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1. (WO2017150916) COMPOSITION FOR SOLUBILIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS, METHOD THEREFOR, AND METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT ANTIGEN BY USING SAME
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

13   14   15  

과제 해결 수단

16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50  

발명의 효과

51   52  

도면의 간단한 설명

53   54   55   56   57   58  

발명의 실시를 위한 형태

59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

도면

1 (R26)   2 (R26)   3 (R26)   4   5   6  

명세서

발명의 명칭 : 재조합 단백질의 가용화를 위한 조성물, 그 방법 및 이를 이용한 재조합 항원의 생산 방법

기술분야

[1]
본 발명은 재조합 단백질의 가용화를 위한 조성물, 그 방법 및 이를 이용한 재조합 항원의 생산 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 내포체를 분리 수득한 후 가용화 조건을 손쉽게 설정하고 이를 이용하여 재조합 항원을 생산하는 방법이며, 그 중에서도 특히, 인간 면역 결핍 바이러스와 뎅기 바이러스의 외피단백질을 타깃으로 하는 가용화 조건의 설정과 생산 방법에 관한 것이다.

배경기술

[2]
감염 또는 질병을 유발하는 마커 단백질을 진단 목적의 원료로 사용하는데 있어 자연 상태의 물질을 대량 공급하는 데에는 어려움이 있기 때문에 주로 유전자 재조합 기술을 사용하게 된다. 외래 단백질을 재조합을 통해 발현하는 시스템은 전통적으로 박테리아, 이스트, 곤충 또는 포유류의 세포, 재조합 식물이나 동물 등에 의한 것으로 분류할 수 있는데, 그 중 대장균은 손쉽게 다룰 수 있으며 유지 및 실험이 용이하다는 장점이 있다(Rosano G. L. 등, Front Microbiol, 5:172, 2014). 그러나, 대장균에서의 재조합 단백질 제조 과정에서는 때때로 타깃 단백질의 소수성, 이황화결합, 또는 독성 등의 원인으로 인해 불안정한 구조의 단백질이 비가역적 반응에 의해 고농도로 얽히는 불용성의 내포체가 형성된다. 내포체로 발현되는 경우, 액상의 재조합 단백질 형태로 이용할 수 없기 때문에 발현 시에 가용성 단백질로 바꾸어 발현 하거나, 또는 내포체 형태로 발현 후 가용화하는 것이 필수적이다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005).
[3]
위와 같은 문제를 해결하기 위한 방법 중 가용성 단백질로 발현하는 방법은 단백질 총합성량을 발현 온도나 프로모터, 배지, 발현 유도물질의 농도 등을 이용해 감소시키는 방법, 샤페론을 이용하는 방법, 분비 형태 또는 세포질(cytoplasm)로 발현하는 방법, 이황화결합 발현 전용 균주를 사용하는 방법, 표지단백질(tagging protein)을 이용하는 방법, 융합 형태의 단백질로 발현하는 방법 등이 포함되며, 내포체를 가용화 하는 방법으로는 화학성분을 이용하는 방법 등이 있다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005; Yamaguchi H. 등, Biomolecules, 4(1):235-51, 2014; Ghosh S. 등, Biotechniques, 37(3):418, 420, 422-3, 2004; Singh P. 등, PLoS One, 8(5):e63442, 2013).
[4]
이러한 방법들 중 내포체를 가용화 하기 위해 화학성분을 이용하는 방법은 6M 이상의 우레아 또는 구아니디늄클로라이드 등의 카오트로픽제에 완충용액 성분을 포함한 조성으로 내포체를 변성하는 과정, 용액의 조성에 있어 각종 완충용액, 응집 방지 물질, 구조 안정화 물질, 계면활성제, 염, 킬레이트제, 산화환원제, 양이온성 물질 등의 조합으로 다양하게 구성될 수 있는 가용화 과정을 포함한다(Singh S. M. 등, J Biosci Bioeng, 99(4):303-10, 2005; Yamaguchi H. 등, Biomolecules, 4(1):235-51, 2014).
[5]
이와 같은 다양한 화학성분과 농도 및 비율의 조합이 타깃 재조합 단백질의 특성에 완전히 부합할 때 변성된 단백질이 침전물을 형성하지 않고 가용성으로 바뀔 수 있으며, 적합한 가용화 조건을 설정하는 데에는 상당한 시간과 노력이 요구되기 때문에, 대장균에서 내포체 형태로 발현되기 쉬운 타깃 재조합 단백질을 얻기 위해서는 가용화 조건을 보다 간단히 설정할 수 있는 기술과 이를 포함하는 재조합 단백질의 생산 기술을 필요로 한다.
[6]
국내외 다양한 시약 제조사에서는 이렇듯 실험자로 하여금 많은 시간과 노력을 요하며, 가용성 단백질에 비해 생산 수율 또한 현저히 낮은 단백질 가용화 조건 탐색을 보다 손쉽게 할 수 있도록 다양한 화학 조성물을 상업용 키트로 제공하고 있다. 이 조성물들은 실험자가 흔히 접할 수 있는 완충 물질과 염, 양이온성 물질, 산화환원제 등을 기본 조성으로 함과 동시에 다양한 친수성 아미노산인 아르기닌, 라이신, 프롤린 등과, 계면활성제인 트윈, N-라우릴사코실, CTAB 등, 환원제인 TCEP 등, 단당류인 만노스, 만니톨 등, 인공 샤페론 기능을 하는 사이클로아밀로스, 사이클로덱스트린 등, 이황화결합에 영향을 줄 수 있는 설포비테인, 시스틴, 시스테인, DTT 등, 응집 방지 기능을 하는 BSA, PEG, 글리세롤, 수크로스 등을 첨가물로 포함하기도 한다. 실제로 이러한 첨가물들은 단백질 가용화에 긍정적인 영향을 미치며, 보다 더 안정적으로 단백질 가용화를 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다 (Burgess R. R., Methods Enzymol, 273:145-9, 1996; Rudolph R. 등, FASEB J, 10(1):49-56, 1996; Vuillard L. 등, 256(1):128-35, 1998; Bessette P. H. 등, 96(24):13703-8, 1999; Wetlaufer D. B. 등, 1(2):141-6, 1987; Cleland J. L. 등, 267(19):13327-34, 1992).
[7]
그러나, 이러한 첨가물들은 또한 미니 스케일로 조건 설정 후 대량으로 단백질을 생산하는 데 있어 생산비용을 큰 폭으로 증가시키며 조성이 매우 복잡할 뿐만 아니라, 가용화 후 해당 물질을 제거하기 위한 투석 과정에서 다시 불용성 침전물을 형성할 가능성이 있어 산업화에 적용하기에는 완벽하지 않다는 한계점을 가지고 있다.
[8]
한편, 본 발명에서 타깃으로 하는 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV)는 후천성 면역 결핍 증후군(Acquired Immunodeficiency syndrome; AIDS)을 유발하는 주요 아형인 HIV-1 또는 2타입으로 분류되며, 각각의 외피유전자(envelope gene; env)가 암호화하는 당단백질인 gp41 또는 gp36을 포함하고 있다. 이는 항원성이 높으며, AIDS 감염 시에 강한 항체반응을 유도하므로 항체 기반 진단 시 유용한 타깃으로 사용될 수 있다 (Xu Z. 등, African J Microbiol Res, 6(33):6295-99, 2012). 그러나 대장균에서의 경우, gp41와 gp36이 갖는 강한 소수성으로 인해 과발현 시 내포체로 형성되기 쉽기 때문에 이를 수득하는데 어려움이 있다 (Scholz C. 등, J Mol Biol, 345(5):1229-41, 2005).
[9]
또한, 뎅기 바이러스(Dengue virus)는 뎅기 출혈열(Dengue hemorrhagic fever; DHF)와 뎅기 쇼크 증후군(Dengue shock syndrome; DSS), 뎅기열(Dengue fever; DF) 등을 유발하는 바이러스로, 4종의 혈청형인 Dengue-1, 2, 3 또는 4타입으로 분류된다. 외피단백질 중 domain III가 바이러스 부착에 기여하며 표면 노출로 인해 항원기로 작용할 수 있으므로 재조합 시 주요 타깃으로 사용되지만, 대장균에서 발현할 경우 이황화결합과 소수성으로 인해 내포체로 형성되기 쉬우므로 수득에 어려움이 있다 (Fahimi H. 등, Iran J Basic Med Sci, 17(11):836-43, 2014; Jaiswal S. 등, Protein Expr Purif, 33(1):80-91, 2004; Liao M. 등, Cell Biol, 171(1):111-20, 2005).
[10]
상기 감염성 질병의 중요성에 의해 면역학적 진단에 이용될 재조합 원료 수득에 앞서, 바이러스 당단백질 등 대장균에서 흔히 내포체 형태로 발현될 수 있는 다양한 재조합 항원 타깃에 대해 보다 간편한 가용화 조건의 탐색 방법과, 고농도의 카오트로픽제 또는 계면활성제 등을 포함하지 않도록 하는 보다 단순화 된 형태의 가용화물 조성, 그리고 이를 포함하는 가용성 재조합 단백질의 생산 방법 확립이 선행되어야 할 것이다.
[11]
[선행 특허 문헌]
[12]
대한민국 특허공개번호 제1020120088348호

