Some content of this application is unavailable at the moment.
If this situation persist, please contact us atFeedback&Contact
1. (WO2018205286) CONJUGATE AND BLOCK COPOLYMER CONTAINING FLUORESCENT CHROMOPHORE AND PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF
Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257   0258   0259   0260   0261   0262   0263   0264   0265   0266   0267   0268   0269   0270   0271   0272   0273   0274   0275   0276   0277   0278   0279   0280   0281   0282   0283   0284   0285   0286   0287   0288   0289   0290   0291   0292   0293   0294   0295   0296   0297   0298   0299   0300   0301   0302   0303   0304   0305   0306   0307   0308   0309   0310   0311   0312   0313   0314   0315   0316   0317   0318   0319   0320   0321   0322   0323  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29  

附图

0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026  

说明书

发明名称 : 含荧光发色团的缀合物、嵌段共聚物及其制备方法和应用

[0001]
本申请要求于2017年05月08日提交中国专利局、申请号为201710317704.5、发明名称为“含荧光发色团的缀合物、嵌段共聚物、靶向药物及其制备方法和应用”,和2017年05月08日提交中国专利局、申请号为201710316952.8、发明名称为“具有荧光发射性质的抗体-药物/探针缀合物及其制备方法和应用”,和2017年05月08日提交中国专利局、申请号为201710317186.7、发明名称为“具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

[0002]
本发明涉及有机桥接分子技术领域,尤其涉及一种含荧光发色团的缀合物、嵌段共聚物及其制备方法和应用。

背景技术

[0003]
多肽、蛋白质及抗体与合成聚合物、药物和成像探针的共价功能化形成了重要的可应用于临床治疗的生物偶联物,与蛋白质-聚合物偶联物,抗体-药物偶联物一起,成为典型的例子。蛋白质-聚合物偶联物可追溯到1970年,Davis,Abuchowski和合作者报道了聚乙二醇(PEG)与牛血清白蛋白的偶联。这项技术现在被称为PEGylation且延伸到了许多聚合物类型上,如,响应性聚合物和两性离子聚合物。合成的聚合物接到蛋白质上如PEGylation能带来许多优点,包括增强蛋白质的溶解性和稳定性,减少免疫原性,增加血液循环半衰期,目前至少PEGylated蛋白质已被美国食品与药物管理局(FDA)认证。另一方面,抗体药物偶联物(ADCs)与能特异性靶向病变部位的单克隆抗体的结合能杀死癌细胞。两种FDA认证的ADCs,brentuximabvedotin(商品名,Adcetris)和曲妥单抗(商品名,Kadcyla),是目前可商购的,目前临床上使用的ADCs约40种。
[0004]
蛋白质-聚合物偶联物通过长出支链(graftfrom)、嫁接支链(graft to)和大单体共聚接枝(graft through)的方法来制备。抗体-药物偶联物和蛋白质-聚合物的制备都依赖于选择合适的高效的偶联反应和连接基元。对于蛋白质/抗体偶联物来说,选择不影响蛋白质/药物活性和抗体功能是最好的。典型的, 可以通过蛋白质/抗体组织工程天然蛋白质特异性位点的改性(如,二硫键的还原,碳末端的改性,或多糖的氧化),和直接利用特定氨基酸的特异性反应来实现。合成的功能性聚合物/药物共价接到蛋白质/抗体上主要利用了正交的click反应,如Staudinger反应,铜催化的叠氮-炔环加成(CuAAC),张力促进的叠氮-环炔烃的环加成(SPAAC),D-A加成,迈克尔加成,和由醛和酮形成肟/腙。新的设计原则的引入,如,模块化设计,温和的合成方式,光学示踪和多功能集成的能力,进一步促进了该领域的发展。
[0005]
值得注意的是,即使是最优设计的蛋白质-聚合物偶联物,蛋白质功能和活性的明显减弱是不可避免的。一种解决方法是制备可断裂的生物偶联物,在体内随着时间的增加释放出天然的蛋白质。在细胞内化的过程中,ADCs应能有效释放出其活性的药物负载,以展现出细胞毒性。然而,监测发现蛋白质-聚合物偶联物和抗体-药物偶联物的偶联和随后释放蛋白质/药物的程度主要依赖于传统的非原位技术,如,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),质谱(MS),高效液相色谱(HPLC),和体积排除色谱(SEC)。这阻止了对聚合物/药物偶联物在体外和细胞水平上的释放过程的实时监测。
[0006]
另外,抗体定向的光学分子的成像在医学诊断和治疗响应评价中展现出巨大的潜力;也可直接与手术或内窥镜过程结合。用荧光探针标记的靶向抗体可以在体内实时高分辨成像,可用于初期的检测和手术中残留癌症组织的监测。然而,一直有荧光的探针也有本质的缺陷,如背景干扰和低的信噪比。
[0007]
抗体-药物缀合物能够降低体系毒性和增强偶联药物的治疗效率。在抗体-药物缀合物中连接键的设计至关重要,因为它不仅要求能够为遮蔽药物在体循环提供充足的稳定性,而且在肿瘤细胞内应能快速有效地释放药物。触发性可断裂连接键常被用来连接药物和抗体。然而,目前偶联效率和触发后释放程度的定量大多依赖于非原位技术,如高效液相色谱、凝胶电泳、体积排除色谱以及质谱。目前尚不能实现对抗体-药物缀合物在体外和细胞水平上的释放过程的实时监测。
[0008]
发明内容
[0009]
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种含荧光发色团的缀合 物、嵌段共聚物及其制备方法和应用,能够通过红外荧光发射强度原位监控缀合物的缀合效率,并应用于靶向介导的药物传输,或多肽与抗癌药物的传输。
[0010]
本发明提供了一种含荧光发色团的缀合物,具有以下任一结构:
[0011]
[0012]
其中,R 1和R 2为能够淬灭荧光发色团荧光并且能够进行“点击”反应的基团。
[0013]
优选的,
[0014]
R 1
[0015]
R 2
[0016]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的嵌段共聚物,其特征在于,具有式Ⅰ-1所示结构:
[0017]
[0018]
其中,
[0019]
x为
[0020]
m为23~445,n为10~150。
[0021]
本发明提供了上述具有荧光发射性质的嵌段共聚物的制备方法,包括以下步骤:
[0022]
含有巯基端基的聚合物B和含有叠氮基的聚合物C与化学缀合分子D进行Michael反应与点击反应,得到式Ⅰ-1所示嵌段共聚物;
[0023]
[0024]
其中,
[0025]
x为
[0026]
m为23~445,n为10~150。
[0027]
优选的,通过荧光发射强度原位监控嵌段共聚物的缀合效率。
[0028]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的靶向药物,具有式Ⅱ-1所示结构:
[0029]
[0030]
其中,
[0031]
Target为环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺;
[0032]
Drug为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[0033]
本发明提供了上述具有荧光发射性质的靶向药物的制备方法,包括以下步骤:
[0034]
靶向分子F、药物分子G和化学缀合分子H进行Michael反应和反向D-A加成反应,得到式Ⅱ-1所示靶向药物;
[0035]
[0036]
[0037]
其中,
[0038]
Target为环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺;
[0039]
Drug为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[0040]
优选的,通过红外荧光发射强度原位监控药物分子和靶向分子的缀合效率。
[0041]
本发明提供了上述靶向药物在靶向介导药物传输中的应用。
[0042]
本发明提供的上述含荧光发色团的缀合物,包含一个荧光发色团和通过共价键连接在荧光发色团上的两个高反应活性基团R 1与R 2,所述缀合物中的荧光发色团初始不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当两个高反应活性基团共同与相应分子反应后,荧光发色团才具有强的荧光发射,因此可以通过红外荧光发射强度原位监控药物分子与靶向分子缀合效率,并应用于靶向介导的药物传输,用于对聚合物/药物偶联物在体外和细胞水平上的释放过程的实时监测。
[0043]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-药物/探针缀合物,具有式Ⅰ-2所示结构:
[0044]
[0045]
其中,Ab为抗体,DP为荧光探针或药物分子。
[0046]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-探针缀合物,具有式Ⅱ-2所示结构:
[0047]
[0048]
其中,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0049]
本发明提供了上述抗体-探针缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0050]
单克隆抗体、含叠氮基元的荧光探针A与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅱ-2所示抗体-探针缀合物;
[0051]
[0052]
其中,所述单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0053]
优选的,通过荧光发射强度原位监控抗体-探针缀合物的缀合效率。
[0054]
本发明提供了上述抗体-探针缀合物或上述制备方法制备的抗体-探针缀合物作为抗原与醌氧化还原酶反应指示剂的应用。
[0055]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-药物缀合物,具有式Ⅲ所示结构:
[0056]
[0057]
其中,DOX为阿霉素,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0058]
本发明提供了上述抗体-药物缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0059]
单克隆抗体、含叠氮基元的前药分子E与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅲ所示抗体-药物缀合物;
[0060]
[0061]
其中,DOX为阿霉素,单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0062]
优选的,通过荧光发射强度原位监控抗体-药物缀合物的缀合效率。
[0063]
本发明提供了上述抗体-药物缀合物或上述制备方法制备的抗体-药物缀合物作为荧光指示剂实时监控药物释放的应用。
[0064]
本发明提供了上述抗体-药物缀合物或上述制备方法制备的抗体-药物缀合物作为靶向药物释放载体的应用。
[0065]
本发明提供的抗体-药物/探针缀合物具有自报告缀合效率特征,其由双官 能度荧光分子桥接抗体与探针/药物分子,所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当抗体-探针/药物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射,因此能够通过荧光监测的方法原位监控缀合过程,并应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。
[0066]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物,具有式Ⅰ-3所示结构:
[0067]
[0068]
其中,POI为蛋白质或多肽;Polymer为聚合物。
[0069]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质-聚合物缀合物,具有式Ⅰ-a所示结构:
[0070]
[0071]
其中,所述POI为牛血清蛋白或鲑鱼降钙素,所述Polymer为聚乙二醇。
[0072]
本发明提供了上述蛋白质-聚合物缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0073]
含巯基的牛血清蛋白、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物;
[0074]
[0075]
[0076]
其中,POI为牛血清蛋白,m为23~445;
[0077]
或者包括以下步骤:
[0078]
含巯基的鲑鱼降钙素、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物;
[0079]
其中,POI为鲑鱼降钙素;m为23~445。
[0080]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的多肽-聚合物缀合物,具有式Ⅰ-b所示结构:
[0081]
[0082]
其中,所述POI为基质金属蛋白酶可切断多肽,所述Polymer为聚三亚甲基碳酸酯。
[0083]
本发明提供了上述多肽-聚合物缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0084]
式J所示的基质金属蛋白酶可切断多肽、式K所示的叠氮端基的聚三亚甲基碳酸酯和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-b所示的多肽-聚合物缀合物;
[0085]
βAPVGLIGβAC-SH 式J;
[0086]
[0087]
其中,y为10~55。
[0088]
优选的,上述制备方法中,通过荧光发射强度原位监控缀合物的缀合效率。
[0089]
本发明提供了上述多肽-聚合物缀合物或上述制备方法制备的多肽-聚合物缀合物组成的聚合物囊泡。
[0090]
优选的,所述聚合物囊泡粒径为60~150nm。
[0091]
上述聚合物囊泡具有基质金属酶响应特性。
[0092]
本发明提供了上述聚合物囊泡作为药物载体的应用,或作为荧光指示剂实时监控药物释放的应用。
[0093]
本发明提供的蛋白质/多肽-聚合物缀合物由双官能度荧光分子桥接蛋白质/多肽与聚合物,所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当蛋白质/多肽-聚合物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射,因此所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物的缀合过程可以通过荧光变化原位监控,并且所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

