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1. (WO2018103679) BENIGN THYROID NODULE-SPECIFIC GENE
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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

说明书

发明名称 : 良性甲状腺结节特异基因

技术领域

[0001]
本发明涉及医学检测领域,更具体地涉及三种良性甲状腺结节特异基因。

背景技术

[0002]
随着常规甲状腺超声检查的普及,甲状腺结节的检出率明显上升。大规模的人群调查研究发现,女性和老年人群中甲状腺结节的患病率最高,达到19-68%。大多数新发结节都为良性结节,明确诊断为恶性的结节不到5%。虽然高分辨率超声联合细针穿刺细胞学使得甲状腺良恶性结节诊断准确率达到85%,患者与临床医生始终焦虑于良性结节是否具有恶性化潜能。因此,2009年美国甲状腺协会(ATA)推荐对于良性结节每12-18个月进行定期随访,从而造成了巨大的医疗资源与社会心理负担。
[0003]
数年来,对于甲状腺结节的分子机制研究主要集中于恶性结节,甲状腺癌分子机制的研究。2014年The Cancer Genome Atlas(TCGA)甲状腺癌研究组详细描述了乳头状癌的基因组特点,发现96.5%的甲状腺乳头状癌存在明确的驱动基因变异。然而,甲状腺良性结节的遗传特征极少有研究报道。本领域迫切需要对良性甲状腺结节的遗传特征进行研究。
[0004]
发明内容
[0005]
本发明的目的在于提供良性甲状腺结节的特异基因。
[0006]
在本发明的第一方面,提供了一种用于检测良性甲状腺结节的试剂盒,所述试剂盒包括选自下组的一对或多对引物:
[0007]
(i)特异性扩增SPOP基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为80-2000bp且含有SEQ ID NO.:1中第281位的扩增产物;
[0008]
(ii)特异性扩增EZH1基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为80-2000bp且含有SEQ ID NO.:3中第1712位的扩增产物;
[0009]
(iii)特异性扩增ZNF148基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为1000-3000bp且含有SEQ ID NO.:5中第1273-2871位的扩增产物。
[0010]
在另一优选例中,所述特异性扩增SPOP基因或转录本的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7和8所示。
[0011]
在另一优选例中,所述特异性扩增EZH1基因或转录本的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9和10所示。
[0012]
在另一优选例中,所述特异性扩增ZNF148基因或转录本的引物选自下组:
[0013]
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.:11和12所示的引物对;
[0014]
(ii)核苷酸序列如SEQ ID NO.:13和14所示的引物对;
[0015]
(iii)核苷酸序列如SEQ ID NO.:15和16所示的引物对。
[0016]
在另一优选例中,所述试剂盒还含有选自下组的试剂:
[0017]
(a)与SEQ ID NO.:1中第281位的C→G突变结合的探针或芯片;
[0018]
(b)识别SEQ ID NO.:1中第281位C→G突变的限制性内切酶;
[0019]
(c)与SEQ ID NO.:3中第1712位的A→G突变结合的探针或芯片;
[0020]
(d)识别SEQ ID NO.:3中第1712位A→G突变的限制性内切酶。
[0021]
在另一优选例中,所述的突变包括单链突变和双链突变。
[0022]
在另一优选例中,所述试剂盒还含有选自下组的试剂:
[0023]
(I)检测SEQ ID NO.:2中第94位P→R突变的特异性抗体;
[0024]
(II)检测SEQ ID NO.:4中第571位Q→R突变的特异性抗体。
[0025]
在另一优选例中,所述试剂盒用于良性甲状腺结节的辅助判断。
[0026]
在另一优选例中,所述试剂盒用于甲状腺结节组织样本和/或血液样本的检测。
[0027]
在另一优选例中,所述检测为预先检测。
[0028]