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[13]
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 대장균 발현 시스템에서 내포체 형태로 발현되는 타깃 단백질의 가용화 조건을 96종의 단순화 된 형태의 조성물을 이용해 미니스케일로 스크리닝 함에 따라 신속하게 설정하며, 이를 이용해 재조합 항원 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
[14]
본 발명의 다른 목적은 면역 진단의 타깃이 되는 단백질 마커 중 재조합 시 대장균에서 흔히 내포체 형태로 발현되는 단백질, 특히 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36, Dengue-2 타입 또는 3 타입재조합 외피단백질(E2 또는 E3)을 얻는 데 있어 상기의 방법을 통해 가용화 조건을 확립, 이를 이용한 생산 방법을 제공하는 데 있다.
[15]

과제 해결 수단

[16]
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)pH 6.5, 내지 9.5의 완충 물질;b)굴루타치온(GSH) 및 산화형 글루타치온(GSSG) 혼합물; 및 c)염화나트륨(NaCl)를 필수 구성성분으로 포함하며,선택적으로 아르기닌, 또는 염화 마그네슘 및 염화 칼슘 혼합물을 유효성분으로 포함하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물을 제공한다.
[17]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 완충 물질은 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid), 트리스(Tris-(hydroxymethyl) aminomethane), 및 글라이신(Glycine) 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[18]
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 GSH와 GSSG의 혼합 몰비는 5/1에서 10/1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[19]
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 염화나트륨은 20 내지 180mM 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[20]
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 아르기닌은 0.5M인 것이 바람직하고, 상기 염화 마그네슘 및 염화 칼슘 농도는 각각 2mM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[21]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36, 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[22]
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 단백질의 경우에 상기 조성물은 pH 6.5 내지 9.5의 완충 용액, 0.5M 아르기닌, GSH와 GSSG의 혼합용액, 20 내지 180mM 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 각각 2mM 염화 마그네슘과 칼슘클로라이드 농도의 혼합용액을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[23]
또 본 발명은 a)내포체를 생산하는 재조합 균주로부터 내포체를 분리 수득하는 단계;및 b) 상기 수득된 내포체에 상기 본 발명의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 가용화 방법을 제공한다.
[24]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 내포체는 발현 완료된 세포에 세포파쇄용액 처리 후 원심분리 하여 얻어진 불용성 침전물을 버퍼로 부유해 파쇄 및 원심분리를 반복하는 워싱 과정을 거치는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[25]
또 본 발명은 상기 본 발명의 가용화 방법에 의하여 얻어진 재조합 단백질을 재조합 항원으로 사용하는 방법을 제공한다.
[26]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36, 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
[27]
또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 사용된 재조합 항원을 검체에 처리하여 양성 검체 내에 존재하는 해당 재조합 항원에 특이적인 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
[28]
또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 사용된 재조합 항원을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
[29]
이하 본 발명을 설명한다.
[30]
본 발명에서 가용화란, 용액 상태의 항원 물질을 얻는 데 있어 용액 내 고농도의 카오트로픽제(chaotropic agent)나 계면 활성제 등을 포함하지 않으며, 따라서 카오트로픽제를 제거하여도 가용성 단백질로 남아 구조적 재구성을 통해 생리 활성이 복구되거나 항원작용기가 기능할 것으로 여겨지는 과정을 뜻한다.
[31]
본 발명은 재조합 대장균에서 발현되는 내포체(inclusion body)의 가용화 조건 설정 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 재조합 대장균 유래의 강한 소수성을 띠는 각각의 타깃 단백질에 8M의 우레아를 포함하는 변성 용액과, 다양한 화학성분을 포함하는 96종의 가용화 용액 조성물을 사용해 불용성 침전물을 형성하지 않는 가용화 조건을 손쉽게 설정하는 방법을 제공한다.
[32]
또한 타깃 단백질의 변성, 정제, 가용화, 투석, 농축을 순차적으로 거치는 일련의 과정을 재조합 단백질의 생산 방법으로 제공한다. 본 발명에서 제공되는 방법으로 얻어진 가용성 재조합 단백질은 고농도의 카오트로픽제(chaotropic agent)나 계면활성제를 포함하지 않으므로 진단 목적 등의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.
[33]
본 발명에서는 재조합 단백질, 특히 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV)-1 타입 외피단백질 gp41 또는 2 타입 외피단백질 gp36, 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피단백질(envelope protein, E) domain III를 발현하는 재조합 대장균 균주로부터 4종의 타깃 단백질을 각각 가용화하여 재조합 항원을 생산하였으며, 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 타깃 단백질의 분자량을 확인하였다. 또한 이를 원료로 하는 신속진단키트를 제작, 시험하여 항원작용기의 기능 여부와 진단 목적의 면역크로마토그래피 원료로 이용 가능성을 확인하였다.