附图说明

[0094]
图1为本发明制备的C1的核磁氢谱图;
[0095]
图2为本发明制备的C1的核磁碳谱图;
[0096]
图3为本发明制备的C1的电喷雾质谱图;
[0097]
图4为本发明制备C1过程中荧光变化与高效液相色谱曲线;
[0098]
图5为本发明制备C1过程中荧光变化与缀合效率的关系曲线;
[0099]
图6为本发明实施例5制备的嵌段聚合物的凝胶渗透色谱图;
[0100]
图7为本发明实施例5制备嵌段聚合物反应过程中的荧光变化;
[0101]
图8为本发明实施例5制备嵌段聚合物缀合过程中荧光变化与缀合效率的关系;
[0102]
图9为实施例6制备的前药分子的核磁共振氢谱图;
[0103]
图10为实施例6制备的前药分子的电喷雾质谱图;
[0104]
图11为实施例7制备的荧光探针A的核磁共振氢谱图;
[0105]
图12为实施例7制备的荧光探针A的电喷雾质谱图;
[0106]
图13为实施例8制备抗体-探针缀合物反应过程中的荧光变化过程曲线图;
[0107]
图14为实施例8制备抗体-药物缀合物反应过程中的荧光变化过程曲线图;
[0108]
图15为实施例8制备的抗体-探针缀合物的酶检测过程荧光变化过程;
[0109]
图16为实施例8制备的抗体-探针缀合物的细胞内癌胚抗原与醌氧化还原酶检测;
[0110]
图17为实施例8制备的抗体-药物缀合物的硝基还原酶触发药物释放过程荧光变化过程;
[0111]
图18为实施例9制备的抗体-药物缀合物的含癌胚抗原的细胞内硝基还原酶触发药物释放过程;
[0112]
图19为实施例10制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的缀合过程荧光变化过程曲线图;
[0113]
图20为实施例10制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的荧光变化与缀合效率之间关系图;
[0114]
图21为实施例10制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的十二磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
[0115]
图22为实施例11制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的缀合过程荧光变化过程曲线图;
[0116]
图23为实施例11制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的体积排除色谱图;
[0117]
图24为实施例11制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的十二磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
[0118]
图25为实施例14制备的囊泡在水中的透射电镜图;
[0119]
图26为实施例15的药物控释曲线图。

