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1. (WO2017150849) ATTENUATED PSEUDOMONAS AERUGINOSA IMPROVED IN PRODUCTIVITY AND SAFETY AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING SAME
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명세서

발명의 명칭

기술분야

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배경기술

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도면의 간단한 설명

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산업상 이용가능성

90   91   92   93   94  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7  

도면

1   2   3   4  

명세서

발명의 명칭 : 생산성 및 안전성이 향상된 약독화 녹농균 및 이를 포함하는 백신 조성물

기술분야

[1]
본 발명은 생산성 및 안전성이 향상된 신규 약독화 녹농균( Pseudomonas aeruginosa), 이를 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물 및 약독화 녹농균의 제조방법에 관한 것이다.
[2]

배경기술

[3]
녹농균( Pseudomonas aeruginosa)은 길이가 1.5 내지 3.0μm이고, 폭이 0.5μm 정도인 기회감염성 균으로서 1개의 편모를 갖고 있다. 또한 형광색소인 플루오레세인과 녹색 색소인 피오시아닌을 내며, 운동성이 있는 그람 음성균으로, 토양, 물, 하수 및 사람의 장관에 널리 분포되어 있다[Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990].
[4]
이러한 녹농균은 다양한 유형의 감염증, 예컨대 패혈증, 전신감염, 만성기도감염증, 낭포성 섬유증 등의 난치성 감염을 일으키는 병원성 균이다. 녹농균은 cystic fibrosis(CF) 환자의 만성 폐질환 감염의 주요 병원균이며, CF 환자 이외에도 화상이나 급성 백혈병, 기관이식이나 정맥주사에서 빈발하게 나타나고 외이염, 폐염, 뇌막염, 요도감염, 골수염에 관여한다(Kronberg, Lipopolysaccharide(LPS). 1-30, 1995). 특히 녹농균에 의해 야기되는 패혈증은 수술, 열상 및 외상 등에 의해 저항력이 저하된 환자의 혈액 중에 미생물 그 자체가 침입하거나 그의 독성 구성성분이 분비됨으로써 유발되는 질병으로 고열, 혈압저하 등의 쇼크를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 하는 것으로 알려져있다. 또한, 녹농균은 콘택트렌즈 사용자의 안구 및 요도감염증에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다.
[5]
따라서, 녹농균에 의해 야기되는 패혈증, 요도감염증 등의 난치성 화농성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제의 개발이 요구되어 왔으며, 녹농균은 일부의 항생제를 제외한 상용 항생물질에 대해 내성을 갖고 있어 녹농균 감염으로 인한 치사율이 높은 심각성이 있다.
[6]
실용화된 녹농균 감염증에 대한 치료법 중 하나는 녹농균에 대한 항독소를 만들어 독소를 중화시키는 방법이다. 항독소는 이미 패혈증이 진행된 환자에게만 사용할 수 있는 치료제로, 예방적인 기능이 없을 뿐만 아니라 가격도 상당히 고가이므로 일반 환자에게 범용적으로 사용할 수는 없다는 단점을 지니고 있다. 또한, 가장 커다란 결점은 이 항독소의 투여를 통해서 치료될 수 있는 완치율이 비교적 낮으며, 부작용도 매우 심해서 치료제로서 사용하기가 부적절하다는 점이다.
[7]
다른 녹농균 감염증에 대한 치료 방법으로서 광범위 항생물질이나 녹농균에 대해 선택성이 높은 화학요법제 등을 선택하여 치료하는 방법이 있으나, 녹농균은 약제 내성이 일반적으로 매우 높고 종류가 다양하여 치료가 불가능한 녹농균에 의한 희생자가 많았다.
[8]
다른 방법으로는 세포융합 기술을 이용하여 녹농균을 중화시킬 수 있는 모노클로날 항체를 이용하는 방법 등이 연구되어 왔다. 그러나, 이 방법은 예방 백신으로 사용될 수 없고, 수십 여종의 녹농균에 의한 감염증을 모두 치료할 수 없다는 단점이 있다.
[9]
이러한 단점들을 극복하기 위해 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체에 투여 시에 효과적으로 녹농균에 대한 항체의 형성을 유발함으로써 우수한 면역원성(즉, 항원성) 작용을 나타낼 수 있는 수단을 찾기 위한 연구가 수행되었다.
[10]
한국등록특허 제113196호에서는 녹농균-감염 환자로부터 분리된 녹농균을 면역형태에 따라 7종으로 구분하여 이들을 각각 반복 순화시킴으로써 약독화시켜, 그의 세포벽 단백질이 녹농균 감염 예방용 백신의 제조에 유용한 약독화 녹농균주를 수득하는 방법이 제시되었고, 후속적인 연구를 통해 녹농균주로부터 분리, 정제된 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린을 활성 성분으로 함유하는 녹농균 감염증 치료제가 개발되었다. 그러나, 등록특허 제113196호는 약독화 균주의 수득율이 낮고, 세포독성이 높아 안전성에 대한 위험이 존재하였다.
[11]
이에, 본 출원의 발명자들은 기존의 방법에 비해 생산성을 증가시키고 배출되는 독소를 감소시킬 수 있는 녹농균을 개발하고자 예의 노력한 결과, 공지의 녹농균을 배양하여 생성된 콜로니 중 i) 비교적 크기가 크고 ii) 테두리가 매끄럽지 않으며 iii) 탈지분유가 포함된 배양배지에서 클리어존이 형성되지 않는 콜로니를 선택하여 반복적인 계대배양을 수행하여 수득율과 병원성 인자의 감소 배출로 인한 세포독성이 현저하게 감소하여 안전성이 개선된 신규 균주를 수득하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
[12]
[13]
발명의 요약
[14]
본 발명의 목적은 생산성 및 안전성이 향상된 약독화 녹농균을 제공하는데 있다.
[15]
본 발명의 다른 목적은 상기 약독화 녹농균을 포함하는 예방 백신 조성물을 제공하는데 있다.
[16]
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약독화 녹농균을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
[17]
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택되는 약독화 녹농균을 제공한다.
[18]
본 발명은 또한, 상기 약독화 녹농균을 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물을 제공한다.
[19]
본 발명은 또한, 수탁번호 KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 및 KCCM 10034로 구성된 군에서 선택된 균주를 40 내지 60 계대 반복 배양하는 단계를 포함하는 약독화 녹농균의 제조방법을 제공한다.
[20]

