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1. (WO2018085955) METHOD FOR PRODUCING A SEA URCHIN EXTRACT ENRICHED WITH 1,4-POLYHYDROXYLATED NAPHTHOQUINONES WITH ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY
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UN MÉTODO PARA PRODUCIR UN EXTRACTO DE ERIZOS MARINOS ENRIQUECIDO EN 1 ,4-NAFTOQUINONAS POLIHIDROXILADAS CON ACTIVIDADES ANTIMICROBIANAS Y ANTIOXIDANTES

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención consiste en un método para obtener desde erizos de mar vivos, un extracto enriquecido en pigmentos 1 ,4-naftoqu ¡nonas polihidroxiladas, especialmente en 6-etil-2,3,5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (equinocromo A, EqA), y también espinocromo A (2-acetil-3, 5, 6, 8-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo B (2,3,5,7-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo C (2-acetil-3,5,6,7,8- pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo D (2,3, 5, 6, 8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo E (hexahidroxi-1 ,4-naftoquinona) o sus mezclas. El método comprende inducir químicamente el desove de los erizos de mar hembra y extraer las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas desde las ovas, conservando la vida del erizo marino. En este procedimiento de extracción no se utilizan ácidos ni bases, sino solamente solventes orgánicos de bajo impacto ambiental como etanol y metanol. El producto posee actividades antimicrobianas contra un amplio rango de bacterias patógenas, incluyendo cepas multirresistentes a antibióticos, por lo que tiene aplicaciones para prevenir o tratar infecciones bacterianas. Además, las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas poseen una alta actividad antioxidante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los espinocromos y los equinocromos son 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas y corresponden a pigmentos naturales que se encuentran en los erizos marinos, especialmente en sus espinas y conchas. Estos pigmentos proporcionan el color negro, verde o rojo a estos equinodermos. Adicionalmente, estos compuestos también están presentes en otras células de los erizos marinos, probablemente con un activo rol antimicrobiano y antioxidante.

Los espinocromos principales, por su abundancia y utilidad, son: espinocromo A (2-acetil-3,5,6,8-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo B (2,3,5,7-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo C (2-acetil-3,5,6,7,8- pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo D (2,3, 5, 6, 8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona) y espinocromo E (hexahidroxi-1 ,4-naftoquinona). Su distribución varía en las distintas especies de erizos marinos. En los erizos marinos Echinus esculentus, Echinus elegans, Paracentrotus lividus y Strongylocentrotus franciscanus se han identificado los espinocromos A, B, C y E. En la especie Pseudocentrotus depressus se han identificado los espinocromos A, B y D. La especie Hemicentrotus mammillatus posee los espinocromos A, B y C, mientras que Strongylocentrotus drobachiensis posee los espinocromos A, C, D y E (Anderson et al., Comp Biochem Physiol (1969), 28:333-345).

Por otra parte, en los erizos marinos de las especies Echinus esculentus, Echinus elegans, Echinus esculentus, Strongylocentrotus franciscanus, Strongylocentrotus purpuratus, Strongylocentrotus droebachiensis y Paracentrotus lividus, se encuentra el equinocromo A (EqA), que corresponde a 6-etil-2, 3, 5, 7, 8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona. Este equinocromo está presente en el fluido celómico de los erizos, en un rango de concentración de 30 a 60 μς/ιηί. Se ha descrito que el EqA se acumula dentro de gránulos en el citoplasma de las células celómicas, los que se denominan esférulas rojas. Como parte de la respuesta inmune innata de estos equinodermos, en respuesta a la presencia de partículas extrañas, las esférulas rojas secretan el EqA hacia el líquido celómico.

Es conocido en el estado del arte que las moléculas 1 ,4-naftoqu ¡nonas polihidroxiladas, además de ser pigmentos tienen propiedades antibióticas y antioxidantes. Se ha descrito que extractos de metanol enriquecidos en 1 ,4-naftoqu ¡nonas polihidroxiladas obtenidos desde la concha del erizo purpura Salmacis virgúlala, muestran una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 500 μg ml para las bacterias Salmonella typhi y Vibrio chorelae y una CMI de 125 μg ml para Proteus vulgaris y P. mirabilis. Este extracto enriquecido en 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas también posee una alta actividad antioxidante, como se explica más adelante en los ejemplos. El extracto obtenido por el método de la invención alcanza un valor EC50 de 18 μΜ, según el ensayo DPPH (un método para evaluar la actividad oxidante). Como referencia, la actividad antioxidante del ácido ascórbico en este mismo ensayo es una EC50 de 45 μΜ.