[34]
본 발명은 대장균 시스템을 이용하여 내포체(inclusion body) 형태로 발현되는 단백질을 가용화 시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 재조합 대장균 유래의 강한 소수성을 띠는 각각의 타깃 단백질을 변성 용액 및 다양한 화학성분을 포함하는 가용화 용액을 사용하여 간편하고 신속하게 조건을 설정한 후, 이를 이용하여 재조합 항원을 생산하는 것을 특징으로 한다.
[35]
본 발명에 따른 내포체의 가용화 조건 설정 방법은 재조합 대장균에서 내포체 형태로 발현되는 경우에 타깃 단백질의 종류와 무관하게 사용될 수 있으므로, 흔히 면역진단의 타깃이 되는 바이러스 당단백질, 소수성 아미노산 잔기의 함유량이 높은 단백질, 이황화 결합을 다수 포함하는 단백질, 균주 생장에 저해가 되는 독소 종류를 포함하는 단백질 등을 재조합 하는 경우 유용하게 이용될 수 있다.
[36]
본 발명에 있어서, 목적 유전자는 N-말단 또는 C-말단에 말토스 결합 단백질(Maltose binding protein), 히스티딘, FLAG, S-표지, c-myc 등을 표지 단백질로 갖도록 하여 클로닝 할 수 있고, T7 프로모터를 가진 BL21, Rosetta, Origami와 같은 계열의 다양한 대장균을 이용하여 형질전환 할 수 있으나, 상기 타깃에 대하여는 C-말단에 6X-히스티딘을 갖는 pET-22b 벡터와 BL21(DE3) 균주를 사용하였다. 재조합 대장균의 발현 시에는 발현 온도와 유도시점 흡광도, 유도물질 β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)의 농도, 진탕배양 조건, 유도 후 발현 시간 등이 실험 조건으로 적용될 수 있으며, 상기 타깃들에 대하여는 O.D 600 0.7 내외에서 IPTG 1mM 조건으로 발현하는 것이 바람직하였다.
[37]
내포체의 분리 수득 시에는 발현 후 수득한 균체 1g 당 5ml의 세포파쇄용액으로 부유하여 20분 교반해 얻어진 상등액과, 동일 부피의 트리스 버퍼로 침전물을 부유해 초음파 파쇄 및 원심분리를 반복하여 얻어진 상등액을 제거하는 것이 바람직하였으나 세포 용해 시 사용 가능한 계면활성제 등은 실험자에 의해 선택될 수 있고, 용해 시에는 프로테아제 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktail) 또는 PMSF 등을 첨가하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
[38]
내포체 변성 용액은 고농도의 카오트로픽제(우레아 또는 구아니디늄클로라이드)를 반드시 포함하며, 트리스 및 소듐포스페이트 등의 완충물질과 EDTA, 소듐클로라이드, 글리세롤, SDS, 이미다졸, DTT, GSH, GSSG, 시스테인, β-mercaptoethanol 등이 첨가제로 사용될 수 있으나, 본 발명의 타깃 단백질을 변성하는 데에는 우레아, 트리스, 소듐클로라이드, GSH, GSSG의 혼합 용액을 사용하는 것이 바람직하였다. 또한, 변성 용액은 상기 타깃의 분리된 내포체 약 0.5g 당 5ml을 사용하는 것이 바람직하였으나, 이에 한정하지 않는다.
[39]
[40]
본 발명의 대장균 유래 내포체를 가용화 하여 재조합 항원을 얻는 방법의 일례는
[41]
(1)과발현된 재조합 대장균 유래 내포체를 분리 수득하여 변성하는 단계;
[42]
(2)변성 내포체를 정제하는 단계;
[43]
(3)정제된 분리 분획을 가용화 하는 단계;
[44]
(4)투석과 농축을 통해 카오트로픽제를 감소, 이용 가능한 고농도의 항원을 만드는 단계이다.
[45]
상기 단계 (1)은 내포체 발현 시 모두 적용될 수 있으나, 정제 시 표지 단백질을 이용하고 그 구조가 반드시 접힘 상태여야 하는 경우 상기 단계의 (3), (4)와 (2)는 순서를 바꾸어 적용할 수 있고, 단계 (2) 완료 후 상기 단계 (3), (4)를 다시 실시함으로써 같은 결과를 얻을 수 있다. 상기 단계 (2)에 있어서 변성 상태의 단백질 정제 시에는 프로본드 니켈 킬레이트 레진을 사용하여 결합 시킨 뒤 우레아가 첨가된 정제 완충용액을 이용하여 타깃 단백질을 수득하는 것이 바람직하였으며, 내포체 1g 당 1-2ml의 레진을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
[46]
본 발명은, 수득한 변성 상태의 단백질을 이용하여 가용화 조건을 신속하게 설정할 수 있도록 다양한 화학성분의 농도와 비율을 포함하는 96종의 용액 조성물을 제공한다. 상기 가용화 반응은 pH를 적정할 수 있는 완충물질로 MES, HEPES, 트리스, 글라이신 이외에도 보레이트, 소듐포스페이트 등을 이용할 수 있고, 불용물 저해제 또는 안정화 물질로 아르기닌, 프롤린, 사이클로덱스트린, 글리세롤, 수크로스, DMSO, PEG, 트라이톤X-100, 암모늄 설페이트, 산화환원 포텐셜 조정을 위한 물질로 GSH, GSSG, DTT, 시스테인, β-mercaptoethanol, 이온성 물질로 마그네슘클로라이드, 칼슘클로라이드, 소듐클로라이드, 포타슘클로라이드 등과 더불어 저농도의 카오트로픽제, EDTA 등이 사용될 수 있다. 상기 가용화 과정에서 사용되는 용액에서는 단일 불용물 저해제로 아르기닌을 사용하는 것이 적합하였다. 바람직하게는, pH 6.5, 7.5, 8.5 또는 9.5의 MES, HEPES, 트리스 또는 글라이신을 50mM로 사용하며, 0 또는 0.5M의 아르기닌, 2mM GSH와 0.2mM GSSG 또는 10mM GSH와 2mM GSSG 혼합용액, 20, 60, 또는 180mM 소듐클로라이드, 0 또는 2mM 마그네슘클로라이드와 칼슘클로라이드 혼합용액의 조합으로 시험하는 것이 적합하였다. 변성 및 가용화 시에는 단백질 구조 변화와 안정화에 충분한 시간을 적용하여야 하므로 4℃에서 O/N 조건으로 수행하는 것이 가장 바람직하다.
[47]
본 발명에서 미니 스케일의 가용화 조건 설정 실험 방법으로 바람직하게는 상기 96종의 각 가용화 조성물 1ml 내에 단백질 농도 기준 50mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 100mg/ml 내외의 변성 용액을 1/100 부피비로 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 16시간 이상 반응하는 것이 적합하였으며, 반응 후 4℃, 16,000g에서 10분 이상 원심분리 하여도 불용성 침전물의 형성이 확인되지 않으면 해당 가용화 용액 조성이 타깃 단백질의 가용화에 적합하다고 보아도 무방하였다.
[48]
가용화된 단백질을 포함하는 용액은 희석된 타깃 단백질과 더불어 카오트로픽제 등 다양한 화학성분을 포함하므로 항원 물질로 다양한 분야에 적용하는데 어려움이 따르기 때문에 성분의 제거와 단백질의 농축 과정을 거치는 것이 바람직하다. 본 발명에서 가장 적합하게는 투석막을 이용해 완충 용액 성분으로 충분히 교환한 후, 단백질 분리막을 포함하는 원심분리형 아미콘 튜브를 이용해 농축하는 방법이 있다.
[49]
본 발명에서는 면역 진단의 타깃이 되는 재조합 단백질, 특히 HIV gp41 또는 gp36, Dengue E2 또는 E3 재조합항원의 제조에 있어 상기의 방법을 통해 얻어진 가용화 조건의 설정 방법 및 이를 이용한 생산 방법을 제공하지만 이에 한정하지 않는다.
[50]

