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1. (WO2014005421) BENZODIOXOLE DERIVATIVE AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
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苯并间二氧杂环戊烯衍生物及其制备方法和用途 发明领域

本发明涉及一类新的苯并间二氧杂环戊烯衍生物,这类化合物具有乙酰胆碱酯 酶抑制活性,可以用于治疗或者预防阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease) . 本发 明也涉及到这类化合物的制备方法。

发明背景

随着老年人口的迅速增长,患有阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease) 的人数 也随之急剧增加。阿尔茨海默氏症又被称为阿尔茨海默型痴呆(Alzheimer type dementia)或阿尔茨海默型老年痴呆 ( senile dementia of the Alzheimer type) 。目前, 虽然这种疾病在全球范围内的患病率仍然是未知的,但根据美国阿尔茨海默氏症协 会 (the Alzheimer's Association) 的最新报告, 201 1年美国大约有 540万人患有阿 尔茨海默氏症,而到 2050年,在美国患有该疾病的人数将增至约 1350万左右。因 此,研发药效更好且副作用更小的治疗这种疾病的新药实在是当务之急。

阿尔茨海默氏症是最常见的一种老年痴呆,它已经成为美国人的第六大死因, 而且是 65岁以及 65岁以上的美国人的第五大死因。虽然科学家己经对这种疾病进 行了广泛而深入的研究,但迄今为止,对造成该疾病的确切原因仍不清楚。阿尔茨 海默氏症是一种渐进性的疾病,它不断杀死神经细胞,破坏大脑中的神经连接,致 使大脑中的组织被破坏,从而导致患者逐渐失去记忆、意识和判断力,并造成患者 出现情绪紊乱和行为障碍。

阿尔茨海默氏症是一种不可逆转的疾病,现在尚无任何药物可以预防这种疾病, 也没有任何药物可以治愈这种疾病或者延缓这种疾病的进程。目前用于治疗该疾病 的药物只能减轻或改善该疾病的症状。这些被美国 FDA批准使用的药物共有 5个, 其中 4个是乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase) 抑制剂。乙酰胆碱(acetylcholine) 是一种神经递质,是一种由神经释放的化学物质,如果大脑中产生乙酰胆碱的系统, 即胆碱能系统遭到损坏,则会导致与阿尔茨海默氏症相关的记忆障碍;而乙酰胆碱 酯酶的功能就是催化乙酰胆碱的水解,即分解乙酰胆碱。由于阿尔茨海默氏症伴随

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着乙酰胆碱活性的衰减,因此抑制乙酰胆碱酯酶就是治疗这种疾病的途径之一。如 前所述,目前在临床使用的 5个治疗阿尔茨海默氏症的药物中,有 4个是乙酰胆碱 酯酶抑制剂,这些乙酰胆碱酯酶抑制剂包括多奈哌齐(donepezil)、他克林(tacrine)、 卡巴拉汀(rivastigmine )和加兰他敏(galantamine),其中多奈哌齐(Sugimoto et al. US4895841 and 5100901 ; Pathi et al. WO 2007077443; Parthasaradhi et al. WO 2005003092; Dubey et al. WO 2005076749; Gutman et al. WO 200009483; Sugimoto et al. J. Med. Chem. 1995, 38, 481 ) 是治疗阿尔茨海默氏症的一线药物。然而,多奈哌 齐和其它四个药物都只能改善病人的症状,而且就是这种只能改善症状的作用也是 短暂的,仅能持续约 6-12 个月,并且病人对这些药物的响应率也只有 50% 左右 (Alzheimer's Association, 201 1 Alzheimer' Disease Facts and Figures, Alzheimer's & Dementia, 201 1, 7(2), 208 ) 。本发明提供一类新的乙酰胆碱酯酶抑制剂,这是一类 新的苯并间二氧杂环戊烯衍生物,是比多奈哌齐更有效的且副作用更小的治疗阿尔 茨海默氏症的药物。

发明内容

本发明的目的之一在于公开了一类新的乙酰胆碱酯酶抑制剂- -苯并间二氧杂 环戊烯衍生物或其药学上适用的盐。

本发明所述的化合物可用式(I ) 表示:


(I )

其中

R1和 R2独立地选自以下基团:氢、甲基或乙基; R1和 R2可以合起来为 =0; R1和 R2也可以与连接它们的碳原子一起环合起来形成三元碳环;

A选自以下基团:苯基、 R3取代的苯基、吡啶基、 R4取代的吡啶基、嘧啶基、 R5取代的嘧啶基、吡咯基、 R6取代的吡咯基、哒嗪基、 R7取代的哒嗪基、吡唑基 或 R8取代的吡唑基;

R3为 1〜5个取代基,独立地选自以下基团:卤素、( -C3) 垸基、(C2-C3) 烯基、(C3-C4) 环垸基、(d- C3) 烷氧基、三氟甲基或氰基;

R4为 1〜4个取代基,独立地选自以下基团:卤素、(C,- C3) 垸基、(C2 - C3) 烯基、(C3-C4) 环垸基、( - ) 烷氧基、三氟甲基或氰基;

R5为 1〜3个取代基,独立地选自以下基团:卤素、( -Cs) 垸基、(C2 - C3) 烯基、(C3-C4) 环垸基、(d- C3) 垸氧基、三氟甲基或氰基;

R6为 1〜4个取代基,独立地选自以下基团:(d-C3) 垸基、(C2~C3) 烯基 或 (C3-C4) 环烷基;

R7为 1〜3个取代基,独立地选自以下基团:卤素、(d-C3) 烷基、(C2-C3) 烯基、(C3- C4) 环垸基、(Cr"C3) 垸氧基、三氟甲基或氰基;

R8为 1〜3 个取代基,独立地选自以下基团:(d-C3) 烷基、(C2-C3) 烯基 或 (C3-C4) 环烷基;

或者其药学上可以接受的盐。

在另一种实施方案中, A优选选自苯基、 R3取代的苯基、吡啶基、 R4取代的吡 啶基、嘧啶基或 R5取代的嘧啶基。

在另一种实施方案中,其中上述 R1和 R2优选氢或甲基、 R1和 R2合起来为 =0 或 R1和 R2与连接它们的碳原子一起环合起来形成三元碳环;更优选的是 R1和 R2 与连接它们的碳原子一起环合起来形成三元碳环。

在另一种实施方案中,其中上述 A优选苯基、 R3取代的苯基、吡啶基、 R4取 代的吡啶基、嘧啶基、 R5取代的嘧啶基、吡咯基、 R6取代的吡咯基、哒嗪基、 R7 取代的哒嗪基、吡唑基、 R8取代的吡唑基;其中 R3为 1〜5个取代基,优选自以下 基团:卤素、(C「C3) 烷基、(d-C3) 垸氧基、三氟甲基或氰基; R4为 1〜4个 取代基,优选自以下基团:卤素、(d-Cs) 垸基、(d-C3) 垸氧基、三氟甲基或 氰基; R5为 1〜3 个取代基,优选自以下基团:卤素、(d-C3) 垸基、(CH 3) 垸氧基、三氟甲基或氰基; R6为 1〜4个取代基,优选自(C,-C3)垸基; R7为 1〜3 个取代基,优选自以下基团:卤素、(d-C3) 烷基、(d-C3) 垸氧基、三氟甲基 或氰基; R8为 1〜3个取代基,优选自(d-C^ 垸基。

在另一种实施方案中,其中上述 A更优选苯基、 R3取代的苯基、吡啶基、嘧啶 基、吡咯基、 R6取代的吡咯基、哒嗪基或吡唑基;其中 R3为 1〜5个取代基,优选 自以下基团:卤素、(CH¾)垸基、( -C3)烷氧基、三氟甲基或氰基; R6为 1~4 个取代基,优选自(d-C3) 垸基。

最优选的是, A 为苯基、 2-氟苯基、 3-氟苯基、 4-氟苯基、 2, 6-二氟苯基、 2-吡啶基、 3-吡啶基、嘧啶 -2-基、吡咯 -2-基、 5-甲基吡咯 -2-基、哒嗪 -3-基或吡唑 -5-基。

更具体地说,其中所述的化合物式(I) 选自:

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(1-1); 6-[2-[1-[(2-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基 ]-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(1-2);

6-[2-[1-[(3-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(1-3);

6-[2-[1-[(4-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(");

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮(1-5); 6-[2-[1-[(2-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮(1~6);

6-[2-[1-[(3-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮(1-7);

6-[2-[1-[(4-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮(1~8);

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基] -5-甲基 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮 (1-9);

6-[2-[1-[(2-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5-甲基 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7-酮 (1-10);

6-[2-[1-[(3-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5-甲基 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-η 异吲哚 -7-酮(1-11);

6-[2-[1-[(4-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -5-甲基 -5Η-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7-酮(1-12);

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基] -7,7-二甲基 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5-酮 (1-13);

6-[2-[l-[(2-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -7,7-二甲基 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -5-酮 (1-14);

6-[2-[1-[(3-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -7,7-二甲基 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -5-酮 (1-15);

6-[2-[1-[(4-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基] -7,7-二甲基 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -5-酮 (1-16);

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙 烷] -5-酮(I一 17);

6-[2-[1-[(2-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7, Γ-环丙烷 ]-5-酮(1-18);

6-[2-[1-[(3-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙浣 ]-5-酮(1-19);

6-[2-[1-[(4-氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮 (1-20);

6-[2-[1-[(2-氯苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮 (1-21);

6-[2-[1-[(2-三氟甲基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7,Γ-环丙烷 ]-5-酮(1-22);

6-[2-[1-[(2-甲基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲 哚 -7,1'-环丙院 ]-5-酮(1-23);

6-[2-[1-[(2-氰基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲 哚 -7,1'-环丙院 ]-5-酮(1-24);

6-[2-[1-[(2,6-二氟苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮 (1-25);

6-[2-[1-[(2-甲氧基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(1-26);

6-[2-[1-[(3-甲氧基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-ί]异 吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮(1-27);

6-[2-[l-[(4-甲氧基苯基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(1-28);

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(1-29);

6-[2-[1-(3-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7, Γ-环丙垸 ]-5-酮(1-30);

6-[2-[1-(4-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(1-31);

6-[2-[1- (嘧啶 -2-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7, Γ-环丙垸 ]-5-酮(1-32);

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮盐酸盐(1-33);

6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙 垸] -5-酮盐酸盐(1-34);

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮磷酸盐(1-35);

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二 酮 (1-36);

6-[2-[1- (哒嗪 -3-基甲基 )-4-哌啶基]乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮 (1-37);

6-[2-[1- (哒嗪 -3-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(1-38);

6-[2-[1-(1Η-吡咯 -2-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 B引哚 -7,1'-环丙浣 ]-5-酮(1-39);

6-[2-[1- [(5-甲基 -1H-吡咯 -2-基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(140);

6-[2-[1-(1Η-吡唑 -5-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮 (1-11);

或其药学上可接受的盐。

在上述化合物中,优选化合物为:

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮(1-29 )

或其药学上可接受的盐。

在上述化合物中,优选所述化合物为:

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-1]异吲哚 -7, Γ-环丙垸 ]-5-酮 ( 1-29 );

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-ί]异吲哚 -7,1 '-环丙垸 ]-5-酮盐酸盐(1-33) ; 或者

6-[2-[1-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮磷酸盐(1-35)。

本发明的另一方面还涉及制备式(I )化合物所使用的中间体式 IV和式 II化合 物,如下所示:

式 IV表示的化合物:


其中

R1和 R2如上所定义; R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc ) ;

式 H化合物,或其盐-


其中, R1和 R2如上所定义。所述的盐是指与酸所形成的盐。其中,优选所述

的酸选自盐酸、硫酸、三氟乙酸等。

本发明的第二方面公幵了通式(I)化合物及其药物组合物在制备用于治疗或者 预防与乙酰胆碱酯酶抑制剂相关的疾病的药物中的应用。

本发明的又一方面在于公丌了通式(I )化合物在制备用于治疗阿尔茨海默氏症 (Alzheimer's disease) 的药物中的应用。

本发明的另一方面在于药物组合物,其中包括有效量的本发明化合物或者它们 药学上可接受的盐。本发明药物组合物中还可以包含与式(I)化合物相容的药学上 适用载体。式(1)化合物可以用一般的剂型给药,如口服剂型和注射剂型,包括胶 囊剂、片剂、粉剂、扁囊剂、混悬液剂和溶液剂,优选以口服剂型给药,更优选以 口服剂型中的片剂和胶囊剂给药。剂型和药用组合物可以用常用的药学上适用的赋 形剂和添加剂以及常用的技术制得。所述药学上适用的赋形剂和添加剂包括无毒性 的可配伍的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味 剂、增稠剂、着色剂、乳化剂等。

本发明的目的之二在于公幵所述苯并间二氧杂环戊烯衍生物(式 I ) 的制备方 法。所述方法包括:将式 II所示的化合物或其盐与式 HI-1或 IH-2所示的化合物反 应得到:


Π I

其中, R1 R2和 A如上所定义; X为卤素或羟基, Y为甲酰基或垸氧羰基。当 X 为羟基时, A 为吡咯或取代吡咯,反应在碱性条件下进行(醇钠、醇钾或者钠 / 醇);当 Y为垸氧羰基时, A为吡咯或取代吡咯,用钠 /醇促进反应。

其中式 II化合物或其盐可以通过以下方法制备得到,所述方法包括:脱除式 IV 所示的化合物的氨基保护基:

其中, R1和 R2如上所定义; R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc)。 本发明还提供了化合物式(I ) 与酸成盐的方法:即将化合物式(I) 与相应的 酸 (如盐酸、硫酸、磷酸等)充分混合,经过后处理,得到相应的盐,如制备化合 物 1-33、化合物 1-34和化合物 I - 35。

本发明的目的之三在于公开所涉及的中间体(式 IV) 的制备方法

本发明的一方面在于提供了以化合物 V为原料制备化合物式(IV-1 )的方法(如 下反应式 1所示)。该方法适用于式(IV)化合物中 R1和 R2合起来为 =0时的情况。 其中, R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc); R1Q为卤素或对甲苯磺酰氧基。


VI IV-1

反应式 1

本发明的又一方面在于提供了以化合物 IV-1为原料,将式 IV-1所示的化合物 先还原成醇,然后将形成的羟基转化成易离去的乙酰氧基,最后通过催化氢解将乙 酰氧基脱掉以得到化合物式(IV-2 ) 的方法(如下反应式 2所示)。该方法适用于式 (IV) 化合物中 R1和 R2均为氢时的情况。其中, R9为氨基的保护基,优选叔丁氧 羰基(Boc)。

VIII IV-2

反应式 2

本发明的再一方面在于提供了以化合物 IV-2为原料,将式 IV-2所示化合物的 苄位(即 5元内酰胺的 CH2基团)单垸基化以得到化合物式(IV-3 ) 的方法(如下 反应式 3所示)。该方法适用于式(IV) 化合物中 R1为甲基或乙基, R2为氢时的情 况。其中, R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc)。


反应式 3

本发明的再一方面在于提供了以化合物 IV-3为原料,将式 IV-3所示化合物的 苄位(即与 R1相连的碳原子)垸基化以得到化合物式(IV-4 ) 的方法(如下反应式 4所示)。该方法适用于式(IV) 化合物中 R1和 R2为甲基或乙基时的情况。其中, R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc)。


IV-3 IV-4

反应式 4

本发明的再一方面在于提供了以化合物 IV-1为原料,将式 IV-1所示的化合物 先与甲基格氏试剂反应形成醇,然后醇在酸性条件下脱水成烯,最后将产生的碳碳 双键用 Et2Zn/TFA/CH2I2转化成三元环以得到化合物式(IV-5)的方法(如下反应式 5所示)。该方法适用于式(IV)化合物中 R1和 R2与连接它们的碳原子一起环合起 来形成三元碳环的情况。其中, R9为氨基的保护基,优选叔丁氧羰基(Boc); X为 卤素。


IV-5

反应式 5

如无特别定义,本发明中所使用的术语具有本领域普遍所接受的含义,进一歩 地,本发明所使用的部分术语定义如下:

"卤素"是指氟、氯、溴和碘。

"垸基" 当作一基团时是指直链或者带有支链的饱和脂肪烃基团。垸 基包括甲基、乙基、正丙基和 2-丙基。

"烯基"作为一基团时是指含有一个碳碳双键的脂肪烃基团,可为直链也可以 带有支链。(C2-C3 ) 烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基和烯丙基。

"环烷基"是指饱和的碳环。(C3-C4) 环垸基包括环丙基和环丁基。三元环具 有与三元碳环相同的含义,都是指环丙基环,即 R1和 R2均为 CH2,并且二者通过 碳碳单键连接起来。

"烷氧基"是指(垸基 -0-) 的基团。其中,垸基如上所定义。(d-C3 ) 烷氧基 包括甲氧基、乙氧基、 JH丙氧基和异丙氧基。

此外,术语 "药学上可接受的盐"是指上述化合物能保持原有生物活性并且适 合于医药用途的某些盐类。式(I)所表示的化合物药学上可接受的盐可以为与合适 的酸形成的盐,合适的酸包括无机酸和有机酸,例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑 磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳 酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、甲磺酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对 甲苯磺酸等。特别优选的是盐酸、磷酸或硫酸。

我们已经发现,本发明所提供的化合物是高活性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,具有 显著的改善学习记忆的作用,能够用于治疗阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease )。

下面通过实施例进一歩阐明本发明。实施例给出了式(I )所表示的代表性化合 物的制备及相关结构鉴定数据。必须说明,下述实施例是用于说明本发明而不是对 本发明的限制。

在下列实例中,除非另有指明,所有温度为摄氏温度,除非另有指明,各种起 始原料和试剂均来自市售。市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用,除非另有 指明。

玻璃器皿用烘箱干燥和 /或加热千燥。反应用玻璃硅胶 -60 F254平板(0.25 mm ) ( TLC ) 上进行跟踪。分析性薄层层析并以适当的溶剂比例(Wv) 加以展幵。以 TLC上起始物质耗尽时为反应终点。

Ή NMR图谱是用 Bruker仪器(400MHz) 测定而得,化学位移用 ppm表示。 使用四甲基硅垸内标准(0.00ppm)。 Ή NMR的表示方法: s=单峰, d=双重峰, t= 三重峰, m=多重峰, 1^=变宽的, dd=双重峰的双重峰。若提供偶合常数时,其单位 为 Hz。

质谱是用 LC/MS仪测定得到,离子化方式可为 ESI或 APCI。

所有熔点均未经修正。

下面的实例仅仅是用来说明所发明的具体化合物的合成方法。但在合成方法上 并没有任何限制。在下面未列出的化合物,也可以用与下面同样的合成路线与合成 方法,选择适当的起始原材料、在有必要的地方稍加适当的常识性的反应条件调整 即可加以制备。

附图说明

图 1是大鼠口服给予盐酸多奈哌齐、 1-33和 1-35后的血浆药物浓度一时间曲线 (横坐标为时间,单位为 h; 纵坐标为浓度,单位为 nmol/L )

具体实施方案

实施例 1 : 4-[2-(5,7-二氧代-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-1]异吲哚-6-基)乙基]哌啶小 羧酸叔丁酯(化合物 XI) 的制备


向 1升反应瓶中,加入 52克(0.27摩尔) [1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(化合物 V-l,参照文献 J. Am. Chem. Soc, 1951, 75, 1371和 J. Am. Chem. Soc, 1963, 473的方法合成得到)和 320毫升二甲基亚砜,搅拌,加热至 60°C,待固 体完全溶解后加入 110毫升溶有 23.4克(0.42摩尔)氢氧化钾的乙醇溶液,搅拌 15 分钟,再加入 160毫升溶有 117克(0.31摩尔) 4-[2- (对甲苯磺酰氧基)乙基]哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 VI-1 , 参照专利 WO 2007082731 的方法合成得到)的二甲基 亚砜溶液,加完后于 60°C反应 5小时,反应完全,加入 500 ml乙酸乙酯和 300 ml 水,萃取,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干得约 102.2克粗品,柱 层析分离,得 72克化合物 XI,收率 65.8%。 1H NMR (DMSO- 6): δ 0.90-1.00 (m, 2 H), 1.36 (s, 10 H), 1.46 (q, 2 H, J = 7.0 Hz), 1.66 (d, 2 H, J= 11.9 Hz), 2.62 (br s, 2 H), 3.51 (t, 2 H, J = 7.0 Hz), 3.88 (d, 2 H, J= 11.5 Hz), 6.24 (s, 2 H), 7.32 (s, 2 H); MS (ESI): m/z 425 [M+Na]+

实施例 2: 6-[2- (4-哌啶基)乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮盐 酸盐(化合物 H-1 ) 的制备


向 500毫升反应瓶中加入 20克(0.05摩尔)化合物 XI,加入 400毫升含 10% 氯化氢的乙酸乙酯溶液,室温反应 2小时,过滤,洗涤,烘干得到 15.5克化合物 11-1, 收率 92.3% Ή NMR (D20): δ 1.40-1.64 (m, 5 Η)' 2.02 (d, 2 H,J= 13.4 Hz), 2.96-3.03 14

(m, 2 H), 3.45-3.50 (m, 4 H), 6.12 (s, 2 H), 6.79 (s, 2 H); MS (ESI).- m/z 303 [M-Cl]' 实施例 3: 6-[2-(l-节基 -4-哌啶基)乙基 ]-[U]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮(化合物 1-1) 的制备