在另一优选例中,所述的血液样品包括血清和血浆。
[0029]
在另一优选例中,所述的检测是对亚洲人群进行检测。
[0030]
在另一优选例中,所述的检测是对中国人群进行检测。
[0031]
在另一优选例中,所述的检测是用于判断甲状腺结节是否为良性。
[0032]
在另一优选例中,所述的检测是用于判断甲状腺结节不为恶性甲状腺结节,较佳地,用于判断甲状腺结节不为乳头状甲状腺癌。
[0033]
在本发明的第二方面,提供了一种多核苷酸分子的用途,用于制备检测良性甲状腺结节的试剂盒;其中,所述的多核苷酸分子包括:
[0034]
(i)SPOP基因、特异性扩增SPOP基因或转录本的引物、与SPOP基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:1中第281位C→G突变特异性结合的探针或芯片、和/或检测SEQ ID NO.:2中第94位P→R突变的特异性抗体;
[0035]
(ii)EZH1基因、特异性扩增EZH1基因或转录本的引物、与EZH1基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G突变特异性结合的探针或芯片、和/或检测SEQ ID NO.:4中第571位Q→R突变的特异性抗体;和/或
[0036]
(iii)、特异性扩增ZNF148基因或转录本的引物、与ZNF148基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位突变特异性结合的探针。
[0037]
在另一优选例中,所述试剂盒用于良性甲状腺结节的辅助判断。
[0038]
在另一优选例中,所述试剂盒还包括一说明书,说明书中记载以下内容:
[0039]
当检测对象具有一种或多种所述突变,则提示检测对象的甲状腺结节为良性。
[0040]
在本发明的第三方面,提供了一种良性甲状腺结节相关基因的用途,用于制备检测良性甲状腺结节的试剂或试剂盒,并且所述的良性甲状腺结节相关基因包括SPOP基因、EZH1基因、和/或ZNF148基因。
[0041]
在另一优选例中,所述的试剂或试剂盒用于检测以下单核苷酸突变:
[0042]
SPOP基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:1中第281位C→G。
[0043]
在另一优选例中,所述的试剂包括特异性扩增SPOP基因或转录本的引物、含有所述突变位点的扩增产物、与所述突变位点特异性结合的探针、特异性检测所述突变位点的核酸芯片。
[0044]
在另一优选例中,所述的试剂盒包括使用说明书以及一种或多种以下试剂:
[0045]
容器(a)以及位于所述容器内的特异性扩增SPOP基因或转录本的引物;
[0046]
容器(b)以及位于所述容器内的与所述突变位点特异性结合的探针;
[0047]
容器(c)以及位于所述容器内的特异性检测所述突变位点的核酸芯片。
[0048]
在另一优选例中,所述的SPOP基因用作标准品或对照品。
[0049]
在另一优选例中,所述的试剂或试剂盒用于检测以下单核苷酸突变:
[0050]
EZH1基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G。
[0051]
在另一优选例中,所述的试剂包括特异性扩增EZH1基因或转录本的引物、含有所述突变位点的扩增产物、与所述突变位点特异性结合的探针、特异性检测所述突变位点的核酸芯片。
[0052]
在另一优选例中,所述的试剂盒包括使用说明书以及一种或多种以下试剂:
[0053]
容器(a)以及位于所述容器内的特异性扩增EZH1基因或转录本的引物;
[0054]
容器(b)以及位于所述容器内的与所述突变位点特异性结合的探针;
[0055]
容器(c)以及位于所述容器内的特异性检测所述突变位点的核酸芯片。
[0056]
在另一优选例中,所述的EZH1基因用作标准品或对照品。
[0057]
在另一优选例中,所述的试剂或试剂盒用于检测以下突变:
[0058]
ZNF148基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位突变。
[0059]
在另一优选例中,所述的ZNF148基因用作标准品或对照品。
[0060]
在本发明的第四方面,提供了一种体外非诊断性检测样品是否存在良性甲状腺结节相关基因突变的方法,包括步骤:
[0061]
(a)用特异性引物扩增样品的SPOP基因、EZH1基因、和/或ZNF148基因,得到扩增产物;和
[0062]
(b)检测扩增产物中是否存在以下突变位点:
[0063]
SPOP基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:1中第281位C→G;