발명의 효과

[51]
본 발명은 상기 가용화 용액의 조성 범위를 이용하여 재조합 대장균 유래 내포체의 가용화 조건을 설정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 가용화 과정을 통해 대장균에서 내포체로 발현되는 단백질을 보다 손쉽게 재조합 항원으로 제조, 대량생산 할 수 있다. 본 발명에서는 이렇게 조제된 재조합 항원을 면역학적 방법으로 검증하였으므로, 면역크로마토그래피 신속진단키트 등에 단백질 마커 원료로 적용 가능할 것으로 사료된다.
[52]

도면의 간단한 설명

[53]
도 1 내지 2는 재조합 항원 단백질 발현 벡터의 구조를 나타낸 것으로, 도 1은 대장균에서 HIV-1 타입 gp41 또는 2타입 gp36 재조합 항원 단백질을 발현하는 벡터 gp41/gp36-pET의 모식도이다. 도 2는 대장균에서 Dengue E2 또는 E3 재조합 항원 단백질을 발현하는 벡터 E2/E3-pET의 모식도이다.
[54]
도 3은 웨스턴 블랏 결과로, A는 항-gp41 항체로 HIV-1 타입 재조합 단백질의 항원성을 검증한 결과이며, B는 항-gp36 항체로 HIV-2 타입 재조합 항원 단백질의 항원성을 검증한 웨스턴 블랏 결과이다. 공통적으로 M은 분자량 마커; A의 라인 1, gp41 재조합 항원 단백질; B의 라인1, gp36 재조합 항원 단백질.
[55]
도 4는 항-히스티딘 항체로 Dengue E2 또는 E3 재조합 항원 단백질을 검증한 웨스턴 블랏 결과이다. M은 분자량 마커; N, negative control로 GST 표지 단백질; 라인1, 뎅기 E2 재조합 항원; 라인2, 뎅기 E3 재조합 항원.
[56]
도 5는 조제된 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 항원 단백질을 테스트 라인의 원료로 하여 면역크로마토그래피 신속진단키트를 제작하고, 이를 양성 혈청을 이용해 검사한 결과이다. 1은 Negative control; 2, gp41 원료를 KFDA Standard HIV/MP2로 test ; 3, gp36 원료를 HIV 양성 혈청 패널(Seracare, USA) 로 test.
[57]
도 6은 조제된 Dengue-2 타입 또는 3타입 외피단백질 domain III 재조합 항원 단백질을 골드 컨쥬게이트의 원료로 하여 면역 크로마토그래피 신속진단키트를 제작하고, 이를 양성 혈청을 이용해 검사한 결과이다. 1은 Negative control; 2, E2와 E3 원료를 Dengue 양성 환자 혈청으로 test.
[58]

