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1. (WO2018030789) PEPTIDE NUCLEIC ACID COMPLEX HAVING IMPROVED CELL PERMEABILITY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2   3  

배경기술

4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42  

도면의 간단한 설명

43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140   141   142   143   144   145   146   147   148   149   150   151   152   153   154   155   156   157   158   159   160   161   162   163   164   165   166   167   168   169   170   171   172   173   174   175   176   177   178   179   180   181   182   183   184   185   186   187   188   189   190   191   192   193   194   195   196   197   198   199   200   201   202   203   204   205   206   207   208   209   210   211   212   213   214   215   216   217   218   219   220   221   222   223   224   225   226   227   228   229   230   231   232   233   234   235   236   237   238   239   240   241   242   243   244   245   246   247   248   249   250   251   252   253   254   255   256   257   258   259   260   261   262   263   264   265   266   267   268   269   270   271   272   273   274   275   276   277   278   279   280   281   282   283   284   285   286   287   288   289   290   291   292   293   294   295   296   297   298   299   300   301   302   303   304   305   306   307   308   309   310   311   312   313   314   315   316   317   318   319   320   321   322   323   324   325   326   327   328   329   330   331   332   333   334   335   336   337   338   339   340   341   342   343   344   345   346   347   348   349   350   351   352   353   354   355   356   357   358   359   360   361   362   363   364   365   366   367   368   369   370   371   372   373   374   375   376   377   378   379   380   381   382   383   384   385   386   387   388   389   390   391   392   393   394   395   396   397   398   399   400   401   402   403   404   405   406   407   408   409   410   411   412   413   414   415   416   417   418   419   420   421   422   423   424   425   426   427   428   429   430   431   432   433   434   435   436   437   438   439   440   441   442   443   444   445   446   447   448   449   450   451  

산업상 이용가능성

452   453   454   455   456   457  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33  

도면

1   2a   2b   3a   3b   3c   4   5a   5b   5c   5d   5e   5f   6a   6b   6c   6d   6e   6f   6g   7   8a   8b   8c   8d   8e   9a   9b   10a   10b   11a   11b   11c   11d   11e   12a   12b   12c   13   14a   14b   15a   15b   16a   16b   16c   17   18  

명세서

발명의 명칭 : 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

기술분야

[1]
본 발명은 생활성 핵산을 세포내에 도입할 수 있는 새로운 구조의 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 및 진단용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자의 발현 조절 방법에 관한 것으로,
[2]
더욱 자세하게는, 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 이를 포함하는 질병의 치료 및 진단용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자의 발현 조절 방법에 관한 것이다.
[3]

배경기술

[4]
전통적으로 새로운 약제를 탐색하는데 있어, 컴퓨터 연구를 통한 다양한 화합물을 스크리닝하는 것을 기본으로 하며, 스크리닝된 화합물의 대다수는 단백질을 표적으로 한다.
[5]
전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
[6]
[7]
올리고 핵산(Oligo nucleic acid)을 기반으로 유전자 발현 조절의 뛰어난 효과 및 다양한 용도에도 불구하고, 핵산을 기반으로 하는 치료제를 개발하기 위해서는 극복해야 할 방해물이 다수 존재한다. 예를 들며, 올리고 핵산은 핵산분해효소(nuclease) 등에 의한 손상의 위험이 있으며, 올리고 핵산의 전기적 성질(전하)과 크기로 인하여 수동 확산(passive diffusion)에 의한 세포막 투과가 불가능한 점 등이 있다. 상기 문제점들을 해소하기 위하여, 핵산의 변형을 통한 생물학적 안정성을 확보하려는 노력이 계속되고 있으며, 변형된 인공핵산(Artificial Nucleic Acid)의 경우 생물학적인 활성의 손실 없이 표적 핵산과의 친화성을 높이는 것이 가능하게 되었다.
[8]
변형된 인공핵산의 한 종류인 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 (2-아미노에틸)-글리신 펩티드 백본((2-aminoethyl)-glycine peptide backbone)이 도입된 인공 핵산으로, 상보적인 염기 서열을 가지는 RNA 및 DNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있다. 특히, 상기 펩티드 핵산은 핵산분해효소에 대해 저항성이 있고, 생물학적 안정성이 높아 다양한 올리고 핵산을 기반으로 하는 치료제 관련 연구가 수행되고 있다. 하지만 상기 펩티드 핵산은 전기적 중성을 가지는 특성으로 세포내 도입이 어려운 단점을 가지고 있다(Joergensen M. 등 Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
[9]
약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입을 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다. 예를 들어, 나노입자(nanoparticle), 양성 리포좀(cationic liposome) 및 폴리머 나노입자(polymeric nanoparticle)룰 사용하는 올리고 핵산을 기반으로 하는 약제의 세포 또는 조직 내로의 운반 전략(방법)을 사용한 임상시험이 진행되고 있으나, 대다수의 경우 운반 시스템을 포함하지 않고, 비경구적인 방법인 근육주사, 안구(ocular) 투여, 피하주사 등의 투여 경로(administration route)로 핵산의 직접 도입이 주를 이루고 있다.
[10]
또한, 올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역활성과 발암유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
[11]
이러한 이유로 세포독성이 적고, 면역활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid) , 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.).
[12]
이러한 핵산전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 앤도좀 에스케이프(endosome escape) 효율 및 생체독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
[13]
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체를 개발하고자 예의 노력한 결과,
[14]
생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
[15]
[16]
발명의 요약
[17]
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 및 진단용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자의 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.
[18]
또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 측면에서의 과제는 본 발명에 따른 핵산 복합체 및/또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
[19]
[20]
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 핵산 복합체를 제공한다.
[21]
[22]
구조식 (1)
[23]
[ A ≡ C (+) ]
[24]
[25]
상기 구조식 (1)에 있어서,
[26]
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고
[27]
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
[28]
‘≡’는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
[29]
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
[30]
C (+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며
[31]
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
[32]
상기 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 적절히 조절함으로써 조절이 가능하다.
[33]
구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
[34]
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 2개 내지 5개 포함된다는 의미), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개에서 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
[35]
본 발명에 따른 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 80 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 70 nm의 크기를 가진다.
[36]
이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체의 전하 밸런스를 조절함을 특징으로 하는 핵산 복합체 입자 크기 조절 방법을 제공한다.
[37]
[38]
또한, 본 발명은 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체를 포함하는 질병의 예방 및 치료용 조성물, 질병의 진단용 조성물 및 목적하는 표적 유전자의 발현 조절용 조성물을 제공한다.
[39]
본 발명은 또한, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체를 포함하는 질병의 진단용 키트를 제공한다.
[40]
본 발명은 또한, (a) 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 캐리어 펩티드 핵산을 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 세포, 세균, 곰팡이, 기생충 등에 접촉시켜 생물체 및 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 상기 복합체를 이용한 표적 유전자 발현의 조절 방법을 제공한다.
[41]
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체 및/또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법을 제공한다.
[42]