도면의 간단한 설명

[21]
도 1은 녹농균과 신규 약독화 녹농균(KCTC 12901BP)의 세포독성을 비교한 것이다.
[22]
도 2는 녹농균과 신규 약독화 녹농균(KCTC 12902BP)의 세포독성을 비교한 것이다.
[23]
도 3은 녹농균과 신규 약독화 녹농균(KCTC 12903BP)의 세포독성을 비교한 것이다.
[24]
도 4는 녹농균과 신규 약독화 녹농균(KCTC 12904BP)의 세포독성을 비교한 것이다.
[25]
[26]
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
[27]
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
[28]
본 발명에서는 공지의 녹농균을 배양하여 생성된 콜로니 중 i) 콜로니의 테두리가 매끄럽지 않거나 ii) 콜로니 주위에 클리어존이 형성되지 않거나, 타 콜로니에 비해 클리어 존이 덜 형성된 콜로니, 또는 iii) 콜로니 사이즈가 주위의 타 콜로니에 비해 큰 콜로니를 선택하여 반복적인 계대배양을 수행하는 경우, 수득율과 병원성 인자의 감소 배출로 인한 세포독성이 현저하게 감소하여 안전성이 개선된 신규 균주를 수득할 수 있었다.
[29]
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 수탁번호 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택되는 약독화 녹농균에 관한 것이다.
[30]
본 발명에 따른 약독화 녹농균은 생산성이 향상되고 녹농균 자체의 독성은 없으면서 그의 세포벽 단백질이 항원성만을 나타내도록 약독화시킨 신규의 안전한 녹농균이다. 본 발명의 일 양태에서, 신규의 녹농균은 기존의 녹농균에 비해 생산성이 향상되었음을 세포 무게 측정을 통해 확인하였다(표 1).
[31]
녹농균의 생산성 향상은 생백신 및 사백신 제조시에 생산성 증가와 직결되며, 또는 균체로부터 유래된 수득물을 이용하는 경우 회수량과 직결되는 것에 중요한 의미가 있다.
[32]
녹농균은 피셔-데블린 면역형태(Fisher-Devlin Immunotype)에 따라 타입 1부터 7까지 구분되는데, 특히 이들 7종의 녹농균 중에서 타입 1과 타입 3의 균주가 녹농균 감염 환자에게서 가장 빈번하게 검출되는 형태이며, 본 발명은 가장 빈번하게 발생하는 타입 1, 2, 3 및 6 녹농균에 관한 것이다.
[33]
녹농균은 각 유형들에서 균력 인자로서의 역할이 중요시되는 많은 세포외성 물질들을 생산한다. 녹농균의 병원성 인자로 보고된 것은 지질다당류를 비롯하여 외독소 A, 프로테아제, 엘라스타아제, 레시티나아제(lecithinase), 콜라게나아제, 당지질, 표면 점액(surface slime), 류코시딘, 엔테로톡신, 색소 및 세포외효소 등이 있으며, 이들 중에서 단백분해효소는 내독소 및 외독소와 더불어 대부분의 임상분리주에서 생산되며, 외독소 다음으로 독성이 강한 물질로 알려져 있다(Liu PV, Extracellular toxins. 132:S94, 1974).
[34]
본 발명의 용어 "약독화"란 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것을 의미하며, 이러한 균주는 숙주 안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 말한다. 본 발명의 약독화된 균주는 바람직하게, 독성 또는 병원성이 백신용으로 투여를 허용할 수 있을 정도로 감소된 균주이며, 더욱 바람직하게는 균주가 숙주 내에서 여전히 복제할 수 있으면서도 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지 약독화시키는 것을 의미한다.
[35]
본 발명에 따르는 약독화 균주는 수탁번호 KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 및 KCCM 10034의 균주를 모균주로 사용하여, 이러한 녹농균을 반복적인 순화과정을 통해 생산성 및 안전성을 향상시킴으로써 수득된다. 이렇게 수득한 신규의 약독화 녹농균은 모균주, 즉 KCCM 10029(피셔타입 1), KCCM 10030(피셔타입 2), KCCM 10031(피셔타입 3) 및 KCCM 10034(피셔타입 6)의 피셔 타입에 따라 각각 순서대로 EGPA01, EGPA02, EGPA03 및 EGPA06으로 명명하였다.
[36]