Dentro de las moléculas 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas producidas por los erizos marinos, el equinocromo A es uno de los más estudiados. Extractos de los erizos marinos Echinus esculentus o Tetrapygus niger, enriquecidos en EqA poseen una amplia actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, lo que la que convierte en una molécula con un alto interés biotecnológico y farmacológico.

En algunas especies de erizos de mar, las ovas no fecundadas poseen un alto contenido de equinocromo A y de otras 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas, mientras que en otras especies de erizos de mar las ovas poseen carotenoides en lugar de 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas.

En Tetrapygus niger, las hembras pueden volver a producir ovas un mes después del desove, en un periodo reproductivo total de 9 meses (Zamora & Stotz, Revista Chilena de Historia Natural (1993) 66:155-169). Nosotros hemos demostrado la presencia del EqA y espinocromos como, por ejemplo, los espinocromo B y E en las ovas de hembras de T. niger y es probable que estas moléculas cumplan un papel protector en la ova y el embrión. En ovas de otras especies de erizos marinos este pigmento es liberado al medio extracelular durante la exposición a un ambiente ácido (Shapiro, Journal of General Physiology (1 946) 29:267-275.}.

La actividad antioxidante de EqA ha sido empleada en la medicina para el tratamiento de infarto agudo al miocardio, enfermedades coronarias (patente US6410601 ), enfermedades inflamatorias de la retina y córnea (US6384084) y tratamiento de amiloidosis (US201 10065657), Se patentó el empleo de EqA y otras naftoquinonas polihidroxiladas como agentes antimicrobianos coloreados como suplemento para alimentos, textiles, cueros y productos agrícolas (US6159585), o como tintura para el cabello (US 4888026 A).

Las aplicaciones propuestas para el EqA y otras 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas, sugieren que estas moléculas no son citotóxicas y que poseen amplias aplicaciones farmacéuticas e industriales, por sus propiedades antioxidantes y antibióticas. Por lo tanto, es de gran interés obtener un nuevo método de obtención de estas 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas en condiciones apropiadas para la industria farmacéutica, es decir sin contaminantes que pudieran ser tóxicos y de bajo impacto ambiental para los recursos marinos.

En el estado del arte se describen distintos métodos para la producción de EqA y de los espinocromos, sin embargo, todos ellos tienen en común una extracción orgánica del equinocromo con solventes orgánicos tóxicos y en presencia de ácidos como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, utilizando como materia prima las espinas y conchas del erizo.

La presente invención describe una nueva metodología para obtener desde ovas de erizos marinos un extracto enriquecido en 6-etil-2,3,5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (equinocromo A) y otras 1 ,4-naftoqu ¡nonas polihidroxiladas, tales como 2,3,5,7-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona (espinocromo B), 2-acetil-3, 5,6,7, 8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (espinocromo C), 2,3, 5, 6,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (espinocromo D) y 2, 3, 5,6, 7, 8-hexahidroxi-1 ,4-naftoquinona (espinocromo E). El método de la invención comprende inducir químicamente el desove de los erizos de mar hembra y extraer las 1 ,4-naftoquinonas desde las ovas, utilizando solventes orgánicos no tóxicos y en ausencia de ácidos.

Dentro de los métodos conocidos para producir 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas desde erizos se encuentran:

La patente RU 2283298 C1 (10.09.2006), que describe un método para producir EqA desde erizos marinos frescos o descongelados, que comprende el lavado de las conchas y espinas con agua para remover mecánicamente las impurezas, la eliminación de las grasas con hexano o cloroformo y finalmente una extracción con un solvente orgánico que contiene un ácido inorgánico. El extracto resultante es purificado por extracción con cloroformo y sublimación al vacío a 220°C.

- La patente RU 2305548 C1 (1 0.09.2007), que protege un método para obtener el EqA desde conchas de erizo con un tratamiento con una solución acuosa alcalina y posteriormente un tratamiento con una solución alcohólica (10%) con ácido sulfúrico (30%).