具体实施方式

[0120]
本发明提供了一种含荧光发色团的缀合物,具有以下任一结构:
[0121]
[0122]
其中,R 1和R 2为能够淬灭荧光发色团荧光并且能够进行“点击”反应的基团。
[0123]
本发明提供的上述含荧光发色团的缀合物,包含一个荧光发色团和通过共价键连接在荧光发色团上的两个高反应活性基团R 1与R 2,所述缀合物中的荧光发色团初始不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当两个高反应活性基团共同与相应分子反应后,荧光发色团才具有强的荧光发射,所述缀合物如上式C1~C3所示,其中,C1中的荧光发色团为香豆素基元,C2中的荧光发色团为萘二酰亚胺基元,C3中的荧光发色团为五甲川基元。
[0124]
优选的,
[0125]
R 1
[0126]
R 2
[0127]
本发明中,弯线表示连接键。
[0128]
本发明中,与上述缀合物反应的分子种类根据R 1和R 2的不同而有所区别, R1-1与R2-3对应于含有巯基的分子,R1-2对应于含反式环辛烯基的分子,R1-3对应于含炔基的分子,R1-4与R2-1、R2-2对应含叠氮基的分子,R2-4对应含丁二烯基的分子。
[0129]
本发明采用含有上述特定反应基团的聚合物、靶向分子或药物分子与上述缀合物进行反应,得到具有荧光发射性质的嵌段聚合物或靶向药物。
[0130]
具体的,本发明提供了一种具有荧光发射性质的嵌段共聚物,采用上述缀合物作为桥连分子制备而成,具有式Ⅰ-1所示结构:
[0131]
[0132]
其中,
[0133]
x为
[0134]
m优选为23~445,n优选为10~150。
[0135]
本发明还提供了上述具有荧光发射性质的嵌段共聚物的制备方法,包括以下步骤:
[0136]
含有巯基端基的聚合物B和含有叠氮基的聚合物C与化学缀合分子D进行Michael反应与点击反应,得到式Ⅰ-1所示嵌段共聚物;
[0137]
[0138]
[0139]
其中,
[0140]
x为
[0141]
m为23~445,n为10~150。
[0142]
本发明优选的,上述反应过程中,通过荧光发射强度原位监控嵌段共聚物的缀合效率。
[0143]
本发明还提供了一种具有荧光发射性质的靶向药物,采用上述缀合物作为桥连分子制备而成,具有式Ⅱ-1所示结构:
[0144]
[0145]
其中,
[0146]
Target为靶向基团,包括:环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺;
[0147]
Drug为药物基团,包括:阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[0148]
本发明还提供了上述具有荧光发射性质的靶向药物的制备方法,包括以下步骤:
[0149]
靶向分子F、药物分子G和化学缀合分子H进行Michael反应和反向D-A加成反应,得到式Ⅱ-1所示靶向药物;
[0150]
[0151]
[0152]
其中,
[0153]
Target为靶向基团,包括:环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺;
[0154]
Drug为药物基团,包括:阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[0155]
本发明优选的,上述反应过程中,通过红外荧光发射强度原位监控药物分子和靶向分子的缀合效率。
[0156]
本发明还提供了上述靶向药物在靶向介导药物传输中的应用。
[0157]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-药物/探针缀合物,具有式Ⅰ-2所示结构:
[0158]
[0159]
其中,Ab为抗体,DP为荧光探针或药物分子。
[0160]
本发明提供的抗体-药物/探针缀合物具有自报告缀合效率特征,其由双官能度荧光分子桥接抗体与探针/药物分子,所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当抗体-探针/药物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射,因此能够通过荧光监测的方法原位监控缀合过程,并应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。
[0161]
具体的,当DP为荧光探针时,本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-探针缀合物,具有式Ⅱ-2所示结构:
[0162]
[0163]
其中,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0164]
本发明还提供了上述抗体-探针缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0165]
单克隆抗体、含叠氮基元的荧光探针A与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅱ-2所示抗体-探针缀合物。
[0166]
所述单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0167]
所述含叠氮基元的荧光探针A如下式A所示:
[0168]
[0169]
所述双官能荧光分子D如下式D所示:
[0170]
[0171]
本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定,可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。
[0172]
本发明优选的,通过荧光发射强度原位监控抗体-探针缀合物的缀合效率。
[0173]
本发明提供的上述抗体-探针缀合物具有醌氧化还原酶作用下的荧光变化,因此可以作为抗原与醌氧化还原酶反应指示剂应用。
[0174]
当DP为药物分子时,本发明提供了一种具有荧光发射性质的抗体-药物缀合物,具有式Ⅲ所示结构:
[0175]
[0176]
其中,DOX为阿霉素,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0177]
本发明还提供了上述抗体-药物缀合物的制备方法,包括以下步骤:
[0178]
单克隆抗体、含叠氮基元的前药分子E与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅲ所示抗体-药物缀合物;
[0179]
所述单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[0180]
所述含叠氮基元的前药分子E如下式E所示:
[0181]
[0182]
式E中,DOX为阿霉素。
[0183]
式E中的氨基为阿霉素四氢吡喃环上的氨基。
[0184]
所述双官能荧光分子D如下式D所示:
[0185]
[0186]
本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定,可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。
[0187]
本发明优选的,通过荧光发射强度原位监控抗体-药物缀合物的缀合效率。
[0188]
本发明提供的上述抗体-药物缀合物具有硝基还原酶作用下的原药阿霉素释放,因此可以作为荧光指示剂实时监控药物释放,或者作为靶向药物释放载体。
[0189]
本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物,具有 式Ⅰ-3所示结构:
[0190]
[0191]
其中,POI为蛋白质或多肽;Polymer为聚合物。
[0192]
所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物由双官能度荧光分子桥接蛋白质/多肽与聚合物,所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力,仅当蛋白质/多肽-聚合物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射,因此所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物的缀合过程可以通过荧光变化原位监控,并且所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。
[0193]
在本发明的某些具体实施例中,所述POI为牛血清蛋白,所述Polymer为聚乙二醇,其结构如式Ⅰ-a所示:
[0194]
[0195]
其中,m为23~445。
[0196]
上述蛋白质-聚合物缀合物优选按照以下方法制备:
[0197]
含巯基的牛血清蛋白、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物;