向反应瓶中加入 5克(0.015摩尔)化合物 11-1, 1.4克(0.01摩尔)碳酸钾, 100毫升乙腈, 2.3毫升(0.02摩尔)氯化苄,加热至 50°C反应 3〜4小时,反应完 毕,加入 200毫升乙酸乙酯和 100毫升水,萃取,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤, 滤液浓缩至干,柱层析分离得 3.5克化合物 1-1,收率 60.4%。 1HNMR(DMSO- ): δ 1.08-1.17 (m, 3H), 1.48 (q, 2H, J =6.6 Hz), 1.67 (d, 2 H, J- 10.0 Hz), 1.85 (t, 2H, J= 10.8 Hz), 2.75 (d, 2H, J= 11.4 Hz), 3.41 (s, 2 H), 3.53 (t, 2H, J=7.1 Hz), 6.27 (s, 2 H), 7.22-7.32 (m, 5 H), 7.37 (s, 2 H); MS (ESI): m/z 393 [M+H]+

以化合物 II-l为原料,选用合适的试剂,按实施例 3方法制备以下化合物: 实施例 结构 Ή NMR (400MHz)和 MS (m/z)

'HNMR(CDC13): δ 1.24-1.32 (m, 3Η), 1.58 (q, 2Η, J =7.5 Hz), 1.75 (d,2H,J= 10.8 Hz), 2.00 (t, 2H, J= 11.0 Hz), 2.89 (d, 2 H,

4 J= 11.5 Hz), 3.57 (s, 2H), 3.64

(t,2H,J=7.4 Hz), 6.15 (s, 2H),

° 1-2 6.99-7.03 (m, 1 H), 7.07-7.11 (m,

1 H), 7.19 (s, 2H), 7.21-7.23 (m, 1 H), 7.37 (t, 1 H, J=7.1 Hz); MS (ESI): m/z 411 [M+H]+


实施例 7: 4-[2-(5-羟基 -7-氧代 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -6-基)乙基] 哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 VH-1) 的制备


XI VII I

向反应瓶中加入 92克(0.23摩尔)化合物 XI, 250毫升甲醇和 250毫升四氢 呋喃,搅拌,降温至 0〜10°C,加入 10克(0.26摩尔)硼氢化钠,于 0〜I0°C反应 20〜30分钟,反应完毕,加入 100毫升水,反应液减压浓缩(温度 45°C)至干,浓 缩残留物加入 500毫升乙酸乙酯, 300毫升水提取洗涤,收集有机层,硫酸钠干燥, 浓缩至少量,加入 300毫升石油醚,析出固体,过滤,石油醚洗涤滤饼,烘干,得 到 64.7克化合物 VH-1,收率 70%。 lH MR (DMSO-^).- δ 0.95-1.04 (m, 2H), 1.39 (s, 10 H), 1.51 (m, 2 H), 1.70 (dd, 2 H, J= 25.0, 12.4 Hz), 2.65 (br s, 2 H), 3.23-3.30 (m, 1 H), 3.54-3.61 (m, 1 H), 3.90 (d, 2 H, J= 10.0 Hz), 5.67 (d, 1 H, J=8.9Hz), 6.12 (s, 1 H), 6.13 (s, 1 H), 6.50 (d, 1 H, J=9.0Hz), 7.08 (s, 1 H), 7.09 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 427 [M+Na]+

实施例 8: 4-[2-(5-乙酰氧基 -7-氧代 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -6-基) 乙基]哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 VHI-1) 的制备


IM VIII-1 向 500毫升反应瓶中,加入 55克(0.136摩尔)化合物 VH-1, 385毫升二氯甲 垸, 43毫升(0.31摩尔)三乙胺, 1.8克(0.015摩尔) 4-二甲氨基吡啶,搅拌,加 入 31毫升(0.33摩尔)乙酸酐,室温反应 1小时,加入 200毫升水洗涤,收集有机 层,加入硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,得约 79克化合物 VHI-1, 未做进一歩 提纯,直接用于下一歩。 'HNMR (OMSO-d6): δ 0.94-1.02 (m, 2 H), 1.39 (s, 10 H), 1.43-1.54 (m, 2H), 1.67 (t, 2H, J =9.9 Hz), 2.14 (s, 3 H), 2.65 (br s, 2H), 3.17-3.24 (m, 1 H), 3.56-3.64 (m, 1 H), 3.90 (d, 2H, J= 10.6 Hz), 6.16 (d, 1 H, J=0.8Hz), 6.18 (d, 1 H, J- 0.6 Hz), 6.90 (s, 1 H), 7.14 (s, 1 H), 7.16 (s, 1 H); MS (ESI):

实施例 9: 4-[2-(7-氧代 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -6-基)乙基]哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 XII) 的制备


VIII-1

向反应瓶中加入 79克化合物 VHI-1和 400毫升乙酸乙酯,再加入 Π克含 50% 水的 5%钯炭,于 60°C常压氢化 7〜8小时,反应完全,过滤,滤液减压浓缩至少 量,滴加石油醚,冷却析出固体,过滤,得到 33 克化合物 XII,收率(按化合物 VH-1计算)约 62.5%。 'HNMR^DMSO-^): δ 0.94-1.04 (m, 2H), 1.39 (s, 10 H), 1.47-1.54 (m, 2H), 1.69 (d, 2H, J= 11.6 Hz), 2.64 (brs, 2 H), 3.50 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.90 (d, 2H, J= 11.3 Hz), 4.32 (s, 2 H), 6.12 (s, 2 H), 7.08 (s, 1 H), 7.11 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 411 [M+Na]+

实施例 10: 6-[2-(4-哌啶基)乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮盐 (化合物 II-2) 的制备


向反应瓶中加入 15克(0.039摩尔)化合物 XII,加入 300毫升含 10%氯化氢 的乙酸乙酯溶液,室温反应 30分钟,反应完全,减压浓缩至干,用乙醇和乙酸乙酯 混合溶液重结晶,得到 10.5克化合物 11-2,收率 84.3%。 1HNMR(D20): δ 1.38-1.49 (m, 2Η)' 1.59-1.61 (m, 3 Η), 1.98 (d, 2Η, J= 13.5 Hz), 2.91-2.98 (m, 2H), 3.42 (d, 2H, J= 12.8 Hz), 3.49 (t, 2H, J=7.0 Hz), 4.13 (s, 2H), 5.97 (s, 2H), 6.72 (s, 1 H), 6.76 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 289 [M-Cl]+

实施例 11: 6-[2-(l-苄基 -4-哌啶基)乙基] -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7-酮(化合物 1-5) 的制备


II-2 1-5

向反应瓶中加入 5克(0.015摩尔)化合物 11-2, 1.4克(0.01摩尔)碳酸钾, 100毫升乙腈, 2.3毫升(0,02摩尔)氯化苄,加热至 50°C反应 3〜4小时,反应完 全,加入 200毫升乙酸乙酯和 100毫升水,萃取,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤, 滤液浓缩至干,柱层析分离得到 3.1克化合物 1-5,收率 53.4%。 1HNMR(CDC13): δ 1.26-1.36 (m, 3 H), 1.57 (q, 2H, J =7.5 Hz), 1.73 (d, 2 H, J=9.2Hz), 1.93 (t, 2H, J= 10.6 Hz), 2.87 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 3.48 (s, 2 H), 3.60 (t, 2H, J- 7.5 Hz), 4.23 (s, 2H), 6.04 (s, 2H), 6.83 (s, 1 H), 7.21 (s, 1 H), 7.22-7.26 (m, 1 H), 7.29-7.30 (m, 4H); MS (ESI): m/z 379 [M+H]+

以化合物 H-2为原料,选用合适的试剂,按实施例 11方法制备以下化合物- 实施例 H NMR (400MHz)和 MS (m/z)


实施例 15: 4-[2-(5-甲基 -7-氧代 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -6-基)乙基] 哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 XIII ) 的制备


向反应瓶中加入 30克(0.077摩尔)化合物 XII和 300毫升四氢呋喃,氮气保 护,降温至 -10〜- 15°C,滴加 78毫升(0.16摩尔, 2摩尔 /升)的二异丙基氨基锂的

正庚垸溶液,滴加时间约为 30分钟,滴完后,保温反应 30分钟,滴加入 4.8毫升 (0.077摩尔)碘甲烷,滴加完毕自然升至室温,反应 2小时,加入 600毫升乙酸乙 酯和 300毫升水,萃取,收集有机层,加入硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩至干, 柱层析分离,得到 14.5克化合物 XIII,收率: 46.7%。 Ή NMR (CDC13): δ 1.07-1.21 (m, 2 H), 1.41 (d, 3 H, J = 6.7 Hz), 1.45 (s, 10 H), 1.55 (q, 2 H, J = 7.4 Hz), 1.66-1.69 (m, 1 H), 1.80-1.83 (m, 1 H), 2.64-2.71 (m, 2 H), 3.17-3.24 (m, 1 H), 3.92-4.00 (m, 1 H), 4.06-4.09 (m, 2 H), 4.41 (q, 1 H, J= 6.7 Hz), 6.05 (s, 2 H), 6.82 (s, 1 H), 7.20 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 403 [M+H]+。

实施例 16: 5-甲基 -6-[2-(4-哌啶基)乙基] -5H-[U]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7- (化合物 II-3 ) 的制备


向反应瓶中加入 5克(0.012摩尔)化合物 XIII和 30毫升乙醇,加入 100毫升 含 10%氯化氢的乙酸乙酯溶液,室温反应 1〜1.5小时,过滤,滤饼以乙酸乙酯洗涤, 干燥,得到 3.4克化合物 11-3,收率 81%。 'H NMR (D20): δ 1.24 (d, 3 H, J= 7.0 Hz), 1.44-1.58 (m, 5 H), 1.98 (m, 2 H), 2.96 (m, 2 H), 3.21-3.25 (m, 1 H), 3.44 (d, 2 H, J= 12.4 Hz), 3.64-3.72 (m, 1 H), 4.34 (q, 1 H, J= 6.6 Hz), 5.94 (s, 2 H), 6.72 (s, 1 H), 6.79 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 303 [M+H]+。

实施例 17: 6-[2-(l-苄基 -4-哌啶基)乙基] -5-甲基 -5H-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] -7-酮(化合物 1-9) 的制备


向反应瓶中加入 2克(0.006摩尔)化合物 II-3和 40毫升乙腈,搅拌,加入 2.4 克 (0.017摩尔)碳酸钾, 1.2毫升(0.0087摩尔)三乙胺, 1.5毫升(0.013摩尔) 氯化苄,升温至 50°C,反应 1.5小时,反应完全,加入 200毫升乙酸乙酯和 100毫

升水,萃取,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱层析分离得到 1.1 克化合物 1—9,收率 47.4%。 1HNMR(CDC13): δ 1.34-1.42 (m, 3 H), 1.46 (d, 3 H, J=6.7Hz), 1.59-1.64 (m, 2 H), 1.72-1.75 (m, 1 H), 1.86-1.89 (m, 1 H), 1.97-2.04 (m, 2H), 2.94 (t, 2 H, J=9.1 Hz), 3.21-3.28 (m, 1 H), 3.55 (s, 2H), 3.97-4.05 (m, 1 H), 4.46 (q, 1 H, J =6.7 Hz), 6.09 (s, 2 H), 6.87 (s, 1 H), 7.26 (s, 1 H), 7.29-7.32 (m, 1 H), 7.34-7.37 (m, 4 H); MS (ESI): m/z 393 [M+H]+。