La patente RU 1508535 A1 (27.08.1996), que divulga un método para la extracción del pigmento rojo del erizo de mar que utiliza una solución diluida de ácido sulfúrico en etanol, seguida por una extracción con agua/cloroformo en proporción 1 :1 v/v. Se concentra el extracto obtenido con una mezcla de 1 ,4-dioxano/hexano en una proporción 5:1 v/v. El producto resultante se lava con hexano y se seca al vacío. El rendimiento del producto deseado es de 0,05-0,06% por peso seco de materia prima.

La publicación de Mathieson & Thomson (Journal of the Chemical Society C, 153-1 60, 1 971 ) divulga un método de producción de EqA que comprende el tratamiento de la materia prima con ácido clorhídrico, la extracción del producto deseado desde los erizos de mar con éter, separándolo en derivados de sodio solubles en agua, una purificación por cromatografía en sílica gel, y una recristalización. El rendimiento del producto es de 0,01 % por peso seco de materia prima.

La patente RU 2086145 C1 (10.08.1 997) describe una metodología para la producción de un aditivo alimenticio enriquecido en EqA de erizo de mar, que consiste en el procesamiento con ácido clorhídrico 2-12% a pH 5,0-5,2, lavado, secado y molienda del producto.

La patente RU 2432956 (10.1 1 .201 1 ) divulga un método que divide el erizo de mar en 4 partes: ovas, fluido ovárico, visceras y concha. Las ovas se utilizan para recuperar las moléculas de gangliósidos y de fosfolípidos (no Eq A, ni otras 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas); mientras que las conchas y las espinas se utilizan para extraer pigmentos con ácido oxálico o con cloroformo y éter dietílico.

Todos estos métodos de extracción de EqA tienen como gran desventaja la utilización de grandes volúmenes de solventes orgánicos tóxicos, ya sean ácidos o bases concentrados, los cuales son inconvenientes para las aplicaciones alimenticias y farmacéuticas. Estas metodologías requieren procesos adicionales para eliminar los residuos alcalinos y ácidos, y las soluciones que contienen grasa. Por lo tanto, estas tecnologías son de un alto costo económico. Además, estos métodos conllevan un impacto ambiental y la necesidad de establecer medidas de repoblamiento del recurso marino. Sin embargo, ello no ocurre con la invención propuesta, ya que el erizo marino se mantiene vivo y puede devolverse a su ambiente natural.

Otro método conocido para producir específicamente la 1 ,4-naftoquinona polihidroxilada EqA es mediante síntesis química. Esta tecnología incluye compuestos intermediarios reactivos con características tóxicas, los cuales pueden co-purificar con el producto final (Pokhilo et al., Chemistry of Natural Compounds (2008) 44: 287-291 ). De este modo, la síntesis química encarece sus costos, al necesitar eliminar los intermediarios, que es una de las razones por la que las industrias de alimentos y las industrias farmacéuticas prefieren las moléculas de origen natural sobre las mismas moléculas producidas mediante síntesis química.

La nueva tecnología protegida en esta patente de invención para obtener un extracto enriquecido en 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas desde huevos de erizo de mar, reduce la generación de productos tóxicos y prescinde del uso de ácidos y bases. Adicionalmente, al mantener los erizos vivos, lo convierte en un método ecológicamente sustentable.

Esta metodología es novedosa y difiere de otros métodos conocidos para producir EqA u otras 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas. Las principales ventajas de la invención sobre los métodos conocidos son:

i) La fuente natural son ovas de erizos marinos enriquecidas en estos pigmentos (e.g., ovas del erizo negro Tetrapygus niger) y liberados por inducción química, ii) el procedimiento de extracción no utiliza ácidos tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico ni bases, y

iii) el desove por inducción química y cuidadosa manipulación permite mantener vivos a los erizos, reduciendo costos e impacto ambiental. Los erizos vivos pueden producir nuevas ovas después de 1 mes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cromatografía HPLC del extracto orgánico obtenido desde ovas de erizo marino (Tetrapygus niger), utilizando extracción con etanol (A) o etanol y ácido clorhídrico (pH 2) (B). La presencia de EqA se monitoreó a 520 nm. La fase móvil es ¡socrática con ácido fórmico 0,1 % (50%), acetonitrilo (32%) y metanol (18%) y se utilizó un flujo constante de 0,5 ml/min. El inserto de la figura ilustra el espectro de absorbancia del compuesto principal, que es similar al reportado por Kuwahara et al. (2010).

