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1. (WO2018042019) EUKARYOTIC ADULT CELLS COMPRISING A TRANSFECTION SYSTEM AND THE PRODUCTION AND USE THEREOF
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Eukaryotische adulte Zellen umfassend ein Transfektionssystem und deren Herstellung und Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein

Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen und mindestens eine Nukleinsäure, umfasst.

Die Transplantation von Stammzellen für die Wiederherstellung von beschädigtem Gewebe stellt einen vielversprechenden Ansatz in der regenerativen Medizin dar. Adulte Stammzellen tragen hierfür ein großes Potential in sich, da sie leicht von einem Probanden oder einem gesunden Spender zugänglich sind, ohne dass sich ethische Konflikte ergäben. Unter den adulten Stammzellen erweisen sich insbesondere Stammzellen, welche das hoch konservierte Transmembran-CD133-Antigen aufweisen (Prominin-1 ), als geeignet, in hämatopoietische, endotheliale, myogene und neurogene Zelllinien auszudifferenzieren, und diverse unterstützende parakrine Faktoren freizusetzen. Allerdings erweist sich die klinische Anwendung von Stammzellen aufgrund verschiedener Faktoren als problematisch: Zum einen erfolgt bei Einbringung in das zu behandelnde Organ eine starke Abwanderung, d.h. die Retention der Stammzellen im zu behandelnden Organ ist sehr gering. Beispielsweise weisen stark perfundierte Organe wie die Leber oder das Herz einen Verlust an

transplantierten Zellen von 90 bis 99 % bereits während der ersten 1 bis 2 Stunden nach Einbringung auf, völlig unabhängig von der Art der Zellen und der Art der Einbringung.

Insbesondere die Retention im zu behandelnden Organ ist ein fundamentales Kriterium für eine effektive Therapie. Des Weiteren tritt ein massiver Zelltod der Stammzellen bei Einbringung in das zu behandelnde Organ auf, der durch die feindliche Umgebung im zu behandelnden Organ bedingt ist.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand daher in der

Bereitstellung von Zellen, welche bei Einbringung in ein zu behandelndes Organ eine höhere Überlebensrate und eine höhere Retention aufweisen.

Überraschend wurde nun gefunden, dass solche Zellen bereitgestellt werden können, in dem in adulte multipotente Stammzellen mittels eines Transfektionssystems Nukelinsäuren, insbesondere microRNA, eingebracht wird.

Eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem

Die vorliegende Erfindung betrifft daher eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein

Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

Das Transfektionssystem ist schematisch in Abb. 1 dargestellt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die eukaryotischen adulten Zellen aus adulten, multipotenten Stammzellen, bevorzugt aus adulten, multipotenten CD133+-Stammzellen, erhalten, bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten Stammzellen, weiter bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133+-Stammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die„eukaryotische adulte Zelle" kann synonym auch als„Derivat einer adulten, multipotenten Stammzelle" bezeichnet werden, welches durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten

Stammzellen, weiter bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133+-Stammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten ist. Das„in-Kontakt-bringen" kann synonym auch als Anwendung des Transfektionssystems auf die adulte, multipotente Stammzelle bezeichnet werden. Aufgrund der Veränderungen, die gegebenenfalls durch das Einbringen des Transfektionssystems, insbesondere durch die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), in der adulten, multipotenten Stammzelle, bzw. in der adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, verursacht werden, kann die„eukaryotische adulte Zelle" im Rahmen der vorliegenden Erfindung selbst noch eine adulte, multipotente Stammzelle sein, kann aber auch eine ausdifferenzierte oder in Ausdifferenzierung befindliche Zelle sein.

Bezüglich der adulten multipotenten Stammzelle, welche als Ausgangspunkt für die eukaryotische adulte Zelle dient, existieren grundsätzlich keine Beschränkungen. Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die adulten multipotenten Stammzellen stammen von Probanden, deren schriftliches

Einverständnis zur Entnahme vorlag. Sie werden der jeweiligen Quelle, d.h. dem

Knochenmark oder dem Blut, bevorzugt dem Knochenmark, entnommen und aus der entnommenen Probe anhand des vorhandenen CD133+-Oberflächenmarkers isoliert.

Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA oder anti-microRNA, wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch.

Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus

dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Hämatopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23

Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer

entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits

vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion.

Das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform bilden das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) und die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), bevorzugt die microRNA, einen Komplex, einen so genannten Polyplex, miteinander, d.h. die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wird in das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen eingelagert. Die Aminogruppen des kationischen Polymers aufweisend Aminogruppen gemäß (i) sind zumindest teilweise biotinyliert, wobei Der Biotinylierungsgrad im .Bereich von 0,1 bis 10 mmol Biotin/mmol PEI, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol Biotin/mmol PEI, weiter bevorzugt im Bereich von 1 ,0 bis 2,0 mmol Biotin/mmol PEI liegt (bestimmt mittels HABA-Assay).

Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische

Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. In einer Ausgestaltung bilden jeweils zwei oder mehr der magnetischen Nanopartikel miteinander sogenannte Partikelkomplexe, welche wiederum eine annähernd sphärische Gestalt und einen Durchmesser im Bereich von 10 bis 1000 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 20 bis 800 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 100 bis 200 nm aufweisen. Die magnetischen Nanopartikel weisen zumindest teilweise daran gebundene Streptavidin-Moleküle auf, wobei zumindest teilweise bedeutet, dass mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, weiter bevorzugt mindestens 90 % der magnetische Nanopartikel daran gebundene Streptavidin-Moleküle aufweisen. Die Streptavidin-Molekühle dienen aufgrund der Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung der Bindungsbildung zwischen kationischem

Polymer und magnetischen Nanopartikeln.

Pharmazeutische Zusammensetzung

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

Hinsichtlich der pharmazeutischen Zusammensetzung ist die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem

Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die adulte multipotente Stammzelle ist bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte

multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der

Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-

Stammzellen, geeignet, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem

zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

Die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische

Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, umfassend

(a) Bereitstellen von adulten multipotenten Stammzellen, bevorzugt von adulten

multipotenten CD133+-Stammzellen,

(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche

zumindest teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin- Molekülen,

(ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

Das„Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen" kann auch aus „Verfahren zur Nukleinsäure-basierten Manipulation von adulten multipotenten Stammzellen" bezeichnet werden. Die„Zugabe eines Transfektionssystems" gemäß (b) kann auch als „Anwendung eines Transfektionssystems" bezeichnet werden. Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der

Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch antientzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der

Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23

Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer

entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits

vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem

zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt

magnetische Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung dient das beschriebene Verfahren der Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem wie eingangs unter „eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem" beschrieben.

In einer beispielhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen wird verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 25 kDA biotinyliert und chromatographisch

aufgereinigt. Der Grad der Biotinylierung beträgt im Bereich von 1 bis 10, bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 mmol Biotin/mml PEI. Für die Ausbildung von Polypiexen werden Nukleinsäure, insbesondere microRNA und biotinyliertes PEI in einer wässrigen Lösung, die bevorzugt Glukose, weiter bevorzugt 0,1 bis 50 Gewichts-% Glukose, weiter bevorzugt 1 bis 10 Gewichts-% Glukose, enthält, gelöst und für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Magnetische Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes

Streptavidin aufweisen, werden mit den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt werden die magnetischen Nanopartikel zuvor mit Ultraschall behandelt, weiter bevorzugt in einem Ultraschallbad inkubiert, um gegebenenfalls gebildete Cluster aufzulösen. Die Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI wird für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt 15 min bis 24 Stunden, weiter bevorzugt 20 bis 120 Minuten, bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Adulte multipotente

Stammzellen, bevorzugt adulte multipotente CD133+-Stammzellen werden in einem geeigneten Gefäß, beispielsweise einer Zellkulturplatte mit der Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt erfolgt eine Inkubation bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 50 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 45 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 30 bis 40 °C für einen ausreichend lange Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt von 1 Stunde bis 48 Stunden, weiter bevorzugt von 10 bis 24 Stunden, in Gegenwart eines Nährmediums (z.B. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium), welches bevorzugt Antibiotika (beispielsweise

Penicilin/Streptomycon) oder fetales Kälberserum, weiter bevorzugt Antibiotika und fetales Kälberserum, enthält.

Die Erfindung betrifft ebenso eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein

Transfektionssystem, erhalten oder erhältlich durch das beschriebene Verfahren.

Herstellung von Gewebe

Die Erfindung betrifft weiterhin eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein

Transfektionssystem, welches

i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,

(ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst, zur Verwendung bei der Herstellung von Gewebe, bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe. Bevorzugt ist die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte

multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA

(Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der

Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion.

Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden einhergehen

Die Erfindung betrifft weiterhin eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein

Transfektionssystem, welches

i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,

(ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit

Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel. Die eukaryotische adulte Zelle ist erhalten oder erhältlich aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die adulte multipotente Stammzelle ist bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-

codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der

Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch antientzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der

Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23

Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer

entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits

vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzug von microRNA in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt

Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische

Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

Herstellung von Gewebe

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Gewebe, bevorzugt zur in vitro Herstellung von Gewebe, umfassend

(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder

Skelettmuskelgewebe,

(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein

Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem wie oben beschrieben oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren wie oben beschrieben, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Gewebe weiterhin

(C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsformen und Kombinationen von Ausführungsformen, die sich aus den entsprechenden Rückbezügen und Verweisen ergeben, näher illustriert:

1 . Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, wobei das

Transfektionssystem

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

2. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 1 , wobei die eukaryotische

adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.

3. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 2, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.

4. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 3, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA,

bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.

Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 4, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.

Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe304-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 8, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 9, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente

Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 9 oder 10, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, ist.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 1 1 , wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 9 bis 12, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt

Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 9 bis 13, wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein

Transfektionssystem umfassen, umfassend

(b) Bereitstellen von adulten multipotenten Stammzellen, bevorzugt von adulten

multipotenten CD133+-Stammzellen,

(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst.

Verfahren gemäß Ausführungsform 15, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte

multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.

Verfahren gemäß Ausführungsform 15 oder 16, wobei die mindestens eine

Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid- DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.

Verfahren gemäß Ausführungsform 17, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.

Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 18, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur

Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anto- microRNA, weiter bevorzugt von micro-RNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter

bevorzugt verzweigtes oder un verzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 19, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten

Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis

10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 20 zur Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7.

Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 20.

Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches

i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,

(ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst, zur Verwendung bei der Herstellung von Gewebe, bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von

Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 23, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 24, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 23 bis 25, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.

Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches

i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest

teilweise biotinyliert sind,

(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,

(ii) mindestens eine Nukleinsäure,

umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit

Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 27, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 28, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 29, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 30, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.

Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 31 , wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt

Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.

33. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 32, wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische

Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.

34. Verfahren zur Herstellung von Gewebe, bevorzugt zur in vitro Herstellung von Gewebe, umfassend

(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder

Skelettmuskelgewebe,

(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein

Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7 oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß einer der

Ausführungsformen 15 bis 20, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

35. Verfahren zur Herstellung von Gewebe gemäß Ausführungsform 34, umfassend

(C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt schematisch die Struktur eines Transfektionssystems (PEI:

Polyethylenimin; MNP: magnetische Nanopartikel; miR: microRNA);

Abb. 2 zeigt die Boolean-Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der Zellviabilität und der Oberflächenmarkerintegrität (SSC:

Seitwärtsstreulicht, Side Scatter);

Abb. 3 zeigt die Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der

Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität von Transfektionskomplexen; Abb.4 zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133+-Zellen bei Verwendung

verschiedener miR/PEI-Komplexe;

Abb. 5 zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133+-Zellen bei

Verwendung verschiedener miR/PEI/MNP-Komplexe;

Abb. 6 zeigt die magnetische Zielführung transfizierter CD133+-Zellen

Abb. 7 zeigt die intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen;

Abb. 8 zeigt die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität nach Transfektion;

Abb. 9 zeigt die hämatopoetische Differenzierungsfähigkeit von Zellen nach der

Transfektion.

Die vorliegende Erfindung wurde durch die folgenden Beispiele näher illustriert.

[Beispiele

1. Material und Methoden

1.1 Knochenmarksproben

Knochenmark wurde von aufgeklärten Patienten, die ihre schriftliche Einwilligung zur Verwendung ihrer Proben für Forschungszwecke nach der Deklaration von Helsinki gegeben haben, verwendet. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Universität Rostock 2010 genehmigt erneuert2015) (Registrierungsnummer A 2010 23). Sternales Knochenmark wurde von Patienten entnommen während sie sich einer Koronararterien-Bypassoperation am Institut der Herzchirurgie (Universitätsklinikum Rostock, Deutschland) unterzogen. Um die Koagulationen des Knochenmarks zu

verhindern wurde eine Heparin-Natrium-Lösung (250 i.E./ml Knochenmark) (Rathiopharm GmbH, Deutschland) verwendet.

Isolation von CD133+ Zellen

Mononukleare Zellen wurden durch eine Dichtegradientenzentrifugation aus dem Knochenmark isoliert. CD133+ Zellen wurden durch magnetbasierte Zellsortierung (MACS®) unter Verwendung des CD133 MicroBead Kits (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers angereichert. Für nachfolgende Experimente wurden nur CD133+ Zellfraktionen die eine Viabilitat und eine Reinheit von > 80% aufwiesen verwendet.

