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1. WO2012066059 - METHOD FOR THE BIOCATALYTIC CYCLISATION OF TERPENES AND CYCLASE MUTANTS WHICH CAN BE USED IN SAID METHOD

Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters

[ DE ]

PATENTANSPRÜCHE

1 . Enzymmutante mit Cyclase-Aktivität, ausgewählt unter Mutanten eines Wildtyp-Enzyms, das eine Aminosäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 2 bis 326 oder eine Teil- sequenz davon umfasst; wobei die Mutante wenigstens die Cyclisierung eines Citronel- lal-lsomers zu wenigstens einem Isopulegol-Isomer katalysiert.

2. Enzymmutante nach Anspruch 1 , umfassend

a) eine Mutation in Position F486 von SEQ ID NO: 2 oder

b) eine Mutation in einer unter SEQ I D NO: 3 bis 326 ausgewählten Sequenzen, wobei die mutierte Position der Position F486 von SEQ ID NO: 2 entspricht.

3. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der bis zu 25% der Aminosäurereste jeweils gegenüber der SEQ ID NO: 2 bis 326 durch Deletion, Insertion, Substitution, Addition, Inversion oder einer Kombination davon verändert sind.

4. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Mutation in der Position F486 von SEQ ID NO:2 oder in einer dieser Positionen entsprechenden Position in einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis 326, eine Substitution ausgewählt unter F486N, F486Q, F486L, F486M, F486E, F486G, F486S, F486V, F486T, F486C,

F486I und F486A ist.

5. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der zusätzlich wenigstens eine Mutation in einer der Positionen W374, D437, D440, F428, W555, Y561 , Y702, Y705 der SEQ ID NO: 2 oder in wenigstens einer aus diesen Positionen ausgewählten, entsprechenden Position in einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis 326, vorliegt.

6. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der keine Mutation in der Position D437 und/oder D439 und/oder D440 von SEQ ID NO: 2 oder der jeweils entsprechenden Position in einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis 326, vorliegt.

7. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der keine Mutation in der Position Y702 von SEQ ID NO: 2 oder in der entsprechenden Position in einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis 326, vorliegt oder falls eine Mutation vorliegt, die- se eine Substitution Y702F oder entsprechende Substitution ist.

8. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche gegebenenfalls weiterhin mutiert ist in wenigstens einer der Positionen P229, D439, D508, E601 , G553, G556, N432, P436, P499, R224, S371 , T376, T563, W414 oder W624 von SEQ ID NO: 2 oder in wenigstens einer aus diesen Positionen ausgewählten, entsprechenden Position in einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis 326.

9. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt unter a) den Einfachmutanten

F486X mit X = N, Q, L, M, E, G, S, V, T, C, I oder A gemäß SEQ ID NO: 2

Y702X mit X = F, A, C oder S gemäß SEQ ID NO: 2

Y561X mit X= A oder S gemäß SEQ ID NO: 2

b) den Mehrfachmutanten F486A / Y702A, F486A / Y561 A oder F486A / Y705A gemäß SEQ ID NO: 2

c) den zu a) oder b) korrespondierenden, von einer der SEQ ID NO: 3 bis 325 abgeleiteten Mutanten.

1 0. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die mindestens 50% der Citronellal-Isopulegol-Cyclase Aktivität eines Enzyms zeigt, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 von Position 1 bis 725, 2 bis 725 oder 16 bis 725,ggf. N- terminal verlängert durch einen Methioninrest, umfasst.

1 1. Enzymmutante nach Anspruch 10, wobei die Citronellal-Isopulegol-Cyclase Aktivität unter Verwendung eines Citronellals als Referenzsubstrat unter Standardbedingungen bestimmt wird.

12. Enzymmutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mutation in einem Enzym erfolgt, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 von Position 1 bis 725, 2 bis 725 oder 16 bis 725, ggf. N-terminal verlängert durch einen Methioninrest, umfasst.

13. Nukleinsäuresequenz, kodierend für eine Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

1 4. Expressionskassette, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13.

1 5. Rekombinanter Vektor, umfassend unter der Kontrolle wenigstens eines regulativen Elements wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 14.

1 6. Rekombinanter Mikroorganismus, enthaltend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 14 oder wenigstens einen Vektor nach Anspruch 15.

17. Verfahren zur Herstellung von Isopulegol der allgemeinen Formel (I)

wobei man Citronellal der allgemeinen Formel (II)


zu Isopulegol der Formel (I) mittels eines Enzyms der EC Klasse EC 5.4.99, insbesondere der EC Klasse EC 5.4.99.17, oder in Gegenwart eines dieses Enzym exprimieren Miroorganismus cyclisiert.