Figura 2. Análisis de Resonancia Magnética Nuclear del principal compuesto presente en el extracto orgánico de erizo marino ( Tetrapygus niger). RMN-H1 (A), RMN-C13 (B), RMN heteronuclear bidimensional HMBC (Siglas en inglés: Heteronuclear Múltiple Bond Correlation) y HMQC (Siglas en inglés: Heteronuclear Múltiple Quantum Correlation). Se incluyen el análisis que correlaciona las señales RMN con la estructura 6-etil-2,3, 5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (equinocromo A).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un nuevo método para obtener 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas de alta pureza, de modo que puede ser utilizado directamente en las industrias farmacéuticas y de alimentos.

Una primera innovación del método de la invención respecto de lo conocido en el estado del arte es la materia prima utilizada para obtener las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas. En la actualidad, las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas como el EqA se extraen principalmente de conchas y espinas de erizos. La invención propone obtener las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas desde ovas de erizos, siendo entonces la primera etapa del método inducir químicamente el desove. Al ser la materia prima ovas y no conchas o espinas, las condiciones químicas necesarias para la extracción y purificación del pigmento EqA son mucho más suaves, produciéndose un menor gasto y contaminación asociada al proceso, dado que no se emplean ácidos o bases fuertes.

Además, la manipulación para inducir el proceso de desove de los huevos de erizo de mar, que se utiliza en esta invención, permite mantener los erizos vivos, lo que posibilita la producción de más ovas por estos erizos. De este modo el procedimiento es renovable y sustentable.

Una vez obtenidas las ovas, el proceso de obtención del extracto enriquecido en 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas comprende las siguientes etapas adicionales: moler las ovas hasta obtener un polvo fino, un proceso de extracción con un solvente alcohólico, tal como etanol o metanol en ausencia de ácidos o bases, opcionalmente una separación y/o concentración del extracto alcohólico y en caso necesario una purificación final por cromatografía líquida con columna de fase reversa. Si se realizan todas estas etapas, el rendimiento del producto EqA es de -0,2% por peso seco de materia prima, con una pureza de -98%.

En términos generales, la invención se refiere a un método para obtener 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas desde erizos de mar vivos, que comprende las siguientes etapas:

a) inyectar una solución salina en el celoma perivisceral de erizos de mar hembra para inducir el desove;

b) recolectar las ovas, y molerlas hasta obtener un polvo fino;

c) mezclar dicho polvo fino con un solvente alcohólico;

d) separar el sobrenadante alcohólico que comprende las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas en solución.

Opcionalmente comprende concentrar, separar y/o purificar desde el sobrenadante alcohólico obtenido en la etapa d) las moléculas 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas. En una realización el sobrenadante alcohólico es precipitado utilizando otro solvente orgánico, o sometido a evaporación, por ejemplo al vacío; y los cristales son resuspendidos en etanol para obtener 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas con alto grado de pureza. En una realización, el sobrenadante alcohólico es concentrado por evaporación y purificado por HPLC. En otra realización, el sobrenadante alcohólico es concentrado por evaporación al vacío, los cristales obtenidos son resuspendidos en etanol y purificado por HPLC.

Donde la sal KCI utilizada en la etapa a) está en un rango de concentración entre 0,1 M a 2 M, y en un volumen entre 0,1 a 2 mL.

Para moler las ovas, según lo indicado en la etapa b) estas opcionalmente se congelan o se secan. El solvente alcohólico de la etapa c) se selecciona preferentemente entre metanol, etanol o sus mezclas.

Se purifican las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas equinocromo A (6-etil-2,3, 5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo A (2-acetil-3,5,6,8-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo B (2,3, 5, 7-tetrahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo C (2-acetil-3,5,6,7,8- pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo D (2,3,5,6,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona), espinocromo E (hexahidroxi-1 ,4-naftoquinona) o sus mezclas.

