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1. (WO2017091017) COMPOSITION FOR INJECTION OF HYALURONIC ACID, CONTAINING HYALURONIC ACID DERIVATIVE AND DNA FRACTION, AND USE THEREOF
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【명세서】

【발명의 명칭】

히알루론산 유도체 및 DNA 분획물이 포함된 히알루론산 주사용 조성물 및 이의 이용

【기술분야】

본 발명은 미용 또는 치료 목적으로 사용하기 위한, 가교된 점탄성 히알루론산 유도체에 DNA 분획물이 포함된 히알루론산 주사용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 특정 범위의 가교도를 갖는 히알루론산 유도체 및 DNA분획물을 포함하는 히알루론산 주사 ·§ 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

히알루론산 -기반 주사용 겔은 미용 목적, 생물학적 조직의 필링 (filling) 또는 대체 목적 (주름의 필링, 안면의 리모델링 (remodelling of the face), 립 볼륨 (lip volume)의 증가 등)으로, 및 메조테라피 (mesotherapy)에 의해 피부를

재수화 (rehydrate)시키는 치료에서도 다년간 사용되어 왔다.

이와 관련하여, 생체 내 지속성 (즉, 주사 부위에서 겔의 체류 시간)을 증가시키고, 그에 의해 치료 효능의 지속시간을 증가시키기 위해, 히알루론산-기반 겔의 물리화학적 안정성을 개선시키기 위한 많은 노력이 추진되었다.

일반적으로 DNA 분획물은 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스와 같은 생체 고분자들로 이루어져 있으며, 이들 성분이 흔합된 조성물는 세포의 필수 구성성분들로서 이들 분획물을 상처부위 등에 주입함으로서 상처 부위의 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의약품이나 세포활성과 관련된 주름 개선 등올 목적으로 하는 화장품 등 여러 용도로 사용되고 있다.

DNA 주사는 생체 적합물질인 폴리뉴클레오타이드 (Polynucleotide, PN) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)이 함유된 주사를 말한다 . DNA 분획물은 세포 간 구성 물질인 세포외 기질 (ECM, Extracellular matrix) 생성을 촉진시키고, 인체 안에서 피부치유 능력을 활성화시키는 역할을 함으로써 피부 스스로 노화되고 위축된 재생능력을 회복시켜주는 기능을 하기 때문에 피부 자체의 기능성을 높여준다.

이에, 여러 가지 필러 제품들이 개발되고 있지만, 현재까지 피부재생 효과를 가지는 기능성 히알루론산 -DNA 복합 필러 제품은 없는 것으로 알려져

있다.

또한 종래의 히알루론산 필러 제품들을 살펴보면, 히알루론산 유도체에 비가교 히알루른산올 추가로 흔합하여 사용함으로써 시술시 사용감올 좋게 조제하고 있으나, 비가교 히알루론산이 효소 반응에 의해 쉽게 분해되는 단점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 기능성을 갖는 히알루론산 -DNA 복합 필러제품을 개발하고자 예의 노력한 결과, 특정 조제방법으로 가교시킨

히알루론산 조성물에 DNA 분획물을 일정비율로 흔합하여 물리학적 특성 (점탄성 및 압출력)이 우수하며, 히루니다제 효소 저항성까지 갖춘 히알루론산 주사용 조성물의 개발을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 가교된 히알루론산에 DNA 분획물을 흔합하여 우수한 점탄성 및 압출력을 갖고, 효소 저항성을 갖춘 히알루론산 주사용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

【발명의 효과】

본 발명에 따른 히알루론산 주사용 조성물 및 이의 제조방법에 의하면, 우수한 탄성적 성질 및 압출력올 나타내고 효소 저항성을 갖는 히알루론산 주사용 조성물을 제공하므로, 미용 또는 치료적인 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 l a 내지 i는 레오미터를 이용하여 실시예 1 내지 5, 비교예 1 내지 4의 주파수별 저장탄성계수 (G'), 손실탄성계수 (G"), Tan(delta), 복합점도 (G) 결과값을 나타낸 도면이다. 이때, 도 la: 비교예 1 , 도 l b: 비교예 2, 도 lc: 비교예 3, 도 Id: 비교예 4, 도 le: 실시예 1, 도 If: 실시예 2, 도 lg: 실시예 3, 도 lh: 실시예 4 도 l i: 실시예 5에 따른 결과를 나타낸다.