[0198]
[0199]
所述叠氮端基的聚乙二醇结构如下:
[0200]
[0201]
本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定,可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。
[0202]
本发明优选的,通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。
[0203]
在本发明的另外一些具体实施例中,所述POI为鲑鱼降钙素,所述Polymer为聚乙二醇,其结构如式Ⅰ-a所示:
[0204]
[0205]
其中,m为23~445。
[0206]
上述蛋白质-聚合物缀合物优选按照以下方法制备:
[0207]
含巯基的鲑鱼降钙素、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物。
[0208]
所述叠氮端基的聚乙二醇和化合物D同上,在此不再赘述。
[0209]
本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定,可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。
[0210]
本发明优选的,通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。
[0211]
在本发明的另外一些具体实施例中,所述POI为基质金属蛋白酶可切断多肽,其序列为βAPVGLIGβAC-SH,其中,SH为巯基(巯基位于碳端半胱氨酸残基),上述多肽购自上海强耀生物科技公司,所述Polymer为聚三亚甲基碳酸酯。其结构如式Ⅰ-b所示:
[0212]
[0213]
其中,y为10~55。
[0214]
其制备方法优选为:
[0215]
式J所示的基质金属蛋白酶可切断多肽、式K所示的叠氮端基的聚三亚甲基碳酸酯和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-b所示的多肽-聚合物缀合物;
[0216]
βAPVGLIGβAC-SH 式J;
[0217]
[0218]
本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定,可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。
[0219]
本发明优选的,通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。
[0220]
本发明还公开了一种囊泡,由上述多肽-聚合物缀合物或上述制备方法制备的多肽-聚合物缀合物组成。
[0221]
本发明对所述囊泡的制备方法并无特殊限定,可以为本领域技术人员熟知的制备方法。本发明优选的,将上述多肽-聚合物缀合物溶解于DMSO中,加去离子水,然后用去离子水透析即可。
[0222]
本发明提供的上述聚合物囊泡分散均匀,且粒径分布均匀,其粒径分布为60~150nm。
[0223]
上述聚合物囊泡具有基质金属酶响应特性,因此可以作为药物载体应用,或作为荧光指示剂实时监控药物释放。
[0224]
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的用作布鲁顿酪氨
[0225]
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的含荧光发色团的缀合物、嵌段共聚物、抗体-药物/探针缀合物,蛋白质/多肽-聚合物缀合物,靶向药物及其制备方法和应用进行详细描述。
[0226]
双封的香豆素(C1-C3)的制备
[0227]
合成路线如下:
[0228]
[0229]
实施例1 C1的合成
[0230]
4-溴水杨醛(1;3.11g,15.4mmol),Pd(PPh 3) 2Cl 2(0.22g,0.31mmol),PPh 3(0.061g,0.23mmol),无水四氢呋喃(50mL)加入到含有磁力搅拌子的反应烧瓶中,用干燥的氮气鼓起泡对反应体系脱气30min,然后新蒸的干燥Et 3N(3.05g,30.0mmol)和三甲基乙炔基硅(1.67g,17.0mmol)在氮气氛围下加入,溶液变成橙色。搅拌20min后将助催化剂CuI(0.088g,0.46mmol)在氮气氛围下加入到反应体系,溶液变成暗棕色。室温下搅拌过夜,然后移除溶剂得到暗棕色固体,将其溶解到正戊烷中过滤得到黄色溶液。旋除所有溶剂,最后,正己烷中两次重结晶得到黄色晶体2(2.96g,收率:88.2%,>95%HPLC纯度)。
[0231]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):11.0(s,1H,苯-O H),9.87(s,1H,-C HO),7.48(d,J=8.4Hz,1H,芳香氢),7.07(m,2H,芳香氢),0.26(s,9H,-Si(C H 3) 3)。
[0232]
将2(2.85g,13.1mmol)溶于干燥的THF(40mL)中,然后加入20mL含有KOH(0.74g,13.2mmol)的MeOH溶液,反应体系在室温下搅拌过夜,然后旋发移除所有溶剂,残存物重新分散在水中,加入1.0mL乙酸并用3x 200mL氯仿萃取。合并有机相并用无水硫酸镁干燥,过滤后移除所有溶剂得到棕色固体,正己烷中重结晶两次得到黄色固体3(1.02g,收率:53.2%,>95%HPLC纯度)。
[0233]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):11.0(s,1H,苯-O H),9.89(s,1H,-C HO),7.52(d,J=8.4Hz,1H,芳香氢),7.12(m,2H,芳香氢),3.29(s,1H,-C≡C H)。
[0234]
将苯磺酰氯(2.51g,14.3mmol),Et 3N(2.15g,21.3mmol)和N-乙酰甘氨酸(0.88g,7.5mmol)溶于THF并在室温下搅拌过夜。移除不溶性盐后,化合物3(1.02g,7.0mmol)添加到反应体系中并在80℃搅拌10h,然后冷却到0℃,得到沉淀4(1.09g,收率:68.5%,>95%纯度)。
[0235]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):9.80(s,1H,-CO-N H-),8.57(s,1H,芳香氢),7.67(d,J=8.4Hz,1H,芳香氢),7.35(m,2H,芳香氢),4.40(s,1H,-C≡C H),2.14(s,3H,-COC H 3)。
[0236]
化合物4(1.09g,4.8mmol),DMAP(0.11g,0.96mmol),(Boc) 2O(2.11g,9.8mmol)溶解在40mL THF中,反应体系在70℃搅拌4h,然后冷却至室温,添加MeOH(10mL)和NH 2NH 2·H 2O(0.96g,19.2mmol),反应体系再搅拌4h。加入CH 2Cl 2,然后反应混合物用1M HCl溶液水洗,收集有机相并用无水MgSO 4干燥。过滤除掉不溶性的MgSO 4,所有溶剂都用旋转蒸发移除,残存物溶解到CH 2Cl 2(40mL)和TFA(10mL)的混合溶剂中,搅拌2h后用NaHCO 3溶液水洗,有机相用MgSO 4干燥,滤除MgSO 4后,旋转蒸发除掉溶剂得到目标产物5(0.76g),立刻用于合成C1,具体如下:
[0237]
化合物5(0.76g,4.1mmol)和马来酸酐(2.01g,20.5mmol)溶解在100mL丙酮中,回流过夜,冷却到0℃得到黄色固体沉淀。上述黄色固体沉淀(1.03g)和一水合对甲苯磺酸(154mg)溶解在30mL甲醇中回流过夜,冷却到0℃得到粗产物黄色沉淀,用EtOAc/DCM(v/v=1/2)作为洗脱剂通过柱层析进一步 纯化,得到黄色固体C1(480mg,收率:39.4%,>95%HPLC纯度)。
[0238]
1H NMR(d 6-DMSO,δ,ppm,TMS):10.28(s,1H,-CON H-),8.65(s,1H,芳香氢),7.73(d,J=8.1Hz,1H,芳香氢),7.49(s,1H,芳香氢),7.38(s,1H,芳香氢),6.74(d,J=9.3Hz,1H,-NHCOC H=CH-),6.51(d,J=8.7Hz,1H,-CH=C H-COO-),4.43(s,1H,-C≡C H),3.66(s,3H,-COO-C H 3),其核磁氢图谱见图1。
[0239]
13C NMR(CDCl 3,δ,ppm TMS):167.5,164.2,157.6,149.9,131.9,129.7,128.8,128.6,125.3,124.0,123.1,120.7,119.2,83.8,83.0,52.1,其核磁碳谱图见图2。
[0240]
RP-HPLC分析:4.4min(流动相:MeOH/H 2O v/v 4/1)。
