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1. (WO2018099452) L-ISOLEUCINE-PRODUCING CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM FERMENTATION MEDIUM AND CULTURE METHOD
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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051  

权利要求书

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基及培养方法

[0001]
本申请要求申请日为2016年12月02日的中国专利申请CN201611093973.X的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

[0002]
本发明属于微生物发酵领域,具体涉及一种用于产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌发酵培养基及培养方法。

背景技术

[0003]
近年来,随着L-异亮氨酸在医药保健、食品加工饲料工业中的应用研究不断深入,市场对L-异亮氨酸的需求在不断生长。L-异亮氨酸虽已实现工业化生产,但目前产量仍不能满足需要。目前,我国L-异亮氨酸的需求缺口较大,并且年需量逐年增加。我国的L-异亮氨酸生产面临产酸低、糖酸转化率低、提取率低等诸多问题。我国L-异亮氨酸产酸水平为25-30g/L,提取率为65-70%,国内最高糖酸转化率为18-20%,普遍糖酸转化率在15%左右。江南大学2014年申请专利CN104480057A中,糖酸转化率仅为12.4%;天津科技大学2015年申请专利CN104878051A专利中5L发酵罐产酸为40.05g/L,糖酸转化率为18.7%;而日本L-异亮氨酸产酸水平为30-35g/L,提取率为70-75%(李静等,CN104450815A,2014)。日本味之素据报道L-异亮氨酸产酸水平3.5%,提取率在70%(冯珍全等,L-异亮氨酸的应用现状及其前景展望,2013)。近年来原材料上涨和劳动成本提高都为生产L-异亮氨酸带来挑战。
[0004]
发明内容
[0005]
本发明的目的是针对目前L-异亮氨酸生产效率低下的现状,提供一种用于产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌发酵培养基及培养方法,采用该发酵培养基及培养方法,能大幅提高糖酸转化率,从而提高生产效率。
[0006]
本发明提供的产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,包括基础培养基和生长因子,所述生长因子由胆碱、甜菜碱和维生素B6组成,各成分占发酵培养基的含量为胆碱0.2-1g/L,甜菜碱0.25-0.5mg/L,维生素B6 0.05-0.3mg/L。
[0007]
优选地,所述基础培养基由以下成分组成,各成分占发酵培养基的含量为:玉米浆15-25ml/L,葡萄糖240-300g/L,尿素20-25g/L,磷酸氢二钾0.4-0.8g/L,硫酸镁0.6-0.8g/L, 维生素B1 0.2-0.4mg/L,硫酸亚铁0.015-0.03mg/L,玉米油1-5ml/L,丝肽粉2-4g/L,消泡剂30-50ml/L。
[0008]
进一步优选地,各成分占发酵培养基的含量为:玉米浆15ml/L,葡萄糖240g/L,尿素25g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.6g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.015mg/L,玉米油1ml/L,甜菜碱0.3mg/L,丝肽粉3g/L,维生素B6 0.3mg/L,胆碱0.5g/L,消泡剂34ml/L。
[0009]
本发明提供的产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养方法是:将产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌接种到所述的发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的5-20%,氨水调节pH至6.5-7,溶氧控制在30-50%,发酵25-30h;然后将溶氧降低到15-25%,并向发酵液中流加50-80%葡萄糖溶液控制残糖为3-4%,继续发酵至60-70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在29-33℃。
[0010]
优选地发酵培养方法是:将产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌接种到如权利要求1-3任何一项所述的发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的10%,氨水调节pH至6.8,溶氧控制在30%,发酵26h;然后将溶氧降低到20%,并向发酵液中流加80%葡萄糖溶液控制残糖为3.5%,继续发酵至70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在31℃。
[0011]
本发明的有益效果是:本发明通过向培养基中添加胆碱、甜菜碱、维生素B6三种生长因子,可以为谷氨酸棒杆菌提供生长因子、维持其细胞内外渗透压平衡、促进氨基酸的合成代谢,从而提高L-异亮氨酸的产量和糖酸转化率。本发明提供的培养基和培养方法具有生产效率高、生产周期短等有点。