도면의 간단한 설명

[43]
도 1은 단일가닥으로 이루어진 생활성 핵산과, 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 평행결합(parallel binding)으로 구성된 핵산 복합체의 입자 크기를 비교하여 나타낸 도면.
[44]
(A) 생활성 핵산 단독
[45]
(B) 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 평행결합으로 결합된 핵산 복합체
[46]
도 2a 및 2b는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체의 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 가지는 전기적 성질에 따른 복합체 입자의 형태 및 크기 변화를 SEM 사진으로 관찰한 결과를 나타낸 도면.
[47]
(A) PNA Duplex 1 (생활성 펩티드 핵산 (서열변호 6), 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 32))
[48]
(B) PNA Duplex 2 (생활성 펩티드 핵산 (서열번호 5), 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 32))
[49]
(C) PNA Duplex 3 (생활성 펩티드 핵산 (서열번호 1), 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 37))
[50]
(D) PNA Duplex 4 (생활성 펩티드 핵산 (서열번호 1), 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 23))
[51]
도 3a 내지 3c는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합 및 전기적 성질에 따른 본 발명에 따른 핵산 복합체의 세포 투과율 분석을 위한 공초점 현미경하에서 촬영된 사진을 나타낸 도면.
[52]
(a) 전하를 가지지 않는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 13)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 38)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[53]
(b) 전하를 가지는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 13)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[54]
(c) 다양한 전하를 가지는 생활성 펩티드 핵산과 양전하 3개를 사용한 캐리어 펩티드 핵산(서열번호40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[55]
(1) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 15)와 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[56]
(2) 생활성 펩티드 핵산 (서열번호 16)와 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[57]
(3) 생활성 펩티드 핵산 (서열번호 14)와 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[58]
(4) 생활성 펩티드 핵산 (서열번호 17)와 캐리어 펩티드 핵산 (서열번호 40)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[59]
도 4는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서 캐리어 펩티드 핵산으로 PNA를 사용한 경우의 시간 경과에 따른 생활성 펩티드 핵산 복합체의 세포 내 존재 여부를 확인한 도면.
[60]
도 5a 내지 5f는 구조식 (1)에 따른 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 이루어진 복합체의 시간 경과에 따른 세포 내에서의 복합체의 분리 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면.
[61]
(a) 복합체의 대조군
[62]
(b) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호39)으로 이루어진 복합체가 24h 후 세포 내에서 복합체를 이루는 모습
[63]
(c) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호39)으로 이루어진 복합체의 48h 후 세포 내에서의 복합체의 모습으로 캐리어 펩티드 핵산이 복합체를 이루거나 분리되는 모습
[64]
(d) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호39)으로 이루어진 복합체의 72h 후 세포 내에서의 복합체의 모습으로 캐리어 펩티드 핵산이 생활성 핵산과 분리되는 모습
[65]
(e) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호39)으로 이루어진 복합체의 96h 후 세포 내에서의 복합체의 모습으로 캐리어 펩티드 핵산이 생활성 핵산과 분리되는 모습
[66]
(f) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 13)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호39)으로 이루어진 복합체의 120h 후 세포 내에서의 복합체의 모습으로 캐리어 펩티드 핵산이 생활성 핵산과 분리된 후 세포 내 남아있는 생활성 핵산의 모습
[67]
도 6a 내지 6g는 single siRNA를 단독으로 사용한 경우와, 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서 single siRNA와 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 39)으로 PNA를 사용한 경우의 세포 내 투과 효율을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면.
[68]
(a) single siRNA를 사용한 경우
[69]
(b~g) single siRNA와 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 39)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우
[70]
도 7은 서바이빈 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 다양한 암 세포주에서 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인한 도면.
[71]
(A) HeLa 세포주를 사용한 실험결과
[72]
(B) SW480 세포주를 사용한 실험결과
[73]
(C) SK-BR-3 세포주를 사용한 실험결과
[74]
도 8a 내지 8e는 서바이빈 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 다양한 암 세포주에서 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인한 도면.
[75]
(a) SW480 세포주를 사용한 전하를 가지지 않는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 1)과 다양한 전하를 가지는 펩티드 핵산을 이용한 복합체를 사용한 실험 결과
[76]
(b) SW480 세포주를 사용한 생활성 펩티드 핵산(서열번호 2)과 다양한 전하를 가지는 펩티드 핵산을 이용한 복합체를 사용한 실험 결과
[77]
(c) SW480 세포주를 사용한 생활성 펩티드 핵산(서열번호 6)과 다양한 전하를 가지는 펩티드 핵산을 이용한 복합체를 사용한 실험 결과
[78]
(d) SW480 세포주를 사용한 생활성 펩티드 핵산(서열번호 12)과 다양한 전하를 가지는 펩티드 핵산을 이용한 복합체를 사용한 실험 결과
[79]
(e) SK-BR-3 세포주를 사용한 생활성 펩티드 핵산(서열번호 12)과 다양한 전하를 가지는 펩티드 핵산을 이용한 복합체를 사용한 실험 결과
[80]
도 9a 및 9b는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 길이에 따른 세포 생존율 변화를 나타낸 도면.
[81]
(a) 캐리어 펩티드 핵산의 길이 변화에 따른 세포 생존율 변화
[82]
(b) 생활성 펩티드 핵산의 길이 변화에 따른 세포 생존율 변화
[83]
도 10a 및 10b는 서바이빈 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간 대장암 세포주의 세포 생존율 변화 및 서바이빈과 그 하위 경로 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인한 도면.
[84]
(a) 세포 생존율 변화
[85]
(b) 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현 변화
[86]
도 11a 내지 11e는 서바이빈 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간 대장암 세포주가 이식된 마우스에서의 종양 성장 억제 효능을 입증한 결과를 나타낸 도면.
[87]
(a) 마우스의 체중 변화
[88]
(b) 종양 부피의 변화
[89]
(c) 종양 무게의 변화
[90]
(d) 종양의 외관 변화
[91]
(e) 간독성 지표의 변화
[92]
도 12a 내지 12c는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간 유방암 세포주와 폐암 세포주의 세포 생존율 변화 및 VEGF와 그 하위 경로 단백질의 발현이 억제 및 세포 사멸 유도를 확인한 도면.
[93]
(a) 세포 생존율의 변화
[94]
(b) VEGF 및 하위 경로 단백질의 발현 변화
[95]
(c) VEGF 억제에 따른 세포 사멸 유도 분석
[96]
도 13은 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 제브라피쉬를 모델로 이용한 항암 약리 효과의 평가 결과를 나타낸 도면.
[97]
도 14a 및 14b는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 인간유래 망막소상피 세포에서의 세포 생존률 억제 및 VEGF와 그 하위경로 단백질의 억제 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면.
[98]
(a) 세포 생존률 변화
[99]
(b) VEGF 및 하위 경로 단백질의 발현 변화
[100]
도 15a 및 15b는 IFI16 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 인간유래의 표피 각화 세포주에서의 세포 생존률 억제 및 IFI16과 그 하위경로 단백질의 억제 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면.
[101]
(a) 세포 생존률 변화
[102]
(b) IFI16 및 하위 경로 단백질의 발현 변화
[103]
도 16a 내지 16c는 IFI16 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 건선이 유도된 마우스 모델에서의 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면.
[104]
(a) 귀 두께 변화를 나타내는 사진 및 두께 측정 결과
[105]
(b) IFI16 및 그 하위 단백질의 발현 변화
[106]
(c) 생검을 통한 귀의 조직에서 표피 각화 세포의 변화를 나타낸 도면
[107]
도 17은 PD-L1 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여, 인간유래 유방암 세포주에서의 PD-L1과 그 하위경로 단백질의 억제 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면.
[108]
도 18은 acpP 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1) 에 따른 핵산 복합체를 사용하여 세균의 증식을 억제한 실험결과를 나타낸 도면.
[109]
[110]
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
[111]
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
[112]
이하 구체적으로 본 발명을 설명한다.
[113]
[114]
본 발명은 하기 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 핵산 복합체에 대한 것이다.
[115]
[116]
구조식 1
[117]
[ A ≡ C (+) ]
[118]
[119]
상기 구조식 (1)에 있어서,
[120]
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
[121]
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
[122]
‘≡’는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
[123]
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
[124]
C (+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며
[125]
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
[126]
[127]
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다
[128]
특히, 본 발명에서의 "생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 생체외( in vitro) 또는 생체내( in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1kb 또는 500, 300, 또는 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
[129]
[130]
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA : Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
[131]
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25, 가장 바람직하게는 15~17개의 핵산 단량체를 포함할 수 있다.
[132]
또한, 상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
[133]
특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
[134]
[135]
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 앤티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
[136]