[Bestimmung der Viabilität und der Reinheit von CD133+ Zellen

Die Viabilität und die Oberflächenmarkerexpression wurden mittels

Durchflusszytometne 0 h und 18 h nach der Zellisolation analysiert. Für die Färbung wurden die Proben mit folgenden Antikörpern behandelt: anti-CD34-FITC (Klon: AC136), anti-CD133/2-PE (Klon: 293C3), Isotypkontrolle Maus IgG 2b-PE (Miltenyi Biotec GmbH), anti-CD45-APC-H7 (Klon: 2D1 ) und 7-AAD (BD Biosciences, Deutschland). Um unspezifische Bindungen zu vermeiden wurde den Proben zusätzlich FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec GmbH) hinzugefügt. Nach einer 10- minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Proben mit dem LSR-II

Durchflusszytometer (BD Biosciences) gemessen und mit Hilfe der FACSDiva Software (BD Bioscience) analysiert. Für die Evaluation wurde die Boolean-Gating- Strategie nach der ISHAGE-Richtlinie für CD34+ Zellanalysen [Sutherland, D. R., Anderson, L, Keeney, M., Nayar, R., and Chin-Yee, I. 1996. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of

Hematotherapy and Graft Engineering. Journal of hematotherapy 5, 3, 213-226] wie folgt angeordnet:

1 . Schritt: Selektion der Zellpopulation (Abb. 2A)

2. Schritt: Selektion von CD45+ Zellen (Abb. 2B)

3. Schritt: Selektion von viablen CD45+ Zellen (Abb. 2C)

4. Schritt: Selektion von viablen CD45VCD34+ Zellen (Abb. 2D)

5. Schritt: Selektion von viablen CD45VCD34VCD133+ Zellen (Abb. 2E)

Die Berechnung der Zellviabilität und der Reinheit erfolgte nach folgenden

Gleichungen:

viable CD45+ Zellen

Viabilität [%] = „n i r.± ^ ,, x 100

L J CD45+ Zellen

viable CD45+ / CD34+ /CD133+ Zellen

Reinheit [%] = , , ^ ,, x 100

L J viable CD45+ Zellen

Präparation der Polyplexe und Transfektion

Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für die Bestimmung der Aufnahmeeffizienz, der Zytotoxizität und für das magnetische Targeting verwendet. Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für durchflusszytometrische Kontrollen, die Analyse der Oberflachenmarkerexpression, die intrazelluläre Visualisierung der Komplexe und zur Untersuchung des hämatopoetischen Differenzierungspotenzials (CFU-Assay) verwendet.

Verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 25 kDA (Sigma-Aldrich, USA) wurde biotinyliert unter Verwendung des EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotins (Thermo Fisher Scientific GmbH, Germany) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor von unsere Gruppe beschrieben [Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kuhn, J.-P., Rimmbach, C, Steinhoff, G., and David, R. 2016. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine]. Die finale Konzentration der Aminogruppen wurde mit Hilfe der Ninhydrin-Methode (2 %ige Ninhydrin Reagent, Sigma-Aldrich) gemessen und ein Biotinylierungsgrad von 1 ,585 ± 0,018 mmol Biotin/mmol PEI mit Hilfe des HABA Assays unter

Verwendung des Pierce Biotin Quantitation Kits (Thermo Fisher Scientific GmbH) bestimmt.

Um größere Aggregate und Partikel zu entfernen wurden die Streptavidin

MagneSphere® Paramagnetic Particles (Promega Corporation, USA) durch 0,45 μηη Millex-HV PVDF Syringe Filter Units (EMD Millipore Corporation, USA) gefiltert. Das biotinylierte PEI und die gefilterten Magnetpartikel (MNPs) wurden bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert.

Für die Bildung der Polyplexe wurden die entsprechenden Mengen an microRNA (Pre-miR Negative Control #1 ; entsprechend der Versuchsanordnung mit Cy3 markiert (Ambion, USA)) und PEI in gleichen Volumina in 5 %iger Glukoselösung (MP Biomedicals, Deutschland) verdünnt. Dabei wurden verschiedene Verhältnisse von Stickstoff (PEI) zu Phosphat (miR) (N/P Verhältnis) getestet. Nach Vereinigung beider Proben und intensiver Durchmischung wurde die microRNA PEI-Lösung 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.

Für die Bildung magnetischer Polyplexe wurden die MNPs vor jeder Anwendung für 20 min im Ultraschallbad inkubiert, um geformte Aggregate zu beseitigen.

Anschließend wurden die MNPs mit den zuvor präparierten microRNA/PEI-Komplexen in verschiedenen Konzentrationen gemischt und für 30 min bei RT inkubiert.

Für die Transfektion wurden 5x104 frisch isolierte CD133+ Zellen in ein Well einer 24er Wellplatte ausgesät und es erfolgte die sofortige Zugabe der zuvor präparierten miR/PEI- oder miR/PEI/MNP-Komplexe. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 37 °C und 5 % C02 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Pan Biotech GmbH, Deutschland) dem 1 % Penicillin/Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Germany) und 2 % fetales Rinderserum (Pan Biotech GmbH) zugesetzt war, wurden die Zellen direkt für die Messung verwendet oder es erfolgte ein Mediumwechsel.