도 2a, b는 본 발명에 따른 히알루론산 주사용 조성물의 프리필드

시린지에서의 압출력을 확인하기 위한 토출하중 시험 결과를 나타내는

그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 히알루론산 주사용 조성물 내의 PDRN 분획물을 전기영동으로 분석한 결과이다.

도 4a 내지 d는 DNA 분획물 흔합에 따른 히알루론산 가교물의 입도분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 히알루로니다제에 의한 히알루론산 분해로 인한 히알루론산의 시간에 따른 점도 변화를 측정한 그래프이다.

도 6a 내지 6i는 레오미터를 사용하여 실시예 및 비교예의 유동학적 특성을 비교한 그래프이다. 이때, 도 6a: 실시예 7, 도 6b: 실시예 8, 도 6c: 실시예 9, 도 6d: 실시예 10, 도 6e: 실시예 1 1 , 도 6f: 실시예 12, 도 6g: 실시예 13, 도 6h: 실시예 14, 도 6i: 실시예 15에 따른 결과를 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 0.1 % 내지 200 %의 가교도를 갖는 히알루론산 유도체 및 전체 조성물에 대해 0.1 내지 50 중량0 /0의 DNA 분획물을 포함하는 히알루론산 주사용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "히알루론산 "은 N-아세틸 -D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 본 발명에서 히알루론산은 히알루론산 자체, 이의 염 또는 이들의 조합을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 히알루른산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산

테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 히알루론산 자체, 또는 이의 염을 단독으로, 또는 히알루론산 자체, 또는 이의 염을 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서, 상기 히알루론산의 분자량은 100,000 내지 5,000,000 Da일 수 있다. 또한 가교된 히알루론산 유도체는 상기와 같은 히알루론산 자체 또는 이의 염을 가교제를 사용하여 가교시켜 제조할 수 있다. 가교를 위해서는, 알칼리 수용액 하에서 가교제를 사용하는 방법올 사용할 수 있다. 상기 알칼리 수용액으로는 NaOH, KOH, 바람직하게는 NaOH 수용액을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 NaC»H 수용액의 경우 0.25N 내지 5N의 농도로 사용할 수 있다. 또한 상기 가교된 히알루론산 유도체는 주파수 0.02 내지 1 Hz의 범위에서 0.01 내지 2.0의 Tan 5값, 복합점도는 25 °C에서 lO Pa.s (l Hz) 내지

6,000,000 Pa.s (l Hz)를 갖는 점탄성의 히알루론산 가교물을 사용할 수 있다.

상기 가교제는 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있으며, 바람직한 예로 부탄디을디글리시딜에테르 (1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE): 핵산디올디글리시딜에테르 ( 1 ,6-hexanediol diglycidyl ether),

프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (propylene glycol diglycidyl ether),

폴 e프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether),

폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르 (polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether),

폴리글리세롤플리글리시딜에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether),

디글리세를폴리글리시딜에테르 (diglycerol polyglycidyl ether),

글리세롤폴리글리시딜에테르 (glycerol polyglycidyl ether),

트리메틸프로판폴리글리시딜에테르 (tri-methylpropane polyglycidyl ether),

비스에폭시프로폭시에틸렌 (l ,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene),

펜타에리쓰리를폴리글리시딜에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 및

소르비를폴리글리시딜에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 1 ,4-부탄디을글리시딜에테르가 특히 바람직하다.)

본 발명에서 용어 "가교도 (degree of crosslinking)"는 히알루론산 기반 조성물의 가교결합된 부분 내의 히알루론산 단량체 단위에 대한

가교결합제의 %중량비로 정의된다. 이것은 히알루론산 단량체의 중량비에 대한 가교결합제의 중량비로서 측정된다. 본 발명에서는 특히, 이러한 히알루론산의 가교도가 상기와 같은 가교제에 의한 가교를 통해 0.1 % 내지 200 %의 범위, 바람직하게는 1 % 내지 50 % 의 범위를 나타내는 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명에 따른 주사용 조성물에는 상기와 같이 특정 가교도를 나타내는 히알루론산 유도체와 함께, DNA 분획물이 포함된다. 본 발명에서, 상기 DNA 분획물은 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 (Polynucleotide, PN),

폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)으로 부터 선택될 수

있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 하나의 양태로서, 상기 DNA 분획물의 농도는 전체 조성물 부피에 대해 으01 내지 20mg/ml 이고, 전체 조성물에 대해 0.1 내지 50 중량% 비율로 주사용 조성물에 포함되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 내지 30 증량0 /。 비율로 포함될 수 있다. 나아가, 본 발명에서 상기 가교된 히알루론산 유도체와 DNA 분획물의 흔합비율은 중량비로 흔합비율로는 가교된 히알루론산 유도체 : DNA = 5.0 내지 9.99: 0.01 내 5.0 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 7.0 내지 9.5 : 0.5 내지 10이다.