본 발명에 있어, 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
[137]
[138]
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2’0-메틸(2'0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[139]
[140]
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
[141]
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로,
[142]
예를 들어 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며,
[143]
캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본(backbone)의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
[144]
이러한 관점에서, 본 발명의 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에 있어, 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지는 것이 바람직하며, 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것이 바람직하다.
[145]
[146]
상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[147]
[148]
바람직하게는 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 특히 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[149]
[150]
전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형이 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[151]
바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[152]
[153]
또한, 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
[154]
[155]
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
[156]
[157]
본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
[158]
[159]
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(표 1 참조). 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
[160]
[161]
본 발명에 있어서, 상기 핵산의 상보적인 결합형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 핵산의 상보적인 결합형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
[162]
역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5’- 방향성과 3’-방향성에 따라 결정된다. 역평행결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5’에서 3’ 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3’에서 5’ 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미하며,
[163]
평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5’에서 3’ 방향 또는 3’에서 5’ 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
[164]
바람직하게는 본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
[165]
상기와 같이 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮도록 하기 위한 구체적인 방법의 예로서는,
[166]
상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며,
[167]
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 가짐으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다 (표1 참조).
[168]
상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[169]
[170]
[표1]
[171]
[172]
상기 표 1에서, N은 핵산의 염기(ATGC)이며, *는 앤티센스 핵산(antisense nucleic acid) 서열과 상보적이지 않은 서열, $는 유니버설 염기(universal base) 이고, =은 링커이며, 5'-, 3'-은 핵산(염기)의 방향성을 나타낸다.
[173]
[174]
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능조절을 위한 핵산들의 결합형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
[175]
특히 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하를 조절함으로써 달성될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하의 적절한 수와 생활성 펩티드 핵산이 가지는 전하를 통한 적합한 전하 밸런스로 인한 핵산 복합제 입자 크기를 작게 할 수 있다.
[176]
한편, 캐리어 펩티드 핵산과 생활성 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
[177]
즉, 본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 및 유니버설 염기(universal base), 및 linker의 유무, 및 개수, 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있고, 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
[178]
[179]
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 적절한 조건에서 혼성화함으로써 제조될 수 있다.
[180]
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
[181]
본 발명에 따른 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산의 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 CY5을 사용한다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[182]
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 생활성 핵산과 상보적으로 수소결합하여 상기 핵산을 세포 내로 운반할 수 있고, 상기 생활성 핵산은 표적 유전자와 결합하여 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[183]
본 발명의 '표적 유전자'는 활성, 억제 또는 표지하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 '표적 핵산'과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
[184]
상기 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
[185]
본 발명은 또 다른 관점에서, 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물, 질병의 예방 또는 치료용 조성물 및 질병의 진단용 조성물을 제공한다.
[186]
또한, 상기 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하며,
[187]
본 발명은 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 발현 조절 방법을 제공한다.
[188]
[189]
본 발명에 따른 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료 또는 진단할 수 있는 질병은, 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체 내의 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자에 따라 결정될 수 있으며, 바람직하게는 암 또는 종양이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[190]
[191]
용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid) 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함한다.
[192]
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 제형의 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
[193]
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
[194]
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
[195]
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
[196]
여기에 사용된 복합체를 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서, 투여될 수 있다.
[197]
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
[198]
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 복합체, 또는 이의 의약으로 허용가능한 염을 포함하는 의약 조성물의 투여(또는 도포)로 항암 활성을 나타내고, 암의 증식의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 복합체, 또는 이의 의약으로 허용가능한 염을 포함하는 의약 조성물의 투여(또는 도포)로 암 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
[199]
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 질병은 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 종양 또는 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 난청, 피부질환 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[200]
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물이 치료할 수 있는 질환은 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자에 의해 결정되며, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자의 예로는, 암 치료를 위한 표적 유전자는 Survivin, VEGF, Androgen receptor, KRAS, Clusterin, TGFßR2, ERBB3, Transglutaminase 2, ABCB1, Hsp27, STAT3, PD-L1 등이 있으며, 염증 질환을 표적으로 하는 유전자는 PDE4B, Pellino-1이고, 희귀질환 및 중증질환을 표적으로 하는 유전자는 SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TTR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6, FMR1, Connexin 26, 신심혈관 질환을 표적으로 하는 유전자는 Factor XI, Apo(a), ApoCIII, AGT이고, 대사성 질환을 표적으로 하는 유전자는 GCGR, ANGPTL3, miR-103/107, DGAT2이고, 피부질환을 표적으로 하는 유전자는 IFI16, TLR6, TIEG1가 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[201]
[202]
본 발명의 치료용 조성물은, 그들만 혹은 이하에서 설명하는 것과 같은 적절당한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 공지의 방법으로 비경구 또는 경구 투여용 제형으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체적인 예로서는, 주사제, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제, 또는 외용제를 들 수 있다.
[203]
바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물은 비경구 투여용 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 적절한 비경구 투여용 제형으로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사용 등에 적절한 주사액 또는 동결건조 제형이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[204]
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 핵산 복합체는 피부 전달(skin delivery) 경로를 통해 투여될 수 있다. 피부 전달을 위한 제형은 수성 용액, 크림 및 연고 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 피부 전달을 위해 해당 기술분야에 알려진 모든 형태의 제형이 이용가능하다.
[205]
비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 본 발명에 따른 복합체를 포함하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
[206]
또한 본 발명에 따른 치료용 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등과 같은 경구 투여 제형으로 제형화될 수 있는데, 이때 약학적으로 허용되는 하나 이상의 부형제가 첨가될 수 있다.
[207]
[208]
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물로 치료 가능한 종양 또는 암은 특별히 제한되지는 않고, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 바람직하게는, 표적 유전자(예컨대, 서바이빈(survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 35(7):553-62, 2009)가 발현되는 모든 암을 포함하며, 보다 바람직하게 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 간세포성암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택된다.