以化合物 II-3为原料,选用合适的试剂,按实施例 17方法制备以下化合物: 实施例 结构 Ή NMR (400MHz)和 MS (m/z)

1HNMR (CDC13):51.36-1.42 (m, 3H), 1.46 (d, 3 H, J=6.7Hz), 1.58-1.63 (m, 2H), 1.73-1.76 (m, 1 H), 1.87-1.89 (m , 1 H), 2.05-2.10 (m, 2 H), 2.95 (m, 2 H),

18 3.20-3.27 (m, 1 H), 3.63 (s, 2 H),

3.98-4.05 (m, 1 H), 4.46 (q, 1 H,

1-10 J= 6.6 Hz), 6.10 (s, 2 H), 6.87 (s,

1 H), 7.07 (t, I H, J =9.1 Hz), 7.16 (t, 1 H,J=7.4 Hz), 7.26-7.35 (m,2H),7.43 (t, 1 H,J=7.1 Hz); MS (ESI): m/z 411 [M+H]+。

1 H NMR (CDC13) :δ 1.34-1.42 (m, 3 H), 1.46 (d, 3 H, J=6.8Hz), 1.59-1.64 (m, 2H), 1.72-1.75 (m, 1 H), 1.87-1.89 (m , 1 H), 1.99-2.04 (m, 2H), 2.92 (t, 2H,

19 J=8.9Hz), 3.21-3.28 (m, 1 H),

3.54 (s, 2 H), 3.97-4.05 (m, 1 H),

I ll 4.47 (q, 1 H, J =6.7 Hz), 6.10 (s,

2H), 6.88 (s, 1 H), 6.96-7.01 (m, 1 H), 7.10-7.15 (m, 2H), 7.26 (s, 1 H), 7.30-7.34 (m, 1 H); MS (ESI): m/z 411 [M+H]+。

Ή NMR (CDCI3): δ 1.32-1.40 (m, 3 H), 1.46 (d, 3H, J=6.7Hz),

20 1.59-1.64 (m, 2 H), 1.73-1.75 (m,

1 H) , 1.86-1.88 (m , 1 H),

1-12 1.95-2.00 (m, 2 H), 2.90 (t, 2H,

J = 8.2 Hz), 3.21-3.28 (m, 1 H),

3.50 (s, 2 H), 3.98-4.05 (m, 1 H), 4.47 (q, 1 H, J= 6.7 Hz), 6.10 (s, 2 H), 6.88 (s, 1 H), 7.02-7.06 (m, 2 H), 7.26 (s, 1 H), 7.31-7.34 (m, 2 H); MS (ESI): m/z 411 [M+H]+。 实施例 21 : 4-[2-(7,7-二甲基 -5-氧代 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-ί]异吲哚 -6-基)乙 基]哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 XIV) 的制备


XIII XIV

向反应瓶中加入 10克(0.025摩尔)化合物 XIII和 100毫升四氢呋喃,搅拌, 氮气保护,降温至 -10〜- 15°C,滴加 48毫升(0.096摩尔, 2摩尔 /升)的二异丙基 氨基锂的正庚垸溶液,滴加时间约为 30分钟,滴完后,保温反应 30分钟,再滴加 1.6毫升(0Ό26摩尔)碘甲垸,滴加完毕自然升至室温,反应 1小时,反应完全后, 加入 300毫升乙酸乙酯, 150毫升水提取洗涤,收集有机层,加入硫酸钠干燥,过 滤,滤液减压浓缩至干,柱层析分离,得到 5.6克化合物 XIV,收率 54.2%。MS(ESI): m/z 417 [M+H]+

实施例 22: 7,7-二甲基 -6-[2-(4-哌啶基)乙基 ]-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5-酮盐酸盐(化合物 H-4) 的制备


XIV H-4

向反应瓶中加入 2克(0.0048摩尔)化合物 XIV和 10毫升乙醇,再加入 50毫 升含 10%氯化氢的乙酸乙酯溶液,室温反应!〜 1.5小时,过滤,滤饼以乙酸乙酯洗 涤,干燥,得到 1.2克化合物 11-4, 收率 71%。 1H NMR (D20): δ 1.27 (s, 6 H), 1.45 (m, 2H), 1.56 (q, 2H, J=6.9Hz), 1.69 (brs, 1 H), 2.00 (d, 2H, J= 13.9 Hz), 3.00 (t, 2H, J= 12.6 Hz), 3.37 (t, 2H, J=7.6Hz), 3.45 (d, 2 H, J= 12.3 Hz), 5.96 (s, 2H), 6.79 (s, 1 H), 6.86 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 317 [M-Cl]+

实施例 23: 6-[2-(l-节基 -4-哌啶基)乙基] -7,7-二甲基 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -5-酮(化合物 1-13) 的制备


向反应瓶中加入 2.3克 (0.0065摩尔)化合物 H-4和 46毫升乙腈,搅拌,加入 6克 (0.043摩尔)碳酸钾, 1.3毫升(0.0094摩尔)三乙胺, 1.7毫升(0.015摩尔) 氯化苄,升温至 50°C,反应 2〜3小时,加入 200毫升乙酸乙酯, 100毫升水,提取 洗涤,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱层析分离得到 1.8克化 合物 I一 13,收率 67.7%。 1HNMR (DMSO-^6): δ 1.18-1.23 (m, 2H), 1.26-1.33 (m, 1H), 1.40 (s, 6H), 1.50-1.56 (m, 2H), 1.70 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 1.89 (t, 2 H, J= 10.4 Hz), 2.77 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 3.35 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.42 (s, 2H), 6.12 (s, 2 H), 7.05 (s, 1 H), 7.21-7.25 (m, 2 H), 7.27-7.33 (m, 4 H); MS (ESI): m/z 407 [M+H]+0

以化合物 H-4为原料,选用合适的试剂,按实施例 23方法制备以下化合物: 实施例 结构 Ή NMR (400MHz)和 MS (m/z)

'HNMR (DMSO-i/6): δ 1.13-1.22 (m, 2H), 1.23-1.28 (m, 1 H), 1.39 (s, 6H), 1.48-1.54 (m,2H), 1.70 (d, 2H, J= 11.6 Hz), 1.94 (t, 2H, J= 10.9 Hz), 2.78 (d,

24 2H, J= 11.2 Hz), 3.33 (t, 2 H,

' 1-14 J= 7.7 Hz), 3.48 (s,2H),6.10(s,

2 H), 7.03 (s, 1 H), 7.12-7.18 (m, 2 H), 7.24 (s, 1 H), 7.27-7.32 (m, 1 H), 7.39 (t, 1 H, J =7.4 Hz); MS (ESI): m/z 425 [M+H]+o


实施例 27: 4-[2-(5-亚甲基 -7-氧代 -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -6-基)乙基] 哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 IX-1) 的制备


XI 1X 1

将 75克(0.19摩尔)化合物 XI和 500毫升四氢呋喃投于反应瓶中,搅拌,氮 气保护,冷却至 0〜10°C, 将 400毫升 1.2 N甲基碘化镁 /乙醚溶液缓慢加至反应瓶 中,反应 1小时,加入少量水至无气泡产生,滴加浓盐酸,调 PH至酸性,反应 15 分钟,加入 500ml乙酸乙酯, 300ml水提取洗涤,收集有机层,加入硫酸钠干燥, 过滤。滤液浓缩至少量,滴加石油醚,析出固体,过滤,烘干得到 47.6克化合物 IX-1, 收率: 63.8%o 'HNMR (DMSO-i6): δ 0.95-1.05 (m, 2 H), 1.38 (s, 10H), 1.48 (q, 2H, J =7.0 Hz), 1.71 (d, 2 H, J= 12.2 Hz), 2.65 (brs, 2H), 3.70 (t, 2 H, J=7.2Hz), 3.90 (d, 2H, J= 11.6 Hz), 4.95 (s, 1 H), 5.34 (s, 1 H), 6.17 (s, 2 H), 7.15 (s, 1 Η)' 7.53 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 423 [M+Na]+

实施例 28: 4-[2-(5-氧代螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7, -环丙'烷] -6-基)乙基]哌啶 -1-羧酸叔丁酯(化合物 XV) 的制备


IX-1

在反应瓶中加入 300毫升二氯甲垸和 300毫升(1N) 二乙基锌的己垸溶液,氮 气保护,降温至 0〜10°C, 搅拌,滴加 200毫升含 23.1毫升(0.31摩尔)三氟乙酸 的二氯甲垸溶液,滴加时间约 20分钟,滴完后反应 20分钟,滴加 200毫升含 24 毫升(0.3摩尔)二碘甲垸的二氯甲烷溶液,滴完后反应 20分钟,再滴加 300毫升 溶有 60克(0.15摩尔)化合物 IX-1的二氯甲垸溶液,滴完后升至 30°C反应 3〜4 小时,反应完全,加入 500 ml水,以 1 N盐酸调至中性,分层,收集有机层,加入 硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩至干得化合物 XV,直接投入下一步反应。 'H NMR (CDC13): δ 1.08-1.19 (m, 2 H), 1.28 (dd, 2 H, J = 6.2, 7.4 Hz), 1.45 (s, 9 H), 1.48-1.57 (m, 5 H), 1.72 (d, 2 H, J= 12.7 Hz), 2.69 (t, 2 H, J= 11.6 Hz), 3.20 (t, 2 H, J = 7.6 Hz), 4.07 (d, 2 H, J = 13.1 Hz), 6.03 (s, 2 H), 6.43 (s, 1 H), 7.23 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 437 [M+Na]+ 0

实施例 29: 6-[2-(4-哌啶)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-fI异吲哚 -7,Γ-环丙 垸] -5-酮盐酸盐(化合物 Η-5) 的制备


向反应瓶中加入上歩化合物 XV的全量, 750毫升乙醇,加热至全溶,加入 36 毫升浓盐酸,保持 50〜55°C左右反应 5小时,减压浓缩至约余 200 ml, 滴加 900 ml 乙酸乙酯,冷却过滤,滤饼洗涤烘干,得到 24.3克化合物 11-5,收率(按化合物 IX-1 计算): 46.2% Ή NMR (D20): δ 1.06 (t, 2 H, J = 6.7 Hz), 1.32-1.46 (m, 6 H),

1.60 (m, 1 H), 1.91 (d, 2 H, J= 13.5 Hz), 2.91-3.03 (m, 4 H), 3.39 (d, 2 H, J: 12.8 Hz), 5.90 (s, 2H), 6.18 (s, 1 H), 6.68 (s, 1 H); MS (ESI): m/z 315 [M-Cl]+