[0064]
EZH1基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G;
[0065]
ZNF148基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位突变。
[0066]
在另一优选例中,所述的扩增产物的长度为80-2000bp且含有SEQ ID NO:1中第281位、SEQ ID NO.:3中第1712位、和/或SEQ ID NO.:5中第1273-2871位。
[0067]
在另一优选例中,所述的扩增样本是甲状腺结节组织样本。
[0068]
在本发明的第五方面,提供了一种检测个体良性甲状腺结节的方法,所述方法包括步骤:
[0069]
检测该个体的下述基因、转录本和/或蛋白:
[0070]
SPOP基因、转录本和/或蛋白,并与正常的SPOP基因、转录本和/或蛋白相比较,
[0071]
EZH1基因、转录本和/或蛋白,并与正常的EZH1基因、转录本和/或蛋白相比较,
[0072]
ZNF148基因、转录本和/或蛋白,并与正常的ZNF148基因、转录本和/或蛋白相比较,
[0073]
其中,存在差异就提示该个体的甲状腺结节为良性。
[0074]
在另一优选例中,检测待测个体结节样本中的基因、转录本和/或蛋白,并与该个体血液样本中的基因、转录本和/或蛋白相比较。
[0075]
在另一优选例中,所述的差异是存在以下突变:
[0076]
SPOP基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:1中第281位C→G;
[0077]
EZH1基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G;
[0078]
ZNF148基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位发生突变。
[0079]
在另一优选例中,对个体的甲状腺结节组织样本进行检测,从而检测个体甲状腺结节是否为良性。
[0080]
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

具体实施方式

[0081]
本发明人经过广泛而深入地研究,首次意外地发现与三种性结节相关的基因,分别是SPOP基因、EZH1基因和ZNF148基因。实验表明,SPOP,EZH1和ZNF148为互不相交的基因突变,在29.2%的良性结节中出现,在配对的PTC(乳头状甲 状腺癌,papillary thyroid carcinoma)肿瘤组织中不发生。上述3个良性结节相关基因,提供了恶性甲状腺结节的“排除”信息,在基因突变检测中有重要诊断意义。
[0082]
SPOP基因
[0083]
SPOP基因(NM_001007226)编码的蛋白调节死亡相关蛋白(DAXX)的转录抑制活性,DAXX与组蛋白去乙酰化酶、核心组蛋白和其他组蛋白相关蛋白相互作用。在小鼠中,SPOP编码的蛋白结合到macroH2A1.2的亮氨酸拉链结构域,后者是H2A组蛋白的异构体,富集在失活的X染色体上。此蛋白的BTB/POZ结构域与其他蛋白作用,调节转录抑制活性,与组蛋白去乙酰化酶的共抑制复合物的组件相互作用。SPOP基因的选择性剪切会产生许多转录变异体,编码相同的蛋白。
[0084]
EZH1基因
[0085]
EZH1基因(NM_001991)编码的蛋白是一个非经典的多梳抑制复合物2(PRC-2)的组成部分,调节组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)的甲基化作用,在维持胚胎干细胞的多能性和可塑性中起重要作用。
[0086]
ZNF148基因
[0087]
ZNF148基因(NM_021964)编码的蛋白(锌指蛋白148)属于Krüppel-like转录因子的一类,对其目标蛋白既有转录激活作用也可抑制转录。ZNF148的低表达与结直肠癌的预后不良相关,在肝细胞癌细胞系中,ZNF148过表达的克隆形成明显减少。
[0088]
甲状腺结节
[0089]
甲状腺结节是指在甲状腺内的肿块,可随吞咽动作随甲状腺而上下移动,是临床常见的病症,可由多种病因引起。临床上有多种甲状腺疾病,如甲状腺退行性变、炎症、自身免疫以及新生物等都可以表现为结节。甲状腺结节可以单发,也可以多发,多发结节比单发结节的发病率高,但单发结节甲状腺癌的发生率较高。
[0090]
甲状腺结节分为良性甲状腺结节和恶性甲状腺结节,大多数新发结节都为良性结节,明确诊断为恶性的结节不到5%。
[0091]
检测方法、检测试剂及试剂盒
[0092]