[209]
바람직하게는 본 발명에 따른 암 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 Survivin, VEGF, Androgen receptor, KRAS, Clusterin, TGFßR2, ERBB3, Transglutaminase 2, ABCB1, Hsp27, STAT3 및 PD-L1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[210]
바람직하게는 본 발명에 따른 암 치료용 조성물에는 서열번호 1 내지 18 중 어느 하나의 서열을 갖는 Survivin 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 19 내지 40 중에서 선택된 어느 하나의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
[211]
또한, 본 발명에 따른 암 치료용 조성물은 바람직하게는 서열번호 41로 표시되는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산 또는 서열번호 49으로 표시되는 PD-L1 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 42, 43(VEGF) 또는 서열번호 50(PD-L1)의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
[212]
[213]
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 노인성 황반변성(Aged Macular Degeneration) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 노인성 황반변성 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF가 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[214]
바람직하게는 본 발명에 따른 노인성 황반변성 치료용 조성물은 서열번호 41로 표시되는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 42, 43의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
[215]
[216]
다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 피부질환은 건선, 색소침착 관련 피부질환 및 아토피 질환 등이 있지만, 이에 한정되는 않는다. 본 발명에 따른 피부질환 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 IFI16, TLR6 및 TIEG1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예시로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[217]
바람직하게는 본 발명은 건선(psoriasis) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 건선 치료용 조성물은 서열번호 44 내지 47 중 어느 하나의 서열인 IFI16 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 48의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
[218]
상기 피부 전달을 위한 예방 또는 치료용 조성물은 수성 용액, 크림, 젤, 페이스트, 로션 및 연고 등의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[219]
[220]
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 염증성 질환 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 PDE4B 및 Pellino-1로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예시로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[221]
[222]
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 희귀질환 및 중증 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 희귀질환 및 중증 질환 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TTR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6 및 Connexin 26이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[223]
바람직하게는 본 발명에 따른 희귀질환 및 중증 질환은 난청이고, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 Connexin 26일 수 있다.
[224]
[225]
본 발명의 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로, 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
[226]
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
[227]
[228]
본 발명은 일 양태에서 복합체, 또는 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여(또는 도포)하여 질병을 치료하고 억제(또는 완화)하는 방법을 제공한다.
[229]
본 발명에 따른 복합체를 이용하여 치료할 수 있는 질환은 사용되는 생활성 핵산의 특성에 따라 결정되며, 특별히 제한되지는 않는다.
[230]
바람직한 본 발명에 따른 복합체를 이용하여 치료가능한 질환의 예로는 암, 황반변성 등의 이상혈관 증식 질환, 피부질환, 염증질환, 자가면역질환 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[231]
본 발명에 따른 복합체를 포함하는 조성물은 암 질환을 치료하기 위하여, 또는 암 질환의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 투여(또는 도포)될 수 있다. 색소 침착 관련 피부질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여(도포) 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여(도포)하거나 순차적으로 투여(도포)할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여(도포)될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여(도포)될 수 있다. 이러한 투여(도포)는 단일 또는 다중 투여(도포)일 수 있다.
[232]
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 복합체를 투여(도포)하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
[233]
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량(도포량)은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여(도포) 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여(도포)할 수도 있다.
[234]
본 발명의 방법들에서 사용되는 임의의 복합체, 또는 이를 포함하는 혼합물에 대한 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 예를 들어, 선량(dose)은 세포 배양에서 결정된 IC50(half maximal inhibitory concentration) 또는 EC50(half maximal effective concentration)를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.
[235]
여기에 기재되어 있는 복합체, 또는 이를 포함하는 혼합물들의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
[236]
[237]
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 복합체를 포함하는 암 또는 종양 진단용 키트에 관한 것이다.
[238]
본 발명에서 암 또는 종양 진단을 위한 검체 시료는 인간을 포함하는 동물의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
[239]
상기 검체 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[240]
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 통상의 기술자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
[241]
[242]
본 발명의 실시예에서는 상기 핵산 복합체의 결합에 따른 입자크기를 분석하였다. 그 결과 도 1에 도시된 바와 같이, 핵산 복합체의 입자크기가 단일가닥 핵산에 비하여 수십 nm로 작아지는 것이 확인되었다(실시예 2 참조).
[243]
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 핵산 복합체를 이용하여 세포 투과 성질을 분석하였다. 그 결과, 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, 전하를 가지는 핵산 복합체의 세포내 도입으로 세포내 Cy3 형광(표지자)이 가장 높게 나타났으며, 전하를 가지지 않는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 쌍(duplex)을 이루지 않은 복합체의 경우 복합체의 세포내 투과율이 낮은 것으로 확인되었다(실시예 3 참조).
[244]
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 핵산 복합체를 이용하여 종양 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다. 그 결과, 도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석 시 상기 핵산 복합체로 처리한 실험군에서 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
[245]
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 핵산 복합체의 결합력을 조절하여 표적유전자인 서바이빈 단백질 발현억제 시점이 조절되며, 서바이빈 및 VEGF 특이적 생활성 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 종양 세포주를 이용한 실험을 통해 항암 효능을 나타냄을 확인하였다(실시예 5 내지 실시예 8 등 참조).
[246]
[247]
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 복합체 구조를 사용하여 세균 및 곰팡이의 증식을 억제하는 것이 가능함을 확인하였다(실시예 12 참조).
[248]
[249]
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산(즉, 변형된 캐리어 펩티드 핵산)은 변형되지 않은 종래의 네이키드 펩티드 핵산(naked-PNA)의 자가응집(self-aggregation) 성질 등으로 인한 침전문제를 해소하였으며, 세포 투과성, 용해도의 증가 및 세포내 확산효과를 증진시킬 수 있다.
[250]
[251]
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 캐리어 펩티드 핵산을 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 표적 세포에 접촉시켜 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 상기 복합체를 이용한 표적 유전자 발현의 조절 방법에 관한 것이다.
[252]
본 발명에 있어서, 상기 표적 세포는 전술한 암 또는 종양 유래 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 복합체가 세포내로 도입되어 이동한 다음, 생활성 핵산은 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산과 결합하고, 캐리어 펩티드 핵산과 분리되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 생활성 핵산은 표적 유전자와 결합하여 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[253]
본 발명에 따르면, 상기 복합체는 표적 핵산(표적 서열)이 부재하는 경우 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 상보적인 결합을 유지하는 반면, 생활성 핵산의 염기서열과 상보성을 이루는 표적 핵산이 존재하는 경우는 “생활성 핵산의 목적서열로의 치환(strand displacement)”, "표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind)" 방법으로, 생활성 핵산은 캐리어 펩티드 핵산으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합한다. 상기 분리 및 결합의 시점은 생활성 핵산의 캐리어 펩티드 핵산과 표적 핵산의 염기서열의 상보성에 따른 각각의 핵산(염기) 간의 수소 결합력의 조절을 통하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
[254]
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표적 특이적 분리 및 결합 방법은: i) 상보적인 결합 중 일부가 다른 서열(partial specific sequence)을 가진 캐리어 펩티드 핵산 구조로 “단일염기서열변이(single nucleotide polymorphism, SNP)”, 혹은 “생활성 핵산보다 짧은 서열”을 가지게 제작하거나, ii) 캐리어 펩티드 핵산의 일부 서열을 유니버설 염기(universal base)로 교체하거나, iii) 캐리어 펩티드 핵산의 일부 서열을 링커(linker)로 교체하거나, vi) 생활성 핵산에 평행(parallel)으로 결합하는 캐리어 펩티드 핵산 구조를 가지도록 하여 표적 핵산과 생활성 핵산의 결합력보다 캐리어 펩티드 핵산과 생활성 핵산의 결합력이 상대적으로 낮게 제작되는 방식으로 구현될 수 있으며, 상기 방법은 두 가지 이상의 조합으로 사용이 가능하며, 평행 결합(parallel binding) 방식을 사용하는 것이 바람직하다.