나아가, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 히알루론산 주사용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 주사용 조성물의 제조방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

a) 알칼리 수용액 하에서 히알루론산 또는 이들의 염을 가교제를

사용하여 가교도 0.1 % 내지 200 %로 가교시켜 히알루론산 유도체를 제조하는 단계; 및

b) 상기 단계 a)에서 제조된, 가교도 0.1 % 내지 200 %를 갖는 히알루론산 유도체에 DNA 분획물을 흔합하는 단계.

상기 제조방법 중 단계 a)의 히알투론산 유도체 제조의 단계 1은, 바람직하게 NaOH 수용액에 대해 1 내지 25 중량0 /。 의 농도로 히알루론산 또는 이의 염을 0.25 내지 5 N의 염기성 수용액에 넣고, 이에 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위를 기준으로 0.1 % 내지 200 %, 바람직하게는 1 % 내지 50 %의 가교도만큼 가교제를 첨가하여 히알루론산 또는 그의 염과 균질한 상태로 흔합하여 제조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 상기 단계에서 히알루론산과 가교제의 가교반응은 10 내지 60oC, 더욱 바람직하게는 20 내지 50oC, 가장 바람직하게는 25 내지 40oC에서 이루어질 수 있다.

바람직한 하나의 양태로서, 상기 가교된 히알루론산 유도체를 조쇄하고, 세척액으로 세척 및 팽윤시킨 다음, 분쇄하는 공정을 더 거칠 수 있다. 상기 세척액은 적절히 선택할 수 있으나 식염수가 바람직하다.

상기 염기성 수용액은 이에 제한되는 것은 아니나 , ΚΟΗ 또는 NaOH를 사용할 수 있으나 NaOH가 바람직하고 , 0.1 내지 5 N, 특히 0.25 내지 2.5N의 NaOH 수용액이 가장 바람직하다. 또한, 상기 가교제는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 부탄디올디글라이시딜 에테르 (1 ,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 핵산디올 디글리시딜 에테르 (1 ,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜

디글리시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether) 등을 들 수 있다.

나아가, 단계 b)에서는 단계 a)에서 수득된 히알루론산 유도체와 DNA 분획물을 흔합하여, 본 발명에 따른 히알루론산 주사용 조성물을 제조한다. 이 단계에서 사용되는 DNA 분획물은 상기 주사용 조성물에서 언급된 것과 동일하며 바람직하게, 0.01 내지 20mg/ml의 농도를 갖는 분획물을 상기 단계 a)에서 얻은 DNA 분획물과 흔합하는 것에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 단계 a)에서 수득된 가교된 히알루론산 유도체와 DNA 분획물은 가교된 히알루론산 유도체 : DNA 분획물 = 5.0 내지 9,99 : 0.01 내지 5.0, 바람직하게는 7.0 내지 9.5 : 0.5 내지 3.0 의 중량비로 흔합될 수 있다.

추가적인 양태로서, 상기 제조방법에서 단계 b) 이후에 최종 제품을 제조하기 위하여 원하는 용기 (예를 들어, 프리필드 시린지용 용기)에 층진하는 단계 및 층진 후 조성물이 층진된 제품을 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제조방법에 따라 수득한 본 발명에 따른 히알루론산 주사용 조성물은 우수한 탄성적 성질 및 압출력을 나타내며, 효소 저항성 (특히, 히알루로니다제 효소 저항성)을 갖는다. 구체적인 일 실시양태에서, 본 발명의 히알루론산 조성물은 특정 가교도를 갖는 히알루론산 유도체와 DNA 분획물올 포함함으로써 주파수 1 Hz의 범위에서 Tan(delta) 값이 다른 히알루론산 유도체 및 시판되는 히알루론산 주사제보다 월등하게 보다 낮아 우수한 탄성적 특성을 가짐올 확인하였고 (실시예 2, 도 If 참조), 효소에 대한 저항성이 높아 조직 수복시 지속기간이 길어지는 특징을 나타낸다 (실시예 2, 도면 5 참조).