[0241]
ESI-MS:m/z calc.for C 16H 12NO 5:298.06[M+H] +;found:298.0705,其电喷雾质谱图见图3。
[0242]
在反应过程中,通过荧光发射强度监控嵌段共聚物的缀合效率,结果见图4和图5,其中,图4为上述反应过程中,荧光变化与高效液相色谱曲线;图5为荧光变化与缀合效率的关系曲线。
[0243]
实施例2 C2的合成
[0244]
2,4-二羟基苯甲醛(6,10.0g,72.4mmol),溴丙炔(8.33g,70.0mmol),K 2CO 3(19.35g,140.0mmol)加入到100mL丙酮中,回流过夜后恢复至室温,过滤并移除所有溶剂,残余物溶于CH 2Cl 2并用水洗,收集有机相并用无水MgSO 4干燥,然后过滤旋发,粗产物利用EtOAc/PE(v/v=1:2)作为洗脱剂通过柱层析进一步纯化,得到白色粉末7(3.2g,收率:25.9%,>95%HPLC纯度)。
[0245]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):11.45(s,1H,苯-O H),9.75(s,1H,-C HO),7.46(d,J=8.1Hz,1H,芳香氢),6.61(d,J=8.1Hz,1H,芳香氢),6.53(s,1H,芳香氢),4.75(s,2H,-OC H 2C≡CH),2.58(s,1H,-OCH 2C≡C H)。
[0246]
N-乙酰甘氨酸(2.23g,19.1mmol),无水乙酸钠(4.48g,54.6mmol),化合物7(3.21g,18.2mmol)加入到100mL干的乙酸酐中,反应体系在150℃搅拌12h,冷却到室温后将反应混合物倒入到冰水里面(300mL),得到黄色沉淀,过滤出黄色固体,在浓盐酸和乙醇的混合溶液中(v:v=2:1)回流两个小时,反应体系然后倒入到冰水里面(100mL),将pH值用NaOH溶液调到5~6,体系 浓缩到约30mL,得到粗产物沉淀。最后,从乙醇中两次重结晶得到产物8(3.49g,纯度:89.2%,>95%HPLC纯度)。
[0247]
1H NMR(d 6-DMSO,δ,ppm,TMS):10.22(s,1H,-CON H-),8.67(s,1H,芳香氢),7.69(d,J=8.4Hz,1H,芳香氢),7.03(m,2H,芳香氢),6.63(d,J=9.3Hz,1H,-COC H=CH-),6.42(d,J=9.0Hz,1H,-CH=C HCOOH),4.92(s,1H,-OC H 2C≡CH),2.50(m,1H,-OCH 2C≡C H)。
[0248]
化合物8(2.15g,10.0mmol)和马来酸酐(2.01g,20.5mmol)溶解在CHCl 3(50mL)中,反应回流6h后冷却至0℃,得到黄色固体(2.76g),与一水合对甲苯磺酸(190mg)溶解在200mL甲醇中回流过夜,冷却至0℃得到粗产物沉淀,利用EtOAc/DCM(v/v=1/3)作为洗脱剂通过柱层析进一步纯化,得到黄色固体C2(1.81g,纯度:55.4%,>95%HPLC纯度)。
[0249]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):9.98(s,1H,-CON H-),8.75(s,1H,芳香氢),7.41(d,J=8.4Hz,1H,芳香氢),6.93(m,2H,芳香氢),6.41(d,J=9.3Hz,1H,-COC H=CH-),6.25(d,J=9.0Hz,1H,-CH=C HCO-),4.74(d,2H,-OC H 2C≡CH),3.85(s,3H,-COOC H 3),2.55(m,1H,-OCH 2C≡C H)。
[0250]
13C NMR(d 6-DMSO,δ,ppm TMS):167.7,163.8,159.3,157.9,151.8,131.7,129.8,129.6,126.0,122.2,113.8,113.6,102.1,79.4,79.0,56.5,52.2。
[0251]
ESI-MS:m/z calc.for C 17H 14NO 6:328.07[M+H] +,C 17H 13NO 6Na:350.08[M+Na] +;理论值分别为:328.081,350.0916。
[0252]
实施例3 C3的合成
[0253]
乙酰乙酸乙酯(3.19g,24.5mmol),化合物7(3.52g,20.0mmol),哌啶催化剂(0.1g)和乙酸(0.1mL)添加到15mL无水乙醇中,反应混合物回流12h,冷却至室温得到亮黄色沉淀为粗产物,通过在无水乙醇中重结晶得到亮黄色晶体9(3.12g,收率:64.5%,>95%HPLC纯度)。
[0254]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):8.49(s,1H,芳香氢),7.57(d,J=8.1Hz,1H,芳香氢),6.97(m,2H,芳香氢),4.80(s,2H,-OC H 2C≡CH),2.71(s,3H,-COC H 3),2.61(t,1H,-OCH 2C≡C H)。
[0255]
化合物9(2.25g,9.3mmol)和2-吡啶甲醛(2.21g,20.6mmol)溶解在EtOH/CH 3CN(80mL,1:1v/v)中,0.4g哌啶作为催化剂加入,在氮气氛围下 回流24后,旋发除掉溶剂,粗产物在无水乙醇中多次重结晶得到黄色固体C3(1.25g,收率:40.6%,>95%HPLC纯度)。
[0256]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):8.68(d,J=7.8Hz,1H,芳香氢),8.56(s,1H,芳香氢),8.30(d,J=9.0Hz,1H,-COCH=C H-),7.80(d,J=9.3Hz,1H,-COC H=CH-),7.70(m,1H,芳香氢),7.59(m,2H,芳香氢),7.28(m,1H,芳香氢),6.97(m,2H,芳香氢),4.80(s,2H,-OC H 2C≡CH),2.61(t,1H,-OCH 2C≡C H)。
[0257]
13C NMR(CDCl 3,δ,ppm TMS):186.8,162.9,159.3,157.5,153.5,150.3,148.3,143.1,136.7,131.4,127.8,124.6,124.3,121.9,114.3,112.8,101.7,56.4。
[0258]
ESI-MS:m/z calc.for C 20H 14NO 4:332.09[M+H] +;found:332.0911。
[0259]
实施例4 HS-PDMA 38的合成
[0260]
[0261]
在一个带有搅拌子的封管中加入带电荷的二甲基丙烯酰胺(DMA)(2.0g,20.2mmol),4-氰基-4-(丙硫基硫代甲酰硫基)戊酸(223mg,0.8mmol),2,2'-二偶氮异丁腈(AIBN)(16mg,0.98mmol)和二氧六环(4mL)。封管通过冻结-泵抽-解冻操作三次进行脱气,然后在处于真空下密封,在恒温油浴锅中70℃反应6h后,反应用液氮立即淬灭,解封,用THF稀释后在过量的乙醚中沉淀重复三次,将产物放到真空干燥箱中干燥得到黄色粉末PDMA(1.63g,86%收率)。
[0262]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS:2.8~3.2(N(C H 3) 2),1.1~2.8(主链),1.0(-S-C H 2-)。
[0263]
PDMA嵌段的实际聚合度通过 1HNMR计算是38,因此将产物缩写为PDMA 38
[0264]
PDMA 38(500mg,0.22mmol)溶解在干的CH 2Cl 2中,将NH 2NH 2·H 2O(55mg,1.1mmol)逐滴加入到反应管中2h后,浓缩溶液并用过量的乙醚沉淀三次,真空干燥箱干燥得到白色粉末HS-PDMA 38(420mg,收率93.8%)。
[0265]
实施例5通过C1介导的HS-PDMA 38和PEG 45-N 3的荧光共轭物
[0266]
HS-PDMA 38(35mg,17.5μmol),PEG 45-N 3(350mg,175μmol), PEG 227(external standard,300mg)溶解在去离子水中(45mL,pH 7.0),然后加入C1(5.2mg,17.5μmol,溶解于5mL DMSO)和CuSO 4/维生素C(1/5摩尔比)。反应体系在25℃搅拌不同的时间,达到既定时间后约1.0mL反应溶液被抽样取出,稀释到9.0mL THF中。快速加入铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,200mg)移除铜离子,然后震荡5min,在进一步荧光和GPC测试之前,上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出。
[0267]
通过荧光发射强度监控嵌段共聚物缀合效率,结果见图6~图8,其中,图6为凝胶渗透色谱图,图7为反应过程中的荧光变化曲线,图8为反应过程中荧光变化与缀合效率的关系曲线。