[255]
상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[256]
상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 분리시점 및 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자의 결합 시점의 조절이 가능한 장점이 있다.
[257]
[258]
실시예
[259]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[260]
[261]
실시예 1: 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
[262]
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체의 효능 검증을 위하여, 표적유전자로 서바이빈을 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 선행된 대부분의 신생종양이나 형질 변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다(survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 35(7):553-62, 2009).
[263]
서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈에 대한 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA) 및 RNA를 사용하였다.
[264]
본 발명의 서바이빈에 대한 생활성 핵산(antisense PNA 및 RNA)는 서열번호 1번 내지 18번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다. 본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 이미징을 위한 형광(Cy3)을 3' 말단에 결합하였으며 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 표 2와 같다.
[265]
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
[266]
본 발명의 서바이빈을 표적 유전자로 하는 생활성 핵산을 세포내로 전달하기 위한 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 19번 내지 40번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다. 본 실시예에 사용된 캐리어 펩티드 핵산의 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 표 2와 같다.
[267]
복합체 입자 크기 분석, 세포 투과율 분석 및 표적 유전자 발현 저해 효율 분석을 위하여 표 2의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산을 조합하여 복합체 제조에 사용하였다.
[268]
[269]
[표2]
[270]
[271]
[272]
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
[273]
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
[274]
[275]
실시예 2: 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합 및 전기적 성질에 따른 입자크기 분석
[276]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 입자의 크기를 분석하고자 하였다.
[277]
[278]
실시예 2-1. 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscopy, FE-SEM) 분석
[279]
실시예 1에서 제조된 복합체의 입자 크기를 분석하기 위하여 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscopy)을 사용하여 입자의 크기를 분석하였다. 주사전자현미경의 분석을 위하여 캐리어 펩티드 핵산과 생활성 핵산 250nM을 혼성화하여 준비된 복합체 3ul를 silicon wafer에 떨어뜨린 후 -70℃에서 한 시간 동안 얼린 후 20분동안 동결 건조 시켰다. 건조된 복합체를 osmium에 10분 동안 코팅해 준 후, 5 kV에서 10 kV의 주사전자현미경에서 분석하였다.
[280]
[281]
실시예 2-2. 다양한 전기적 성질에 따른 복합체 구조의 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscopy, FE-SEM) 분석
[282]
실시예 1의 방법으로 다양한 전기적 성질을 가지는 복합체를 제조하여 입자 크기를 분석하기 위해서 실시예 2-1의 방법으로 분석하였다.
[283]
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 서로 다른 전기적 성질을 가지는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 평행결합(parallel binding)으로 구성된 복합체의 입자 크기가 단일가닥으로 이루어진 생활성 핵산의 입자 크기보다 작은 것을 확인하였으며, 도 2a 및 2b에서처럼 PNA duplex 1은 생활성 펩티드 핵산(서열번호 6)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 32), PNA duplex 2는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 5)과 3개의 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 32), PNA duplex 3은 생활성 펩티드 핵산(서열번호1)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 37), PNA duplex 4은 전하를 가지지 않는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 1)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 23)을 사용하여 복합체의 입자 크기를 확인하였다. 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 2개에서 3개로 증가하면 입자의 크기가 작아지나 5개 이상을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징이 있다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 요소로 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산 전하에 따른 전반적인 복합체의 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 가지는 적절한 전기적 성질에 따라서 복합체의 입자의 크기가 다른 것을 확인하였다.
[284]
[285]
실시예 3: 캐리어 펩티드 핵산 특성에 따른 세포 투과율 분석
[286]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 세포 투과 성질을 분석하고자 하였다.
[287]
[288]
실시예 3-1. 세포 배양
[289]
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(HeLa)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에서 배양하였다.
[290]
[291]
실시예 3-2. 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[292]
실시예 3-1에서 배양된 HeLa 세포주(5×10 3 cells/웰)를 같은 배양 조건으로 8-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 다음, 실시예 1에서 제작된 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체를 500nM의 농도로 처리하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음, 복합체의 세포내 도입을 측정하였다.
[293]
[294]
실시예 3-3. 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 투과율 분석
[295]
생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 세포내 도입 정도를 확인하기 위해 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 통해 관찰하였다. 핵은 DAPI 염색으로 확인하였으며, 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산은 Cy3를 표지하여 세포 내 도입 여부를 확인하였다.
[296]
[297]
실시예 3-4. 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 복합체의 세포내 목적유전자 존재 시 분리여부 분석
[298]
생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 세포내 도입되어 목적유전자를 만나 그 결합이 떨어지는지를 확인하기 위하여, Cy3로 표지한 생활성 핵산과 Alexa488로 표지한 캐리어 펩티드 핵산의 중첩 시그날의 유무를 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 통해 관찰하였다.
[299]
[300]
실시예 3-5. 캐리어 펩티드 핵산을 이용한 단일 생활성 소간섭 리보핵산(single antisense siRNA)의 세포 내 투과율 분석
[301]
생물학적 활성을 가지는 단일 생활성 소간섭 리보핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 세포내 도입 정도를 확인하기 위해 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 통해 관찰하였다. 핵은 DAPI 염색으로 확인하였으며, 생물학적 활성을 가지는 단일 생활성 소간섭 리보핵산은 Cy3를 표지하여 세포 내 도입 여부를 확인하였다.
[302]
그 결과, 도 3a 내지 3c에 도시된 바와 같이, 전하를 가지는 생활성 펩티드 핵산(서열번호14)와 캐리어 펩티드 핵산(서열번호32)복합체의 세포내 도입으로 세포내 Cy3 형광이 가장 높게 나타났으며, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 쌍(duplex)을 이루지 않거나, 복합체의 전하가 부재한 경우 생활성 펩티드 핵산(서열번호 1)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 19) 복합체의 세포내 투과율이 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 복합체는 어떤 전기적 성질 및 형태로 구성되었는지에 따른 세포내의 투과율이 달라짐을 확인할 수 있었다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 생물학적 안정성을 보이는 펩티드 핵산으로 구성된 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)와 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 32) 복합체는 세포내 투과율이 높을 뿐 아니라 오랜 기간 동안 세포내에 존재하는 것이 확인되었다. 동일한 전하를 가지는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14)와 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 39)의 복합체는 세포 내부로 도입되면 복합체는 결합한 상태로 존재하다가 48시간 이후 분리되는 것이 도 5a 내지 5f와 같이 확인되었다. 도 6a 내지 6g에서의 결과에서는, 표 2에 나와있는 생활성 핵산과 동일한 서열을 가지는 single siRNA는 그 자체만으로는 세포내 투과율이 되지 않는 것이 확인되었으나, 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 39)과 single siRNA와 복합체를 이루면 높은 효율로 세포내 투과가 되는 것이 확인되었다.
[303]
[304]
실시예 4: 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용한 종양 세포주에서의 표적 유전자 발현 억제
[305]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 종양 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하고자 하였다.
[306]
[307]
실시예 4-1. 세포 배양
[308]
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간유래 대장암 세포(SW480), 인간유래 유방암 세포(SK-BR-3)를 RPMI 1640 배양배지(Roswell Park Memorial Institute, 웰진, 한국)에 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에서 배양하였다.
[309]
[310]
실시예 4-2. 세포 배양 및 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[311]
인간유래 암 세포주의 배양 조건 및 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법은 실시예 3와 같았다. 다만, 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 표적 유전자의 발현 억제 여부를 확인하였다.
[312]
[313]
실시예 4-3. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[314]
실시예 4-2의 조건으로 처리된 세포주로부터 총 단백질을 추출하여 BCA 정량법(Bicinchoninic acid assay)을 사용하여 단백질을 정량하였으며, 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 단백질 크기 별로 분리하고, 분리된 겔상의 단백질을 멤브레인에 옮긴 다음, 항-survivin 항체(Cell Signaling, 미국), 항-CyclinD 1(SantaCruz, 미국) 토끼 유래 항체를 1차 반응시키고, 2차 반응으로 항-토끼 항체(SantaCruz, 미국)를 이용하여 반응시킨 후 ECL(Enhanced chemiluminescence, Amersham, 미국) 용액을 처리하였다. 항체 처리 및 세정과정이 끝난, 상기 멤브레인은 LAS 하에서 서바이빈(Survivin) 및 하위 경로(downstream) 유전자인 Cyclin D1의 단백질 발현 양상을 확인하였다.
[315]