本发明提供了一种检测个体良性甲状腺结节的方法,通过检测甲状腺结节中的SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因,并将其与血液样本中的相应基因进行比 较,提前预测甲状腺结节是否为良性。本发明的方法可以用于辅助诊断分型,尤其是早期辅助性诊断。
[0093]
具体地,本发明的方法、试剂及试剂盒检测如下突变:
[0094]
[0095]
本领域的技术人员知道,有大量的分析技术可用于检测基因中所述位点是否存在突变。这些技术包括(但并不限于):DNA测序、杂交测序;酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(芯片)、焦磷酸测序、Taqman探针检测技术、分子信标等。
[0096]
用于本发明的测试样品没有特别限制,对于检测突变位点而言,可以是从细胞或组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。由于本发明的突变主要存在于甲状腺结节细胞中,通常而不存在于外周血细胞中。因此,优选的测试样品是甲状腺结节细胞,外周血细胞可以用作对照。
[0097]
本发明的基因序列检测的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”或“核酸芯片”)上,用于分析组织中基因的序列和差异表达分析,以及基因诊断。用SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因的特异性引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测相应的转录产物。
[0098]
检测可以针对cDNA,也可针对基因组DNA。SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因的突变的形式包括与正常野生型DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响相关蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
[0099]
最方便的检测本发明突变位点的方法,是通过用SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因的特异性引物分别扩增样品的SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因,得到扩增产物;然后检测扩增产物中是否存本发明的单核苷酸突变(SNV)。
[0100]
具体地,可用于检测的代表性引物序列如下所示:
[0101]
SPOP引物序列:
[0102]
F:CCAGATCAAAGCCACAAC(SEQ ID NO.:7)
[0103]
R:CTGGACGATAGAGTAAGACC(SEQ ID NO.:8)
[0104]
EZH1引物序列:
[0105]
F:ACACCTGCTTTTTTGACTCG(SEQ ID NO.:9)
[0106]
R:AACCAGTGGAAAGAGAATGC(SEQ ID NO.:10)
[0107]
ZNF148最后一个外显子引物序列:
[0108]
1)F:TCTTGGTTGACCAAAACCAC(SEQ ID NO.:11)
[0109]
R:GGCCCCTCCTGCAAATTATC(SEQ ID NO.:12)
[0110]
2)F:TTTGGGAGGGTCTGGTTATC(SEQ ID NO.:13)
[0111]
R:CCACATATGAAGAGAGCAAAG(SEQ ID NO.:14)
[0112]
3)F:CAGGCTTTGGACAGAACTAG(SEQ ID NO.:15)
[0113]
R:TACACAGAGTAACCCCACTC(SEQ ID NO.:16)
[0114]
应理解,在本发明首次揭示了SPOP基因、EZH1基因、和ZNF148基因的突变位点与良性甲状腺结节的相关性之后,本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该突变位点位置的扩增产物,然后通过测序等方法确定是否存在本发明的突变。通常,引物的长度为15-50bp,较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的,但是本领域技术人员知道,在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下,也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内,只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明基因突变位点的对应位置。