具体实施方式

[0012]
以下通过实施例对本发明进行详细地说明。
[0013]
实施例1
[0014]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)发酵培养基,它由基础培养基和生长因子组成,各组分在发酵培养基中的含量为:
[0015]
基础培养基:玉米浆15ml/L,葡萄糖240g/L,尿素25g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.6g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.015mg/L,玉米油1ml/L,丝肽粉3g/L,消泡剂34ml/L。
[0016]
生长因子:甜菜碱0.3mg/L、胆碱0.5g/L,维生素B6 0.3mg/L。
[0017]
混合后121℃灭菌25min。
[0018]
液体种子培养基:一水葡萄糖17g/L,玉米浆10ml/L,尿素1g/L,无水硫酸镁0.5g/L, 磷酸氢二钾1g/L,丝肽粉0.1g/L,维生素B1 0.1mg/L,玉米油0.1g/100ml,碳酸钙2g/100ml;用NaOH调pH7.0,121℃灭菌20min。
[0019]
将试管斜面上的产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌,挑取一环,接种到种子培养中,往复式摇床31℃、105rpm培养24h得到种子培养基菌液。
[0020]
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法:将谷氨酸棒杆菌接种到上述发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的10%,氨水调节pH至6.8,溶氧控制在30%,发酵26h;然后将溶氧降低到20%,并向发酵液中流加重量含量为80%的葡萄糖溶液控制残糖为3.5%(重量含量),继续发酵至70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在31℃。
[0021]
实施例2
[0022]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,它由基础培养基和生长因子组成,各组分在发酵培养基中的含量为:
[0023]
玉米浆15ml/L,葡萄糖300g/L,尿素20g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.6g/L,维生素B1 0.4mg/L,硫酸亚铁0.03mg/L,玉米油5ml/L,丝肽粉2g/L,消泡剂50ml/L,胆碱0.8g/L,甜菜碱0.4mg/L,维生素B6 0.2mg/L。
[0024]
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法:将谷氨酸棒杆菌接种到发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的5%,氨水调节pH至6.5,溶氧控制在30%,发酵25h;然后将溶氧降低到15%,并向发酵液中流加80%葡萄糖溶液控制残糖为3%,继续发酵至60小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在33℃。
[0025]
实施例3
[0026]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,它由基础培养基和生长因子组成,各组分在发酵培养基中的含量为:
[0027]
玉米浆25ml/L,葡萄糖240g/L,尿素25g/L,磷酸氢二钾0.8g/L,硫酸镁0.8g/L,维生素B1 0.2mg/L,硫酸亚铁0.015mg/L,玉米油1ml/L,丝肽粉4g/L,消泡剂30ml/L,胆碱0.3g/L,甜菜碱0.5mg/L,维生素B6 0.1mg/L。
[0028]
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法:将谷氨酸棒杆菌接种到发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的20%,氨水调节pH至7,溶氧控制在50%,发酵30h;然后将溶氧降低到25%,并向发酵液中流加50%葡萄糖溶液控制残糖为4%,继续发酵至70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在29℃。
[0029]
实施例4
[0030]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,它由基础培养基和生长因子组成,各组分在发酵培养基中的含量为:
[0031]
玉米浆20ml/L,葡萄糖260g/L,尿素23g/L,磷酸氢二钾0.6g/L,硫酸镁0.7g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.02mg/L,玉米油3ml/L,丝肽粉3g/L,消泡剂40ml/L,胆碱0.6g/L,甜菜碱0.25mg/L,维生素B6 0.05mg/L。
[0032]
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法:将谷氨酸棒杆菌接种到发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的15%,氨水调节pH至6.7,溶氧控制在40%,发酵28h;然后将溶氧降低到18%,并向发酵液中流加70%葡萄糖溶液控制残糖为3.8%,继续发酵至64小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在30℃。
[0033]
实施例5
[0034]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,它由基础培养基和生长因子组成,各组分在发酵培养基中的含量为:
[0035]
玉米浆16ml/L,葡萄糖280g/L,尿素21g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.7g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.02mg/L,玉米油2ml/L,丝肽粉3g/L,消泡剂40ml/L,胆碱0.4g/L,甜菜碱0.35mg/L,维生素B6 0.15mg/L。
[0036]
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法:将谷氨酸棒杆菌接种到发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的12%,氨水调节pH至6.8,溶氧控制在30%,发酵27h;然后将溶氧降低到20%,并向发酵液中流加80%葡萄糖溶液控制残糖为3.5%,继续发酵至70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在32℃。
[0037]
试验例
[0038]
对比例1
[0039]
玉米浆15ml/L,葡萄糖240g/L,尿素25g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.6g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.015mg/L,玉米油1ml/L,丝肽粉3g/L,消泡剂34ml/L。
[0040]
发酵培养方法与实施例1相同。
[0041]
对比例2
[0042]
在对比例1的基础上增加甜菜碱0.3mg/L。发酵培养方法与实施例1相同。
[0043]
对比例3
[0044]
在对比例1的基础上增加胆碱0.5g/L。发酵培养方法与实施例1相同。
[0045]
对比例4
[0046]
在对比例1的基础上增加维生素B6 0.3mg/L。发酵培养方法与实施例1相同。
[0047]
对发酵液中的L-异亮氨酸含量进行检测(检测方法参考唐涛,《氨基酸柱前衍生化的HPLC方法发展及应用》硕士论文,南京理工大学,2006.5),计算L-异亮氨酸的产量,并根据培养基中的含糖量计算出糖酸转化率,结果见下表1。
[0048]
表1实施例1-5的产物含量和糖酸转化率
[0049]
[表0001]
L-异亮氨酸含量(g/L) 糖酸转化率(%)
实施例1 46.7 21.4
实施例2 42.2 18.9
实施例3 41.5 19.2
实施例4 44.8 20.6
实施例5 44.5 21.7
对比例1 34.1 15.5
对比例2 38.7 17.9
对比例3 37.9 16.8
对比例4 40.8 17.6