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, PNA 1과 2는 표2에 나온 것과 같은 동일한 서열을 가지나 서로 다른 전기적 성질을 가지는 생활성 펩티드 핵산과 동일한 전기적 성질을 가지는 캐리어 펩티드 핵산과의 복합체를 이룬 것이다. PNA 1의 경우 생활성 펩티드 핵산(서열번호 3), PNA 2는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 6)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 32)의 복합체이다. 서로 다른 전기적 성질을 가지는 복합체는 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석 시 처리한 실험군에서 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현의 억제가 복합체를 이루는 전기적 성질에 따라 시간의 차이를 보이나 억제하는 것을 확인하였다.
[316]
[317]
실시예 5: 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 조절을 이용한 종양 세포주에서의 표적 유전자 발현 억제
[318]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 다양한 전기적 성질을 가지는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 조절을 이용하여 종양 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하고자 하였다.
[319]
[320]
실시예 5-1. 세포 배양 및 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[321]
SW480와 SK-BR-3 세포주의 배양 조건 및 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법은 실시예 2과 같았다. 다만, 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 표적 유전자의 발현 억제 여부를 확인하였다.
[322]
[323]
실시예 5-2. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[324]
실시예 4-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 조절을 이용하여 종양 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
[325]
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 표 2에 나오는 동일한 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산을 사용하였으나, 각각의 복합체를 이루는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산은 동일하지만 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산의 경우 서로 다른 다양한 전기적 성질을 가진다. A는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 1)으로 이루어진 복합체이며, B는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 2)으로 이루어진 복합체이며, C와 D는 생활성 펩티드 핵산(서열번호 12)와 이루어진 복합체에 대해서 서로 다른 암세포에서의 서바이빈 단백질과 질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석하였다. 다양한 전기적 성질을 가지는 복합체를 통하여 생활성 펩티드 핵산과 캐리어어 펩티드 핵산 복합체의 전기적 성질의 차이에 따른 복합체의 구조에 따른 서바이빈 및 하위 경로 단백질의 발현억제 시점이 달라지는 것을 확인하였다.
[326]
[327]
실시예 6: 다양한 길이에 따른 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 복합체를 이용한 종양 세포주에서의 세포 생존율 분석
[328]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 다양한 동일한 전기적 성질을 가지나 다른 길이에 따른 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 종양 세포주에서 세포 생존율의 억제 효율을 분석하고자 하였다.
[329]
[330]
실시예 6-1. 세포 배양 및 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[331]
SW480 세포주의 배양 조건 및 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법은 실시예 2과 같았다. 다만, 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6×10 3 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 세포 생존률을 확인하였다.
[332]
[333]
실시예 6-2. MTT (MTT assay)으로 종양 세포주에서 세포 생존률 분석
[334]
실시예 6-1의 조건으로 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
[335]
그 결과, 도 9a 및 9b에서처럼 생활성 펩티드 핵산(서열번호 6~11) 및 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 23~36)이 결합되어 있는 복합체의 길이별 효율에 따른 세포 생존율의 차이가 확인되었다.
[336]
[337]
실시예 7: 서바이빈을 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질을 복합체를 통한 항암 약제 평가
[338]
실시예 1에서 표 2의 구조로 제조된 서바이빈을 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 후보물질 복합체를 이용하여 종양 세포주 및 종양세포를 이식한 동물 모델에서 표적 유전자의 발현 억제를 통한 종양의 억제를 분석하고자 한다.
[339]
[340]
실시예 7-1. 세포 배양 및 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[341]
SW480 세포주의 배양 조건 및 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법 및 실험 내용은 실시예 4와 5와 같았다.
[342]
[343]
실시예 7-2. MTT (MTT assay)으로 종양 세포주에서 세포 생존률 분석
[344]
실시예 6-1의 조건으로 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
[345]
[346]
실시예 7-3. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[347]
실시예 4-1의 조건으로 처리된 세포주를 실시예 4-3의 실험 조건으로 단백질 발현 양상을 확인하였다.
[348]
[349]
실시예 7-4. 인간유래 대장암 세포주(SW480)가 이식된 생쥐에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체의 미정맥 투여를 통한 항암 약효 평가
[350]
항암 약표 평가를 위해 특정병원체 부재(SPF) BALB/C 계통 및 암컷 누드 마우스(Nara Biotech Co, 한국)을 이용하여 인간유래 대장암 세포를 배양하여 5주령 된 누드 마우스에 이식을 위해 배양된 SW480 세포주를 3×10 7 cells/ml로 조절 한 후 조절된 세포 배양액을 마우스당 0.3 ml(9×10 6 cells/mouse)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와부위 피하에 주입 하였다. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체를 음성대조물질(1, 2 mg/kg)과 물질 1, 2, 3(1, 2 mg/kg)은 조제된 것을 마우스 당 0.1 ml씩 2회/주 (days 0, 3, 7, 10, 14, 17)로 미정맥투여 하였다. 모든 동물에 대하여 주사 개시 시 및 시험기간 중 투여직전 일반증상 관찰 및 체중 측정을 하였다. 암세포 이식 후 군별평균 종양 크기가 44.1 mm 3 도달 시부터 18일째까지 총 9회 개체별로 Vernier caliper를 이용하여 3 방향을 측정한 후 length×width×height/2의 계산식으로 계산하였다. 약물투여 개시 18일째 안와정맥에서 헤파린 튜브를 사용하여 채혈(5000rpm, 5분간 원심분리, 상층액인 혈장만을 분리하여 vial에 분주하여 -70℃에 보관) 한 뒤 CO 2 gas로 마우스를 안락사 시킨 후 종양을 분리 하여 chemical balance에 무게를 측정 하였으며, 종양조직은 사진 촬영하였다.
[351]
[352]
실시예 7-5. 인간유래 대장암 세포주(SW480)가 이식된 생쥐에서의 혈액을 이용한 간독성 지표 물질 분석
[353]
항암 약표 평가를 진행했던 마우스의 채혈을 이용하여 채혈한 혈액 내 혈장을 분리하여 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT) 와 아스팔테이트 아미노트랜스퍼레이즈 (AST) 분석 키트 (Biovision, 미국) 분석 용액에 적절한 희석비율로 희석하여 웰당 20 μL가 되도록 넣어주고, 또한 혈장 내 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT) 와 아스팔테이트 아미노트랜스퍼레이즈 (AST)의 양을 정량할 수 있도록 도와주는 표준 물질도 같이 준비하여 넣어 준 후, 분석 키트 내 방법대로 반응 용액 (분석용액을 포함한 효소 및 염색시약 혼합물) 을 제조하여 웰당 총 100 μL가 되도록 넣고 잘 섞어준 후 570 nm에서 OD를 spectrophotometer로 측정하였다.
[354]
그 결과, 도 10a 및 10b에서 나타난 바와 같이, 서바이빈을 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체를 이용하여 먼저 인간유래 대장암 세포에서의 세포 생존률이 억제되는 것이 확인되었으며, 표적 유전자인 서바이빈 및 하위 유전자의 단백질 발현도 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 도 11a 내지 11e의 결과에서처럼, 인간유래 대장암 세포주가 이식된 마우스에서의 미정맥 투여를 통한 동물 실험을 통해서, 투여 다음날부터 최종일까지 음성대조물질과 비교하여 모든 물질 투여군에서 시험기간 동안 특이한 일반증상 및 통계적으로 유의한 체중 감소는 관찰 되지 않았다. 또한, 종양 크기의 경우에는 최종일(day 18) 결과를 보면 음성대조물질 1 mg/kg투여군과 비교하여 물질 1, 2, 3의 1 mg/kg투여군에서는 각각 18.9%(p<0.01), 8.2%, 8.9%, 음성대조물질 2 mg/kg투여군과 비교하여 물질1, 2, 3의 2 mg/kg투여군에서는 각각 40.1%(p<0.001), 28.0%(p<0.001), 31.7%(p<0.001)의 종양성장 억제효과가 나타났으며, 최종일 종양 무게의 경우에는 약물투여 개시 후 18일째 SW480 tumor를 절제하여 그 무게를 측정 한 결과 음성대조물질 1 mg/kg투여군과 비교하여 물질 1, 2, 3의 1 mg/kg투여군에서는 각각 18.9%(p<0.01), 8.9%, 8.5%, 음성대조물질 2 mg/kg투여군과 비교하여 물질1, 2, 3의 2 mg/kg투여군에서는 각각 40.7%(p<0.001), 28.9%(p<0.001), 32.7%(p<0.001)의 종양무게 감소가 있었음을 확인할 수 있었다. 마지막으로, 항암 약효 평가에서 사용되었던 마우스에서 채혈하여 간독성 지표 물질을 비교한 결과, 모든 투여 그룹에서 특이적으로 간독성이 확인되지 않았다.
[355]
[356]
실시예 8: 신규 복합체를 사용한 인간유래 유방암 세포 및 폐암 세포에서의 혈관내피 성장인자의 억제에 의한 항암 약리 효과 확인
[357]
많은 암세포에서 높은 발현이 확인되는 혈관 내피 성장 인자인 VEGF는 암세포에서 세포 혈관 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기에 이에 대한 신규 복합체를 이용하여 VEGF를 억제하여 항암 약리 효과를 확인하고자 한다.
[358]
[359]
실시예 8-1. 세포 배양
[360]
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)과 인간 폐암 세포(A549)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에서 배양하였다.
[361]
[362]
실시예 8-2. 세포 배양 및 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[363]
혈관내피 성장 인자를 억제하기 위한 신규 복합체는 혈관 성장의 필수 유전자인 VEGF mRNA와 상보적인 서열(서열번호 41)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 42~43)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 3 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법은 실시예 2와 같았다.
[364]
[365]
[표3]
[366]
[367]
실시예 8-3. 인간유래 유방암 세포와 폐암 세포주에서의 세포 생존율 분석
[368]
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 8-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6×10 3 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72,96시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 6-2의 실험 조건으로 세포 생존률을 확인하였다.
[369]
[370]
실시예 8-4. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[371]
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 7-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 4-3의 실험 조건으로 항-VEGF 항체(SantaCruz, 미국), 항-p-Akt1 (Cell signaling, 미국)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
[372]
[373]
실시예 8-5. 유세포 분석기(FACS)를 통한 세포 사멸의 분석
[374]
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제를 통한 세포 사멸을 분석하기 위하여 실시예 7-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 72시간 동안 배양한 다음 세포를 수집한 다음 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD, 미국)의 Annexin V binding buffer 500 μL에 잘 풀어준 후, FITC Annexin V과 Propidium Iodide Staining Solution를 각각 5 μL를 처리한 후 유세포 분석기 전용 tube로 옮긴 후 이용하여 처리 시간 경과 후 FACS CantoII (BD, 미국)으로 분석하였다.
