WIPO logo
Mobile | Deutsch | Español | Français | 日本語 | 한국어 | Português | Русский | 中文 | العربية |
PATENTSCOPE

Search International and National Patent Collections
World Intellectual Property Organization
Search
 
Browse
 
Translate
 
Options
 
News
 
Login
 
Help
 
Machine translation
1. (WO2016184447) CLONING SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INTERACTION PARTNERS IN PROTEIN COMPLEXES
Latest bibliographic data on file with the International Bureau   

Pub. No.:    WO/2016/184447    International Application No.:    PCT/DE2016/000193
Publication Date: 24.11.2016 International Filing Date: 04.05.2016
IPC:
C12N 15/10 (2006.01), G01N 33/68 (2006.01)
Applicants: EBERHARD KARLS UNIVERSITÄT TÜBINGEN [DE/DE]; Geschwister-Scholl-Platz 72074 Tübingen (DE)
Inventors: GREFEN, Christopher; (DE)
Priority Data:
10 2015 006 187.9 15.05.2015 DE
Title (DE) KLONIERUNGSSYSTEM UND VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN IN PROTEINKOMPLEXEN
(EN) CLONING SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INTERACTION PARTNERS IN PROTEIN COMPLEXES
(FR) SYSTÈME DE CLONAGE ET PROCÉDÉ D'IDENTIFICATION DE PARTENAIRES D'INTERACTION DANS DES COMPLEXES PROTÉIQUES
Abstract: front page image
(DE)Die Erfindung betrifft ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern, mit denen zugleich ein schnelles Hochdurchsatz-Screening von cDNA-Banken möglich ist. Das Klonierungssystem besteht aus einem ersten Vektor und einem zweiten Vektor. Der erste Vektor enthält zwei Expressionskassetten: In die erste Expressionskassette wird die DNA eines ersten bekannten Proteins, gekoppelt an die Cub-Sequenz des Ubiquitins und an die DNA eines Transkriptionsfaktors für mindestens zwei Reportergene kloniert; In die zweite Expressionskassette wird die DNA eines zweiten bekannten Proteins, gekoppelt an die Nub-Sequenz des Ubiquitins kloniert. Der zweite Vektor enthält eine Expressionskassette, in welche die cDNA Bank oder die DNA eines dritten, auf die Interaktion mit den beiden bekannten Proteinen zu testenden dritten Proteins eingefügt werden kann. Die beiden Vektoren enthalten weitere Elemente, wie speziell ausgewählte Replikationsursprünge, Promotoren, Antibiotikaresistenz-Gene und Auxotrophie-Marker-Gene, die das Durchführen des Verfahrens, auch als Hochdurchsatz-Screening einer cDNA-Bank auf das Vorhandensein eines potentiellen Proteinpartners erlauben. Bei diesem Verfahren werden der erste Vektor in Hefezellen des ersten Paarungstyps und der zweite Vektor in Hefezellen des zweiten Paarungstyps übertragen, die Hefezellen beider Paarungstypen miteinander gepaart und auf einem speziellen Mangel-Medium selektioniert. Dabei wachsen auf dem Medium nur solche Hefe-Zellen, welche die DNA des ersten und des zweiten Proteins von dem ersten Vektor, sowie die DNA des dritten Proteins von dem zweiten Vektor exprimieren und das erste, das zweite und das dritte Protein synthetisieren können, wobei diese drei Proteine untereinander interagieren müssen.
(EN)The invention relates to a cloning system and to a method for examining interactions among three protein partners, said system and method allowing rapid high-throughput screening of cDNA libraries. The cloning system consists of a first vector and a second vector. The first vector contains two expression cassettes: The DNA of a first known protein, linked to the Cub sequence of ubiquitin and to the DNA of a transcription factor for at least two reporter genes, is cloned into the first expression cassette; the DNA of a second known protein, linked to the Nub sequence of the ubiquitin, is cloned into the second expression cassette. The second vector contains an expression cassette, into which the cDNA library, or the DNA of a third protein, which is to be tested for an interaction with the two known proteins, can be introduced. The two vectors contain additional elements, such as specifically selected replication origins, promoters, antibiotic-resistance genes and auxotrophic marker genes, which allow the method to be carried out, also in the form of high-throughput screening of a cDNA library for the presence of a potential protein partner. In said method, the first vector is transferred into yeast cells of the first mating type and the second vector is transferred into yeast cells of the second mating type, the yeast cells of both mating types are paired together and are selected on a special auxotrophic medium. The only yeast cells that grow on the medium are those that express the DNA of the first and second proteins from the first vector, those that express the DNA of the third protein from the second vector and those that can synthesize the first, the second and the third protein, and these three proteins must interact with one another.
(FR)L'invention concerne un système de clonage et un procédé pour analyser des interactions entre trois partenaires protéiques rendant possible un criblage à la fois rapide et à rendement élevé de banques d'ADNc. Le système de clonage se compose d'un premier vecteur et d'un second vecteur. Le premier vecteur contient deux cassettes d'expression : dans la première cassette d'expression est cloné l'ADN d'une première protéine connue, couplé à la séquence Cub de l'ubiquitine et à l'ADN d'un facteur de transcription pour au moins deux gènes rapporteurs; dans la seconde cassette d'expression est cloné l'ADN d'une deuxième protéine connue, couplé à la séquence Nub de l'ubiquitine. Le second vecteur contient une cassette d'expression dans laquelle est introduit(e) la banque d'ADN ou l'ADN d'une troisième protéine à tester quant à l'interaction avec les deux autres protéines connues. Les deux vecteurs contiennent d'autres éléments tels que des origines de réplication sélectionnées, des promoteurs, des gènes de résistance aux antibiotiques et des gènes marqueurs d'auxotrophie, qui permettent aussi bien la mise en œuvre du procédé que le criblage à haut rendement d'une banque d'ADNc quant à la présence d'un partenaire protéique potentiel. Selon le procédé de l'invention, le premier vecteur est transféré dans des cellules de levure du premier type d'appariement et le second vecteur est transféré dans des cellules de levure du second type d'appariement, les cellules de levure des deux types d'appariement sont appariées entre elles et sélectionnées sur un milieu déficitaire particulier. Selon l'invention, seules croissent sur le milieu des cellules de levure qui expriment l'ADN de la première et de la deuxième protéine par le premier vecteur, et l'ADN de la troisième protéine par le second vecteur et peuvent synthétiser la première, la deuxième et la troisième protéine, ces trois protéines devant interagir entre elles.
Designated States: AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
African Regional Intellectual Property Organization (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Eurasian Patent Organization (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM)
European Patent Office (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
African Intellectual Property Organization (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Publication Language: German (DE)
Filing Language: German (DE)