[0115]
虽然扩增产物的长度没有特别限制,但是通常扩增产物的长度为100-2000bp,较佳地为150-1500bp,更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有本发明的单核苷酸突变(SNV)位点。
[0116]
本发明的主要优点包括:
[0117]
(a)发现SPOP,EZH1和ZNF148这3个良性结节相关基因,提供了甲状腺乳头状癌的“排除”信息;
[0118]
(b)强有力地证实了大部分良性结节并非癌前状态,与乳头状癌的发生无关;
[0119]
(c)存在SPOP,ZNF148,或EZH1突变时,可能无需对良性甲状腺结节进行常规监测,节省大量医疗资源。
[0120]
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则 百分比和份数按重量计算。
[0121]
通用材料和方法
[0122]
样本准备和DNA提取
[0123]
经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准,并在患者知情同意后,从28位患者的手术标本中共获得127例组织样本,其中包括21位伴癌结节患者(同时患有甲状腺良性结节和甲状腺乳头状癌)与8位单纯良性结节患者。单纯良性结节定义为至少患有一个甲状腺结节并存在时间大于2年,且无恶性组织学征象。所有患者在标本采集前均未接受治疗(放疗或化疗)。使用患者血液标本作为生殖细胞系对照(以识别体细胞变异)。所有组织收集时迅速放入液氮中储存,并独立分析,以最大程度减少污染和干扰。经有经验的病理科医师检阅核对HE染色切片后,对病理证实的区域提取DNA(甲状腺乳头状癌组织的细胞密度>80%)。使用数字病理切片扫描仪nanozoomer 2.0-RS(Hamamatsu)扫描病理切片,并使用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit提取组织DNA。对于伴癌结节患者,同时收集良性结节、乳头状癌和正常组织;对于单纯结节患者,收集良性结节和配对的正常甲状腺组织。
[0124]
全外显子组测序
[0125]
通过超声组织匀浆仪将28例患者共127个组织DNA随机打碎成小片段,构建测序文库,平均插入片段大小为300bp。使用SureSelect Human All Exon 50Mb kit(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)进行全外显子组捕捉,再用Illumina HiSeq2500测序系统进行深度测序,生成100bp的配对序列。所有样本测序数据经过严格过滤后,得到平均为13.26GB数据量的高质量原始测序数据(全外显子测序的平均有效覆盖为161x,最低为130倍覆盖,最高为180倍)。
[0126]
变异位点的注释和命名
[0127]
使用BWA软件(第0.7版),采用其默认参数设置,将获得的全外显子测序的配对序列与人类参考基因组(hg19)进行序列比对。PCR扩增造成的重复产物使用Picard工具(1.1版)进行去除。在有插入或缺失突变的局部区域,重新进行序列比对,并矫正碱基质量打分。经过这些分析,最后获得BAM文件(二进制比对文件),使用GATK软件包中的UnifiedGenotyper模块识别突变位点。为了比较具体每个患者配对组织的突变情况,在GATK联合识别体细胞突变位点的基础上,使用单个正常组织-多个肿瘤样本的策略。为避免测序或比对过程中的误差,采用以下标准:1)组织和对照血样都要有完整、足够的序列覆盖(至少10x深度);2)组织中覆盖某个位点的序列中,至少10%支持此处有突变碱基(如果局部深度>50倍,则设为5%);3)组织中,测序数据中发现突变至少要超过3次。4)对每个可能的体细胞突变位点,使用卡方检验检测多个 组织和对照血样的等位基因深度和频率;5)排除对照血样品中也出现突变的位点(大于2个序列支持血样中也发生突变)。后续分析中,排除dbSNP数据库中的常见突变(build 142)、千人基因组中(最小等位基因频率MAF>5%)、exome aggregation consortium数据库中(MAF>1%)、内含子区域和基因间隔区的突变。使用ANNOVAR软件对体细胞突变的单碱基突变(SNV)和插入缺失突变进行注释,找出位于的基因及可能受影响的蛋白编码。
[0128]
突变分析
[0129]
假设人类外显子的蛋白编码基因共30Mb并完全覆盖,计算突变密度。体细胞突变的碱基使用前述的SNV分析结果。分析良性肿瘤的共有突变时,比较配对肿瘤和良性结节的突变序列,以找到良性肿瘤特有的重要突变。