实施例 30: 6-[2-(l-节基 -4-哌啶基)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,Γ-环丙垸 ]-5-酮(化合物 1-17) 的制备


向反应瓶中加入 2克(0.006摩尔)化合物 11-5, 40毫升乙腈,搅拌,加入 1.2 克 (0.008摩尔)碳酸钾, 1毫升(0.007摩尔)三乙胺, 2毫升(0.017摩尔)氯化 苄,升温至 60°C,反应 2.5小时,反应完全,加入 200毫升乙酸乙酯, 100毫升水, 萃取洗涤,收集有机层,硫酸钠干燥,过滤,滤液浓縮至干,柱层析分离得到 1.5 克化合物 1-17,收率 65.2%。 1H NMR (CDC13): δ 1.24-1.33 (m, 5H), 1.49-1.57 (m, 4H), 1.72 (d, 2H, J =9.6 Hz), 1.96 (t, 2H, J= 10.8 Hz), 2.87 (d, 2H, J= 11.4 Hz), 3.19 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.49 (s, 2 H), 6.03 (s, 2H), 6.42 (s, 1 H), 7.22-7.25 (m, 2H), 7.28-7.32 (m, 4H); MS (ESI): m/z 405 [M+H]+。

以化合物 II-5为原料,选用合适的试剂,按实施例 30方法制备以下化合物: 实施例 结构 Ή NMR (400MHz)禾口 MS (m/z)

Ή NMR (CDC13): δ 1.23-1.31 (m, 5H), 1.48-1.55 (m, 4H), 1.72 (d, 2H, J =9.2 Hz), 2.02 (t, 2H, J= 10.3 Hz), 2.88 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 3.18 (t, 2H,

31 J=7.9Hz), 3.56 (s, 2 H), 6.02

(s, 2 H), 6.41 (s, 1 H), 6.99-7.03

1-18 (m, 1 H), 7.07-7.11 (m, 1 H),

7.19-7.25 (m, 2 H), 7.35-7.39 (m, 1 H); MS (ESI): m/z 423 [M+H]+

1H NMR (CDC13): δ 1.24-1.32 (m, 5H), 1.49-1.56 (m, 4H),

32 1.71 (d, 2H, J= 10.2 Hz), 1.95

(t, 2 H, J= 10.7 Hz), 2.83 (d,
2H, J= 11.2 Hz), 3.19 (t, 2H,


2H), 6.04 (s, 2H), 6.44 (s, 1

H), 7.16 (s, 3H), 7.26-7.29 (m, 2 H); MS (ESI): m/z 419 [M+H]+。

Ή NMR (CDC13): δ 1.25-1.33 (m, 5H), 1.49-1.57 (m, 4H), 1.72 (d, 2H, J= 10.7 Hz), 2.09 (t, 2H, J= 10.8 Hz), 2.85 (d, 2H, J= 11.1 Hz), 3.19 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.67 (s, 2H), 6.03 (s, 2 H), 6.42 (s, 1 H), 7.23 (s,
1 H), 7.31-7.35 (m, 1 H),

7.52-7.55 (m, 2 H), 7.62 (d, 1 H, J =7.7 Hz); MS (ESI): m/z 430 [M+H]+

1H NMR (CDCI3): δ 1.24-1.27

F (m, 5H), 1.49-1.51 (m, 4 H),

1.71 (d, 2H, J=9.0Hz), 2.04 c4 (t, 2H, J= 10.4 Hz), 2.91 (d,

2H, J= 10.4 Hz), 3.17 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.68 (s, 2H), 6.02

1-25 (s, 2H), 6.41 (s, 1 H), 6.87 (t,

2H, J=7.5Hz), 7.22 (m, 2 H); MS (ESI): m/z 441 [M+H]+

Ή NMR (DMSO-i/tf) : δ 1.14-1.24 (m, 3 H), 1.33 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.40 (q, 2H, J = 6.5 Hz), 1.57 (t, 2 H, J= 7.7 Hz), 1.66 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 1.86 (t, 2H, J= 10.8 Hz), 2.76 (d, 2H, J= 11.1 Hz), 3.13 (t, 2H


, J =7.6 Hz), 3.37 (s, 2 H),

3.73 (s, 3 H), 6.11 (s, 2 H), 6.79-6.81 (m, 1 H), 6.84-6.86 (m, 2H), 6.88 (s, 1 H), 7.11 (s, 1 H), 7.21 (t, 1 H, J =7.9 Hz); MS (ESI): m/z 435 [M+H]+0

Ή NMR (DMSO-d0) : δ 1.12-1.20 (m, 3 H), 1.33 (t, 2 H, J =6.4 Hz), 1.40 (q,2H,J=6.4 Hz), 1.57 (t, 2H, J=7.7Hz), 1.66 (d, 2H, J= 11.0 Hz), 1.90 (t, 2H, J= 10.4 Hz), 2.78 (d, 2H, J= 11.3 Hz), 3.13 (t, 2H,

J=7.7Hz), 3.41 (s, 2H), 3.76

(s, 3 H), 6.10 (s, 2H), 6.88 (s, 1 H), 6.91 (d, 1 H, J=7.4 Hz), 6.95 (s, 1 H), 7.11 (s, 1 H), 7.21 (t, 1 H,J=7.3 Hz), 7.29 (d, 1 H, J =7.4 Hz); MS (ESI): m/z435 [M+H]+。

Ή NMR (DMSO-i6) : 6 1.13-1.16 (m, 2H), 1.23 (brs, 1 H), 1.39 (t, 2H, J =6.9 Hz),

I.38 (q, 2H, J=6.6Hz), 1.57 (t, 2H, J=7.5 Hz), 1.65 (d, 2 H, J= 11.4 Hz), 1.83 (t, 2H,

41 On J= 11.0 Hz), 2.74 (d, 2H, J =

1-28 II.1 Hz), 3.12 (t, 2 H, J= 7.6

Hz), 3.34 (s,2H),3.73 (s, 3 H), 6.10 (s, 2H), 6.86 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 6.88 (s, 1 H), 7.10 (s, 1 H), 7.17 (d, 2H, J=8.4Hz); MS (ESI): m/z 435 [M+H]+。 实施例 42:6-[2-[l-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7,Γ-环丙浣 ]-5-酮(化合物 1-29) 的制备


向反应瓶中加入 24.3克(0.069摩尔)化合物 11-5, 36.5克(0.26摩尔)碳酸 钾, 243毫升乙醇, 6.1毫升(0.044摩尔)三乙胺,升温至 50°C左右,加入 31.5 克 (0.049摩尔) 2-氯甲基吡啶盐酸盐,保持 50°C左右反应 5小时,反应完全,加 入 750 ml水,析出固体,过滤,滤饼水洗,烘干得 17.8 g化合物 1-29,收率: 63.4%。 'HNMR (CDC13): δ 1.26 (dd, 2H, J=6.1, 7.6 Hz), 1.35 (brs, 3 H), 1.49-1.57 (m, 4H), 1.72 (d, 2H, J=8.6Hz), 2.08 (t, 2H, J= 10.4 Hz), 2.89 (d, 2H, J= 10.7 Hz), 3.19 (t, 2H, J =7.9 Hz), 3.64 (s, 2H), 6.03 (s, 2H), 6.42 (s, 1 H), 7.15 (dd, 1 H, J=5.2, 6.7 Hz), 7.24 (s, 1 H), 7.41 (d, 1 H, J = 7.7 Hz), 7.64 (td, 1 H, J = 7.6, 1.8 Hz), 8.55 (d, 1 H, J =4.2 Hz); MS (ESI): m/z 406 [M+H]+

以化合物 II-5为原料,选用合适的试剂,按实施例 42方法制备以下化合物-


实施例 46: 6-[2-[l-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7,Γ-环丙烷 ]-5-酮盐酸盐(化合物 1-33) 的制备


向反应瓶中加入 5克(0.012摩尔)化合物 1-29和 25毫升乙醇, 50°C加热搅

拌至全部溶解,加入 1毫升(0.012摩尔)浓盐酸,加入 1 g活性炭脱色 20分钟, 过滤,将滤液冷却至室温,滴加 50 ml异丙醚,析出固体,搅拌 1小时,过滤,少 量异丙醚洗涤滤饼,烘干得到 5 g化合物 1-33,收率: 91.7%。可用乙醇 /异丙醚再 次精制,收率约 90%。 1HNMR (D20): 51.14 (t, 2 H, J- 7.0 Hz), 1.38-1.70 (m, 7 H), 1.96 (d, 2H, J= 13.3 Hz), 2.99-3.14 (m, 4 H), 3.50 (d, 2 H, J= 11.0 Hz), 4.37 (s, 2H), 5.93 (s, 2H), 6.28 (s, 1 H), 6.75 (s, 1 H), 7.47 (dd, 1 H, J=5.6, 7.5 Hz), 7.55 (d, 1 H, J=7.8Hz), 7.91 (td, 1 H, J=7.8, 1.7Hz), 8.58 (d, 1 H, J =4.4 Hz); MS (ESI): m/z 406 [M-Cl]+

实施例 47: 6-[2-(l-苄基 -4-哌啶基)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮盐酸盐(化合物 1-34) 的制备


以 6-[2-(1-苄基 -4-哌啶基)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-ί]异吲哚 -7,1'-环 丙垸] -5-酮盐酸盐(化合物 Ι-Π)为原料按实施例 46的方法制备化合物 1-34。 Ή NMR (CDC13): 1HNMR (CDC13): δ 1.27 (dd, 2H, J =6.2, 7.5 Hz), 1.48-1.66 (m, 5 H), 1.95-2.10 (m, 4H), 2.62 (ddd, 2 H, J=4.6, 12.4, 22.2 Hz), 3.25 (t, 2H, J=6.7 Hz), 3.43 (d, 2H, J= 11.3 Hz), 4.11 (d, 2H, J =5.0 Hz), 6.04 (s, 2H), 6.43 (s, 1 H), 7.21 (s, 1 H), 7.41-7.46 (m, 3 H), 7.62 (dd, 2 H, J=2.3, 5.9 Hz), 12.31 (br s, 1 H); MS (ESI): m/z405 [M-Cl]+

实施例 48:6-[2-[l-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -7,Γ-环丙院 ]-5-酮磷酸盐(化合物 I-3S) 的制备


向反应瓶中加入 2克(0.0049摩尔)化合物 1-29和 40毫升乙醇, 60°C加热搅 拌至全部溶解,加入 0.57克(0.0049摩尔) 85%磷酸,搅拌析出固体,滴加 40亳