이와 같이, 본 발명에 따른 히알루론산 조성물은 특징적인 탄성적 성질, 압출력, 효소 저항성에 의해, 미용 또는 치료적 목적으로 매우 유용하게 사용될

수 있다. 구체적인 예시로서, 이러한 히알루론산 주사용 조성물은, 생물학적 조직의 필링 (filling) 또는 대체를 위한 조성물, 주름의 필링 (filling wrinkle), 안면의 리모델링 (remodeling of the face) 또는 입술 용적 (lip volume)의 증가를 위한 조성물, 메조테라피 (mesotherapy)에 의한 피부의 재수화 (rehydration) 치료에 사용하기 위한 조성물, 관절염에서 활액 (synovial fluid)의 대체 또는 일시적 보충을 위한 조성물, 비뇨기과 /부인과에서 괄약근 또는 요도의 용적을 증가시키기 위한 조성물, 안과에서 백내장 수술에서의 보조제 (adjuvant) 또는 녹내장 치료를 위한 조성물, 약제학에서 활성 물질을 방출시키는 겔, 외과에서 골 재건 (bone reconstruction), 성대 용적의 증가, 또는 외과용 조직 (surgical tissue)의 제조를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 히알루론산 주사용 조성물을 포함하는 점성보층용 조성물에 관한 것이다. 상기 점성보층용 조성물은 생물학적 조직의 보충, 관절염에서 활액 대체, 백내장 수술의 보조 또는 녹내장 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 히알루론산 주사용 조성물을 포함하는 피부 주입용 필러, 안구건조증 치료용 조성물에 관한 것이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-4: DNA 분획물 포함 및 불포함 히알루론산 -기반 복합 주사용 조성물의 제조

실시예 1: lg의 히알루론산 (분자량: 약 200 내지 300만 달톤)을 10 중량0 /0 농도로 0.25N NaOH 용액에 녹인다. 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜

에테르 (butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용했고, 사용된 가교도 (degree of crosslinking)의 정의는 다음과 같다: 중량 (BDDE)/중량 (건조 NaHA).

BDDE를 가교도 5 %에 해당하는 양을 투입한 후, 흔합하였다. 혼합된 용액을 항온수조에 넣고 가교 반웅시켜 얻은 겔을 일정한 크기로 조쇄하고, 완층용액을 이용하여 세척 및 팽윤하였다. 팽윤된 겔을 분쇄 장치를 이용하여

분쇄한 후, 히알루론산 유도체를 획득하였다. 제조된 겔을 유리병 (glass bottle) 내에 200mL씩 충진 (pack)시킨 후, 가열 멸균한다.

실시예 2: 히알루론산 (분자량: 약 200~300만 달톤)을 10 중량0 /。 농도로 0.25N NaOH 용액과 흔합하고, 1 ,4-부탄디을 디글리시딜 에테르를 가교도 5 %에 해당하는 양을 투입한 후, 항온수조에서 가교 반응시켰다. 이 가교젤에

생리식염수에 녹인 PDRN분획물 (12.5 mg/mL)을 15% 첨가하여 1.875mg/ml PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실시예 3: 히알루론산 (분자량: 약 200 300만 달톤)을 10 중량0 /0 농도로 1.25N NaOH 용액과 혼합하고, 1,4-부탄디을 디글리시딜 에테르를 가교도 5 %에 해당하는 양을 투입한 후, 항온수조에서 가교 반응시켰다. 이 가교젤에

생리식염수에 녹인 PDRN분획물 (12.5 mg/mL)을 15% 첨가하여 1.875mg/ml PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실시예 4: 히알루론산 (분자량: 약 200~300만 달톤)을 10 중량0 /。 농도로 2.5N NaOH 용액과 흔합하고, 1 ,4-부탄디을 디글리시딜 에테르를 가교도 5 %에 해당하는 양을 투입한 후, 항온수조에서 가교 반웅시켰다. 이 가교젤에

생리식염수에 녹인 PDRN분획물 (12.5 mg/mL)을 15% 첨가하여 1.875mg/ml PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실시예 5: 실시예 2의 가교젤과 동일한 방법으로 조제한 젤에 20mg/mL HA (분자량: 80~100만 달톤)을 15 중량0 /。 농도로 첨가하여 겔올 조제하였다.

실험예 1: 본 발명에 의해 제조한 히알루론산 주사용 조성물 (겔)의 점탄성 특성 조사

제조된 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 유동학적 특성 규명을 위하여 레오미터 (rheometer)를 사용하여 분석하였다 (비교예 1: LG 이브아르, 비교예 2: BNC 큐젤, 비교예 3 : 갈더마 레스틸렌, 비교예 4: 휴메딕스 엘라비에).