[0050]
从以上结果可以看出,向基础培养基中添加二种生长因子,能提高L-异亮氨酸含量和糖酸转化率,当同时添加时产量和转化率增加最为明显。
[0051]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这些仅是举例说明,在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此,本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

权利要求书

[权利要求 1]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,其特征在于:包括基础培养基和生长因子,所述生长因子由胆碱、甜菜碱和维生素B6组成,各成分占发酵培养基的含量为胆碱0.2-1.0g/L,甜菜碱0.25-0.5mg/L,维生素B6 0.05-0.3mg/L。
[权利要求 2]
如权利要求1所述的产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,其特征在于:所述基础培养基含有以下成分,各成分占发酵培养基的含量为:玉米浆15-25ml/L,葡萄糖240-300g/L,尿素20-25g/L,磷酸氢二钾0.4-0.8g/L,硫酸镁0.6-0.8g/L,维生素B1 0.2-0.4mg/L,硫酸亚铁0.015-0.03mg/L,玉米油1-5ml/L,丝肽粉2-4g/L,消泡剂30-50ml/L;和/或,胆碱0.3-0.8g/L。
[权利要求 3]
如权利要求2所述的产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基,其特征在于:各成分占发酵培养基的含量为:玉米浆15ml/L,葡萄糖240g/L,尿素25g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.6g/L,维生素B1 0.3mg/L,硫酸亚铁0.015mg/L,玉米油1ml/L,甜菜碱0.3mg/L,丝肽粉3g/L,维生素B6 0.3mg/L,胆碱0.5g/L,消泡剂34ml/L。
[权利要求 4]
一种产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养方法,其特征在于:将产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌接种到如权利要求1-3任何一项所述的发酵培养基中,菌液体积占发酵培养基体积的5-20%,氨水调节pH至6.5-7,溶氧控制在30-50%,发酵25-30h;然后将溶氧降低到15-25%,并向发酵液中流加50-80%葡萄糖溶液控制残糖为3-4%,继续发酵至60-70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在29-33℃。
[权利要求 5]
如权利要求4所述产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养方法,其特征在于:菌液体积占发酵培养基体积的10%,氨水调节pH至6.8,溶氧控制在30%,发酵26h;然后将溶氧降低到20%,并向发酵液中流加80%葡萄糖溶液控制残糖为3.5%,继续发酵至70小时终止发酵,整个发酵过程的温度控制在31℃。