升乙酸乙酯,冷却至室温,搅拌 1小时,过滤,少量乙酸乙酯洗涤滤饼,烘干得到 2.1 g化合物 1-35,收率: 84.7%。 1HNMR(D20): δ 1.10 (t, 2 H, J =7.2 Hz), 1.33-1.64 (m, 7 H), 1.92 (d, 2 H, J= 13.4 Hz), 2.95-3.09 (m, 4 H), 3.46 (d, 2 H, J= 10.7 Hz), 4.34 (s, 2H), 5.89 (s, 2 H), 6.20 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 7.45 (dd, 1 H, J- 5.2, 7.4 Hz), 7.53 (d, 1 H, J- 7.8 Hz), 7.88 (td, 1 H, J=7.7, 1.2 Hz), 8.54 (d, 1 H, J =4.6 Hz)。

实施例 49: 6-[2-[l-(2-吡啶甲基) -4-哌啶基]乙基] -[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异 吲哚 -5,7-二酮(化合物 1-36) 的制备


以 6-[2-(4-哌啶基)乙基 ]-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮盐酸盐(化 合物 H-1 )和 2-氯甲基吡啶盐酸盐为原料,按实施例 3方法制备化合物 1-36: 1H NMR (DMSO-^).- δ 1.12-1.19 (m, 3 H), 1.48 (q, 2 H, J=6.1 Hz), 1.67 (d, 2H, J-9.4 Hz), 1.94 (t, 2H, J- 10.3 Hz), 2.76 (d, 2H, J- 11.2 Hz), 3.54 (m, 4H), 6.27 (s, 2H), 7.24 (dd, 1 H, J=6.8, 5.4 Hz), 7.38 (s, 2H), 7.42 (d, 1 H, J=7.8Hz), 7.74 (td, 1 H, J =1.1, 1.4 Hz), 8.64 (d, 1 H, J=4.2 Hz): m/z 394 [M+H]+

实施例 50: 6-[2-[l- (哒嗪 -3-基甲基 )-4-哌啶基]乙基 ]-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f] 异吲哚 -5,7-二酮(化合物 1-37) 的制备


以 6-[2-(4-哌啶基)乙基 ]-[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -5,7-二酮盐酸盐(化 合物 H-1)和 3-溴甲基哒嗪氢溴酸盐为原料,按实施例 3方法制备化合物 1-37: Ή

NMR(CDC13): δ 1.26-1.32 (m, 3H), 1.58 (q, 2H, J=5.0 Hz), 1.75 (d, 2H, J=8.9Hz), 2.12 (t, 2H, J= 10.6 Hz), 2.81 (d, 2H, J= 11.1 Hz), 3.65 (t, 2H, J=7.2 Hz), 3.84 (s, 2H), 6.15 (s, 2H), 7.19 (s, 2H), 7.45 (dd, 1 H, J=8.4, 4.9 Hz), 7.66 (dd, 1 H, J=8.4, 1.2 Hz), 9.07 (dd, 1 H, J=4.8, 1.6 Hz): m/z395 [M+H]+。

实施例 51: 6-[2-[l- (哒嗪 -3-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮(化合物 1-38) 的制备


以 6-[2-(4-哌啶)乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮 盐酸盐(化合物 II-5) 和 3-溴甲基哒嗪氢溴酸盐为原料,按实施例 42方法制备化 合物 1-38: 'HNMR(CDC13): δ 1.25-1.37 (m, 5 H), 1.49-1.58 (m, 4H), 1.73 (d, 2H, J= 11.2 Hz), 2.14 (t, 2H, J= 10.7 Hz), 2.82 (d, 2 H, J= 11.6 Hz), 3.19 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.85 (s, 2H), 6.03 (s, 2H), 6.43 (s, 1 H), 7.23 (s, 1 H), 7.46 (dd, 1 H, J=8.4, 4.9 Hz), 7.67 (d, 1 H, J=8.0 Hz), 9.08 (dd, 1 H, J=4.8, 1.4 Hz): m/z407 [M+H]+。

实施例 52: 6-[2-[1-(1Η-吡咯 -2-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊烯 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙垸 ]-5-酮(化合物 1-39) 的制备


向反应瓶中加入 100毫升无水乙醇, 1.4克(0.061摩尔)金属钠,反应完全后 加入 4.2克 (0.043摩尔) 1H-吡咯 -2-基甲醇, 2.5克(0.0071摩尔)化合物 11-5, 加热回流 3小时,反应完全,加入乙酸乙酯、水萃取洗涤,收集有机层,无水硫酸 钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱层析分离,得到 1.5 克化合物 1-39。 Ή NMR (DMSO- )·· δ 1.10-1.19 (m, 3 H), 1.33-1.40 (m, 4H), 1.57 (t, 2H, J=6.6Hz), 1.64 (d, 2H, J= 11.7 Hz), 1.81 (t, 2H, J= 11.1 Hz), 2.74 (d, 2 H, J= 10.9 Hz), 3.13 (t, 2 H, J = 1.6 Hz), 3.34 (s, 2 H), 5.83 (s, 1 H), 5.90 (s, 1 H), 6.10 (s, 2H), 6.61 (s, 1 H), 6.88 (s, 1 H), 7.10 (s, 1 H), 10.60 (s, 1 H): m/z 394 [M+H]+。

注: 1H-吡咯 -2-基甲醇可由 1H-吡咯 -2-甲醛经由硼氢化钠还原而制得。

实施例 53: 6-[2-[1- [(5-甲基 -1H-吡咯 -2-基)甲基] -4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧

[4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙烧 ]-5-酮(化合物 140) 的制备


H-5 1-40

向反应瓶中加入 300毫升无水乙醇, 10克(0.029摩尔)化合物 Π-5, 20克(0.13 摩尔) 5-甲基 -1H-吡咯 -2-甲酸乙酯,室温搅拌,分批加入 30克(1.30摩尔)金属钠, 加完后升温至 60〜70°C反应 5〜6小时,反应完全,加入乙酸乙酯、水萃取洗涤, 收集有机层,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱层析分离,得到 2克化合 物 140。 'HNMR (DMSO-i6): δ 1.08-1.22 (m, 3 H), 1.32-1.42 (m, 4H), 1.57 (t, 2H, J=7.0 Hz), 1.65 (d, 2H, J= 11.5 Hz), 1.84 (t, 2H, J=9.1 Hz), 2.13 (s, 3H), 2.78 (d, 2H, J= 10.2 Hz), 3.13 (t, 2 H, J=7,5 Hz), 3.31 (s, 2 H), 5.57

(s, 1 H), 5.69 (s, 1 H), 6.10 (s, 2H), 6.88 (s, 1 H), 7.10 (s, 1 H), 10.35

(s, 1 H): m/z 408 [M+H]+

实施例 54: 6-[2-[1-(1Η-吡唑 -5-基甲基 )-4-哌啶基]乙基]螺环 [[1,3]二氧杂环戊 烯并 [4,5-f]异吲哚 -7,1'-环丙烷 ]-5-酮(化合物 141) 的制备


II-5 1-41

向反应瓶中加入 10克(0.029摩尔)化合物 11-5, 3.4克 (0.035摩尔) 1H-P比 唑 -5-甲醛, 150毫升无水甲醇,搅拌,加入 3.6毫升(0.063摩尔)乙酸,搅拌 30 分钟,加入 2.5克(0.040摩尔)氰基硼氢化钠,于 50〜60°C反应 6小时,降至室

温,加入 150毫升水,以氢氧化钠调反应液 PH至 8〜9, 继续滴加 300毫升水,析 出白色固体,过滤得到 8.1克化合物 Ι· 1。 Ή NMR (DMSO-i/6): δ 1.09-1.21 (m, 3 H), 1.33 (t, 2H, J=7.1 Hz), 1.40 (q, 2 H, J=7.8Hz), 1.57 (t, 2H, J =1.5 Hz), 1.65 (d, 2H, J= 11.4 Hz), 1.89 (t, 2H, J= 10.8 Hz), 2.77 (d, 2H, J = 10.4 Hz), 3.12 (t, 2H, J =1.6 Hz), 3.45 (s, 2H), 6.10 (s, 3 H), 6.88 (s, 1 H), 7.11 (s, 1 H), 7.56 (brs, 1 H), 12.58 (brs, 1 H): m/z 395 [M+H]+。

本发明化合物的药效学筛选,按下列方式进行

一. 体外药效学筛选

本实验采用改良的 Ellman 法 ( Alvin V. et al. JWS-USC-75-IX Improves Information Processing and Cognitive Function in Animal Models [J]. Journal of Pharmacology and experimental therapeutics, 2010, 336( 3) :751) 检测式 (I) 系列化 合物对乙酰胆碱酯酶抑制作用,以筛选出具有活性的 AChEIs, 通过式(I) 系列化 合物对酶抑制 IC50值来评价活性。实验结果见表 1:

表 1 化合物(I)对乙酰胆碱酷醉抑制活性数据 化合物 IC50 (nM) 化合物 1C50 (nM)

DPH 94 1-21 653

1-1 86 1-22 >2000

1-2 80 1-23 959

1-3 269 1-24 >2000

1-4 167 1-25 249

1-5 502 1-26 >2000

1-6 483 1-27 >2000

1-7 486 1-28 〉2000

1-8 658 1-29 903

1-9 601 1-30 >2000

1-10 239 1-31 >2000

1-11 889 1-32 >2000

1-12 >2000 1-33 950

1-13 >2000 1-34 197

1-14 >2000 1-35 601

1-15 〉2000 1-36 161

1-16 >2000 1-37 905

1-17 202 1-38 >2000

1-18 154 1-39 >2000

H9 376 1-40 >2000

1-20 706 1-41 990

体外药效筛选实验,以盐酸多奈哌齐(DPH )作为阳性药,结果显示化合物 1-1 和 1-2在酶学水平上药效略好于阳性药; 1-3、 1-4、 1-10、 1-17、 1-18、 1-25、 1-34、 1-36 药效略差于阳性药; 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-11、 1-19、 1-20、 1-21、 1-23、 1-29、 1-33、 1-35、 1-37、 1-41次之; 1-12、 1-13、 1-14、 1-15、 1-16、 1-22、 1-24、 1-26、 1-27、 1-28、 1-30、 1-31、 1-32、 1-38、 1-39、 1-40活性较弱。

二. 体内药效学筛选

(一)式(I) 系列化合物对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的改善

东莨菪碱是中枢 M胆碱受体竞争性拮抗剂,可阻断 Ml和 M2受体,造成记忆 障碍,成为老年痴呆模型。以盐酸多奈哌齐(DPH)作为阳性药,对式(I ) 系列化 合物进行药效筛选。给药 3-5天后,动物进行 Morris水迷宫行为测试。

实验材料:

1.实验动物:雄性 c57小鼠, 22±2 g,动物饲养于明暗交替(10 h/14 h)清洁级动物 房内,自由饮水进食,适应性喂养一周后开始进行实验;

2.实验器材: Morris水迷宫;

3.实验药物:东莨宕碱,盐酸多奈哌齐(DPH) , 式(I) 系列化合物

实验方法:

1.动物分组及给药方案:

动物按体重随机分组,每组 15只。分别为正常组、东莨菪碱组、盐酸多奈哌齐 组 (DPH) 、式(I) 系列化合物组,每天灌胃给药(10 ml/kg) ,正常组及模型组 给予等体积的溶媒。