[0268]
由图6~图8可知荧光发色团荧光的增强与嵌段共聚物的缀合效率线性相关,因此,通过原位实时监控荧光的变化测定嵌段聚合物的缀合效率。
[0269]
由上述实施例可知,本发明能够通过红外荧光发射强度原位监控上述聚合物的缀合效率。
[0270]
实施例6 C1介导靶向药物的合成
[0271]
合成路线如下:
[0272]
[0273]
化合物10(4.16g,20.0mmol)和NEt 3(3.22g,31.9mmol)加入到100mL干的DCM中,冷却至0℃,4-硝基氯甲酸苯酚酯(6.12g,30.4mmol,20mL DCM溶液)逐滴加入,在0℃反应12h。过滤后溶液用水洗,有机相用无水MgSO 4干燥,滤除MgSO 4后旋发得到粗产物,利用EtOAc/PE(v/v=1:8)作为洗脱剂通过柱层析进一步纯化,得到白色粉末11(3.82g,收率:51.2%,纯度>95%,HPLC纯度)。
[0274]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm,TMS):8.29(t,4H,芳香氢),7.64(d,2H,芳香氢),7.38(d,2H,芳香氢),5.74(m,1H,>C H-CH 2N 3),3.5~3.8(m,2H,>CH-C H 2N 3)。
[0275]
化合物11(186mg,0.5mmol),DOX-HCl(58mg,0.1mmol)和NEt 3(120mg,1.18mmol)溶解在干的DMF(10mL)中,室温下搅拌24h,抽滤除去盐后,旋发掉溶剂得到粗产物,利用CHCl 3/MeOH(v/v=100:0到90:10)作为洗脱剂通过柱层析进一步纯化,得到红色粉末DOX-pNB-N 3(43mg,收率:55.3%,纯度>95%)。
[0276]
1H NMR(DMSO-d 6,δ,ppm):7.6~8.2(broad,5H,芳烃氢),7.42(d,2H,芳烃氢),5.95(m,1H,>C H-CH 2N 3),5.49(d,2H,>CH-O H&C-O H),5.31(s,1H,-CH 2O H),4.92(m,2H,>C H-O-C H<),4.62(d,2H,-C H 2OH),4.15(m,1H,>C H-OH),3.95(s,3H,-OC H 3),3.5~3.9(m,3H,>C H-CH 2N 3&>C H-NHCO-),2.8~3.1(m,1H,>C HCH 3),1.6~2.2(m,4H,-C H 2-),1.12(d,3H,>CHC H 3)。其核磁共振氢谱图如图9所示。
[0277]
RP-HPLC分析:3.7min(淋洗液:MeOH/H 2O v/v 1/3)。
[0278]
ESI-MS:m/z calc.for C 36H 36N 5O 15:778.21[M+H] +;found:778.2109。其电喷雾质谱图如图10所示。
[0279]
200μLC1的DMSO溶液(含0.2μmolC1),DOX-pNB-N 3(10.0mg,1.0μmol)和CuSO 4/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)添加HS-cRGD(0.1μmol,溶解于1.8mL PBS缓冲溶液)中,在25℃搅拌不同的时间,通过原位观测在~420nm处荧光发射强度的改变检测轭合进程,4h后,快速添加铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,100mg)移除铜离子,震荡5min后,上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出。
[0280]
实验结果表明,荧光发色团荧光的增强与靶向药物的缀合效率线性相关,因此,可以通过原位实时监控荧光的变化测定靶向药物的缀合效率。
[0281]
实施例7 荧光探针A(QNAM-N 3)的合成
[0282]
合成路线如下:
[0283]
[0284]
Q 3PA(0.51g,2.0mmol)和三乙胺(0.61g,6.0mmol)溶解在60mL的二氯甲烷中,将混合物降温到0℃,然后缓慢滴加氯甲酸异丁酯(0.31g,2.2mmol),反应1小时后,加入NAM-N 3(0.49g,1.75mmol)。反应体系在0℃下继续反应5小时。反应结束后,通过抽滤除去所有的无机盐,旋蒸除去所有的溶剂后得到粗产物。纯产物通过柱色谱分离(使用乙酸乙酯/正己烷(v/v=1/5)为流动相)得到。
[0285]
1H NMR(CDCl 3,δ,ppm):8.37(d,1H,芳烃氢),8.22(d,1H,芳烃氢),7.92(d,1H,芳烃氢),7.24(t,1H,芳烃氢),7.04(broad,1H,-CON H-),6.29(d,1H,芳烃氢),3.81(t,2H,-C H 2-CH 2N 3),3.47(t,2H,-C H 2N 3),2.82(m,9H,醌-(C H 3) 3),1.95(s,2H,-C H 2-CONH-),1.38(s,6H,>C(C H 3) 2),其核磁共振氢谱图见图11。
[0286]
RP-HPLC分析:10.7min(流动相:MeOH/H 2O v/v 7/3)。
[0287]
ESI-MS:m/z calc.for C 28H 28N 5O 5:514.20[M+H] +;found:514.22,其电喷雾质谱图见图12。
[0288]
实施例8 通过双官能荧光分子C1介导的Anti-CEA抗体和DOX-pNB-N 3或QNAM-N 3的荧光缀合物
[0289]
二硫苏糖醇(DTT,154mg,100μmol)溶解在磷酸缓冲液(PBS)中(10mL,pH 8.0,50mM),然后取10μL上述溶液(含0.1μmol DTT)添加到含有anti-CEA抗体的(ACEA,1mg)PBS(1mL,pH 8.0,50mM)溶液中,在37℃搅拌30min,产物通过超滤纯化(离心-0.5,微孔,截留分子量10kDa),使用之前要将其重新溶解到PBS中(2.0mg/mL,pH 7.0,50mM),利用5,5’-二巯基(2-硝基苯甲酸)(DNTB)作为探针确定巯基含量,每个抗体分子中巯基数约为4。
[0290]
10μL双官能荧光分子C1的DMSO溶液(0.5μmolC1),10μL DOX-pNB-N 3(0.5μmol)或QNAM-N 3溶液(0.5μmol)和CuSO 4/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)添加到ACEA溶液中(0.2mg,in 180μL PBS,pH 7.0),温度保持在25℃,共轭合过程利用荧光原位监测,共培养6h后,共轭物利用超滤进一步纯化(Amicon Ultra-0.5,Millipore,截留分子量10kDa),得到抗体-探针缀合物或抗体-药物缀合物。
[0291]
在反应过程中,通过荧光发射强度监控嵌段共聚物的缀合效率,结果见图13和图14,其中,图13为制备抗体-探针缀合物反应过程中的荧光变化过程 曲线图,图14为制备抗体-药物缀合物反应过程中的荧光变化过程曲线图。
[0292]
图15为实施例8制备的抗体-探针缀合物的酶检测过程荧光变化过程;QNAM-C1-ACEA抗体-探针缀合物用NADPH/NQO1在水体系中培养,观察到NAM发射强度(~530nm)显著的增加,并伴随着C1在~435nm发射强度的大幅下降。在约1小时的培养时间内,观察到约20倍FRET比率(两发射峰强度比值)的变化(见插图)。上述结果表明,C1香豆素连接键和酶促产生的NAM残基之间的有效的FRET过程的发生。在QNAM-C1-ACEA偶联体与NQO1作用后FRET比率的突变(~20倍),表明抗体-探针缀合物可用于检测NQO1酶浓度。
[0293]
图16为实施例8制备的抗体-探针缀合物的细胞内癌胚抗原与醌氧化还原酶检测。将活的HepG2细胞(缺少CEA,缺少NQO1)、LS180细胞(CEA正常,缺少NQO1)和HT29细胞(CEA正常,NQO1正常)与QNAM-C1-ACEA抗体-探针缀合物共培养。共培养后,CEA正常和NOQ1缺乏的LS180细胞共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示在细胞内存在C1香豆素的间断蓝色发光点和极少的NAM绿色发射信号。这些结果表明QNAM-C1-ACEA能显著的被细胞摄取和其具有胞内稳定性,这是由于胞质中缺乏NQO1。对于存在CEA和NQO1的结肠癌细胞(HT29),绿色通道NAM发射明显增强,几乎能与C1香豆素连接键的蓝色通道发射共定位。后者的强度由于FRET过程发生被显著减小。然而,用QNAM-C1-ACEA处理缺乏CEA和NQO1的HepG2细胞显示了非常低的蓝色和绿色发射。由于NQO1酶主要位于特定类型癌细胞的胞质中,以上结果表明,QNAM-C1-ACEA偶联体-探针只能以“AND”逻辑门型方式显示强烈的绿色通道发射(即需要CEA和NQO1同时存在)。
[0294]