Auf ahmeeffizienz und Zytotoxizität der Transfektionskomplexe

Für die Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität der

unterschiedlich zusammengesetzten Transfektionskomplexe wurden die CD133+ Zellen 18 h nach der Transfektion für 10 min bei 4 °C mit LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes, USA) gefärbt und anschließend mit einer 4 %igen Formaldehydlösung (FA) (Merck Schuchardt OHG, Deutschland) fixiert. Die Proben wurden mit dem LSR-II Durchflusszytometer gemessen und die Daten mit Hilfe der FACSDiva Software (BD Bioscience) analysiert. Abb. 3 zeigt die

repräsentative Gating-Strategie.

Eine qualitative Analyse der transfizierten CD133+ Zellen erfolgte 18 h nach der Transfektion von Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA). Hierzu wurden die Zellen mit 2 % FBS gewaschen um nicht aufgenommene Partikel zu lösen. Anschließend wurden die Zellen in 4 %iger FA-Lösung für 20 min fixiert. Danach wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich,

Germany) auf einem Objektträger gebettet. Mit Hilfe der Laser-Scanning Mikroskopie (LSM) (40x Ölimmersion) wurde ein tile-scan der Proben durchgeführt, welches zu einer besseren Übersicht von 1062.33 μηη x 1062.33 μηη führte. Desweiteren wurde ein z-stack mit einer Tiefe von 7 μηη zur Bestimmung der Aufnahme von Cy3-markierter miR durchgeführt.

Magnetisches Targeting

Der Nachweis des magnetischen Zelltargetings der CD133+ Zellen erfolgte mit den optimierten Transfektionskomplexen (20 pmol miR; N/P Verhältnis: 7,5; 3 und 5 μg/ml MNP). 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen in ein neues Well einer 12er Wellplatte überführt. Ein magnetisches Feld wurde, lokal durch eine Magnetplatte unterhalb der Zellkulturschale, erzeugt (OZ Biosciences, France; Feldstärke 70 - 250 mT). Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 wurde die Zellzahl in den Areal mit (+M) und ohne (-M) Magnet mit Hilfe des LSM 780 ELYRA PS.1 erfasst und nachfolgend durch ZEN 201 1 Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Deutschland) und ImageJ 1 .48 (NIH, USA) analysiert. Das entsprechende Verhältnis des magnetischen Targetings wurde wie folgt ermittelt: Zahlzahl (+M)/ Zellzahl (-M).

Magnetpartikel Spektroskopie zur [Bestimmung des Eisengehaltes in CD133+ Zellen

Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden 5x105 CD133+ Zellen mit den optimalen miR/PEI/MNP Komplexen transifiziert (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 μg/ml MNPs). Nach einer Inkubationszeit von 18 h wurden die Proben mit 2 % FBS in PBS gewaschen, anschließend mit 4 %iger FA-Lösung fixiert und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Messungen wurden mit Hilfe eines MPS (Bruker Biospin, Deutschland) unter einer magnetischen Flussdichte von B<*nve = 25 mT und einer Frequenz von fo = 25 kHz durchgeführt. Hierbei werden nicht-lineare

dynamische magnetische Momente der Proben in höheren Frequenzen als fo bestimmt. Die Eisenquantifizierung der Proben erfolgte durch die Bestimmung der dritten harmonischen Frequenz des MPS-Spektrums (A3). Das MPS-Spektrum wurde

gegen ein Referenzspektrum der eingesetzten MN Ps und CD133 MircoBeads normalisiert (bekannter Eisengehalt, MNPs: 3,2 μg; CD133 MircoBeads: 2,5 μg). das Verhältnis von A5/A3 wird als charakteristischer Fingerabdruck zur Identifizierung der verschiedenen magnetischen Nanopartikel herangezogen.

Intrazelluläre Visualisierung der Transfektionskomplexe

Zur Visualisierung der Transfektionskomplexe wurde Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule - Negative Control #1 (Ambion) mit Hilfe des Label IT® miRNA Labeling Kits (Mirus Bio LLC, USA) mit Cy5™ Farbstoff markiert, entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Überflüssiger Farbstoff wurde durch die mitgelieferten

Aufreinigungssäulen entfernt. Die Konzentration der Cy5-markierten miR wurde spektrophotometrisch mit Hilfe des NanoDrops ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ermittelt und nachfolgend lichtgeschützt bei -20 °C gelagert. PEI wurde mit Hilfe des FluoReporter® Oregon Green® 488 Protein Labeling Kits (Molecular Probes), entsprechend den Vorgaben des Herstellers, gefärbt. Hierzu wurde PEI mit 1 M Natriumbicarbonat-Lösung gemischt und 1 h mit der Oregon Green® Stammlösung (10 mg/ml in DMSO) inkubiert. Nichtgebundener Farbstoff wurde durch Größenausschluss-Chromatographie mittels PD-10 Entsalzungssäulen (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) entfernt. Die Konzentration von 488-markiertem PEI wurde durch eine Ninhydrinanalyse ermittelt und nachfolgend lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.