El proceso de la invención comienza con el desove, el que se induce por inyección de KCI (0,5 M) en el celoma perivisceral. Las hembras de erizo inducidas, son depositadas sobre un recipiente de diámetro menor al de ésta, el cual contiene agua de mar filtrada y estéril, en donde se reciben las ovas. Las ovas recogidas se filtran, preferentemente usando un tamiz fino de 1 /32 pulgadas (0,079375 centímetros) de tamaño de poro para eliminar las impurezas. Posteriormente se lava con agua de mar filtrada y estéril. El exceso de agua se elimina posteriormente por decantación de las ovas. Luego las ovas son secadas a 60-80 °C por 24-72 horas, y son molidas hasta obtener un polvo fino, el cual es limpiado al pasarlo por un tamiz de 1 /120 pulgada (0,021 centímetros) de tamaño de poro. Luego se extrae el producto mezclando el polvo con metanol o etanol en una proporción 1 :30 v/v en agitación constante. Se filtra adicionalmente para eliminar los residuos de huevos y se evapora al vacío a 55s C hasta 1/10 del volumen inicial. El extracto resultante se purifica por cromatografía con columna RP-C18, elución con metanol 30-40% para extraer principalmente espinocromo E, y finalmente una elución con etanol 100% para la extracción de EqA. El extracto resultante posee equinocromo A con una pureza de 99%. Finalmente el producto es guardado a -20°C donde mantiene una alta estabilidad durante meses.

La presente invención en una realización preferida permite obtener 6-etil-2,3,5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (equinocromo A) desde ovas de erizo de mar, especialmente desde erizo marino negro (Tetrapygus niger) desovadas por inducción química, seguida por una extracción con etanol o metanol sin ácidos ni bases. Dadas sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes el EqA obtenido puede ser utilizado en la acuicultura, en el procesamiento de pescado, la industria alimenticia y médica, la medicina veterinaria y la cosmetología. Además, puede ser aplicado sobre superficies inertes, para proporcionarle propiedades antimicrobianas.

Con el objeto de probar la actividad antibiótica de estos compuestos los inventores estudiaron la actividad antibacteriana, medida como concentración mínima inhibitoria (CMI), del extracto de erizo marino negro (Tetrapygus niger) enriquecido en equinocromo A (85% pureza) y el EqA purificado (99% pureza) contra diversas cepas bacterianas patógenas de origen clínico, cuyos resultados se muestran en la Tabla 1 .

Los resultados muestran que el extracto, que comprende mezcla de 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas tiene mejor actividad antibiótica que EqA puro, no obstante tanto el extracto como EqA muestran buenos resultados frente a cepas resistentes a antibióticos convencionales.

Tabla 1. Actividad antimicrobiana del extracto de erizo de mar Tetrapygus niger enriquecido en equinocromo A (85% pureza) y del EqA (99% pureza) contra diversas cepas patógenas


CMI, concentración mínima inhibitoria.

Como hemos indicado, las 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas de erizo de mar, tal como EqA, poseen una alta actividad antioxidante, que se demostró mediante el ensayo de captura del radical DPPH (2,2-difenil-1 -picrilhidrazilo). La actividad antioxidante del EqA, que fue observada en el ensayo DPPH realizado por los autores de esta invención, fue

mayor a las actividades antioxidantes de -tocoferol y ácido ascórbico, ambos compuestos reconocidos por su actividad antioxidante. La actividad antioxidante de EqA es dependiente de la concentración del pigmento, del pH y de la concentración de calcio. En ausencia de calcio, la actividad antioxidante se observa sólo a pH alcalino, pero en presencia de calcio, la actividad antioxidante se observa a pH alcalino y pH neutro, por la formación de complejos estables semiquinona-calcio (Levedeb et al., Archives of Biochemistry and Biophysics (2003) 413: 191 -198). La invención se ilustra en los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

En el presente método, erizos de mar hembra (erizo negro Tetrapygus niger) son inducidas a desovar por la inyección de 0,1 -1 ,0 mi of KCI (0,5 M) entre los dientes y la dura concha externa. Para la liberación de las ovas rojas, el erizo es colocado boca arriba sobre un vaso precipitado o algún otro recipiente de diámetro menor al del erizo, el cual contiene agua de mar filtrada y estéril. Las ovas colectadas al fondo del recipiente son lavadas de impurezas sólidas con agua de mar filtrada y estéril, y por filtración a través de un tamiz metálico de 1/32 pulgadas (0,079375 cm) de tamaño de poro hasta que todas las impurezas sólidas hayan sido removidas. Las ovas son decantadas para remover el exceso de agua, previo a su procesamiento o almacenamiento a -20°C. Las ovas son secadas a 60-80°C, molidas y filtradas por un tamiz de 1 /120 pulgadas (0,021 cm) de tamaño de poro. Cincuenta mi de ovas son vertidos sobre 1500 mi de etanol o metanol e incubados a temperatura ambiente en agitación constante por 24 - 48 horas. El extracto es colectado y la materia prima es re-extraída en metanol hasta que no se observa más color rojo.