발명의 실시를 위한 형태

[59]
이하, 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 실시예 1을 통하여 대장균 유래 내포체의 분리수득과 96종 가용화 조건 탐색을, 그리고 실시예 2와 3을 통하여 HIV gp41 또는 gp36, Dengue E2 또는 E3 재조합 항원의 가용화 조건 설정 및 생산 방법을 각각 나열하고자 한다. 본 발명의 요지에 따라 다음 실시예에 의해 국한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[60]
[61]
[62]
실시예 1 : 96종 가용화 용액 조성물 및 재조합 항원의 가용화 조건 스크리닝 방법
[63]
내포체로 과발현된 불용성 단백질을 얻기 위해 수득된 세포 1g 당 단백질추출용액인 버그버스터(Novagen, USA) 5ml로 부유, 20분 교반하여 세포용해 후 상등액을 제거하고 침전물을 취한 뒤, 순수분리를 진행하였다. 워싱 목적으로 50mM 트리스(pH 8.0) 완충용액을 버그버스터와 동일 부피로 첨가해 20초간 초음파 파쇄와 원심분리 후 상등액을 버리는 과정을 각각 3회 반복 실시하였다. 이후, 수득된 내포체는 pH 7.8의 8M 우레아, 5mM 트리스, 0.1M 소듐클로라이드로 구성된 변성 용액을 내포체 약 0.5g 당 5ml 첨가해 초음파 파쇄를 위와 동일 조건으로 실시한 뒤, 2mM의 GSH와 1mM의 GSSG를 첨가하였다. 상기 용액을 4℃에서 16시간 이상 반응한 후 원심분리 함에 따라 변성상태의 상등액 단백질로 수득할 수 있었다.
[64]
상기 재조합 항원은 변성상태로, 니켈킬레이트 레진을 이용한 오픈컬럼 정제를 실시하여 타깃 단백질을 얻을 수 있다. 정제된 재조합 항원의 분리분획은 변성 상태이기 때문에 항원 원료로 이용되기 위해 카오트로픽제가 제거된 상태에서도 가용성 용액이어야 하며, 이를 위해 시약의 조성은 가용화에 도움을 줄 수 있는 각종 화학성분의 농도와 비율을 포함해 96종의 시험용 조합으로 구성하였다.
[65]
상기 조성은 아래 표 1과 같이 구성하였다. 이는 단백질을 안정화할 수 있는 완충 pH 범위를 4종류로 나누었고, 이는 50mM의 MES, HEPES, 트리스 또는 글라이신에 해당하며, 이외의 첨가제로 0 또는 0.5M 아르기닌, 2mM GSH와 0.2mM GSSG 또는 10mM GSH와 2mM GSSG 혼합용액, 20, 60 또는 180mM 소듐클로라이드, 0 또는 2mM 마그네슘클로라이드와 칼슘클로라이드 혼합용액(각각 2mM 농도로 혼합)의 조합과 같다. 상기 농도 및 비율 조합을 바탕으로, 가용화 조건을 설정할 수 있는 96종 조성물에 대해 미니 스케일 스크리닝을 진행한다. 가용화 용액 1ml 당 50mg/ml 이상의 변성상태 용리 단백질을 1/100의 부피비로 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 16시간 이상 반응하였다. 반응이 완료된 후에는 4℃에서 16,000g로 10분 이상 원심분리 하여 불용성 침전물 여부를 확인한 후 적합한 가용성 버퍼 조성을 선택하였다.
[66]
[67]
[표1]
Buffer50mM Arginine 0M Arginine 0.5M
MES (pH 6.5) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 GSH/GSSG2/0.2mM
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 GSH/GSSG10/2mM
HEPES(pH 7.5) 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 GSH/GSSG2/0.2mM
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 GSH/GSSG10/2mM
Tris-HCl(pH 8.5) 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 GSH/GSSG2/0.2mM
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 GSH/GSSG10/2mM
Glycine(pH 9.5) 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 GSH/GSSG2/0.2mM
85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 GSH/GSSG10/2mM
MgCl2/CaCl2 0mM MgCl2/CaCl2 2mM MgCl2/CaCl2 0mM MgCl2/CaCl2 2mM
NaCl 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM NaCl

[68]
[69]
표 1은 96종 미니스케일 스크리닝 조성
[70]
[71]
실시예 2 : HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 항원의 가용화 조건 설정 및 생산 방법, 조제항원 기반 면역크로마토그래피 신속키트 적용
[72]
1) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 유전자 클로닝 및 발현벡터 조제
[73]
gp41 또는 gp36 유전자를 주형으로 해당 타깃 DNA를 얻기 위하여 표 2의 프라이머를 이용해 PCR을 수행 후, 전기영동 하여 약 400bp 크기의 타깃 DNA가 얻어진 것을 확인하였다. 타깃 DNA를 pGEM ®-T easy 벡터(Promega, USA)와 라이게이션 한 후, 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. 상기 균주는 선별하여, EcoRI, SalI(Takara, Japan) 제한효소를 37℃에서 처리하여 동일 제한효소로 처리된 발현벡터인 pET-22b(+)(Novagen, USA)를 이용해 도 1과 같이 서브 클로닝 하였다. 대장균 DH5α와 동일하게 앰피실린을 포함하는 배지를 이용해 조제 벡터(gp41-pET, gp36-pET)가 포함된 BL21(DE3)(Invitrogen, USA) 균주인 gp41-pET-BL21과 gp36-pET-BL21을 선별하였다.
[74]
[표2]
gp41 - pET gp36 - pET
정방향 프라이머 CGC GAA TTC G ATG ACG CTG ACG GTA CGC GAA TTC G GCC CAG TCC CGG ACT
역방향 프라이머 GC GTC GAC CAA ACT TGC CCA GC GTC GAC GGA GGT TAA GTC