[0130]
使用PCR和Sanger一代测序验证突变
[0131]
对全外显子组测序发现的变异位点,进一步使用96孔板进行PCR检测验证(GeneAmp PCR系统9700,由法国的Biosystems提供),每个反应使用20ng的DNA模板。PCR产物由3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems,Courtaboeuf,France)测序,并使用测序分析软件(5.2版本Applied Biosystems,Courtaboeuf,France)进行分析。所有阳性的突变均根据原始测序的trace文件通过了人工核对得到了确认。
[0132]
扩大群体评估良性结节中重要突变的频率
[0133]
进一步收集了259例患者共328例液氮冰冻的甲状腺良性结节组织。按上述方法抽提基因组DNA,对SPOP P94R和EZH1Q 571R热点突变位点,设计引物对位点所在外显子区段进行PCR扩增,并使用Sanger测序方法对PCR产物进行测序,根据原始测序的trace文件人工核对确认变异,计算变异频率。对于ZNF148基因(NM_021964),由于全外显子组发现多个位于最后一个外显子的变异,因此设计PCR产物,对所有编码区域和内含子-外显子连接区域的侧翼逐一测序,统计整个ZNF148编码区的变异。
[0134]
实施例1甲状腺结节的突变分析
[0135]
对手术收集的28例患者的127例组织样本进行全外显子测序和突变分析,来自21位伴癌结节患者(同时患有甲状腺良性结节和甲状腺乳头状癌PTC)的样本为PTC组样本,来自8位单纯良性结节患者的样本为非PTC组样本。
[0136]
在28位患者的样本库中,共发现了535个基因的734个体细胞突变。良性结节中的突变频率(每Mb有0.36个突变)实际上高于乳头状癌(每Mb有0.33个突变)(P=0.58)。经比较,来源于PTC组和非PTC组的良性结节的突变频率无明显差异(分别为每Mb有0.34和每Mb有0.38个突变,P=0.70,t检验)。
[0137]
28位患者的良性结节中,最常见的频发突变为SPOP(有4位患者中检出, 14.3%),EZH1(有3位患者中检出,10.7%)和ZNF148(有6位患者中检出,21.4%)。SPOP和EZH1均为热点突变,分别为(P94R)和(Q571R);ZNF148的突变均位于最后一个外显子,为无义突变或移码突变。
[0138]
实施例2良性甲状腺结节特异基因的扩大分析
[0139]
为扩大样本验证这三个基因与甲状腺良性结节的特异关系,对231例额外的良性甲状腺结节患者进行检测,结果发现,231例患者中,有29例患者(11.2%)存在SPOP P94R突变,24例患者存在EZH1 Q571R突变,14例患者存在ZNF148突变(5.4%),每个突变互不相交。
[0140]
对甲状腺癌的TCGA数据库中的信息进行分析,结果显示上述三个基因的发生率极低(几千份样本中,只发现有1个SPOP,2个EZH1,2个ZNF148),且均同时伴有已知的PTC驱动突变。
[0141]
讨论
[0142]
甲状腺结节形成是甲状腺肿大的原发早期刺激因素。结节形成的原因包括碘缺乏、营养性甲状腺肿或自身免疫疾病。相比之下,滤泡上皮细胞的局部增殖导致的甲状腺结节形成为单克隆增殖,且由体细胞突变引起。甲功正常的甲状腺结节中,仅有一小部分发生TSHR,GNAS,或RAS家族基因的体细胞突变。此外,多结节疾病中尚不清楚是否有特异的亚群为癌前病变。利用全外显子测序技术首次描述了良性甲状腺结节的基因突变情况。有趣的是,发明人发现虽然良性结节和乳头状癌的基因突变频率相似,但特异的基因却各不相同。SPOP、EZH1和ZNF148为互不相交的基因突变,仅在29.2%的良性结节中出现,在配对的PTC肿瘤组织中不发生。扩大样本到259个良性结节中验证,25.8%的结节含有这3种基因突变。虽然这3个基因参与肿瘤相关的细胞生物学行为,发明人在甲状腺细胞系中做了功能实验,结果发现这3个基因仅促进增殖,但不影响侵袭功能。以上发现提示,这3个基因突变参与良性甲状腺结节形成,但并不导致其向肿瘤转化。目前甲状腺结节的基因突变检测仅包含甲状腺癌转换相关基因,为“纳入”检测;而发明人发现了SPOP,EZH1和ZNF148这3个良性结节相关基因,提供“排除”信息,在基因突变检测中有重要诊断意义。
[0143]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求书

[权利要求 1]