Los extractos se mezclan, se concentran a 55°C en vacío hasta obtener 1 /1 0 del volumen inicial. La purificación se realiza mediante HPLC con una columna RP-C1 8, lavado con metanol 30% - 40% para eluir espinocromo E u otros pigmentos, y finalmente eluir el EqA con etanol 100%. El espectro se muestra en la Figura 1 A.

Ejemplo 2

Se extraen 108 gramos (peso húmedo) de huevos de erizo marino (erizo negro Tetrapygus niger) y se incuban con 3 litros de metanol. Se hacen 6 extracciones hasta

que el extracto no muestra color rojo. Se concentran los extractos con rotavapor hasta un volumen de 150 mi. Se agrega agua hasta un volumen final de 400 mi y luego se realiza una cromatografía del extracto por una columna C18, previamente equilibrada con agua. Se realizan eluciones con metanol 10%, metanol 30% y metanol 40%, eluyendo espinocromo E u otros pigmentos de menor grado de hidrofobicidad que el EqA. Luego, el EqA retenido en la columna se eluye con etanol o metanol (1 00%), presentando una alta pureza (>90%).

Ejemplo 3

Cincuenta mi de ovas frescas o congeladas y lavadas, son vertidos sobre 1500 mi de metanol, para luego ser procesados y extraídos como fue descrito en el Ejemplo 1 .

Ejemplo 4

El producto obtenido del Ejemplo 1 o Ejemplo 3, es precipitado utilizando otro solvente orgánico, o sometido a evaporación. Finalmente los cristales son resuspendidos en etanol para obtener equinocromo A con una alta pureza (>99%).

La concentración de EqA en etanol fue cuantificada a 341 nm, considerando su coeficiente de extinción molar de 10650 (M~1 x cnr1). Las muestras se diluyeron hasta obtener lecturas entre 0,2 y 1 ,0 unidades de absorbancia. Las lecturas se realizaron en triplicado. La pureza del producto se determinó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector de arreglo de diodos (DAD). Se utilizó una columna RP-C1 8 (250 mm χ 4,6 mm, 3,5 μιη). La presencia de EqA se monitoreó a una longitud de onda de 520 nm. Se utilizó un flujo de 0,5 mL/min, con una temperatura de horno de 25°C. La fase móvil consistió de una mezcla de 50% ácido fórmico 0,1 % (solución A), 32% acetonitrilo (solución B) y 18% metanol (solución C). En estas condiciones el EqA tuvo un tiempo de retención de 10,6 minutos. Este producto se identificó por su espectro de absorbancia con 2 máximos de absorción a 341 y 468 nm, como lo descrito por Kuwahara et al. (2010). Alternativamente, se utilizó a un flujo constante de 0,5 ml/min el siguiente gradiente: 0-3 min, solución A (95%), solución C (5%); 3-7 min, solución A (75%), solución B (1 0%), solución C (15%); 7-15 min solución B (30% ), solución C (70%); 1 5-18 min, solución C (100 %); 20 min, solución A (95%), sol solución C (5%). En estas condiciones el EqA tuvo un tiempo de retención de 14,8 min.

La masa del EqA purificado se determinó mediante MALDI-TOF analizando el ion positivo que posee una masa m/z 267 [M-H+], deduciendo una masa de 266 u.m.a. Este valor se corresponde con el reportado por Kuwahara et al. (2010). El análisis por resonancia magnética nuclear de protones, carbono 13, y análisis bidimensional de correlación heteronuclear HMBC (siglas en inglés: Heteronuclear Múltiple Bond Correlation) y HMQC (siglas en inglés: Heteronuclear Múltiple Quantum Correlation) confirman la estructura del equinocromo A como 6-etil- 2,3,5,7,8-pentahidroxi-1 ,4-naftoquinona (Figura 2).