图17为实施例8制备的抗体-药物缀合物的硝基还原酶触发药物释放过程荧光变化过程;当用硝基还原酶/还原型辅酶Ⅱ共培养DOX-C1-ACEA,偶联的阿霉素药物随着时间线性持续释放。阿霉素的释放过程伴随着C1连接键在435nm处发射的显著增强和阿霉素在590nm处发射的明显降低,这清楚地表明药物-抗体偶联体的断裂和FRET过程破坏。
[0295]
实施例9 胞内细胞成像
[0296]
HT29or HepG2细胞(~10 5)培养液铺展在35mm玻璃底培养皿中培养过 夜,然后DOX-C1-ACEA与细胞在37℃共培养24h,细胞用PBS(3×1mL)和DMEM培养液冲洗,细胞荧光成像需要在Leica SP5共聚焦显微镜下进行。样品中含有的C1基团激发在405nm,吖啶橙激发在488nm,DOX激发在543nm。
[0297]
图18为实施例9制备的抗体-药物缀合物的含癌胚抗原的细胞内硝基还原酶触发药物释放过程。当用DOX-C1-ACEA偶联体与含有CEA的HT29细胞在正常氧含量下培养时,共聚焦显微镜观察到在细胞质内有间断的强C1绿色发射,和阿霉素的红色圆点发射,而且蓝色/绿色发射能彼此共定位。与此相对的是,对于缺乏CEA的HepG2细胞C1香豆素连接键的蓝色荧光强度仅仅是HT29中的22%。若用DOX-C1-ACEA在缺氧条件下与HT29共培养4小时,明显的阿霉素红色发射能与吖啶橙染色的细胞核很好的共定位。除此之外,非连续的C1-ACEA残基的蓝色发射只共定位在细胞质内。以上结果表示某些癌细胞(如HT29)表面的CEA抗原有助于DOX-C1-ACEA偶联体的细胞摄取,并且在缺氧环境中胞内很容易酶触发阿霉素的释放,这能联系上固体瘤组织的微环境。
[0298]
由上述实施例可知,药物-抗体缀合物与探针-抗体缀合物可以通过连接分子C1构建,并通过荧光的方法原位监控缀合效率。
[0299]
实施例10 双官能荧光分子c1介导的BSA和PEG 227-N 3的荧光缀合物
[0300]
牛血清蛋白BSA(498mg,7.5μmol)溶解在磷酸缓冲液(PBS)(70mL,pH6.5,0.1M,含1mM EDTA)中,同时将三(2-氯乙基)磷酸酯盐酸化物(TCEP·HCl)(21.5mg,75μmol)溶解在PBS(2.5mL)中,然后逐滴加入到上述BSA溶液中,4h后,溶液用去离子水透析24h(2.0kDa截留分子量),然后冻干以获得BSA red
[0301]
BSA或BSA red(4mg,0.06μmol)溶解在PBS(0.9mL,pH 7.0,50mM)中,C1(0.6μmol,溶解于0.1mL DMSO),PEG 227-N 3(6mg,0.6μmol)和CuSO 4/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)加入到溶液中,25℃搅拌不同的时间,通过原位观测在约420nm处荧光发射强度的改变检测轭合进程。达到既定时间后,80μL的样品溶液被取出,然后用2mL PBS稀释,快速添加铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,100mg),移除铜离子,震荡5min后,在进一步SDS-PAGE测试 之前,上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出。
[0302]
反应过程中,其荧光变化图如图19所示,其荧光变化与缀合效率之间的关系如图20所示。
[0303]
凝胶电泳实验:SDS-PAGE实验在凝胶电泳仪(Bio-Rad)上操作,含有BSA-PEG缀合物的溶液(80μL)与20μL SDS-PAGE加样缓冲液混合,根据标准方案使用15.0wt%聚丙烯酰胺凝胶,凝胶电泳带在紫外光(365nm)或者UVP EC3成像系统的白光辐照(染色用考马斯亮蓝)可以直接观察到。
[0304]
其凝胶电泳图如图21所示。
[0305]
实施例11 双官能荧光分子c1介导的鲑降钙素(sCT)和PEG 227-N 3的荧光缀合物
[0306]
TCEP·HCl(14.2mg,50μmol)溶解在PBS(2mL,pH 7.0,50mM)中,取40μL上述溶液(含1μmolTCEP·HCl)添加到含有鲑降钙素(sCT,1.7mg,0.5μmol PBS(9mL,pH 7.0,0.05M))的小瓶中,在室温下搅拌,RP-HPLC分析显示Cys 1-Cys 7二硫键在~30min内定量还原。
[0307]
200μLC1的DMSO溶液(含0.2μmolC1),PEG 227-N 3(10.0mg,1.0μmol)和CuSO 4/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)添加到还原的sCT(0.1μmol,溶解于1.8mL PBS缓冲溶液)中,在25℃搅拌不同的时间,通过原位观测在~420nm处荧光发射强度的改变检测轭合进程,4h后,快速添加铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,100mg)移除铜离子,震荡5min后,上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出。80μL溶液用于SDS-PAGE实验,其余溶液在做RP-HPLC实验之前用去离子水透析24h。
[0308]
反应过程中,其荧光变化图如图22所示。
[0309]
采用体积排除色谱法测定制备的蛋白质-聚合物缀合物分子量,其体积排除色谱图如图23所示。
[0310]
凝胶电泳实验:SDS-PAGE实验在凝胶电泳仪(Bio-Rad)上操作,含有sCT-PEG缀合物的溶液(80μL)与20μL SDS-PAGE加样缓冲液混合,根据标准方案使用了15.0wt%聚丙烯酰胺凝胶,凝胶电泳带在紫外光(365nm)或者UVP EC3成像系统的白光辐照(染色用CoomassieBrilliant Blue)可以直接观察到。
[0311]
其凝胶电泳图如图24所示。
[0312]
实施例12 合成叠氮功能化的PTMC(PTMC-N 3)
[0313]
重结晶的三亚甲基碳酸酯(TMC)单体(500mg,4.9mmol)溶解在干的CH 2Cl 2中(1mL),然后逐滴滴加3-叠氮基-1-丙醇(24mg,0.24mmol)和1,3-二环己基脲(DCU,8mg,0.05mmol)在干的CH 2Cl 2中(1mL),反应混合物在室温氮气氛围下搅拌12h,用乙酸淬灭反应,四氢呋喃稀释,然后用过量的冷甲醇沉淀三次,放进真空干燥箱干燥得到白色粉末PTMC-N 3(160mg,收率30.5%),PTMC的实际聚合度由 1H NMR计算得到,为14,因此缩写为PTMC 14-N 3
[0314]
实施例13 双官能荧光分子C1介导的PVGLIG多肽和PTMC 14-N 3的荧光缀合物
[0315]
PTMC 14-N 3(7.5mg,5.0μmol)和C1(1.5mg,5.1μmol)溶解在DMSO中(1.8mL),PVGLIG(8.1mg,10.1μmol)和CuSO 4/抗坏血酸(1/5摩尔比)溶于0.2mL去离子水后加入,反应体系在25℃搅拌,缀合过程通过荧光原位检测。在共培养~3h后,快速添加铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,100mg)移除铜离子,震荡5min后,上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出,滤液用过量冷乙腈沉淀,离心收集沉淀后真空干燥箱干燥过夜。
[0316]
实施例14 制备PVGLIG-C1-PTMC 14聚合物囊泡
[0317]
PVGLIG-C1-PTMC 14(2mg)溶于1mL DMSO中,加入到一个含有磁力搅拌棒的15mL的小瓶中,室温下搅拌3h,搅拌条件下在~20s内加入9mL去离子水(~500rpm),继续搅拌5h后用去离子水透析(截留分子量3.5kDa)24h。
[0318]
制备的囊泡在水中的透射电镜图如图25所示。
[0319]
实施例15 PVGLIG-C1-PTMC 14聚合物囊泡包埋阿霉素盐酸盐
[0320]
PVGLIG-C1-PTMC 14(2mg)溶于1mL DMSO中,加入到一个含有磁力搅拌棒的15mL的小瓶中,搅拌条件下先加入含DOX·HCl的去离子水(5g/L,2mL),剩余7mL去离子水同样速度加入,继续搅拌5h后用去离子水透析(截留分子量为3.5kDa)24h。DOX的负载含量~8.0wt%。
[0321]
其药物控释应用曲线图如图26所示。
[0322]
由上述实施例可知,本发明制备的上述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可以通过荧光发射强度原位监控缀合效率,并且应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。
[0323]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

