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1. (WO2017092538) USE OF TOBACCO GENE NTTCTP IN PLANTS AGAINST POTATO VIRUS Y
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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

附图

0001   0002  

说明书

发明名称 : 烟草基因NtTCTP在植物抗马铃薯Y病毒中的应用

[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本发明要求2015年12月1日提交、申请号为201510858859.0的中国专利申请的优先权,其所公开的内容作为参考全文并入本申请。

技术领域

[0003]
本发明属于植物基因工程领域,具体地说,涉及烟草基因NtTCTP在植物抗马铃薯Y病毒中的应用。

背景技术

[0004]
翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP),也称p21或p23,是真核生物中普遍表达和分布的一种蛋白。其最早发现于哺乳动物肿瘤细胞中,并在转录后水平受到调控。
[0005]
多种生物中的大量研究发现,TCTP参与多种细胞学过程,如促进组胺释放,细胞凋亡,微管组装、离子平衡等,并与一系列蛋白,如polo激酶、tubulin、actin和钠钾ATP酶等有相互作用。动物中TCTP参与细胞生长分化,恶性转化,抗逆以及细胞凋亡等。敲除TCTP基因后的老鼠,由于缺少细胞分化和过度细胞凋亡,导致老鼠出现胚胎致死现象。果蝇中,某一特异器官中TCTP表达被中断后,该器官细胞数目下降和细胞生长出现缺陷最终导致该器官变小。植物中TCTP mRNA表达与有丝分裂密切相关,黑暗可以诱导牵牛中TCTP mRNA积累。另外,TCTP蛋白在调节韧皮部蛋白的长距离运输和花粉管生长的过程中发挥着重要作用。最近研究发现,拟南芥中,TCTP作为有丝分裂生长的正调控因子,能够特异调控细胞周期的时间。TCTP通过TOR(Target of rapamycin)生长调控途径调节细胞分化。卷心菜中的研究发现,TCTP不仅调控生长发育,同时受外界环境诱导。这些已有研究表明,TCTP不仅能够调控有机体生长发育,而且具有植 物专属功能,因此,研究该类基因对PVY的抗性研究,具有重要意义。
[0006]
挖掘植物基因组中抗马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)基因,是植物抗病毒育种的关键。
[0007]
发明内容
[0008]
本发明的目的是提供烟草基因NtTCTP在植物抗马铃薯Y病毒中的应用。
[0009]
为了实现本发明目的,本发明的烟草基因NtTCTP,其活性与烟草抗PVY的抗性密切相关,基因序列为:
[0010]
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;或
[0011]
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列;或
[0012]
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;或
[0013]
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0014]
本发明还提供所述基因NtTCTP编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]
本发明还提供所述基因NtTCTP在烟草抗马铃薯Y病毒(PVY)中的应用。即,将烟草基因NtTCTP用于调节烟草对PVY的抗性。所述马铃薯Y病毒包括PVY坏死株系(N株系)。
[0016]
所述应用是利用RNAi技术沉默烟草中的基因NtTCTP。例如,可将如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列克隆至植物表达载体上,然后采用农杆菌介导的方法,将重组表达载体转入烟草中,筛选转基因烟草植株。优选所述植物表达载体为pBin438。
[0017]
本发明还提供一种转基因烟草植株的构建方法,先构建所述基因 NtTCTP的RNAi表达载体,然后采用农杆菌介导的方法,将重组表达载体转入烟草中,筛选转基因烟草植株。优选出发载体为pBin438。
[0018]
本发明还提供所述基因NtTCTP在改良烟草品种中的应用。
[0019]
本发明还提供所述基因NtTCTP在烟草抗PVY育种中的应用。
[0020]
本发明进一步提供一种表达载体,所述表达载体携带有抑制烟草基因NtTCTP的表达盒。
[0021]
优选地,所述表达载体携带有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0022]
本发明从烟草中克隆得到翻译控制肿瘤蛋白基因NtTCTP,该基因全长507bp,编码一个含168个氨基酸的蛋白,并研究了该基因在烟草抗PVY过程中的作用。在栽培烟草中沉默该基因,烟草表现出对PVY更强的抗性,可达到免疫水平,在栽培烟草中超量表达该基因,烟草对PVY更敏感。说明该基因在烟草抗PVY过程中具有重要作用,可用于烟草等植物抗PVY育种。
[0023]
本发明构建了基因NtTCTP的RNAi表达载体,通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化,结果表明,该基因在烟草中沉默后,提高烟草对PVY的抗性,抗性可提高50%-80%。