이러한 반복적 순화 과정에 의해 수득되는 약독화 녹농균은 형태학적이나 균학적 성질 등에서 기존의 녹농균과 거의 동일하나, 녹농균에 비해 생산성 및 안정성이 상당히 향상되므로 신규한 균주로 분류된다. 따라서 이들 균주는 각각 2015년 09월 22일자로 국제 기탁기관인 생물자원센터에 기탁되어 EGPA01는 KCTC 12901BP, EGPA02는 KCTC 12902BP, EGPA03은 KCTC 12903BP 또한 EGPA06은 KCTC 12904BP의 수탁번호를 부여받았다.
[37]
따라서, 본 발명에서 수탁번호 KCTC 12901BP는 수탁번호 KCCM 10029를 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12902BP는 수탁번호 KCCM 10030을 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12903BP는 수탁번호 KCCM 10031를 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12904BP는 수탁번호 KCCM 10034를 약독화한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[38]
다른 관점에서, 본 발명은 수탁번호 KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 및 KCCM 10034로 구성된 군에서 선택된 균주를 40 내지 60 계대 이상 반복 배양하는 단계를 포함하는 약독화 녹농균의 제조방법에 관한 것이다.
[39]
상기 제조방법은 예를 들어, (a) 녹농균을 배양하여 생성된 콜로니 중 i) 콜로니의 테두리가 매끄럽지 않거나, ii) 콜로니 주위에 클리어 존이 형성되지 않거나, 타 콜로니에 비해 클리어 존이 덜 형성된 콜로니 또는 iii) 콜로니 사이즈가 주위 콜로니에 비해 비교적 큰 콜로니를 선택하는 단계; 및 (b) 상기 선택된 콜로니를 40 내지 60 계대 반복 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
[40]
본 발명의 제조방법은 녹농균을 배양하여 생성된 콜로니 중 특정 콜로니를 선택하여 반복적인 계대배양을 수행하는 과정을 포함하며, 해당 과정 중 포함된 구성은 앞서 언급한 약독화 녹농균에 포함된 구성과 중첩되므로, 이에 대한 설명은 동일하게 적용된다.
[41]
본 발명의 일 실시예에 따르면, 녹농균을 탈지유가 포함된 Tryptic-soy broth (TSB) 한청평판에 획선 도말(streaking)하고 배양한 결과, 콜로니가 생성되었다. 생성된 콜로니 중 테두리가 매끄럽지 않고 크기가 크며, 주위 클리어 존이 다른 것들에 비해 형성되지 않은 콜로니를 선택하였다.
[42]
상기 선택된 콜로니를 40계대 이상, 예를 들어 40 내지 50계대 또는 40 내지 60계대로 반복 배양하는 경우 목적하는 약독화 녹농균을 수득할 수 있다. 40계대 미만으로 배양하면, 목적하는 정도로 약독화된 녹농균을 수득하기 어렵고, 60계대를 초과하여 배양하면, 약독화가 더 이상 이루어지지 않으며 균의 성질이 변형될 가능성이 있다.
[43]
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 약독화 녹농균을 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물에 관한 것이다.
[44]
본 발명에서 용어, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로서, 약독화시킨 미생물 또는 바이러스로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다.
[45]
약독화 녹농균을 포함시킨 백신은 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체에 투여 시에 효과적으로 녹농균에 대한 항체의 형성을 유발함으로써 우수한 면역원성 작용을 나타낸다. 특히, 녹농균의 세포벽 단백질은 녹농균 감염 예방용 백신의 제조에 유용하며, 녹농균으로부터 분리, 정제된 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린을 활성 성분으로 함유하는 녹농균 감염증 치료제를 제조할 수 있다.
[46]
