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1. (WO2015119447) HIGH-THROUGHPUT ANALYSIS METHOD OF INTERACTION BETWEEN MATERIALS, USING PROTEIN FUSION DISPLAY TECHNIQUE
Latest bibliographic data on file with the International Bureau   

Pub. No.:    WO/2015/119447    International Application No.:    PCT/KR2015/001226
Publication Date: 13.08.2015 International Filing Date: 06.02.2015
IPC:
C40B 30/06 (2006.01), C40B 40/06 (2006.01), G01N 33/68 (2006.01)
Applicants: KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY [KR/KR]; 125, Gwahak-ro Yuseong-gu Daejeon 305-806 (KR)
Inventors: LEE, Seung Goo; (KR).
KIM, You Jung; (KR).
GAM, Jong Sik; (KR).
KIM, Ha Seong; (KR).
LEE, Dae Hee; (KR).
JUNG, Heung Chae; (KR)
Agent: SON, Min; (KR)
Priority Data:
10-2014-0014334 07.02.2014 KR
Title (EN) HIGH-THROUGHPUT ANALYSIS METHOD OF INTERACTION BETWEEN MATERIALS, USING PROTEIN FUSION DISPLAY TECHNIQUE
(FR) PROCÉDÉ D'ANALYSE À HAUT DÉBIT D'INTERACTIONS ENTRE MATÉRIAUX, À L'AIDE DE TECHNIQUE D'AFFICHAGE DE FUSION DE PROTÉINE
(KO) 단백질 융합 디스플레이 기술을 이용한 물질 간 상호작용 고속분석 방법
Abstract: front page image
(EN)The present invention relates to: a method for analyzing the interaction between a binding protein and a target material, comprising a step of measuring the interaction between a binding protein and an external target material through an optimum dialysis step of using interaction trapper cells (ITcells) in which the binding protein is displayed on the surface of intracellular inclusion bodies by expressing a fusion protein which forms active protein particles containing the binding protein, that is, insoluble aggregates (inclusion bodies) and allows the intrinsic interaction and activity of the binding protein to be exhibited, and having no effect on the activity and genetic information of the binding protein displayed in the cells; and a method for screening a library, further comprising a recovery step by an individual cell unit. In addition, the present invention relates to cells and a cell library, which can introduce, into the cells, an external target material while conserving the activity and genetic information of the binding protein displayed on the surface of intracellular inclusion bodies and contain a structure comprising a polynucleotide encoding the fusion protein, or express the fusion protein such that a binding protein is displayed on inclusion bodies. High-throughput screening (HTS) can be provided by using the method of the present invention, wherein the HTS has high screening efficiency since the signal-to-noise ratio is remarkably high compared with known screening methods at 450 times the level thereof by sensitively labelling, through the overexpression of a binding protein, a target material interacting therewith, and can readily isolate a single cell unit, thereby searching and isolating interacting proteins in many libraries at an ultra-high speed by using a fluorescence microscope and a flow cytometer. Additionally, the interaction of in vivo materials can be readily analyzed at a high speed through the introduction into cells after extracellular expression even if the expression of extrinsic materials in cells is difficult. The present invention can be used in various fields such as in the development of antibodies/artificial antibodies, the preparation of a novel interacting protein, and the analysis and optimization of the interaction of a target protein and a drug candidate material.