[75]
표 2는 프라이머 서열
[76]
2) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36의 재조합 단백질 과발현
[77]
형질전환된 각각의 재조합 균주(gp41-pET-BL21, gp36-pET-BL21)는 발현 시에 각각 600nm에서의 흡광도가 gp41은 0.7, gp36은 0.6에 도달했을 때 IPTG 최종농도 1mM 조건으로 과발현 유도를 실시하였고, 유도 시점부터 각각 4시간씩을 더 배양하였다. 발현된 배양액은 원심분리하여 균체를 회수하였다. 분리된 균체는 버그버스터(Novagen, USA) 단백질 추출용액을 첨가하여 부유한 뒤, 20분간 교반하며 세포 용해를 진행하였다. 원심분리를 통해 상등액과 침전물을 분리하여 침전물은 내포체, 상등액은 가용성 단백질인 것으로 보고 이를 각각 12% SDS-PAGE로 확인하여 각각의 재조합 항원이 약 17kDa 크기로 내포체로 과발현 됨을 확인하였다. 타깃 단백질은 발현벡터에 의해 C-말단에 6X-히스티딘 잔기를 보유하고 있을 것으로 생각되었다.
[78]
[79]
3) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36의 대장균 유래 내포체 분리 수득
[80]
재조합 항원 gp41 또는 gp36은 내포체로 과발현 되기 때문에 상기 실시예2 -2)에서 획득한 세포를 실시예1과 같이 용해한 후 얻어진 상등액은 제거하고 침전물을 취하였다. 분리된 침전물은 내포체 양에 비례한 변성 용액을 통해 실시예 1과 동일조건으로 변성 과정을 실시하여 카오트로픽제에 의해 용해된 상등액인 변성 단백질을 얻을 수 있었다.
[81]
[82]
4) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 단백질 정제
[83]
상기 재조합 항원 gp41 또는 gp36은 변성 상태로 오픈 컬럼 정제를 실시하였다. 실시예2 -3)으로부터 수득한 변성 상태의 gp41 또는 gp36은 시린지 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다.
[84]
오픈 컬럼 정제는 프로본드 정제시스템 중 변성조건을 바탕으로 시약 및 정제방법을 일부 변경하여 사용하였다. 레진은 타깃 단백질의 C-말단에 포함된 히스티딘 잔기가 특이적으로 결합할 수 있는 니켈 킬레이트 레진(Invitrogen, USA)을 사용하였고, 정제 시 사용되는 버퍼는 동일 조성을 갖는 4종의 pH로 구성하였다. 조성은 8M 우레아, 20mM 소듐포스페이트, 0.5M 소듐클로라이드이며, pH 7.8을 단백질 결합 시, pH 6.5와 5.9를 워싱 시, pH 4.0을 용리 시에 사용하였다.
[85]
슬러리 상태로 20% 에탄올에 저장된 레진을 오픈 컬럼 내부에 첨가한다. 증류수로 충분히 에탄올을 세척한 후, pH 7.8의 결합용 완충용액을 레진의 5-10배 부피로 흘려준다. 상기 재조합 항원이 변성된 상태의 용액을 컬럼에 주입한 뒤, 레진과 함께 부유하여 코니칼 튜브에 옮기고 교반기에서 상온 2시간 교반하여 결합하였다. 반응이 완료된 재조합 항원과 레진은 천천히 컬럼에 옮겨 완충용액을 pH 7.8, pH 6.5 pH 5.9 순차대로 흘려주며 타깃 이외의 단백질을 워싱하여 분리하고, 최종적으로 pH 4.0의 용리 완충용액을 주입하여 타깃 단백질을 얻을 수 있었다. 각 pH별 분획은 모두 회수하여 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였고, 그 중 용리 단계에서 타깃 단백질이 효과적으로 분리됨을 확인하였다.
[86]
[87]
5) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 단백질의 가용성 향상 방법
[88]
상기 정제된 재조합 항원 gp41과 gp36은 대장균 발현 시 내포체로써, 불용성단백질이기 때문에 액상의 항원 원료로 이용되기 위해 카오트로픽제를 제거하여도 가용성 상태여야 한다. 실시예 1과 같이 해당 타깃 단백질의 용리 분획을 96종 가용화 조성물을 이용한 미니스케일 스크리닝 방법을 통해 적합한 가용화 용액 조건을 탐색하였다. 스크리닝 결과, 표 4와 같이 침전 유무를 확인할 수 있었으며, 재조합 항원 gp41 또는 gp36이 동일한 조성 조건에서 가용성 단백질로 안정화됨을 확인하였다. 아르기닌을 첨가하지 않을 때, 완충버퍼 범위와 첨가제 유무 및 농도와 상관없이 침전물이 생기는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, 0.5M 아르기닌이 첨가된 조성에서는 첨가제 유무, 농도에 따라 가용화가 향상되는 조건을 설정 할 수 있었다.
[89]
MES버퍼는 10mM GSH와 2mM GSSG 조건에서 소듐클로라이드 농도와 마그네슘클로라이드 및 칼슘클로라이드 유무에 영향 받지 않는 19~24번 버퍼가 침전물이 생기지 않았다. 또한, HEPES 버퍼는 31~36, 43~48번, 트리스는 MES와 동일 조성인 67~72번 조성, 글라이신은 HEPES와 동일 조성인 79~84번, 91~96번 조성이 적합함을 확인하였다.
[90]
상기 정제 후 용리된 변성 상태의 재조합 항원 gp41 또는 gp36은 36개의 조성 중 한 가지를 택하여 4℃에서 16시간 이상 반응하였다. 이후, 용액 조성물을 투석 과정을 통해 제거하였다. 투석막(Spectrum, USA)을 증류수로 활성화시킨 뒤, 이에 타깃 재조합 단백질을 포함하는 가용화 용액을 넣고, 10mM 카보네이트 완충용액에서 교반하되, 반복하여 투석용액을 계속 교체하여 가용화 버퍼 내 조성물을 서서히 제거하였다. 이어서, 가용화 용액으로 인해 희석된 상태의 재조합 단백질을 재농축하기 위해 단백질용 원심분리 필터인 아미콘 튜브(Merck, USA)를 사용하여 원심분리를 수행하였다. 최종 수집된 농축 상태의 재조합 단백질이 적정 농도가 될 때까지 이를 반복 수행하였다.
[91]
[92]
6) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 항원의 면역학적 검증
[93]
상기 조제된 gp41 또는 gp36 재조합 항원을 면역학적 방법으로 검증하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 재조합 항원은 12% SDS-PAGE에 로딩하여 전개가 완료된 겔로부터 10분간 메탄올에서 활성화 된 PVDF 막(Whatman, USA)으로 Trans blot SD(BIO-RAD)를 이용해 25V에서 40분, 반건조 조건으로 옮겼고, 상기 PVDF 막은 PBS 희석된 5% 카제인 용액에서 1시간 교반해 블로킹하였다. 이후, PBST 용액으로 10분간 교반해 워싱하고, PBS로 1:1,000 희석된 염소 유래 항-gp41, gp36 단클론 항체(Pierce, USA)와 교반해 결합시켰다. 이를 PBST로 10분씩 3회 워싱 후, HRP가 결합된 염소 유래 항-마우스 면역글로불린G를 PBS로 1:5,000 희석한 용액에 30분 교반하여 반응하였다. 이를 PBST로 10분씩 3회 워싱 후, 증류수로 1회 추가 워싱하여 디아미노벤지딘(SIGMA Aldrich, Germany)을 이용해 발색하였고, 적정 수준으로 발색 되면 소듐아자이드로 반응을 완료하였다. 상기 모든 반응은 상온에서 실시하였다.
[94]
그 결과, 도 3과 같이 gp41 또는 gp36 재조합 항원 모두 각각의 단클론 해당 항체에 대해 특이적으로 반응하여 약 17kDa 크기의 단백질이 검출되었으므로, 조제된 두 항원이 효과적으로 정제 및 가용화되어 항원작용기가 기능함을 확인할 수 있었다.
[95]
[96]
7) HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36 재조합 항원의 항체 기반 면역 크로마토그래피 신속키트 적용
[97]
상기 조제된 gp41 또는 gp36 재조합 항원의 항체 기반 진단 기법인 면역 크로마토그래피 신속키트 적용 가능성을 확인하기 위하여 조제된 재조합 항원을 테스트용 라인으로 사용하는 신속키트의 제작이 필요하였다. 골드클로라이드에 대해 가열된 소듐사이트레이트를 첨가해 환원 상태의 콜로이달 골드 용액을 조제하여 pH를 보정하고, 결합하고자 하는 단백질을 인산염완충용액(pH 7.4)을 이용해 적정 농도로 희석한 후, 적정 비율로 콜로이달 골드 및 포타슘카보네이트 용액과 교반하여 결합시켰다. 이후, 카제인 용액을 이용하여 30분간 블로킹 하였고, 원심분리 후 하층부의 단백질 결합된 콜로이달 골드에 대해 동일 카제인 용액으로 부유하였다. 부유 시 용액의 부피비는 사용하고자 하는 컨쥬게이트의 농도에 따라 달라질 수 있다. 상기 항원과 콜로이달 골드의 적정 결합 조건은 고농도의 소듐클로라이드를 첨가함으로써 침전 발생 여부 또는 용액의 색 변화에 따라 확인할 수 있다.
[98]
상기 조제한 재조합 항원을 인산염완충용액 및 수크로스와 혼합하여 신속키트의 테스트 라인에 Reagent dispensor(Kinematic, USA)를 이용해 각각 1.5mg/ml의 농도로 분주하였다. 이에 신속키트용 스트립은 하이플로우 플러스 멤브레인(Merck, USA)을 사용하였으며, 트라이톤X-100으로 전처리 된 PE 골드용 패드를 사용하여 상기 컨쥬게이트를 흡습시켰고, 스트립과 패드는 모두 분주 후 데시케이터에서 충분히 건조하였다. 그 다음, 상기 테스트 라인이 분주된 스트립을 절단하여 플라스틱 카세트 상하판을 이용해 조립하였고, 적합한 조성의 시료 희석 용액과 함께 HIV-1 타입 gp41은 KFDA Standard HIV/MP2(Mixed Titer Performance Panel), HIV-2 타입 gp36은 HIV 양성 혈청 패널(Seracare, USA)을 이용해 검사하였다. 검사 시에는 크로마토그래피의 충분한 전개 및 전개 초기 과량의 콜로이달 골드로 인한 잘못된 결과 분석을 배제하기 위하여 시료 로딩 후 10분째에 검사 결과를 확인하였다.
[99]
그 결과, 도 5와 같이 gp41 또는 gp36 모두 각각의 재조합 항원이 분주된 위치에 컨트롤 라인과 유사 세기의 라인을 형성하였고, 이로써 조제된 재조합 항원이 HIV-1 또는 2타입 양성 검체로부터 해당 항원에 특이적인 항체와 반응하여 이를 검출하였기 때문에 gp41과 gp36 재조합 항원은 항체 기반 면역 크로마토그래피 신속키트에 적용 가능함이 확인되었다.
[100]
[101]
실시예 3 : 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피단백질 domain III의 재조합 항원 가용화 조건 설정 및 생산 방법
[102]
뎅기 바이러스-2 타입 또는 3타입 외피단백질 domain III의 주형 DNA에서 표 3의 프라이머를 이용해 상기 HIV gp41 또는 gp36과 동일조건으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 타깃 DNA를 증폭하였다. 아가로스 겔에 약 400bp 크기의 타깃 DNA를 확인한 후 상기 HIV gp41 또는 gp36의 클로닝 및 발현 벡터 조제와 동일 방법으로 형질전환주를 확보하였고, 도 2의 조제벡터(E2-pET, E3-pET)가 포함된 BL21(DE3)균주인 E2-pET-BL21, E3-pET-BL21을 최종 선별하였다.
[103]
[표3]
E2- pET E3- pET
정방향 프라이머 CCG GAA TTC G ATG TTT GTG GAA GGG GTT CCG GAA TTC G ATG TTT GTG GAA GGA GTC
역방향 프라이머 CTA CGC GTC GAC TGT GTC ATT TCC GAC ATA CGC GTC GAC TGT GTC ATT TCC CAC