본 발명에서 녹농균 감염증 예방 백신 조성물은 상기 약독화 녹농균 중 하나 이상의 약독화 녹농균을 포함할 수 있다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12901BP를 필수적으로 포함하고, 예를 들어, i) 수탁번호 KCTC 12901BP 및 iii) KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 KCTC 12901BP 및 KCTC 12902BP; KCTC 12901BP 및 KCTC 12903BP; KCTC 12901BP 및 KCTC 12904BP; KCTC 12901BP, KCTC 12902BP 및 KCTC 12903BP; KCTC 12901BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP; KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP; KCTC 12902BP 및 KCTC 12903BP; KCTC 12902BP 및 KCTC 12904BP; KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP; 또는 KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP을 포함할 수 있다.
[47]
본 발명의 백신을 투여할 수 있는 개체는 제한이 없으며, 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물을 포함한다.
[48]
본 발명의 백신에 대한 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
[49]
본 발명의 백신 조성물에는 상기 약독화 녹농균 이외에도, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다.
[50]
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
[51]
[52]
또한, 본 발명에 사용될 수 있는 면역보조제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 면역보조제가 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게 상기 면역보조제는 콜레라독소 결합 유닛, 알루미늄 염, 지질 유제 (MF-59), 합성 세제 (Tween), 마이크로스피어, 리포좀, 점막점착 중합체 등을 들 수 있으나, 상기 예에 제한되는 것은 아니며, 이 분야의 새로운 제형이 개발되고 있는바, 이들 또한 사용될 수 있다.
[53]
본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
[54]
상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
[55]
본 발명의 백신 조성물이 적용되는 녹농균 감염증은 예를 들어, 패혈증, 전신감염, 만성기도감염증, 낭포성 섬유증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[56]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[57]
[58]
실시예 1: 녹농균 모균주와 약독화 균주 배양 후 생산수율 (wet cell 무게) 비교
[59]
녹농균과 본 발명의 약독화 균주의 생산수율을 비교하기 위하여, 시험 균체를 TSB 한천평판에 획선 도말하고 37℃ 배양기에서 16 내지 20시간 동안 배양하였다. 시험 균체 콜로니를 취하여 10ml TSB가 들어있는 시험관에 접종하고 37℃, 200rpm에서 16 내지 20시간 배양하였다. 배양된 균액 1ml을 취하여 새로운 10ml TSB에 접종하고 6 내지 8시간 배양하였다. 균 배양액의 흡광도가 OD 600>1.0인 것을 확인하고 배양 균액을 희석하여 OD 600을 1.0으로 맞추었다. OD 600=1.0으로 흡광도를 균일하게 맞춘 각 균주 배양액 5ml을 100ml TSB가 들어있는 500ml 플라스크에 접종하여 5% (v/v) 접종량을 맞추었다. 37℃, 200rpm, 8 내지 10시간을 배양하였다. 배양이 종료된 후 세포 배양액을 7000rpm, 20분, 4℃ 조건에서 원심분리한 후 상층액을 제거하고 wet cell의 무게를 측정하였다.
[60]
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 측정된 Wet cell 무게를 비교하면 본 발명의 약독화 균주는 기존의 녹농균에 비해 112 내지 131%의 수득율 증가로 생산성이 향상되었으며, 특히 피셔 타입 6의 EGPA06은 같은 타입의 KCCM 10034에 비해 131%의 현저히 상승된 생산성을 나타내었다.
[61]
[62]
[표1]
Wet cell (g) 수득율 증가율
모균주 약독화 균주
피셔 타입 1 1.28 1.61 125.8%
피셔 타입 2 1.57 1.77 112.7%
피셔 타입 3 1.67 2.02 130%
피셔 타입 6 1.58 2.07 131%