En extracto contiene EqA (85-90%) y otro compuesto (10%) que tiene en el cromatograma HPLC un tiempo de retención de 6 min (Figura 1 A). Este compuesto posee un espectro de absorbancia con dos máximos a 353 nm y 478 nm, que corresponden a los valores reportados para espinocromo E (hexahidroxi-1 -4-naftoquinona). El análisis por espectrometría de masa mediante MALDI-TOF de este compuesto indica un ion positivo de masa m/z 255 [M-H+], lo que permite deducir una masa de 254 u.m.a., que corresponde a la masa molecular del espinocromo E. Por consiguiente, se concluye que el extracto de ovas de erizo de mar de la invención contiene espinocromo E.

El extracto de ovas de erizo de mar negro ( Tetrapygus niger) posee actividad antimicrobiana contra diversas cepas bacterianas patógenas, incluyendo algunas cepas multirresistentes a antibióticos, con una concentración inhibitoria mínima en un rango de 4-64 μg/ml (Tabla 1 ), donde la máxima actividad se encuentra a pH ácidos. El EqA purificado de este extracto que contiene EqA (85%) posee una actividad antibiótica con una concentración inhibitoria mínima entre 8 y 64 μg/ml (Tabla 1 ) sobre bacterias patógenas multirresistentes a antibióticos. Este resultado sugiere que la actividad antibiótica del extracto se debe principalmente a la presencia del EqA.

La actividad antioxidante del extracto y del equinocromo A purificado se evaluó por el ensayo de captura del radical DPPH (2, 2- difenil-1 -picryihidracil) (Shankarlal et al., (201 1 ) Am-Euras. J. Sci. Res. 6:178-181 ). La ECso de extracto de equinocromo A (85% EqA) para este ensayo fue de 18 μΜ y la EC50 del equinocromo A puro (99% pureza) fue de 13 μΜ. En estas condiciones la EC50 de -tocoferol es 1 00 μΜ y de ácido ascórbico es 45 μΜ, indicando una mayor actividad antioxidante de EqA puro frente a estos conocidos

antioxidantes. Esto resultados también sugieren que el EqA posee la principal actividad antioxidante del extracto de la invención.

Ejemplo 5

De modo de comparar el método de la invención respecto del método tradicional, se realizó una extracción desde las ovas ajustando el pH a 2 con ácido clorhídrico.

Para lo cual a 50 mi de ovas se agrega HCI hasta alcanzar un pH 2, posteriormente las ovas acidificadas son vertidas sobre 1500 mi de etanol o metanol e incubadas a temperatura ambiente en agitación constante por 24-48 horas. El extracto es colectado y la materia prima es re-extraída en metanol hasta que no se observa más color rojo.

Los extractos se mezclan, se concentran a 55°C en vacío hasta obtener 1 /10 del volumen inicial. La purificación se realiza mediante HPLC con una columna RP-C1 8, lavado con metanol 30%-40% para eluir espinocromo E u otros pigmentos, y finalmente eluir el EqA con etanol 100%. El espectro de este ejemplo comparativo se muestra en la Figura 1 B.

La extracción con etanol y ácido clorhídrico y la extracción con etanol sin ácido clorhídrico, permiten obtener el mismo producto final (Figura 1 A y 1 B), que corresponde a equinocromo A. El espectro de absorbancia y el espectro de masas del producto corresponden a los espectros de absorbancia y de masas de EqA (Kuwahara et al. LWT-Food Science and Technology (2010) 43:1 185-1 190). Esto es esperable ya que en el método tradicional se utiliza el ácido clorhídrico para disolver la estructura calcárea de conchas y espinas de erizo, que son la materia prima de dicho método tradicional. Sin embargo, debido a que los huevos de erizos no poseen estructura calcárea, al comparar la extracción con HCI o tradicional con el método de la invención , comprobamos que no hay diferencias en el perfil de moléculas eluidas con ambos métodos.

De este modo, la invención permite obtener 1 ,4-naftoquinonas polihidroxiladas sin residuos de ácido clorhídrico, ni de ningún otro ácido o base fuerte, dado que no se utiliza en su extracción.