[104]
표 3은 프라이머 서열
[105]
상기 선별된 각각의 재조합 균주(E2-pET-BL21, E3-pET-BL21)는 실시예2 -2)의 동일 조건에서 배양 후 600nm에서의 흡광도가 E2는 0.5, E3는 0.7에 도달했을 때 각각 IPTG 최종농도 1mM 조건으로 과발현 유도를 실시하였고, 유도 후 4시간씩 추가 배양하였다. 배양 후 상기와 동일 방법을 통해 각각의 재조합 항원이 17kDa 크기로 내포체 과발현됨을 확인하였다. 과발현된 내포체를 분리하고자 실시예2 -3)의 방법을 통해 변성 상태의 단백질을 수득 후, 재조합 항원 E2 또는 E3를 실시예2 -4)와 동일한 방법으로 정제하여 타깃 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 정제된 재조합 항원 E2 또는 E3는 상기 실시예1과 같이 96종 미니스케일로 가용화 용액 조성의 조건을 탐색하였다. 그 결과, gp41 또는 gp36과 같이 표 4와 동일한 조성범위를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 가용화 조성 36개 중 한가지 조성을 사용하여 가용화 과정을 진행 하였다. HIV gp41 또는 gp36과 동일한 투석 과정을 진행하여 가용화 용액 내 조성을 제거하고, 재조합 단백질의 농축을 통해 재조합 항원을 수득하였다. 이어서, 실시예2 -6)과 같이 웨스턴 블랏을 통해 타깃 단백질의 크기를 확인하였다. 상기와 동일 방법으로 수행하되, 1차 항체로는 PBS로 1:1500 희석된 항-히스티딘 단클론 항체(Pierce, USA)를 사용하였다. 그 결과, 도 4와 같이 Dengue E2 또는 E3 재조합 항원의 표지 단백질인 히스티딘에 특이적으로 반응하여 각각의 타깃 단백질 분자량인 약 17kDa의 크기를 확인할 수 있었다.
[106]
단백질 분자량이 확인된 Dengue E2 또는 E3 두 종류의 재조합 항원은 실시예2 -7)과 같이 조제된 콜로이달 골드와 반응시켜 컨쥬게이트를 제작하였다. Dengue E2 또는 E3 항원을 인산염 완충용액(pH7.4)을 이용하여 적정 농도로 희석 후 콜로이달 골드에 적정 비율의 포타슘카보네이트 용액과 교반시켜 결합하였고, 이후 카제인 용액을 이용하여 30분간 블로킹 하여 원심분리 된 하층부의 단백질 결합 콜로이달 골드에 대해 동일 카제인 용액으로 부유하였다. 부유 시 용액의 부피비는 사용하고자 하는 컨쥬게이트의 농도에 따라 달라질 수 있으며, 컨쥬게이트를 트윈 20으로 전처리 된 PE 골드용 패드를 사용하여 흡습시킨 다음 실시예2 -7)과 같은 방법으로 항-사람 면역글로불린 G와 M을 테스트 라인 원료로 분주하여 상기와 같이 신속키트를 제작하였다. 이어서 적합한 조성의 시료 희석 용액과 함께 필리핀에서 제공받은 Dengue 양성 환자의 혈청을 이용해 검사하였고, 충분한 전개 및 전개 초기 과량의 콜로이달 골드로 인한 잘못된 결과 분석을 배제하기 위하여 시료 로딩 후 10분째에 검사 결과를 확인하였다.
[107]
그 결과, 도 6과 같이 항-사람 면역글로불린 G 테스트 라인 위치에 라인을 형성하였으므로 조제된 재조합 항원 E2 또는 E3-골드 컨쥬게이트가 양성 혈청 내 존재하는 특이적인 항체와 반응하여 이를 검출한 것임을 확인할 수 있다. 이로써 Dengue E2 또는 E3 재조합 항원은 항체 기반 면역 크로마토그래피 신속키트에 적용 가능할 것으로 사료된다.
[108]
[표4]
Buffer50mM Arginine 0M Arginine 0.5M
MES (pH 6.5) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 GSH/GSSG2/0.2mM
X X X X X X X X X X X X
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 GSH/GSSG10/2mM
X X X X X X O O O O O O
HEPES(pH 7.5) 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 GSH/GSSG2/0.2mM
X X X X X X O O O O O O
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 GSH/GSSG10/2mM
X X X X X X O O O O O O
Tris-HCl(pH 8.5) 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 GSH/GSSG2/0.2mM
X X X X X X X X X X X X
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 GSH/GSSG10/2mM
X X X X X X O O O O O O
Glycine(pH 9.5) 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 GSH/GSSG2/0.2mM
X X X X X X O O O O O O
85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 GSH/GSSG10/2mM
X X X X X X O O O O O O
MgCl2/CaCl2 0mM MgCl2/CaCl2 2mM MgCl2/CaCl2 0mM MgCl2/CaCl2 2mM
NaCl 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM 20mM 60mM 180mM NaCl

