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1. (WO2018099063) METHOD FOR EFFICIENTLY SECRETING AND EXPRESSING FOREIGN PROTEIN USING BACILLUS
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Pub. No.: WO/2018/099063 International Application No.: PCT/CN2017/091056
Publication Date: 07.06.2018 International Filing Date: 30.06.2017
IPC:
C12N 15/75 (2006.01)
C CHEMISTRY; METALLURGY
12
BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
N
MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
15
Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
09
Recombinant DNA-technology
63
Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
74
Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
75
for Bacillus
Applicants:
成都美溢德生物技术有限公司 CHENGDU MYTECH BIOTECH CO., LTD [CN/CN]; 中国四川省成都市 双流县籍田镇红阳村1组武圣路 Wusheng Rd., No. 1 Group, Hongyang Village, Jitian Town, Tianfu New Area Chengdu, Sichuan 610000, CN
Inventors:
任钧 REN, Jun; CN
唐旭 TANG, Xu; CN
雷蕾 LEI, Lei; CN
樊超 FAN, Chao; CN
柴进凯 CHAI, Jinkan; CN
曹付明 CAO, Fuming; CN
范佳 FAN, Jia; CN
曹镜 CAO, Jing; CN
Agent:
成都九鼎天元知识产权代理有限公司 CHENGDU JIUDINGTIANYUAN INTELLECTUAL PROPERTY AGENCY LTD.; 中国四川省成都市 洗面桥街33号艺墅花乡405 Room 405, Human. Art Wisdom Plaza 33 Ximianqiao Street Chengdu, Sichuan 610041, CN
Priority Data:
201611081187.830.11.2016CN
201611082702.430.11.2016CN
201611085518.530.11.2016CN
Title (EN) METHOD FOR EFFICIENTLY SECRETING AND EXPRESSING FOREIGN PROTEIN USING BACILLUS
(FR) PROCÉDÉ DE SÉCRÉTION ET D'EXPRESSION EFFICACES D'UNE PROTÉINE ÉTRANGÈRE À L'AIDE DE BACILLUS
(ZH) 一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法
Abstract:
(EN) Disclosed is a method for efficiently secreting and expressing a foreign protein using Bacillus, in particular comprising the steps of: (1) constructing a Bacillus strain lacking eight proteases: knocking out eight protease genes, i.e. aprE, bpr, epr, mpr, nprB, nprE, wprA and vpr, of a Bacillus expression strain to avoid degradation of a protein of interest by proteases secreted by a Bacillus subtilis expression strain after the protein of interest is secreted into a fermentation broth; (2) cloning the gene for the protein of interest, constructing an expression vector according to the requirements for an expression system, and transferring the expression vector into the Bacillus strain lacking the eight proteases to obtain an expression strain expressing the protein of interest; and (3) inducing and culturing the expression strain in step (2) to obtain the secreted protein of interest. When any protein of interest is expressed in cells in a large amount, it can be secreted out of cells through this route in a large amount, and the maximum secretion amount can reach the level of g/L.
(FR) L'invention concerne un procédé de sécrétion et d'expression efficaces d'une protéine étrangère à l'aide de Bacillus, comprenant en particulier les étapes de : (1) construction d'une souche de Bacillus dépourvue de huit protéases : inactivation de huit gènes de protéase, c'est-à-dire aprE, bpr, epr, mpr, nprB, nprE, wprA et vpr, d'une souche d'expression Bacillus pour éviter la dégradation d'une protéine d'intérêt par les protéases sécrétées par une souche d'expression Bacillus subtilis après que la protéine d'intérêt soit sécrétée dans un bouillon de fermentation ; (2) clonage du gène pour la protéine d'intérêt, construction d'un vecteur d'expression selon les exigences pour un système d'expression, et transfert du vecteur d'expression dans la souche de Bacillus dépourvue des huit protéases pour obtenir une souche d'expression exprimant la protéine d'intérêt ; et (3) induction et culture de la souche d'expression de l'étape (2) pour obtenir la protéine d'intérêt sécrétée. Lorsqu'une quelconque protéine d'intérêt est exprimée dans des cellules en grande quantité, elle peut être sécrétée hors des cellules par l'intermédiaire de cette voie en grande quantité, et la quantité de sécrétion maximale peut atteindre le niveau du g/l.
(ZH) 一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法,具体包括以下步骤:(1)构建缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌株:敲除芽孢杆菌表达菌株的aprE、bpr、epr、mpr、nprB、nprE、wprA和vpr八个蛋白酶基因,避免目的蛋白分泌到发酵液中后,被枯草芽孢表达菌株分泌的蛋白酶降解掉;(2)克隆目的蛋白基因,根据表达系统的要求构建表达载体,并将表达载体转入缺失八个蛋白酶的芽孢杆菌菌株,获得表达目的蛋白的表达菌株;(3)对步骤(2)中的表达菌株进行诱导培养,即得分泌的目的蛋白。当任一目的蛋白在细胞内大量表达,就可以通过这一途径大量分泌到细胞外,最大分泌量可以达到g/L级别。
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Publication Language: Chinese (ZH)
Filing Language: Chinese (ZH)