회전형 레오미터 (Rotational Rheometer)의 분석조건

(1) 시험장비 : Rotational Rheometer (KI EXUS pro+)

(2) Frequency: 0.1 ~ 10 Hz

(3) Temperature: 25 °C

(4) Strain: 5 %

(5) Measuring geometry: 20 mm plate

(6) Measuring gap: 0.5 mm

위의 분석 조건으로 주파수별 저장탄성계수 (σ), 손실탄성계수 (G"),

Tan(delta), 복합점도 (G) 결과값을 도 la-i와 표 1에 나타내었다.

【표 1 1


(비교예 1 : LG생명과학 이브아르, 비교예 2: BNC 큐젤, 비교예 3: 갈더마 레스틸렌, 비교예 4: 휴메딕스 엘라비에)

상기 표 1 및 도 la-i을 통해, 본 발명에 따른 실시예 2은 실시예 1 , 3 및 4, 비교예 1 내지 4에 비해 높은 복합점도를 가지면서도 우수한 탄성적 성질 (보다 낮은 Tan delta)를 나타내는 것으로 판단된다. 비교예 1 내지 4를 분석하여 보면 비교예 2 및 3은 높은 복합점도를 갖는 대신 탄성적 성질이 다소 떨어지며, 비교예 1 및 4는 탄성적 성질은 좋으나, 복합점도가 낮음이 확인된다. 또한

비교예 2 내지 4에서 NaOH의 농도가 높아질수록 점탄성이 감소하는 결과를 통해 히알루론산 기반 가교젤은 2.5N 이하의 NaOH 염기성 하에서 가교시킨 후, DNA분획물과 흔합 시 가장 좋은 물성을 가짐을 확인하였다.

실험예 2: 본 발명에 의해 제조한 히알루론산 겔의 토출하중 조사 실시예 1 및 실시예 2의 히알루론산 조성물의 프리필드 시린지에서의 압출력을 확인하기 위하여 아래의 조건으로 토출하중 시험을 수행하였다.

I토출하중 시험의 분석조건 I

(1) 入 1험기기: Universal Testing Machine

(2) 시험속도: 30 mm/min

(3) 측정변위 : 20 mm

(4) 로드셀: 200 N

(5) 시험환경: (25±2) °C , (45±5) % RH

위의 분석조건으로 시험한 결과를 도 2 a, b에 나타내었다.

도 2a, b에서 할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 실시예 2은

히알루론산 가교 유도체만을 포함하는 실시예 1에 비해 낮은 토출하중 결과값을 나타낸다. 이를 통해 가교된 히알루론산 유도체에 DNA 분획물을 흔합하면 우수한 탄성을 나타낼 뿐만 아니라, 시술 시 중요시 되는 겔의 부드러움도 증가시킴을 확인하였다.

실험예 3: 본 발명에 의해 제조한 히알루론산 겔의 PDRN 함유 확인 조사 실시예 1의 히알루론산 및 본 발명에 따른 실시예 2의 히알루론산 주사용 조성물 내에 함유된 PDRN 분획물을 분석하기 위하여 전기영동을 하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2에 포함된 PDRN분획물 (c)은 실시예 1과 흔합 전의 대조군 PDRN(a)과 비교하였을 때, 동일한 분자량을 확인하였다. 이는 히알루론산 겔이 PDRN분획물의 분자량에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

실험예 4: DNA 분획물 흔합에 따른 히알루론산 유도체의 입도분석 실시예 1-4 및 비교예 1 내지 3의 히알루론산 조성물의 입자크기와 분포도를 확인하기 위해 각 시료 3g을 증류수 15mL로 희석하여 Beckman Coulter LS Particle Size Analyzer를 이용하여 0.375 um에서 2000 um사이의 입자를

계수하였다. 그 결과를 도 4와 표 2에 나타내었다 (비교예 1 : LG 이브아르, 비교예 2: BNC 큐젤).