附图说明

[0024]
图1为本发明实施例3中不同烟草株系中TCTP基因的Western Blot验证结果。
[0025]
图2为本发明实施例3中PVY接种后,基因TCTP过表达株系O2、O7;基因TCTP沉默株系Ri16、Ri20以及野生烟草的叶片性状图。从图中可以看出,超量表达株系O2、O7叶脉已坏死,而沉默株系Ri16和Ri20叶脉无任何症状。

具体实施方式

[0026]
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验 手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0027]
实施例1 烟草基因NtTCTP的克隆
[0028]
一、材料与方法
[0029]
1.实验材料
[0030]
1.1栽培烟草品种‘山西烟’,由贵州省烟草科学研究院育种工程中心提供。
[0031]
1.2试剂
[0032]
LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。DNA凝胶纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。T 4DNA连接酶购自NEB公司;pGEM-T vector载体购自Promega生物技术有限公司。ABI PRISMTM Optical 96-Well Reaction Plates,Optical Caps购自ABI公司;Escherichia coli DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHA105)、植物表达载体pBin438均为市售商品。DNA合成及测序由华大基因科技服务有限公司完成。
[0033]
2.实验方法
[0034]
登录NCBI,根据Genbank中烟草TCTP基因(Accession NO:KM507327.1)的全长序列设计扩增全长基因的引物,并添加酶切位点BamH Ⅰ和Sal Ⅰ。设计的引物序列如下:
[0035]
TCTPF1:5’-GGATCCATGTTGGTTTATCAGGATCTTCTCT-3’
[0036]
TCTPR1:5’-GTCGACTTAACACTTGACCTCCTTGAGTCCA-3’
[0037]
2.2烟草基因NtTCTP全长扩增
[0038]
提取‘山西烟’叶片总RNA,反转录合成cDNA第一链,在0.2ml离心管中加入下列试剂,进行PCR反应:
[0039]
[0040]
[0041]
PCR反应程序为:加热盖,95℃预变性5min;然后95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环。
[0042]
扩增得到的DNA片段经测序,结果如SEQ ID NO:1所示。
[0043]
实施例2 烟草基因NtTCTP转基因株系的构建
[0044]
1.过表达基因NtTCTP载体的构建
[0045]
1.1将植物表达载体pBin438、全长扩增PCR产物分别用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,酶切体系如下:
[0046]
[0047]
1.2切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,回收PCR酶切产物和载体pBin438的大片段,连接。回收产物按下列比例进行定向连接。连接体系如下:
[0048]
[0049]
16℃连接16小时或更长,以增加连接效率。
[0050]
1.3重组质粒转化根癌农杆菌
[0051]
1)取0.5~1.0μL DNA,加入到根癌农杆菌感受态细胞中,轻轻混合,冰浴5min,迅速投入液氮中冷冻5min;
[0052]
2)37℃水浴融化,加入800μL YEB液体培养基,28℃,100r/min, 振荡培养4h;
[0053]
3)4 000r/min,离心5min,倒去大部分上清液,余100μL左右,悬浮菌体;
[0054]
4)涂布在含有40mg/L利福平(Rif)、50mg/L链霉素(Sm)和100mg/L卡那霉素(Km)的固体YEB培养基上,28℃培养48~96h。
[0055]
2.沉默载体的构建
[0056]
将烟草基因NtTCTP中从第1bp~330bp位之间330bp的片段的正向序列和反向互补序列通过中间序列连接,并添加BamH Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位点,设计好的序列通过上海生工合成,合成的序列如SEQ ID NO:3所示。合成片段经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切,与经过同样酶切的pBin438载体连接,构建成最终的沉默载体。
[0057]
3.根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化
[0058]
先将烟草叶盘预培养2-3天,然后用含有植物表达载体的根癌农杆菌EHA105分别进行侵染。共培养3-4天后,将叶盘取出,在含有除菌剂的液体培养基中除菌2-3h,然后再转到筛选培养基进行筛选及分化培养,约3周左右开始分化出抗性芽。待抗性芽长至3-4cm高时,将其从外植体基部切下,接种到生根培养基上进行生根培养。待小植株根系发达后,进行驯化移栽。得到大量移栽成活的抗性植株。将PCR检测呈阳性的植株移栽到大花盆中,直到收获种子。
[0059]
基本培养基:MS培养基,pH5.8,0.8%琼脂。
[0060]
筛选培养基:基本培养基+25mg/L Km+100mg/L头孢菌素。
[0061]
分化培养基:基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA,pH5.8,0.75%琼脂。
[0062]
生根培养基:MS培养基+0.5mg/L NAA,pH5.8,0.75%琼脂。,pH5.8,0.8%琼脂。
[0063]
获得了转基因材料,TCTP基因超量表达株系O2、O7;TCTP基因沉默株系Ri16、Ri20。
[0064]
实施例3 转基因烟草株系对PVY抗性的研究
[0065]
1.材料与方法
[0066]
1.1实验材料
[0067]
实施例2中构建得到的过表达基因NtTCTP的转基因烟草株系O2、O7。
[0068]
实施例3中构建得到的基因NtTCTP沉默的转基因烟草株系Ri16、Ri20。
[0069]
PVY毒株为PVY坏死株系(N株系)。
[0070]
1.2实验方法
[0071]
1.2.1PVY接种物制备:将新鲜的病叶加入在打碎机中,加少量磷酸缓冲液打碎,用纱布过滤去病叶残体,取新鲜的汁液制成P VY接种物。
[0072]
1.2.2PVY接种:接种时期为烟草4叶期,在待接种的烟株上选择2-3片幼嫩叶片用砂纸轻轻摩擦,产生微伤,然后用毛刷蘸取PVY接种物轻轻刷在摩擦后的叶片上。
[0073]
1.2.3数据调查:选择发病最重的时间,调查PVY的发病率和病级。
[0074]
病级按如下标准调查:
[0075]
0级:全株无病或出现极轻微花叶。
[0076]
1级:1/10到1/3的叶片表现轻微小叶脉坏死或出现点刻状条斑症状以及轻微变形,整株其他叶片无症状,植株无明显矮化。
[0077]
2级:1/3到1/2的叶片表现点刻状条斑或脉坏死,病叶大部分小叶脉坏死,造成叶片较大面积的黄化、枯死,植株矮化为正常株高的2/3以上。
[0078]
3级:1/2到2/3的叶片表现较严重的脉坏死或2/3以上的叶片出现点刻状条斑坏死,单叶较大面积的枯死,少部分叶片脱落。或整株叶片开始变黄。
[0079]
4级:全株叶片表现严重的脉坏死或叶片变形、萎缩,2/3左右的叶片萎蔫脱落,病株矮化为正常烟株的1/2至1/3,或整株凋萎。
[0080]
病情指数DI=[∑(各级病株株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100
[0081]
2.实验结果
[0082]
(1)NtTCTP基因在不同烟草株系中的表达验证
[0083]
通过Western Blot验证表明,2个沉默株系Ri16和Ri20中TCTP基因都没有表达,说明已经成功沉默TCTP基因,而2个过表达株系O2和O7表达量均超过对照(WT),说明TCTP基因过表达也构建成功(图1)。
[0084]
(2)NtTCTP基因过表达和沉默株系抗病性鉴定结果
[0085]
接种14天后调查病情,沉默株系Ri16和Ri20均表现免疫,未发病,病情指数为0,抗病性有很大提高,而过表达株系O2和O7均表现出比野生型对照(WT)更严重的坏死症状,病情更为严重(图2)。其中,株系O2的病情指数为96.97,O7的病情指数为91.92,对照野生烟草的病情指数为85.86。
[0086]
以上结果表明,在烟草中沉默TCTP基因能够提高植物对PVY的抗病性,该基因具有重要的应用价值。
[0087]
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