[375]
[376]
실시예 8-6. 제브라피쉬를 이용한 항암 약리 평가
[377]
2일동안 배양기에서 배양한 후 얻어진 제브라피쉬 알을 이용하여 실시예 8-1에 의한 방법에 의해서 배양되는 인간유래 유방암세포인 MDA-MB-231를 CellTrace™ CFSE(Thermoscientific, 미국)를 이용하여 녹색으로 30분 동안 염색한 후 수집하여 제브라피쉬 한 마리당 150개의 염색된 인간유래 유방암 세포를 미세주입법을 이용하여 제브라피쉬 유충에 주입한다. 인간유래 유방암 세포가 주입된 제브라피쉬를 신규 복합체가 포함된 물의 들어있는 96웰 플레이트에 분주한 후, 4일동안 배양기에서 배양한다. 4일 동안 배양한 후에는 0.04 % tricaine를 이용하여 마취한 후, 형광현미경(OLYMPUS, 일본)으로 분석하였다.
[378]
그 결과, 도 12a 내지 12c에 도시된 바와 같이, 신규 복합체를 통한 혈관내피 성장인자 억제에 의해서 세포 생존률이 억제되는 것이 인간유래 유방암 세포와 폐암 세포에서 확인되었으며, 혈관내피 성장 인자인 VEGF와 하위 유전자인 p-Akt1의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다. 또한, 혈관내피 성장인지가 억제가 되어 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하기 위해 유세포 분석기로 확인한 결과 생활성 펩티드 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산의 길이 및 전하의 성질이 다른 복합체를 분석한 결과 각각 3.2%와 2%의 세포 사멸이 유도되는 것이 확인되었다. 마지막으로, 항암 약리효과를 확인하는 동물 모델로 사용되는 제브라피쉬를 이용하여 인간유래 유방암 세포를 이식한 후 확인한 결과 도 13의 결과에서처럼 이식된 유방암 세포의 성장이 억제되는 효과를 확인할 수 있었다.
[379]
[380]
실시예 9: 신규 복합체를 사용한 인간유래 망막소상피 세포에서의 혈관내피 성장인자의 억제를 확인
[381]
노인성 황반변성의 원인으로 알려진 황반에서의 혈관 내피 성장 인자인 VEGF에 대한 신규 복합체를 이용하여 인간유래 망막소상피 세포에 처리하여 혈관 생성을 억제하는지를 확인하였다.
[382]
[383]
실시예 9-1. 세포 배양
[384]
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 망막소상피세포(ARPE-19)를 DMEM-F12 배양배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, gibco, 미국)에 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에서 배양하였다.
[385]
[386]
실시예 9-2. 세포 배양 및 생활성 펩티드 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[387]
혈관내피 성장 인자를 억제하기 위한 신규 복합체는 실시예 7-2와 동일하게 사용 하였으며, 신규 복합체의 처리방법은 실시예 2와 같았다.
[388]
[389]
실시예 9-3. 인간유래 망막소상피 세포주에서의 세포 생존율 분석
[390]
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 9-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6×10 3 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 6-2의 실험 조건으로 세포 생존률을 확인하였다.
[391]
[392]
실시예 9-4. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[393]
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 9-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 4-3의 실험 조건으로 항-VEGF 항체(SantaCruz, 미국), 항-p-Akt1(Cell signaling, 미국), 항-p-ERK-1(Cell signaling, 미국)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
[394]
그 결과, 도 14a 및 14b에 도시된 바와 같이, 신규복합체를 처리함으로 인해 인간유래 망막소상피 세포에서의 세포 생존률이 억제되는 것이 확인되었으며, 동일하게 VEGF와 하위 유전자인 p-Akt-1과 p-ERK-1의 단백질 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
[395]
[396]
실시예 10: 건선에 신규복합체를 이용한 항염증 약리 효과 확인
[397]
신규 복합체를 이용하여 피부질환인 건선에 대한 효능 검증을 위하여, 표적유전자인 IFI16 (Interferon gamma inducible protein 16)를 억제하여 항염증 약리 효과를 확인하고자 한다.
[398]
[399]
실시예 10-1. 세포 배양
[400]
CLS(Cell Line Service, 독일)로부터 입수한 인간유래 표피각화세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5%(v/v) CO 2의 조건하에서 배양하였다.
[401]
[402]
실시예 10-2. 세포 배양 및 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[403]
IFI16을 억제하기 위한 신규 복합체는 IFI16 mRNA와 상보적인 서열(서열번호 44~47)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 48)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 4 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리방법은 실시예 2와 같았다.
[404]
[405]
[표4]
[406]
[407]
실시예 10-3. 인간유래의 표피 각화 세포주에서의 세포 생존율 분석
[408]
IFI16 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 10-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 6×10 3/웰로 세포를 24시간 배양 후 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 인간 표피각화세포의 염증반응을 유도하기 위해 IL-17A를 20 ng/mL로 처리하여 72, 96, 120시간까지 배양한 후, 실시예 6-2의 실험 조건으로 세포 생존률을 확인하였다.
[409]
[410]
실시예 10-4. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[411]
신규 복합체의 IFI16 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 10-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 72, 96, 120, 144 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 4-3의 실험 조건으로 항-IFI16 항체(Cell Signaling, 미국), 항-p-NF-kB 항체 (Cell signaling, 미국)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
[412]
[413]
실시예 10-5. 이미퀴모드를 이용한 Balb/C 마우스 건선 모델 유도 및 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용한 이미퀴모드 건선 모델에서의 표현형 변화 분석
[414]
Balb/C 마우스 수컷 6주령의 오른쪽 귀에 이미퀴모드를 매일 20 mg씩 12일동안 도포하여 건선을 유도한 마우스 모델에서 신규 복합체를 2일에 한번씩 총 12일 동안 6번 액상 또는 크림으로 도포하여 오른쪽 귀의 두께를 마이크로미터로 측정하였으며, 초기 건선 유도 전 오른쪽 귀의 두께와 건선 유도 후 대조군 대비 신규 복합체를 처리한 그룹에서의 귀 두께의 차이를 확인하였다.
[415]
[416]
실시예 10-6. 이미퀴모드를 이용한 Balb/C 마우스 건선 유도 모델에서 신규 복합체를 이용한 유전자 발현 억제
[417]
실시예 10-5과 같은 조건으로 신규 복합체를 도포한 후 마우스 오른쪽 귀를 생검하여 총 단백질을 추출하여 BCA 정량법(Bicinchoninic acid assay)을 사용하여 단백질을 정량 하였으며, 실시예 10-4의 방법으로 단백질 발현을 확인하였다.
[418]
[419]
실시예 10-7. 이미퀴모드를 이용한 Balb/C 마우스 건선 유도 모델에서 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용한 조직 내 각화세포의 이상증식 억제
[420]
실시예 10-5과 같은 조건으로 신규 복합체를 도포한 후 마우스 오른쪽 귀를 생검하여 4% 포름알데하이드 용액에 고정한 후, 파라핀 포매하여 만든 파라핀 블록을 마이크로톰으로 섹션하고 탈파라핀한 조직을 슬라이드 글라스에 올린 후 마운팅하여 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색을 위한 준비를 하였다.
[421]
그 결과, 도 15a 및 15b에 도시된 바와 같이, 인간유래의 표피 각화 세포주에서 IFI16을 표적 유전자로 하는 신규 복합체를 처리하였을 때 세포 생존률이 감소하는 것이 확인되었으며, IFI16 표적 유전자와 하위 경로 유전자인 p-NF-kB의 단백질 발현이 감소하는 것이 확인되었다. 건선에 대한 신규 복합체의 항염증 약리 효과를 확인하기 위한 동물 실험을 한 결과, 도 16에 도시된 바와 같이, 건선을 유도하지 않은 음성대조군 대비 이미퀴모드로 건선을 유도한 양성대조군에서 마우스 오른쪽 귀의 두께가 증가하였으며, IFI16을 표적으로 신규 복합체를 처리한 군에서 음성 대조군과 비슷한 수준으로 귀의 두께가 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 실험 동물에서 생검한 조직을 이용하여 표적 유전자의 발현이 억제되는지를 확인한 결과, IFI16의 발현이 증가된 양성 대조군과 달리 신규 복합체를 처리한 그룹에서는 IFI16의 발현이 감소하는 것이 확인되었다. 마지막으로, 실험에 사용한 마우스의 생검을 이용하여 H&E 염색을 진행한 결과, 음성대조군 대비 양성 대조군에서 표피의 각화세포 증식이 늘어나는 것을 확인하였으며, 신규 복합체를 도포한 그룹에서 표피의 각화세포 증식이 감소하는 것을 확인하였다.
[422]
[423]
실시예 11: 신규 복합체를 사용한 인간유래 유방암 세포에서의 면역 항암 효과의 확인
[424]
많은 암세포 유전자의 표면에서 발현되는 PD-L1으로 인해, T 세포의 PD-1과 결합하여 면역 세포에 의한 사멸이 유도되지 않고, 계속적으로 암세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기에 높은 발현을 보이는 인간유래 유방암 세포에서 PD-L1을 표적으로 하는 신규 복합체를 이용하여 PD-L1을 억제하여 면역 항암 효과를 확인하고자 한다.
[425]
[426]
실시예 11-1. 세포 배양
[427]
실시예 8-1과 동일한 방법으로 배양하였다.
[428]
[429]
실시예 11-2. 세포 배양 및 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포내 도입
[430]
PD-L1을 억제하기 위한 신규 복합체는 암세포 표면에 발현하고 있는 PD-L1 mRNA와 상보적인 서열(서열번호 49)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 50)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 5 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 신규 복합체의 처리방법은 실시예 2와 같았다.
[431]
[432]
[표5]
[433]
[434]
실시예 11-3. 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
[435]
신규 복합체의 PD-L1 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 11-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1×10 5 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 96, 120, 144 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 실시예 4-3의 실험 조건으로 항-PD-L1 항체(Abcam, 영국)를 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
[436]
그 결과, 도 17에 도시된 바와 같이, 신규 복합체를 처리함으로 인해 인간유래 유방암 세포에서의 표적 유전자인 PD-L1의 단백질 발현이 음성대조군에 비해 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
[437]
[438]
실시예 12: 신규 복합체를 사용한 세균 증식억제
[439]
신규 복합체를 이용하여 세균의 증식에 필수 유전자로 알려진 acpP를 표적유전자로 하여 세균에서도 복합체를 이용한 세균 증식이 억제되는지 확인하고자 한다.
[440]
[441]
실시예 12-1. 세균 배양
[442]
세균 DH5α(Enzynomics, 한국)를 Luria-Bertani (LB) broth에 접종 후 30℃에서 10 5 CFU가 되도록 배양하였다.
[443]
[444]
실시예 12-2. 세균 증식억제용 신규 복합체의 제작
[445]
세균 증식을 억제하기 위한 신규 복합체는 세균의 필수 유전자인 acpP mRNA와 상보적인 서열(서열번호 51)의 생활성 핵산을 제작하였으며, 생활성 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 52)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 6 참조)
[446]
[447]
[표6]
[448]
[449]
실시예 12-3. 복합체의 세균 증식억제 분석
[450]
신규 복합체의 세균증식억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 12-1에서 배양된 세균에 실시예 6-2에서 제작된 복합체를 1 μM의 농도로 24시간 처리한 후 단계희석한 배양액을 고체배지에 동량씩 떨어뜨린 후 12, 24, 48 시간 동안 관찰하였다. 그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 단일 가닥으로 이루어진 생활성 핵산만을 처리한 실험구보다 복합체 형태로 처리한 실험구의 성장이 저해되는 것을 확인하였다.
[451]