2. Morris水迷宫实验

2.1实验方法与歩骤

Morris水迷宫由圆形水池、图像自动采集和处理系统组成。动物入水后启动监 测装置,记录动物运动轨迹,实验完毕自动分析报告相关参数。

Morris水迷圆柱形水池其内部被分为 4个大小相等的象限,在第 I象限中央放置 一平台,此平台位置在整个行为学测试中保持不变。实验前一天放入适量水,使平 台没于水下 l cm。实验前加入食用白色素(2 g/L) ,使水池内水成乳白色(实验期 间水池内的水每天更换一次)。实验训练阶段连续进行 5 d,每天训练 2次。训练时, 训练前 30 min腹腔注射东莨菪碱(l mg/kg),将小鼠面向池壁从第 III象限放入水池,

记录小鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间,作为潜伏期,用秒(S ) 表模 ¾ w正示 £ s ss常,小鼠找到平台后,让其在平台上站立 10 s。若入水后 60 s小鼠未能找到平台, 则逃避潜伏期记为 60 s, 并将其轻轻从水中拖上平台,并停留 10 s。

2.2实验项目

1. 定位航行实验(place navigation) :用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获 取能力。实验观察和记录小鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间,即记录其潜伏 期。

2. 空间搜索实验(spatial probe test) :用于测量小鼠学会寻找平台后,对平台 空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后,撤去平台,从同一个入水点放入 水中,测其第一次到达原平台位置的时间、穿越原平台的次数。

2.3 脑组织生化指标测定:

行为学测试结束后,将小鼠断头处死,取大脑组织(在冰盘上操作),用预冷 的生理盐水制成 10%的组织匀浆,离心(3000 rpm, lO min) , 上清液按试剂盒进 行丙二醛(MDA) 测定。

实验结果- ( 1 ) 1-17、 1-18和 1-19对东莨菪碱所致老年痴呆模型小鼠的治疗作用

本实验分为正常组、东莨菪碱(1 mg/kg)组、盐酸多奈哌齐(DPH) ( 5 mg/kg) 组、 1-17 ( 5 mg/kg) 组、 1-18 ( 5 mg/kg) 组和 1-19 (5 mg/kg) 组。 Morris水迷宫实 验结果见表 2:

表 2 1-17、 1-18和 1-19的 Morris水迷宫实验结果 (^±SD)

潜伏期(s)

Group n 站台穿越数

dayl day2 day 3 day4 day 5

15 59.0土3.7 57.0±8.6 52.0士 12.1 44.5±9.7 47.7±16.9 1.8±3.2

15 58.3±6.7 60士0 55.U13.6 59.6±1.5 57. U7.8 0.5±0.6

15 60±0 60±0 51.3±15.6 60±0 57.7±6.6 1.3±1.5*

15 56.8±8.6 60±0 48.7±] 5.7 56.7±8.1 47.2±13.4* 1.8±2.5*

15 60±0 60±0 53.1±10.4 56.9±8.2 56.8±8.6 0.5±0.6

15 60±0 60±0 55.2±1 1.8 57.3±10.4 53.9士 12.4 0.8± 1.4

*P<0.05,与模型组比较.

结果显示,与模型组相比, 1-17显著减少动物上台潜伏期,同时提高动物穿越 平台次数,可以改善东莨菪碱所致动物学习记忆障碍,好于盐酸多奈哌齐组。 1-18 和 1-19可以减少动物上台潜伏期,同时提高动物穿越平台次数,有改善东莨菪碱所

致动物学习记忆障碍的作用。

模正模: w 22 ¾:正!

(常2 ί常 ¾ u 439 _-) 1-3和 1-18对东莨菪碱所致老年痴呆模型小鼠的治疗作用

本实验分为正常组、东莨菪碱(1 mg/kg)组、盐酸多奈哌齐(DPH) ( 5 mg/kg) 组、 1-3 ( 10 mg/kg) 组、 1-3 ( 5 mg/kg) 组、 1-18 ( 10 mg/kg) 组和 1-18 ( 5 mg/kg) 组。 Morris水迷宫实验结果见表 3:

表 3 1-3和 1-18的 Morris水迷宫实验结果士 SD)

潜伏期 (s)

Group n 站台穿越次数 dayl day2 day3 day4 da 5

15 55.3±9.0 49.3±12.4 35· 1±Π · 1 18.6±14.6 22.7±14.0 3.1±1.8

14 59.9±0.3 58.2土 6.8 59.4±2.3 49.7±13.3 48.0±13.5 1.4±1.2

DPH 15 57.1±7.7 59.5±2.1 58.2±7.1 42.9±19.2 45.5±17.4 1.8±1.1

1-3 ( 10 mg/kg) 15 59.3±2.6 56.3±9.7 55.5±9.5 49.4±15.7 45.0±15.0 l . lil . l 1-3 ( 5 mg/kg) 13 56.5±8.5 56.5±8.6 60±0 43.9±15.4 34.0±19.5* 1.9±1.5 1-18 ( 10 mg kg) 14 56.0±9.9 52.4±12.4 60±0 48.8±15.4 49.2±15.9 1.5士 1.2 1-18 ( 5 mg/kg) 15 55.0±10.3 55.9±9.0 60±0 51.8±15.6 35.6±15.4 1.5±1.7

*P<0.05,与模型组比较

结果显示,在 Morris水迷宫实验中,各组潜伏期均有随时间而下降的趋势,其 中 1-3组比模型组下降明显,接近或好于盐酸多奈哌齐组,化合物 1-3可能有改善东莫 菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用。

( 3 ) 1-14、 1-15、 1-23和 1-29对东莨菪碱所致老年痴呆模型小鼠的治疗作用

本实验分为正常组、东莨菪碱(1 mg/kg)组、盐酸多奈哌齐(DPH ) ( 5 mg/kg) 组、 1-14 (5 mg/kg) 组、 1-15 ( 5 mg/kg)组、 1-23 (5 mg/kg)和 1-29 ( 5 mg/kg) 组。 Morris水迷宫实验结果见表 4, 生化检测结果见表 5:

表 4 1-14、 1-15、 1-23和 1-29的 Morris水迷宫实验结果(x±SD)

消伏期(s)

Group n 站台穿越次数 dayl day2 day3 day4 day5

15 57.5±5.8 50.3±18.0 47.4±15.1 43.1±16.9 36.0±18.5 2.4±2.6

15 59.7士 1.2 57.5±6.9 56.8±8.4 53.5±12.2 55.6±12.5 0.8±0.9

15 60±0 59.6±1.4 57.0士 8.0 57.2±7.5 53.7±1 1.5 1.6±1.7*

15 57. U7.6 60±0 60±0 54.2±8.9 49.9±14.7 1.3±1.8

15 60士 0 58.9±4.4 56.5±8.3 57.8±5.3 51.1±10.9 1.9±1.5*

13 57.8±5.4 57.7±7.1 55.5±8.8 43·9±14· 1 * 51.8±10.9 1.5±1.5*

15 59.3士 2.7 54.6士 12.5 48.0±15.8* 46.0±16.3 40.4±21.6* 1.5±1.4* 与模型組比较, *P<0.05.

表 5 1-14、 1-15、 1-23和 1-29化合物生化检测结果 组别 n 剂 ( mg kg) MDA ( nmol/mgprot) 正常 15 一 7.85±2.3

模型 15 一 10.12±4.7

DPH 15 5 8.44±3.09

1-14 15 5 7.36±1.3*

1-15 15 5 7.41±2.1 *

1-23 13 5 6.53±2.3*

1-29 】5 5 6.66土 1.75*

*P<0.05 , 与模型组比较.

结果显示,与模型组相比,在 Morris水迷宫实验中,各组动物上台潜伏期都有 随时间而下降的趋势,穿越平台次数也较多,其中 1-29组好于盐酸多奈哌齐组或与 之相当;同时各组均可显著降低动物脑中 MDA含量,化合物 1-29抗氧化作用的效 果尤为显著,可能有改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用。

(4 ) 1-9和 1-17对东莨菪碱所致老年痴呆模型小鼠的治疗作用

本实验分为正常组、东莨菪碱(1 mg/kg)组、盐酸多奈哌齐(DPH) ( 5 mg/kg) 组、 1-9 ( 10 mg kg) 组、 1-9 ( 5 mg/kg) 组、 1-17 ( 10 mg/kg) 组和 1-17 ( 5 mg/kg) 组。 Morris水迷宫实验结果见表 6:

表 6 1-9和 1-17的 Morris水迷宫实验结果 ±SD)

潜伏期(s)

Group n 站台穿越次数 dayl day2 day3 day4 day5

正常 15 55.7±6.2 45.0±18.8 44.6±15.0 35.9±16.8 28.0±16.6 2.60±2.10

15 58.4±5.5 59.7±1.3 55.3±8.3 52.8±10.3 50.6±16.0 1.33±1.23

DPH 15 58.8±4.8 60±0 54.4±8.4 47.0±14.7 48.1±14.4 1.40±1.40

1-9 ( 10 mg/kg) 15 58.3±6.5 56.6±9.1 56.5±6.3 51. ]±1 1.6 49.2士 16.9 1.80±1.74

1-9 ( 5 mg/kg) 15 58.9±4.0 60±0 51.2±11.0 53.4±1 1.8 51.1±1 1.5 1.27±1.44

1-17(10 mg/kg) 15 59.9±0.3 58.1±6.2 51.1±12.0 42.1±15.5* 39.3±16.7* 2.60±1.96

1-17(5 mg/kg) 15 57.3±6.7 56.3±9.1 52.5±10.4 46.4±16.6 43.7±1 1.8 2.00±1.41

*P<0.05, 模^组比较

结果显示,与模型组相比,在 Morris水迷宫定位航行实验中,各组动物上台潜 伏期都有随时间而下降的趋势,其中 1-17 ( 10 mg/kg)组比盐酸多奈哌齐组效果好, 下降趋势明显;在 Morris水迷宫空间探索实验中, 1-9 ( 10 mg/kg )组、 1-17 ( 10 mg/kg ) 组和 1-17 ( 5 mg/kg)组穿越平台的次数比盐酸多奈哌齐组多。在 Morris水迷宫实验

中,无论是上台潜伏期还是穿越平台次数, Ι-Π ( 10 mg/kg) 组都比盐酸多奈哌齐 组效果好。化合物 1-17有改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用。

(二)化合物 1-29的盐酸盐(1-33) 对侧脑室注射 Αβ1-42所致大鼠学习记忆障碍 的改善

侧脑室注射 Α β 1-42后引起学习记忆障碍模型是最常用的评价化合物是否有改 善学习记忆作用的动物模型。该动物模型显著破坏了动物的学习能力和记忆功能, 而且影响记忆的机制比较清楚,结果易重复,无明显非特异性作用。本研究采用 Morris水迷宫实验和侧脑室注射 A β 1-42引起的学习记忆障碍模型,评价了 1-33在 不同浓度(0.7 mg/Kg、 3.5 mg Kg 7 mg/ g) 对大鼠学习记忆的改善作用。