Die MNPs wurde mit dem Farbstoff Atto 565-konjugiert zu Biotin (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Deutschland) gefärbt. Hierzu wurden die MNPs mit Atto 565 Farbstoff (Verhältnis 1 : 1000 w/w), parallel zur Generierung der miR/PEI Komplexe, gemischt und für 30 min im Dunkeln inkubiert.

Um die intrazelluläre Verteilung der Transfektionskomplexe zu verfolgen, wurden 5x104 CD133+ Zellen mit den oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Komplexen und unter den optimalen Bedingungen (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 μg/ml MNPs) transfiziert. 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen einmalig mit 2 % FBS in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Pan Biotech GmbH) gewaschen um

freie Partikel zu lösen, anschließend wurden diese mit 4 % FA für 20 min fixiert. Nachfolgend wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und nochmals mit PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich, Germany) auf einem Objektträger gebettet.

Zunächst wurde die intrazelluläre Lokalisation aller Transfektionskomplexbestandteile mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) untersucht. Hierzu wurde das ELYRA PS.1 LSM 780 System genutzt. Zur anschließenden Aufbereitung der aufgenommen Bilder wurde die ZEN Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH) verwendet. Eine detaillierte Analyse zur Lokalisation der Komplexen erfolgte durch 3-dimensionale structured Illumination Mikroskopie (SIM), welche ebenfalls mit dem ELYRA PS.1 LSM 780 System durchgeführt wurde. SIM-Aufnahmen mit 4

Fluorophoren erfolgten mit einem 100x alpha Plan-Apochromat Objektiv

(Ölimmersion), NA=1 ,46 und bei Anregungswellenlängen von 405, 488, 561 und 633 nm. Die Aufnahmen wurden als 16bit z-Stapel generiert, mit 3 Rotationen, 3 Phasen und einem Average-Wert von 4. Der Gitterabstand für die jeweiligen

Anregungswellenlängen betrug: 23 μηη für 405 nm, 34 μηη für 488 nm, 42 μηη für 561 nm und 51 μηη für 633nm. Die ermittelten Sl Rohdaten wurden durch die ZEN Software rekonstruiert. Für jeden Farbkanal wurde aus dem aufgenommen z-Stapel eine 2D Maximum Projection generiert und anschließend erfolgte die Überlagerung der einzelnen Farbkanäle zu einem Einzelbild.

Hämatopoetischer CFU (CFU-H) Assay

Um das hämatopoetische Differenzierungspotenzial der microRNA-modifizierten CD133+ Zellen zu bestimmen wurde ein CFU-H Assay durchgeführt. 18 h nach der Transfektion mit Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 wurden die Zellen mit MethoCult H4434 Classic (STEMCELL Technologies,

Deutschland) gemischt und anschließend in einer Konzentration von 1x103 Zellen pro 35 mm Zellkulturschale ausgesät. Die Bewertung der gebildeten Kolonien, nach Anzahl und Art, wurde nach einer Inkubationszeit von 14 Tage bei 37 °C und

5 % CO2 durchgeführt. Nach Herstellerangaben wurden alle Proben in Duplikaten untersucht.

Statistische Auswertung

Eine statistische Auswertung wurde mittels Student's t-test und der SigmaPlot 1 1 .0 Software (Systat Software GmbH, Deutschland) durchgeführt. Alle Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Daten mit p < 0.05 (*;#); p < 0.01 (**;##); und p < 0.001 (***;###) wurden als statistisch signifikant betrachtet. Für jedes Experiment wurden verschiedene Knochenmarksspender (n) verwendet.

Ergebnisse

Optimierung der miR/PEI-Komplexe für die Transfektion

Für die Optimierung der Transfektion der CD133+-Stammzellen wurden verschiedene Zusammensetzungen von miR/PEI-Komplexen, die vier unterschiedliche Gehalte an miR aufwiesen (10, 20, 30 und 40 pmol pro 5x104 Zellen) und drei verschiedene N/P-Verhältnisse (2,5, 5,0 und 7,5) bezüglich der Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität untersucht. Bei allen Messungen dienten nicht-transfizierte Zellen als interne

Kontrolle. Komplexe mit der kleinsten miR-Menge (10 pmol) zeigten die geringsten Aufnahmeraten (im Bereich von 20 bis 60 % Cy3+ Zellen) und eine moderate