[109]
[110]
표 4는 4종 재조합 항원의 96종 미니스케일 스크리닝 결과
[111]

청구범위

[청구항 1]
a)pH 6.5, 내지 9.5의 완충 물질; b)굴루타치온(GSH) 및 산화형 글루타치온(GSSG) 혼합물; 및 c)염화나트륨(NaCl)을 필수 구성성분으로 포함하며, 선택적으로 아르기닌, 또는 염화 마그네슘 및 염화 칼슘 혼합물을 유효성분으로 포함하는 재조합 단백질 가용화 조성물.
[청구항 2]
제 1 항에 있어서, 상기 완충 물질은 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid), 트리스(Tris-(hydroxymethyl) aminomethane), 및 글라이신(Glycine) 중 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 조성물.
[청구항 3]
제 1 항에 있어서, 상기 GSH와 GSSG의 혼합 몰비는 5/1에서 10/1인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 염화나트륨은 20 내지 180mM 범위인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 아르기닌 농도는 0.5M인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 6]
제 1 항에 있어서, 상기 염화 마그네슘 및 염화 칼슘 농도는 각각 2mM인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 7]
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36, 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 8]
제 8 항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 경우에 상기 조성물은 pH 6.5 내지 9.5의 완충 용액, 0.5M 아르기닌, GSH와 GSSG의 혼합물, 20 내지 180mM 염화나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 9]
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 각각 2mM 염화 마그네슘과 염화 칼슘 농도의 혼합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 가용화 용액 조성물.
[청구항 10]
a)내포체를 생산하는 재조합 균주로부터 내포체를 분리 수득하는 단계;및 b) 상기 수득된 내포체에 상기 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 가용화 방법.
[청구항 11]
제 10 항에 있어서, 상기 내포체는 발현 완료된 세포에 세포파쇄용액 처리 후 원심분리 하여 얻어진 불용성 침전물을 버퍼로 부유해 파쇄 및 원심분리를 반복하는 워싱 과정을 거치는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 가용화 방법.
[청구항 12]
제 10 항의 가용화 방법에 의하여 얻어진 재조합 단백질을 재조합 항원으로 사용하는 방법.
[청구항 13]
제 12 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HIV-1 타입 gp41 또는 2 타입 gp36, 뎅기 바이러스(Dengue virus)-2 타입 또는 3 타입 외피 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 항원으로 사용하는 방법.
[청구항 14]
제 12 항 또는 제 13 항의 방법에 의하여 사용된 재조합 항원을 검체에 처리하여 양성 검체 내에 존재하는 해당 재조합 항원에 특이적인 항체를 검출하는 방법.
[청구항 15]
제 12 항 또는 제 13 항의 방법에 의하여 사용된 재조합 항원을 포함하는 HIV 또는 뎅기 바이러스 진단 키트.

도면

[도1]   [규칙 제26조에 의한 보정 23.03.2017] 

[도2]   [규칙 제26조에 의한 보정 23.03.2017] 

[도3]   [규칙 제26조에 의한 보정 23.03.2017] 

[도4]

[도5]

[도6]