【표 2】


상기 표 2 및 도 4a-d를 통해, 본 발명에 따른 실시예 2의 조성물은 비교예 1 및 2와 비교하였을 때, 입자분포도가 고르게 나타났으며, 실시예 1과 비교하였을 때, 평균 입자크기가 유사하였다. 이 결과로 보아 DNA 분획물이 히알루론산 입자크기에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

실험예 5: 본 발명에 따른 히알루론산유도체의 효소 저항성 조사 실시예 2과 비교예 1(LG생명과학 이브아르)의 히알루론산 조성물을 각각 코니칼 튜브에 5g씩 넣고 100 IU/mL 히알루로니다아제를 2.5g의 양으로 넣고 균질하게 흔합한 후. 37°C 항온수조에서 반웅시켰다. 시간에 따른 히알루론산의 점도 변화를 역가용 점도계를 이용하여 측정하였다. 히알루로니다아제 저.항성이 높을수록 점도비율의 변화가 적다. 점도비율이 높아질수록 점도가 감소됨을 의미한다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 조성물은 (HA함량: 19.8mg/ml)는 비교예 1 (HA함량: 20,3mg/ml)에 비해

히알루로니다아제 처리 하에서 점도비율이 천천히 증가되는 경향 (보다 낮은

기울기)을 보인다 (점도비율이 높아질수록 용액의 점도가 낮아짐을 의미). 이에 따라, 본 발명의 히알루론산 유도체가 시판되고 있는 주사제인 비교예 1보다 우수한 효소 저항성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 6 내지 15: 가교율 및 DNA분획물의 흔합 비율에 따른

히알루론산 -기반 복합 겔의 제조

실시예 6: 히알루론산 (분자량: 약 200~300만 달톤)을 10 중량0 /。 농도로 0.25N NaOH 용액과 흔합하고, BDDE를 가교도 0.05 %에 해당하는 양을 투입한 후, 가교시킨 결과, 젤이 형성되지 않았다.

실시예 7-9: 히알루론산 (분자량: 약 200 300만 달톤)을 10 중량% 농도로

0.25N NaOH 용액과 흔합하고, BDDE를 가교도 0.1 %에 해당하는 양을 투입한 후, 흔합하였다. 이 가교젤에 물에 녹인 PDRN분획물 (80 mg/mL)을 0.1 중량0 /0(실시예 7), 50 중량0 /。(실시예 8), 70 중량0 /。(실시예 9) 첨가하여 1.875mg/mL PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실시예 10~12: 히알루론산 (분자량: 약 200~300만 달톤)을 10 중량0 /。 농도로

0.25N NaOH 용액과 흔합하고, BDDE를 가교도 200 %에 해당하는 양을 투입한 후, 흔합하였다. 이 가교젤에 물에 녹인 PDRN분획물 (80 mg/tnL)을 0.1 중량0 /0(실시예 10), 50 증량0 /。(실시예 1 1 ), 70 증량0 /。(실시예 12) 첨가하여 1.875mg/mL PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실시예 13~15: 히알루론산 (분자량: 약 200 300만 달톤)을 10 증량0 /。 농도로

0.25N NaOH 용액과 흔합하고, BDDE를 가교도 400 %에 해당하는 양을 투입한 후, 흔합하였다. 이 가교젤에 물에 녹인 PDRN분획물 (80 mg/mL)을 0.1 중량0 /0(실시예 13), 50 증량0 /。(실시예 14), 70 중량0 /。(실시예 15) 첨가하여 1.875mg/mL PDRN을 함유하는 히알루론산 기반 PDRN 복합 겔을 조제하였다.

실험예 6: 실시예 6 내지 14 히알루론산 조성물 (겔) 의 특성 비교

제조된 실시예 6 내지 14는 레오미터 (rheometer)를 사용하여 유동학적 특성을 비교하였다. 주파수별 저장탄성계수 (G'), 손실탄성계수 (G"), Tan(delta), 복합점도 (G) 결과값을 하기 도 6a-i 및 표 3에 나타내었다.

【표 3】

Frequency: 1.0 (Hz)

Complex

G' (Pa) G" (Pa) Tan (delta)

viscosity (Pa.s) 실시예 7 407 27 0.067 65

실시예 8 507 134 0.126 84

실시예 9 139 18 0.126 22

실시예 10 468 1 19 0.254 77

실시예 Π 506 100 0.197 82

실시예 12 317 312 0.985 71

실시예 13 290,760 124,537 0.428 50,342

실시예 14 8,226 3,446 0.419 1 ,420

실시예 15 3,596 1 ,800 0.501 640

도 6a-i 및 표 3을 통해, 실시예 Ί, 실시예 8, 실시예 10 및 실시예 1 1가 다른 가교젤과 비교하였을 때, 우수한 복합점도 값을 가짐과 동시에 보다 낮은 Tan delta 값아 확인되었다. 이를 통해 DNA분획물을 포함하는 히알루론산 기반 젤의 최적의 조제방법 (2.5N 이하의 NaOH 사용, BDDE 가교도 0.1 % ~200 %, DNA 흔합비율 0.1 50 중량%)을 확인하였다.