Zytotoxizität (ca. 40 tote Zellen) im Vergleich zur Kontrolle (ca. 25 % tote Zellen). Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 gezeigt. Komplexe mit höheren Gehalten an miR ergaben eine signifikant erhöhte Aufnahmeeffizienz (bis zu ca. 95 % Cy3+ Zellen), ergaben aber auch erhöhte zytotoxische Effekte (bis zu ca. 80 % tote Zellen), wobei höhere PEI-Mengen erforderlich waren. Daher wurden Komplexe, die 20 pmol miR enthielten, als optimal für die Transfektion der CD133+-Stammzellen angesehen, da sie eine Balance zwischen erhöhten Aufnahmeraten (ca. 75-90 % Cy3+ Zellen) und relativ geringer Zytotoxizität aufwiesen.

miR/PEI/MNP Komplexe sind geeignet für eine CD133+ Stammzelltransfektion

Zur Ermöglichung einer magnetischen Zielführung und Auffindung wurden die vorher ausgewählten Polyplexe (20 pmol miR, N/P-Verhältnis 2,5, 5,0 und 7,5) mit magnatischen Nanopartikeln (MNP) in fünf verschiedenen Konzentrationen (1 , 2, 3, 4 und 5 μg pro ml fertiger miR/PEI-Mischung) versetzt. Der Einfluss der MNPs auf die Aufnahmeeffizienz und die Zytotoxizität wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Nicht-transfizierte Zellen wurden als Kontrolle eingesetzt.

Die Aufnahmeraten der miR/PEI/MNP-Komplexe unterschieden sich nicht signifikant von denen der entsprechenden miR/PEI-Komplexe (ohne MNP), die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Dahingegen führten erhöhte N/P-Verhältnisse (2,5, 5 und 7,5) zu erhöhten Aufnahmeeffizienzen (ca. 40 %, ca. 60 % und ca. 80 % Cy3+-Zellen). Repräsentative Aufnahmen belegen die intrazelluläre Lokalisation von Cy3-markierter miR und der gleichzeitigen hohen Aufnahmeeffizienz bei einem Einsatz von 20 pmol miR N/P-Verhätnis 7,5 kombiniert mit 3 μg/ml MNPs. Weiterhin konnten keine signifikanten Veränderungen in der Zytotoxizität zwischen Kontrolle (36 % ± 1 1 tote Zellen) und den transfizierten Zellen (zwischen ca. 25 % und ca. 35 % tote Zellen) ermittelt werden. In Folgeexperimenten wurden magnetische Komplexe,

zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 7,5, kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs, verwendet im Hinblick auf ihre höchsten Aufnahmeraten und geringe

Zytotoxizität im Vergleich zur Kontrolle. Für die Vergleichsuntersuchung wurden

Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 5 kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs für Folgeuntersuchungen verwendet.

Zielführung von transfizierte CD133+-Zellen in einem magnetischen Feld

Zur Untersuchung des Einflusses eines Magnetfeldes auf die Zielführung von Zellen, die mit optimierten miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert waren, wurde eine

Magnetplatte lokal unter einem Teilbereich der Zellkulturplatte für 24 Stunden angebracht (Abb.6).

Bei nicht-transfizierten Zellen wurde nahezu die gleiche Anzahl von Zellen in beiden Bereichen (mit und ohne Magnet, siehe Abb. 6b und c) beobachtet. Diese Resultate indizierten, dass MACS CD133 Microbeads allein nicht ausreichend waren für eine Zielführung der Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit magnetischen Komplexen, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 5 und 7,5, kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs höhere Zellzahlen im Bereich des Magneten (+M) als in dem Bereich ohne Magnet (-M). Entsprechend zeigten transfizierte Zellen signifikant höhere magnetische Zielführungsverhältnisse (Verhältnis zwischen 1 ,6 und 2,6) als nicht-transfizierte Zellen (Verhältnis 1 ±0,12). Die Ergebnisse sind in Abb. 6a dargestellt. Weiterhin zeigten Transfektionskomplexe mit einem N/P-Verhältnis von 7.5 signifikant höhere Zielführungsverhältnisse (2,6±0,17 und 2,2±0,08 mit 3 und 5 μg/ml MNPs). Daher wurden Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 7,5 in Kombination mit 3 oder 5 μg/ml MNPs als am besten geeignet für die Zielführung von transfizierten Zellen in einem Magnetfeld angesehen und daher für die weiteren Untersuchungen eingesetzt. Abb. 6c zeigt eine Übersicht der Ergebnisse.

