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1. (WO2018054964) SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD AND ASSOCIATED PROBES
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Pub. No.: WO/2018/054964 International Application No.: PCT/EP2017/073759
Publication Date: 29.03.2018 International Filing Date: 20.09.2017
IPC:
C12Q 1/68
Applicants: BASE4 INNOVATION LIMITED[GB/GB]; Broers Building JJ Thomson Avenue Cambridge Cambridgeshire CB3 0FA, GB
Inventors: BALMFORTH, Barnaby; GB
FRAYLING, Cameron Alexander; GB
Agent: BRISCOE, Paul Brian; GB
Priority Data:
1618920.109.11.2016GB
16189791.320.09.2016EP
Title (EN) SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD AND ASSOCIATED PROBES
(FR) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE MONONUCLÉOTIDES ET SONDES ASSOCIÉES
Abstract:
(EN) A method of sequencing a nucleic acid is provided. It is characterised by the steps of (1) generating a stream of single nucleoside triphosphates by progressive enzymatic digestion of the nucleic acid; (2) producing at least one substantially double-stranded primary oligonucleotide used probe by reacting, in the presence of a polymerase and a ligase, at least one of the single nucleoside triphosphates with a corresponding primary probe comprising (a) a first single- stranded oligonucleotide including a first restriction endonuclease nicking-site, a single nucleotide capture site for capturing the single nucleoside triphosphate and oligonucleotide flanking regions juxtaposed either side of the capture site and (b) second and third single-stranded oligonucleotides capable of hybridising to the first oligonucleotide flanking regions; (3) nicking the first oligonucleotide strand of the used primary probe at the first nicking-site with a first nicking restriction endonuclease to create separate first oligonucleotide components; (4) separating the first oligonucleotide components generated in step (3) from the complementary strand of the used probe; (5) producing at least one substantially double-stranded secondary used probe by reacting, in the presence of a ligase, at least one of the separated first oligonucleotide components with a corresponding secondary probe comprising (c) a complementary fourth oligonucleotide including a second restriction endonuclease nicking-site and bearing fluorophores in a substantially undetectable state and optionally (d) a single-stranded fifth oligonucleotide at least in part complementary to the fourth oligonucleotide; (6) nicking the fourth oligonucleotide strand of the used secondary probe with a second nicking restriction endonuclease to create separate fourth oligonucleotide components at least some of which bear fluorophores in a detectable state and a single-stranded sixth oligonucleotide which is at least in part the sequence complement of the fourth oligonucleotide and (7) detecting the fluorophores released in step (6).
(FR) La présente invention concerne un procédé de séquençage d'un acide nucléique. Ce procédé est caractérisé par les étapes consistant à (1) générer un flux de mononucléosides triphosphates par digestion enzymatique progressive de l'acide nucléique ; à (2) produire au moins une sonde utilisée oligonucléotidique primaire sensiblement double brin en faisant réagir, en présence d'une polymérase et d'une ligase, au moins l'un des mononucléosides triphosphates avec une sonde primaire correspondante comprenant (a) un premier oligonucléotide simple brin comprenant un premier site de coupure d'endonucléase de restriction, un site de capture de mononucléotide servant à capturer le mononucléoside triphosphate et des régions encadrantes oligonucléotidiques juxtaposées de part et d'autre du site de capture et (b) des deuxième et troisième oligonucléotides simple brin capables de s'hybrider aux premières régions encadrantes oligonucléotidiques ; à (3) couper le premier brin oligonucléotidique de la sonde primaire utilisée au niveau du premier site de coupure au moyen d'une première endonucléase de restriction de coupure pour créer des premiers constituants oligonucléotidiques séparés ; à (4) séparer les premiers constituants oligonucléotidiques produits lors de l'étape (3) du brin complémentaire de la sonde utilisée ; à (5) produire au moins une sonde utilisée secondaire sensiblement double brin en faisant réagir, en présence d'une ligase, au moins l'un des premiers constituants oligonucléotidiques séparés avec une sonde secondaire correspondante comprenant (c) un quatrième oligonucléotide complémentaire comportant un second site de coupure d'endonucléase de restriction et portant des fluorophores dans un état sensiblement indétectable et éventuellement (d) un cinquième oligonucléotide simple brin au moins en partie complémentaire du quatrième oligonucléotide ; à (6) couper le quatrième brin d'oligonucléotide de la sonde secondaire utilisée au moyen d'une seconde endonucléase de restriction de coupure pour produire des quatrièmes constituants oligonucléotidiques séparés dont au moins certains portent des fluorophores dans un état détectable et un sixième oligonucléotide simple brin qui est au moins en partie le complément de séquence du quatrième oligonucléotide et à (7) détecter les fluorophores libérés à l'étape (6).
Designated States: AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DJ, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JO, JP, KE, KG, KH, KN, KP, KR, KW, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW
African Regional Intellectual Property Organization (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Eurasian Patent Office (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM)
European Patent Office (EPO) (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
African Intellectual Property Organization (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG)
Publication Language: English (EN)
Filing Language: English (EN)