[63]
[64]
실시예 2 : 녹농균 모균주와 약독화 균주의 세포독성 비교
[65]
녹농균과 본 발명의 약독화 균주의 세포독성을 비교하기 위하여 하기의 단계를 포함하는 실험을 수행하였다. WST 분석법은 EZ-Cytox 세포 생존 키트(대일랩사이언스, 한국)를 이용하여 분석하였다.
[66]
A. 세포 배양 및 시딩
[67]
액체 질소에 동결되어 있는 BEAS-2B 세포를 꺼내어 37℃ 워터 배스에서 약 3분간 담가 녹였다. 녹은 세포를 15ml 코니칼 튜브에 옮긴 후 complement media 9ml을 넣고 1,300rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 complement media 1ml을 넣어 세포 펠릿을 현탁하였다. 1) 75∮세포 배양 플라스크의 complement media 10ml에 현탁액을 모두 옮기고 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다. 2) 75Φ세포 배양 플라스크 면적에 세포가 70~80% 정도 배양되었을 때, 트립신-EDTA 3ml로 떼어내어 15ml 코니칼 튜브에 회수하였다. 3) 1,300 rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리 하였다. 4) 상층액을 버리고 새로운 complement media 5 ml을 넣어 세포 펠릿을 현탁 하였다. 5) 현탁된 세포 중 20ul를 취하여 트리판 블루 용액으로 일정 비율 희석 및 염색하였다. 6) 세포의 수를 1×10 6 세포/ml의 농도가 되도록 complement media와 현탁 된 세포 10ml을 75Φ 세포 배양 접시에 넣었다. 2일 간격으로 1)~6)의 과정을 거치면서 시험 전까지 세포를 유지하였다. 무균실험대에서 플레이트에 붙어있는 세포를 트립신-EDTA 3ml로 떼어내어 배지를 15 ml 코니칼 튜브에 회수 후 complement media로 10ml까지 채워주었다. 1,300rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리 하였다. 세포 펠릿을 남겨두고 새로운 배지 1ml을 넣어 현탁 하였다. 현탁 된 세포 중 20ul를 취하여 트리판 블루 용액으로 일정 비율 희석 및 염색하였다. 염색이 된 세포를 혈구계수기에 10ul의 용량을 넣어 현미경으로 세포 수를 측정하였다. 세포의 수를 4×10 4 세포/ml로 만든 후 96 웰 세포 배양 플레이트에 100ul/웰로 공급하였다. 이 때 대조 표본(Background control, 세포가 있는 배양배지+Ez-cytox)를 위한 세포도 100ul/웰 시딩하였다. CO 2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
[68]
B. 샘플 처리
[69]
유리관에 TSB 배지 5ml을 넣고 녹농균 주(stock) 10ul를 접종한 후, 37℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양된 녹농균 배양액의 O.D 600을 측정한 후, 0.6이 되도록 TSB로 희석하고 5ml TSB 배지 유리관에 500ul 접종하였다. 37℃, 200rpm에서 2시간 30분 동안 배양한 후, 배양액 5ml을 7,000rpm, RT, 5분 동안 원심분리 하였다. PBS 5ml로 3회 세척하였다. PBS 3 ml로 현탄한 후 O.D를 측정하였다. 최종 O.D가 0.6이 되도록 균을 PBS로 희석한 후 1×10 6 CFU/ml 과 5×10 6 CFU/ml로 희석하여 준비하였다. 96 웰 배양 플레이트에서 배지를 제거한 후, FBS와 페니실린 스트렙토마이신이 첨가되지 않은 DMEM으로 각 웰당 100ul씩 넣었다. 이때 대조 표본(세포가 없는 배양배지+Ez-cytox, 세포가 없는 배양배지+녹농균+Ez-cytox)을 위한 DMEM도 각 웰당 100ul씩 첨가하였다. 희석된 녹농균을 세포이 공급된 96 웰 배양 플레이트에 각 웰당 10ul씩 첨가하였다. 37℃, 5% CO 2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
[70]
C. 세포독성(WST) 분석
[71]
24시간 동안 배양된 96 웰 배양 플레이트를 PBS를 이용하여 3번 세척하였다. 세척 후 FBS와 페니실린 스트렙토마이신이 첨가되지 않은 DMEM으로 96 웰 배양 플레이트에 각 웰당 100ul씩 첨가하였다. EZ-Cytox 10ul를 각 웰에 첨가한 후 30분간 배양기에서 반응시켰다. 흡광도를 측정하기 전 1분 정도 부드럽게 진탕 하였다. 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다(도 1 ~ 4).
[72]
그 결과, 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약독화 균주는 녹농균에 비해 모든 타입에서 증가된 세포 생존도를 나타내었다.
[73]
[74]
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[75]
[76]
[수탁번호]
[77]
1. 기탁기관명 : 미생물자원센터
[78]
수탁번호 : KCTC 12901BP
[79]
수탁일자 : 2015. 9. 22
[80]
2. 기탁기관명 : 미생물자원센터
[81]
수탁번호 : KCTC 12902BP
[82]
수탁일자 : 2015. 9. 22
[83]
3. 기탁기관명 : 미생물자원센터
[84]
수탁번호 : KCTC 12903BP
[85]
수탁일자 : 2015. 9. 22
[86]
4. 기탁기관명 : 미생물자원센터
[87]
수탁번호 : KCTC 12904BP
[88]
수탁일자 : 2015. 9. 22
[89]