(FR)La présente invention concerne : un procédé pour analyser l'interaction entre une protéine de liaison et une matière cible, comprenant une étape consistant à mesurer l'interaction entre une protéine de liaison et une matière cible externe par une étape de dialyse optimale d'utilisation de cellules de piège d'interaction (ITcells) dans laquelle la protéine de liaison est présentée sur la surface de corps d'inclusion intracellulaires par l'expression d'une protéine de fusion qui forme des particules protéiques actives contenant la protéine de liaison, à savoir, des agrégats non solubles (corps d'inclusion) et permet à l'interaction et l'activité intrinsèques de la protéine de liaison d'être montrées, et n'ayant aucun effet sur l'activité et les informations génétiques de la protéine de liaison présentée dans les cellules ; et un procédé pour cribler une banque, comprenant en outre une étape de récupération par une unité cellulaire individuelle. De plus, la présente invention concerne des cellules et une bibliothèque de cellules, qui peuvent introduire, dans les cellules, une matière cible externe tout en conservant l'activité et les informations génétiques de la protéine de liaison présentée sur la surface des corps d'inclusion intracellulaire, et contiennent une structure comprenant un polynucléotide codant pour la protéine de fusion, ou expriment la protéine de fusion de telle sorte qu'une protéine de liaison est présentée sur des corps d'inclusion. Un criblage à haut débit (HTS) peut être fourni par utilisation du procédé de la présente invention. Le HTS a une efficacité de criblage élevée étant donné que le rapport signal-sur-bruit est remarquablement élevé par comparaison avec des procédés de criblage connus à 450 fois le niveau de ces derniers par marquage de manière sensible, par l'intermédiaire de la surexpression d'une protéine de liaison, d'une matière cible interagissant avec cette dernière, et peut facilement isoler une unité cellulaire unique, ce qui permet de chercher et d'isoler des protéines d'interaction dans de nombreuses banques à une ultra-haute vitesse par utilisation d'un microscope à fluorescence et d'un cytomètre en flux. De plus, l'interaction de matières in vivo peut être facilement analysée à grande vitesse par introduction dans des cellules après expression extracellulaire, même si l'expression de matières extrinsèques dans des cellules est difficile. La présente invention peut être utilisée dans divers domaines tels que dans le développement d'anticorps/anticorps artificiels, la préparation d'une nouvelle protéine d'interaction, et l'analyse et l'optimisation de l'interaction d'une protéine cible et d'une matière de médicament candidat.
(KO)본 발명은 결합단백질을 포함하고 있는 활성형 단백질입자, 즉 불용성 응집체(봉입체; inclusion bodies)를 형성하면서도 결합단백질 고유의 상호작용 및 활성을 나타내도록 하는 융합 단백질을 발현시켜 결합단백질이 세포내 봉입체 표면에 디스플레이 된 상호작용 포획 세포(ITcells; Interaction Trapper cells)를 이용하고 상기 세포를 디스플레이 되어 있는 결합단백질의 활성 및 유전정보에는 영향을 주지 않는 최적의 투과처리 단계를 통해 결합단백질과 외부 표적물질의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하는 결합단백질과 표적물질 간 상호작용을 분석하는 방법 및 이에 개별 세포 단위로 회수하는 단계를 추가로 포함하는 라이브러리 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포내 봉입체 표면에 디스플레이 되어 있는 결합단백질의 활성 및 유전정보를 보존하면서도 외부 표적물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 특징으로 하며, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물을 포함하거나, 융합 단백질이 발현되어 결합단백질이 봉입체에 디스플레이 된 세포 및 세포 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 결합단백질의 과발현으로 인해 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지함으로써 신호 대 잡음비가 450배 수준으로 기존의 스크리닝 방법들에 비해 월등히 높아 스크리닝 효율이 높으며, 단일세포 단위로 용이하게 분리할 수 있어 형광 현미경 및 유세포분석기를 이용하여 대량의 라이브러리에서 상호작용 단백질을 초고속으로 탐색 및 분리할 수 있는 고속 탐색 기술(high-throughput screening; HTS)을 제공할 수 있다. 또한, 세포 내에서 발현이 어려운 외래 물질도 세포 외 발현 후 세포내 도입을 통해 생체 물질 간의 상호작용을 손쉽게 고속으로 분석할 수 있다. 본 발명은 항체/인공 항체개발, 새로운 상호작용 단백질의 제조, 표적단백질과 의약후보물질의 상호작용 분석 및 최적화 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.
Designated States: AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KN, KP, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
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Publication Language: Korean (KO)
Filing Language: Korean (KO)