一种用于检测良性甲状腺结节的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括选自下组的一对或多对引物: (i)特异性扩增SPOP基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为80-2000bp且含有SEQ ID NO.:1中第281位的扩增产物; (ii)特异性扩增EZH1基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为80-2000bp且含有SEQ ID NO.:3中第1712位的扩增产物; (iii)特异性扩增ZNF148基因或转录本的引物,所述的引物扩增出长度为1000-3000bp且含有SEQ ID NO.:5中第1273-2871位的扩增产物。
[权利要求 2]
如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有选自下组的试剂: (a)与SEQ ID NO.:1中第281位的C→G突变结合的探针或芯片; (b)识别SEQ ID NO.:1中第281位C→G突变的限制性内切酶; (c)与SEQ ID NO.:3中第1712位的A→G突变结合的探针或芯片; (d)识别SEQ ID NO.:3中第1712位A→G突变的限制性内切酶。
[权利要求 3]
如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有选自下组的试剂: (I)检测SEQ ID NO.:2中第94位P→R突变的特异性抗体; (II)检测SEQ ID NO.:4中第571位Q→R突变的特异性抗体。
[权利要求 4]
如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于良性甲状腺结节的辅助判断。
[权利要求 5]
如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括一说明书,说明书中记载以下内容: 当检测对象具有一种或多种所述突变,则提示检测对象的甲状腺结节为良性。
[权利要求 6]
一种多核苷酸分子的用途,其特征在于,用于制备检测良性甲状腺结节的试剂盒;其中,所述的多核苷酸分子包括: (i)SPOP基因、特异性扩增SPOP基因或转录本的引物、与SPOP基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:1中第281位C→G突变特异性结合的探针或芯片、和/或检测SEQ ID NO.:2中第94位P→R突变的特异性抗体; (ii)EZH1基因、特异性扩增EZH1基因或转录本的引物、与EZH1基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G突变特异性结合的探针或芯片、和/或检测SEQ ID NO.:4中第571位Q→R突变的特异性抗体;和/或 (iii)、特异性扩增ZNF148基因或转录本的引物、与ZNF148基因的核苷酸序列即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位突变特异性结合的探针。
[权利要求 7]
一种良性甲状腺结节相关基因的用途,其特征在于,用于制备检测良性甲状腺结节的试剂或试剂盒,并且所述的良性甲状腺结节相关基因包括SPOP基因、EZH1基因、和/或ZNF148基因。
[权利要求 8]
如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述的试剂或试剂盒用于检测以下单核苷酸突变: SPOP基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:1中第281位C→G。
[权利要求 9]
如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述的试剂或试剂盒用于检测以下单核苷酸突变: EZH1基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G。
[权利要求 10]
一种体外非诊断性检测样品是否存在良性甲状腺结节相关基因突变的方法,其特征在于,包括步骤: (a)用特异性引物扩增样品的SPOP基因、EZH1基因、和/或ZNF148基因,得到扩增产物;和 (b)检测扩增产物中是否存在以下突变位点: SPOP基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:1中第281位C→G; EZH1基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:3中第1712位A→G; ZNF148基因的核苷酸序列:即SEQ ID NO.:5中第1273-2871位突变。