Intrazelluläre Eisenkonzentration

Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden Transfektionskomplexe

herangezogen, welche als optimal für die Transfektion von CD133+ Zellen sowie für ihre magnetische Zielführung definiert wurden. Die intrazelluläre Eisenkonzentration wurde mit Hilfe der magnetischen Partikelspektroskopie (MPS) quantifiziert. Eine Eisenkonzentration von 0,155 ± 0,0419 pg Eisen pro Zelle konnte durch die

Transfektion von miR/PEI/MNP Komplexen erzielt werden. Ein entsprechender A5/A3 Wert von 20,5 ± 3,1 % erlaubt eine eindeutige Identifizierung von MNPs und verhindert somit ein falsch-positives Signal ausgehend von CD133 MicroBeads (A5/A3: 27 - 30 %).

Intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen

Zur intrazellulären Bestimmung optimierter Transfektionskomplexe wurden CD133+-Stammzellen mit markierten miR/PEI- und miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert. Um eine genaue Verteilung der Komplexbestandteile zu untersuchen wurde SIM-Aufnahmen erstellt (laterale Auflösung 100 nm) (Abb. 7). Diese zeigen, dass 18 h nach der Transfektion alle Bestandteile des Transfektionssystems im Zytoplasma zu finden sind, wobei sie in der perinukleären Region, ohne erkennbaren Unterschied, lokalisiert sind. Das Signal von PEI wurde jeweils in Kolokalisation mit MNPs und miR vorgefunden. Die Transfektionskomplexe weisen eine Größe von etwa 100 - 400 nm auf und befinden sich in einer anderen Bildebene als der Nukleus (Daten ersichtlich aus z-stacks)

miR/PEI/MNP Komplexe haben keinen negativen Einfluss auf die Viabilität und die Expression von Stammzelloberflächenmarkern

Zur Untersuchung des Einflusses von 18 Stunden Kultivierungszeit und Transfektion auf die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität von transfizierten CD133+-Zellen wurden durchflusszytometrische Messungen vorgenommen. Wie eingangs

beschrieben wurden Parameter angewandt, die als optimal für den Zielführungsansatz ermittelt worden waren; als interne Kontrolle wurden nicht-transfizierte Zellen eingesetzt. Ein signifikanter Abfall in der Viabilität von nicht-transfizierten CD133+-Zellen von ca. 95 % ± 1 (0 h Kontrolle) auf ca. 77 % ± 3 (18 h Kontrolle) wurde beobachtet (siehe Abb. 8), was einen Zelltod, verursacht durch die 18 h Kultivierung, bedeutet. Jedoch wurde kein signifikanter Unterschied in der Viabilität nach 18 h zwischen Kontrolle und Zellen, die mit 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 pg/ml MNPs transfiziert waren (ca. 70 % lebende Zellen), festgestellt, was illustriert, dass die Transfektionsbedingungen einen milden Charakter aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurden keine signifkanten Veränderungen in der Oberflächenmarkerintegrität nach 18 h Kultivierungszeit beobachtet (93 % ± 2 bei der 0 h Kontrolle; 87 % ± 2 bei der 18 h Kontrolle). Darüberhinaus zeigte die Analyse der Zellen, die mit 20 pmol miR, N/P-Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 pg/ml MNPs transfiziert worden waren (92 % ± 2; 90 % ± 4; 89 % ± 4), keinen signifikanten Unterschied bei beiden Kontrollen, was den Erhalt von hämatopoetischen

Stammzellmarkern anzeigt.

Multipotentes Differenzierungspotenzial von transfizierten CD133+-Zellen

Dem Knochenmark entstammende CD133+-Zellen sind bekannt für ihr multipotentes Differenzierungspotenzial. Zur Bestimmung der Auswirkung der Transfektion auf ihre Fähigkeit zur hämatopoetischen Differenzierung wurden CFU-Assays verwendet. Der Vergleich von nicht-transfizierten Zellen (Kontrolle) und Zellen, die mit optimierten miR/PEI- bzw. miR/PEI/MNPs-Komplexen (20 pmol miR; N/P-Verhältnis 7,5; 0, 3 oder 5 μΙ/ml MNPs) transfiziert worden waren, zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Menge der gebildeten CFU-Granulozyten, Erythroid, Makrophagen,

Megakaryocyten (CFU-GEMM), CFU-Granulozyten, Makrophagen (CFU-GM), Burst-bildender Unit-Erythroid (BFU-E) und CFU-Erythroid (CFU-E), siehe Abb. 9e.

Vielmehr wiesen die transfizierten Zellen keine morphologischen Abnormitäten auf (siehe Abb. 9a-d). Diese Ergebnisse zeigen klar, dass eine Transfektion unter

optimierten Bedingungen keinen Einfluss auf das multipotente Differenzierungspotenzial von CD133+-Zellen hat.