산업상 이용가능성

[452]
본 발명의 구조식 (1)에 따른 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체는 생활성 핵산의 안정성을 높이고, 생활성 핵산의 자가 응집(self-aggregation) 등으로 인한 침전 등의 손실을 감소시킬 수 있으며, 세포내 생활성 핵산의 전달 효율을 높이고, 표적 유전자의 발현을 용이하게 조절할 수 있다.
[453]
특히, 본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 생활성 핵산의 표적 유전자의 염기서열 존재 하에서만 분리되기 때문에 상기 생활성 핵산의 단독 세포내 도입에 비해 표적 유전자에 대한 선택성 및 특이도가 높고, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 간의 다양한 구조 조합을 통해 결합력을 조절하여 복합체를 제조할 수 있으므로 생활성 핵산의 세포 내(또는 세포외에서) 작용시점의 조절이 가능한 장점이 있다.
[454]
[455]
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[456]
[457]
전자파일 첨부하였음.

청구범위

[청구항 1]
구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체 구조식 (1) [ A ≡ C (+) ] 상기 구조식 (1)에 있어서, A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고, C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고; ‘≡’는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며, A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며, C (+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, LNA, PNA 및 변형된 펩티드 핵산으로 구성된 군에서 선택된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 6]
제5항에 있어서, 상기 일부가 상보적인 서열로 구성되는 캐리어 펩티드 핵산은 하나 이상의 유니버설 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 8]
제7항에 있어서, gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 9]
제8항에 있어서, gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 가지는 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E), 아스파트산(Aspartic acid, Asp, D) 또는 아미노산 유사체를 backbone에 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 10]
제8항에 있어서, gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 11]
제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel)으로 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 12]
제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 13]
제12항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 14]
제12항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 가짐으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 15]
제12항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 분리시점 및 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자의 결합 시점의 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 16]
제14항에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 17]
제1항에 있어서, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱터머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 18]
제17항에 있어서, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱터머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 19]
제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 20]
제19항에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 핵산 복합체의 전하 밸런스를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
[청구항 21]
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물.
[청구항 22]
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 23]
제22항에 있어서, 상기 질환은 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 희귀질환 및 중증 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 또는 피부질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 24]
제23항에 있어서, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 Survivin, VEGF, Androgen receptor, KRAS, Clusterin, TGFßR2, ERBB3, Transglutaminase 2, ABCB1, Hsp27, STAT3 및 PD-L1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 25]
제23항에 있어서, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF인 것을 특징으로 하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 26]
제23항에 있어서, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 IFI16, TLR6 및 TIEG1로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 27]
제26항에 있어서, 상기 피부질환은 건선, 색소침착 관련 피부질환 및 아토피 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 28]
제27항에 있어서, 수성 용액, 크림, 젤, 페이스트, 로션 및 연고에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 29]
제23항에 있어서, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 PDE4B 및 Pellino-1로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 치료용 조성물.
[청구항 30]
제23항에 있어서, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TTR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6, FMR1 및 Connexin 26인 것을 특징으로 하는 희귀질환 및 중증 질환 치료용 조성물 치료용 조성물.
[청구항 31]
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 질병의 진단용 조성물.
[청구항 32]
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 핵산 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 발현 조절 방법.
[청구항 33]
구조식 (1)에 따른 핵산 복합체의 전하 밸런스를 조절함을 특징으로 하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체의 입자 크기 조절 방법.

도면

[도1]

[도2a]

[도2b]

[도3a]

[도3b]

[도3c]

[도4]

[도5a]

[도5b]

[도5c]

[도5d]

[도5e]

[도5f]

[도6a]

[도6b]

[도6c]

[도6d]

[도6e]

[도6f]

[도6g]

[도7]

[도8a]

[도8b]

[도8c]

[도8d]

[도8e]

[도9a]

[도9b]

[도10a]

[도10b]

[도11a]

[도11b]

[도11c]

[도11d]

[도11e]

[도12a]

[도12b]

[도12c]

[도13]

[도14a]

[도14b]

[도15a]

[도15b]

[도16a]

[도16b]

[도16c]

[도17]

[도18]