权利要求书

[权利要求 1]
一种含荧光发色团的缀合物,其特征在于,具有以下任一结构: 其中,R 1和R 2为能够淬灭荧光发色团荧光并且能够进行“点击”反应的基团。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的缀合物,其特征在于, R 1 R 2
[权利要求 3]
一种具有荧光发射性质的嵌段共聚物,其特征在于,具有式Ⅰ-1所示结构: 其中, x为 m为23~445,n为10~150。
[权利要求 4]
权利要求3所述的具有荧光发射性质的嵌段共聚物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 含有巯基端基的聚合物B和含有叠氮基的聚合物C与化学缀合分子D进行Michael反应与点击反应,得到式Ⅰ-1所示嵌段共聚物; 其中, x为 m为23~445,n为10~150。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,通过荧光发射强度原位监控嵌段共聚物的缀合效率。
[权利要求 6]
一种具有荧光发射性质的靶向药物,其特征在于,具有式Ⅱ-1所示结构: 其中, Target为环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺; Drug为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[权利要求 7]
权利要求6所述的具有荧光发射性质的靶向药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 靶向分子F、药物分子G和化学缀合分子H进行Michael反应和反向D-A加成反应,得到式Ⅱ-1所示靶向药物; 其中, Target为环状RGD多肽、叶酸或磺酰胺; Drug为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
[权利要求 8]
根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,通过红外荧光发射强度原位监控药物分子和靶向分子的缀合效率。
[权利要求 9]
权利要求6所述的靶向药物在靶向介导药物传输中的应用。
[权利要求 10]
一种具有荧光发射性质的抗体-药物/探针缀合物,其特征在于,具有式Ⅰ-2所示结构: 其中,Ab为抗体,DP为荧光探针或药物分子。
[权利要求 11]
一种具有荧光发射性质的抗体-探针缀合物,其特征在于,具有式Ⅱ-2所示结构: 其中,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[权利要求 12]
权利要求11所述的抗体-探针缀合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 单克隆抗体、含叠氮基元的荧光探针A与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅱ-2所示抗体-探针缀合物; 其中,所述单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[权利要求 13]
根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于,通过荧光发射强度原位监控抗体-探针缀合物的缀合效率。
[权利要求 14]
权利要求11所述的抗体-探针缀合物或权利要求12~13任一项所述的制备方法制备的抗体-探针缀合物作为抗原与醌氧化还原酶反应指示剂的应用。
[权利要求 15]
一种具有荧光发射性质的抗体-药物缀合物,其特征在于,具有式Ⅲ所示结构: 其中,DOX为阿霉素,Ab为癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[权利要求 16]
权利要求15所述的抗体-药物缀合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 单克隆抗体、含叠氮基元的前药分子E与双官能荧光分子D进行Michael反应和点击反应,得到式Ⅲ所示抗体-药物缀合物; 其中,DOX为阿霉素,单克隆抗体为含巯基的癌胚抗原单抗或赫赛丁。
[权利要求 17]
根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,通过荧光发射强度原位监控抗体-药物缀合物的缀合效率。
[权利要求 18]
权利要求15所述抗体-药物缀合物或权利要求16~17任一项所述的制备方法制备的抗体-药物缀合物作为荧光指示剂实时监控药物释放的应用。
[权利要求 19]
权利要求15所述抗体-药物缀合物或权利要求16~17任一项所述的制备方法制备的抗体-药物缀合物作为靶向药物释放载体的应用。
[权利要求 20]
一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物,其特征在于,具有式Ⅰ-3所示结构: 其中,POI为蛋白质或多肽;Polymer为聚合物。
[权利要求 21]
一种具有荧光发射性质的蛋白质-聚合物缀合物,其特征在于,具有式Ⅰ-a所示结构: 其中,所述POI为牛血清蛋白或鲑鱼降钙素,所述Polymer为聚乙二醇。
[权利要求 22]
一种权利要求21所述的蛋白质-聚合物缀合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 含巯基的牛血清蛋白、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物; 其中,POI为牛血清蛋白,m为23~445; 或者包括以下步骤: 含巯基的鲑鱼降钙素、叠氮端基的聚乙二醇和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-a所示的蛋白质-聚合物缀合物; 其中,POI为鲑鱼降钙素;m为23~445。
[权利要求 23]
一种具有荧光发射性质的多肽-聚合物缀合物,其特征在于,具有式Ⅰ-b所示结构: 其中,所述POI为基质金属蛋白酶可切断多肽,所述Polymer为聚三亚甲基碳酸酯。
[权利要求 24]
权利要求23所述的多肽-聚合物缀合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 式J所示的基质金属蛋白酶可切断多肽、式K所示的叠氮端基的聚三亚甲基碳酸酯和化合物D进行Michael反应和点击反应,制备得到式Ⅰ-b所示的多肽-聚合物缀合物; βAPVGLIGβAC-SH 式J; 其中,y为10~55。
[权利要求 25]
根据权利要求22或24所述的制备方法,其特征在于,通过荧光发射强度原位监控缀合物的缀合效率。
[权利要求 26]
权利要求23所述的多肽-聚合物缀合物或权利要求24所述的制备方法制备的多肽-聚合物缀合物组成的聚合物囊泡。
[权利要求 27]
根据权利要求26所述的聚合物囊泡,其特征在于,所述聚合物囊泡粒径为60~150nm。
[权利要求 28]
根据权利要求26所述的聚合物囊泡,其特征在于,所述聚合物囊泡具有基质金属酶响应特性。
[权利要求 29]
权利要求26~28任一项所述的聚合物囊泡作为药物载体的应用,或作为荧光指示剂实时监控药物释放的应用。

附图

[ 图 0001]  
[ 图 0002]  
[ 图 0003]  
[ 图 0004]  
[ 图 0005]  
[ 图 0006]  
[ 图 0007]  
[ 图 0008]  
[ 图 0009]  
[ 图 0010]  
[ 图 0011]  
[ 图 0012]  
[ 图 0013]  
[ 图 0014]  
[ 图 0015]  
[ 图 0016]  
[ 图 0017]  
[ 图 0018]  
[ 图 0019]  
[ 图 0020]  
[ 图 0021]  
[ 图 0022]  
[ 图 0023]  
[ 图 0024]  
[ 图 0025]  
[ 图 0026]