산업상 이용가능성

[90]
본 발명에 따르면, 종래의 약독화 녹농균에 비해 생산성이 증가되고 배출되는 병원성 인자의 감소로 인해 세포독성이 현저하게 줄어듦으로써 안정성이 향상되어 기존의 녹농균 감염증 백신에 비해 개선된 신규 백신을 제조할 수 있다.
[91]
[92]
[93]
[94]

청구범위

[청구항 1]
수탁번호 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택되는 약독화 녹농균.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 수탁번호 KCTC 12901BP는 수탁번호 KCCM 10029를 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12902BP는 수탁번호 KCCM 10030을 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12903BP는 수탁번호 KCCM 10031를 약독화하고, 수탁번호 KCTC 12904BP는 수탁번호 KCCM 10034를 약독화한 것을 특징으로 하는 약독화 녹농균.
[청구항 3]
수탁번호 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 약독화 녹농균을 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물.
[청구항 4]
제3항에 있어서, 수탁번호 KCTC 12901BP; 및 KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 약독화 녹농균을 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물.
[청구항 5]
제3항에 있어서, KCTC 12901BP 및 KCTC 12902BP, 또는 KCTC 12901BP 및 KCTC 12903BP, 또는 KCTC 12901BP 및 KCTC 12904BP, 또는 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP 및 KCTC 12903BP, 또는 KCTC 12901BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP, 또는 KCTC 12901BP, KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP, 또는 KCTC 12902BP 및 KCTC 12903BP, 또는 KCTC 12902BP 및 KCTC 12904BP, 또는 KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP, 또는 KCTC 12902BP, KCTC 12903BP 및 KCTC 12904BP을 포함하는 녹농균 감염증 예방 백신 조성물.
[청구항 6]
수탁번호 KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 및 KCCM 10034로 구성된 군에서 선택된 균주를 40~60계대 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 약독화 녹농균의 제조방법.
[청구항 7]
제6항에 있어서, (a) 녹농균을 배양하여 생성된 콜로니 중 i) 콜로니의 테두리가 매끄럽지 않거나, ii) 콜로니 주위에 클리어 존이 형성되지 않거나, 타 콜로니에 비해 클리어 존이 덜 형성된 콜로니 또는 iii) 콜로니 사이즈가 주위의 타 콜로니에 비해 큰 콜로니를 선택하는 단계; 및 (b) 상기 선택된 콜로니를 40-60계대 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]