工业实用性

[0088]
本发明提供的烟草基因NtTCTP,其活性与烟草抗PVY的抗性密切相关。通过构建基因NtTCTP的RNAi表达载体,采用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化,结果表明,该基因在烟草中沉默后,提高烟草对PVY的抗性,抗性可提高50%-80%。
[0089]
[0090]

权利要求书

[权利要求 1]
烟草基因NtTCTP在烟草抗马铃薯Y病毒中的应用;其中,烟草基因NtTCTP为: i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;或 ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列;或 iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;或 iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的应用,其特征在于,利用RNAi技术沉默烟草中的基因NtTCTP。
[权利要求 3]
根据权利要求2所述的应用,其特征在于,将如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列克隆至植物表达载体上,然后采用农杆菌介导的方法,将重组表达载体转入烟草中,筛选转基因烟草植株;优选所述植物表达载体为pBin438。
[权利要求 4]
根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于,所述马铃薯Y病毒包括马铃薯Y病毒坏死株系N株系。
[权利要求 5]
一种转基因烟草植株的构建方法,其特征在于,先构建基因NtTCTP的RNAi表达载体,然后采用农杆菌介导的方法,将重组表达载体转入烟草中,筛选转基因烟草植株。
[权利要求 6]
根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所用出发载体为pBin438。
[权利要求 7]
烟草基因NtTCTP在改良烟草品种中的应用。
[权利要求 8]
烟草基因NtTCTP在烟草抗PVY育种中的应用。
[权利要求 9]
一种表达载体,其特征在于,所述表达载体携带有抑制烟草基因NtTCTP的表达盒。
[权利要求 10]
根据权利要求9所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体携带有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

附图

[ 图 0001]  
[ 图 0002]