcggtc ggggagttgatgatcctagcgccG -3,。

上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC, 与 BamHI酶切后形成的粘端 互补;反义链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端 互补;

(2) 将等量的正义链和反义链 DNA混合,进行退火,以形成 DNA双 链,得到 Tud RNA模板;

(3) 将 pGLV3载体用 BamHI和 EcoRI双酶切,得到线性化的 pGLV3 载体;

(4) 将步骤(2) 中的 Tud RNA模版和步骤 (3)中线性化的 pGLV3载 体进行连接,得到重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-185。