实验材料与分组

1 . 实验动物: SD,雄性 (220土 20g), 动物饲养于明暗交替 ( 12 h: 12 h) 清洁级动物 房中,自由进食饮水。动物在动物房中适应环境 3天后幵始进行实验。 Α β 1-42按照 说明书方法配制成 2 μβ/μ1ο

2. 实验分组:

( 1 ) 正常组:侧脑室注射生理盐水

(2 ) 侧脑室注射 Α β 1-42模型组:侧脑室注射 Α β 1-42

(3 )盐酸多奈哌齐对照组:盐酸多奈哌齐(DPH) (3 mg/Kg) +侧脑室注射 A β 1-42

(4) 1-33 (低浓度组): 1-33 ( 0.7 mg/Kg) +侧脑室注射 Α β 1-42

(5 ) 1-33 (中浓度组): 1-33 (3.5 mg/Kg) +侧脑室注射 Α β 42

(6) 1-33 (高浓度组): 1-33 (7 mg/Kg) +侧脑室注射 A β 1-42

3. 实验仪器:大鼠 Morris水迷宫装置,脑立体定位仪。

4. 实验试剂: A β 1-42, 盐酸多奈哌齐 (DPH), 1-33。

实验方法:

将 SD大鼠随机分成正常对照组、侧脑室注射 Α β 1-42模型组、阳性对照组(盐 酸多奈哌齐 3 mg/Kg) 和待测药 1-33组(0.7 mg/kg、 3.5 mg/Kg 和 7 mg/kg组);」下常 对照组侧脑室注射生理盐水 5 μΐ/只,其余各组侧脑室注射 Α β 1-42 5 μΐ/只。术后大 鼠均恢复一周再进行后续实验。正常对照组及侧脑室注射 Α β 1-42模型组每天早上 固定时间灌胃给予相应的溶剂; 1-33组和盐酸多奈哌齐对照组分别按体重给与相应 剂量的药物,共给药 8天。第 5天开始进行水迷宫实验训练,第 9天进行正式水迷宫测

试。

实验结果:见表 7

(1) 各组大鼠游泳速度没有明显统计学差异,说明大鼠的状态相同。

(2) 大鼠侧脑室注射 Αβ 1-42 (lO g/只)后,第一次到达平台的时间(潜伏 期)显著延长。盐酸多奈哌齐(DPH) (3 mg/Kg)可对抗 A β 1-42的作用,明显缩短 第一次到达平台的时间。所测试的 1-33不同剂量均能显著缩短大鼠第一次到达平台 的时间(潜伏期)。

(3) 大鼠侧脑室注射 Αβ 1-42 (10 g/只)后,穿越平台的次数明显减少。盐 酸多奈哌齐(DPH) (3mg/Kg)可对抗 Αβ 1-42的作用,明显增加穿越平台的次数。 所测试的 1-33不同剂量均能显著增加穿越平台的次数。

1-33对侧脑室注射 ΑβΙ-42所致大鼠学习记忆障碍的改善 ±SD)


*Ρ<0.05, 与 Αβ组比较.

结果显示,在 Morris 水迷宫中, 1-33 各剂量组均可以显著改善侧脑室注射 Αβ1-42所致大鼠学习记忆障碍,并有剂量依赖性。

急性毒性试验

参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》,将本发明具有代表性的化合物 1-29的盐酸盐(1-33) 和化合物 1-17的盐酸盐(1-34) 对小白鼠进行初步的急性毒 性实验。

实验方法- 首先进行预试验,确定每个化合物正好 0%死亡率和 100%死亡率的浓度,然后 开始正式试验。按体重将动物分组,在 0%~100%区间内,分别给予不同剂量的药物。 给药体积: 10ml/kg。给药方式:分别为静脉注射或灌胃。

(一)盐酸多奈哌齐的急毒试验

1 .静脉注射:将动物分成 6组,每组 5只; 6组所用的剂量分别为: 4.00 mg/kg, 3.60 mg/kg, 3.24 mg/kg, 2.92 mg/kg, 2.62 mg/kg和 2.36 mg/kg。每只尾静脉注射一 次,观察 1W。

2. 灌胃:将动物分成 6组,每组 5只; 6组所用的剂量分别为: 64.80 mg/kg, 58.32 mg/kg, 42.51 mg/kg, 38.27 mg/kg, 34.44 mg/kg和 30.99 mg/kg 0 给药前禁食 12 h。每只灌胃一次,观察 1W。

(二) 1-33的急毒试验

1 .静脉注射:将动物分成 6组,每组 5只; 6组所用的剂量分别为: 50.00 mg/kg, 40.00 mg kg, 32.00 mg/kg, 25.60 mg/kg, 20.48 mg/kg和 16.18 mg/kg。每只尾静脉 注射一次,观察 1W。

2. 灌胃:将动物分成 6组,每组 5只; 6组所用的剂量分别为: 500.00 mg/kg, 450.00 mg/kg, 295.25 mg/kg, 265.72 mg/kg, 239.15 mg/kg和 215.23 mg/kg 给药 前禁食 12 h。每只灌胃一次,观察 1W。

(三) 1-34的急毒试验

1.静脉注射:将动物分成 5组,每组 5只; 5组所用的剂量分别为: 25.60 mg/kg, 23.04 mg/kg, 20.25 mg/kg, 18.23 mg/kg和 16.40 mg/kg。每只尾静脉注射一次,观 察 1 W。

2. 灌胃:将动物分成 5组,每组 5只; 5组所用的剂量分别为: 300.00 mg/kg, 240.00 mg/kg, 192.00 mg/kg, 153.60 mg/kg和 122.88 mg/kg。给药前禁食 12 h。每 只灌胃一次,观察 1W。

观察指标:

观察动物给药后的毒性反应及死亡情况,统计死亡率,结果经 LD50数据处理 软件分析。

实验结果:见表 8。

2.62 5 1 20

2.36 5 0 0

64.80 5 5 100

58.32 5 4 80

警 42.51 5 3 60

42.52 30.13 ^LD50^60.00

38.27 5 2 40

34.44 5 1 40

30.99 5 0 0

50.00 5 5 100

静 40.00 5 4 80

脉 32.00 5 3 60

注 31.30 8.77^LD50^ 1 1 I .69 射 25.60 5 1 20

20.48 5 0 0

16.18 5 0 0

1-33

500.00 5 5 100

450.00 5 4 80

響 295.25 5 3 60

303.13 176.25^LD50^521.34

265.72 5 2 40

239.15 5 1 0

215.23 5 0 0

25.60 5 5 100

脉 23.04 5 4 80

注 20.25 5 3 60 20.14 8.06 LD50 50.51 射 18.23 5 1 20

16.40 5 0 0

1-34

300.00 5 5 100

灌 240.00 5 4 80

H 192.00 5 3 60 171.20 96.23 ^LD50^304.59

153.60 5 2 40

122.88 5 0 0

初歩实验结果显示, 1-33的口服和静脉给药半数致死量分别为盐酸多奈哌齐的 口服或静脉给药半数致死量的 8〜10倍, 1-34的口服和静脉给药半数致死量分别为 盐酸多奈哌齐的口服或静脉给药半数致死量的 4〜7倍, 1-33和 1-34均显示比盐酸 多奈哌齐更小的毒性,有更好的安全性。

药代动力学研究

参照《临床前药代动力学研究指导原则》,我们又对本发明的代表性化合物 1-29 的盐酸盐(1-33) 和其磷酸盐(1-35) 进行了口服大鼠血浆药代动力学研究。 实验方法及结果:口服给予大鼠不同药物,分别是为盐酸多奈哌齐给药组、 1-35 给药组和 1-33给药组给药剂量为 5mg/kg,给药容积为 10mL/kg。分别在给药后 0.083, 0.167, 0.333 , 0.666, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12, 24, 36, 48, 72和 96h 经大鼠眼球后静脉丛采静脉血,每个时间点 6只大鼠。在相应时间点取全血 0.3mL, 肝素抗凝, 4000rpm离心 10min,分离血浆,取大鼠血浆样品 50μ!^,加入 ΙΟΟμί的 乙腈(含 0.1%的甲酸),涡流混合 l min,离心(12000 rpm) lO min, 取上清液, 用液相质谱联用仪测定分析,记录峰面积,以此计算血药浓度,绘制药时曲线。同 时用中国药理学会 DAS 2.0药动学软件自动拟合,其相关药动学参数见表 9和图 1 :

表 9 1-33和 1-35口服大鼠血浆药代动力学实验结果

参数 盐酸多奈哌齐(5 mg/kg ) 1-33 ( 5 mg kg) 1-35 ( 5 mg kg)

AUC(O-t) 1370.709±3 1 1.367 4933.099±1397.72 5165.21 1±441.415

AUC(O-oo) 1415.126±337.15 I 4990.306±1423.91 5222.684±433.165

MRT(O-t) 2.734±0.251 2.212士 0.389 2.343±0.206

MRT(0-∞) 3.1 19±0.404 2.352±0.373 2.483±0.265 t l/2z 2.473±0.449 2.085±0.392 1.965士 0.296

Tmax 0.389±0.136 0.305±0.068 0.555±0.172

Cmax 638.5±127.792 2463.333±385.73 21 1 1 .667±331 .748

实验结果显示,与盐酸多奈哌齐相比,等剂量下, 1-33和 1-35的吸收程度(AUC) 和达峰浓度(Cmax)显著高于盐酸多奈哌齐的吸收程度(AUC)和达峰浓度(Cmax)。

综上所述,在本发明所提供的化合物中, 1-1、 1-2、 1-4和 Ι-Π或其盐酸盐(1-34) 具有和多奈哌齐盐酸盐相当的乙酰胆碱酯酶抑制活性;而与盐酸多奈哌齐相比, 1-17 和 1-29或其盐酸盐(1-33 ) 在 Morris水迷宫实验中,表现出了更强的改善学习记忆 的作用,展示了更好的体内药效;尤其引人注目的是 1-29或其盐酸盐(1-33),虽然 该化合物体外的乙酰胆碱酯酶抑制活性较弱,只有盐酸多奈哌齐的 10%左右,但却 具有比盐酸多奈哌齐更好的体内药效,而且抗氧化的效果也比盐酸多奈哌齐更强, 这说明 1-29除了作用于乙酰胆碱酯酶以外,可能还通过别的途径也产生了改善学习 记忆的作用;另一十分令人鼓舞的实验结果是:在对小白鼠进行的初歩的急性毒性 实验中, 1-29 盐酸盐(1-33) 所表现出来的毒性小到约为盐酸多奈哌齐毒性的十分 之一,这就更使得该化合物具有巨大的使用潜力,而且可以大大减小病人由于现有 药物的毒副作用所带来的痛苦。这预示着 1-29无限美好的前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。