18. Verfahren zur Herstellung von Isopulegol der allgemeinen Formel (I)


wobei man Citronellal der allgemeinen Formel (II)


zu Isopulegol der Formel (I) mittels einer Enzymmutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder in Gegenwart eines diese Enzymmutante exprimieren Miroorganismus nach Anspruch 16 cyclisiert.

19. Verfahren zur Herstellung von Menthol der Formel III

wobei man

a) Citronellal zu Isopulegol nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 cyclisiert und

b) Isopulegol katalytisch zu Menthol hydriert.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Hydrierung in Gegenwart von

Wasserstoff und einem Katalysator erfolgt, der

- 30 bis 70 Gew.-% sauerstoffhaltige Verbindungen des Nickels, berechnet als NiO,

- 15 bis 45 Gew.-% sauerstoffhaltige Verbindungen des Zirkons, berechnet als ZrO2,

- 5 bis 30 Gew.-% sauerstoffhaltige Verbindungen des Kupfers berechnet als CuO und

- 0, 1 bis 10 Gew.-% sauerstoffhaltige Verbindungen des Molybdäns, berechnet als MoO3,

umfasst, wobei sich die Gew.-%-Angaben auf den trockenen, nicht reduzierten Katalysator beziehen.

21 . Verfahren zu enzymatischen oder biokatalytischen Umsetzungen von Verbindungen der allgemeinen Formel IV


worin

"a", "b", "c" und "d", jeweils unabhängig voneinander, eine C-C-Einfach- oder Doppel bindung darstellen, mit der Maßgabe, dass kumulierte Doppelbindungen ausgeschlos sen sind; und den folgenden Maßgaben:

R1 folgende Bedeutungen besitzt:

(1 ) wenn "a" eine Doppelbindung ist:

R1 ausgewählt ist unter

Oxo (=O), oder

CH-(CH2)n-Z,

worin n für 0, 1 oder 2 steht und

Z für OH, CHO, C(O)C1-C4-Alkyl; COOH, C(CH2)-CH=CH2;

C(OH)(CH3)-CH=CH2; C(CH3)=CH-CH=CH2; oder einen Rest der Formel

C(CH3)=CH-CH2Y steht

worin

Y für OH, CH2OH, COOH, oder CH2C(O)CH3 steht; oder

(2) wenn "a" eine Einfachbindung ist:

R1 ausgewählt ist unter

CH3; CHO; CH2CH2OH; CH=CH2; CH2C(O)OH; CH2CHO oder

C3H6CH(CH3)CHO steht;

wobei, wenn "a" eine Doppelbindung ist, diese E- oder Z- Konfiguration aufweist;

R2 und R3 folgende Bedeutungen besitzen:

(1 ) wenn "a" und "b" jeweils eine Einfachbindung sind:

R2 und R3 unabhängig voneinander für H, C1-C4-Alkyl oder OH stehen oder R2 und R3 zusammen für eine Methylen (=CH2)- oder Oxo (=O)- Gruppe stehen; oder

(2) wenn "a" oder "b" eine Doppelbindung ist, einer der Reste R2 und R3 fehlt und der andere der beiden Reste für H, C1-C4-Alkyl oder OH steht;

R4 für H oder Hydroxy-C1-C4-alkyl steht;

R5 und R6 folgende Bedeutungen besitzen:

(1 ) wenn "c" eine Einfachbindung ist:

R5 und R6 jeweils für H stehen oder R5 und R6 zusammen für eine Oxo (=O)- Gruppe stehen; oder

(2) wenn "c" eine Doppelbindung ist, einer der Reste R5 und R6 fehlt und der andere der beiden Reste für H steht;

R7, R8 und R9 folgende Bedeutungen besitzen:

(1 ) wenn "d" eine Einfachbindung ist:

zwei der Reste R7, R8 und R9 jeweils unabhängig voneinander für H oder C1- C4-Alkyl stehen und der andere der Reste für OH steht; oder

(2) wenn "d" eine Doppelbindung ist, einer der Reste R7, Rs und R9 fehlt und die andere der beiden Reste jeweils unabhängig voneinander für H oder C1-C4- Alkyl stehen;

R10 für H oder Hydroxy-C1-C6-Alkyl oder ein oder mehrfach ungesättigtes C2-C6-Alkenyl steht;

wobei man eine Verbindung der Formel IV in stereoisomerenreiner Form oder ein Stereoisomerengemisch davon unter Verwendung eines Enzyms der Klasse EC 5.4.99, insbesondere der Klasse EC 5.4.99.17, oder eine Enzymmutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder in Gegenwart einen diese Enzyme oder Enzymmutanten exprimierenden Mikroorganismus nach Anspruch 16 umsetzt.

22. Verfahren nach Anspruch 21 , worin eine Verbindung umgesetzt wird, die ausgewählt ist unter Verbindungen der Formel IVa


worin R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzt und insbesondere für

den Rest CH-(CH2)n-Z steht

worin

n = 0 und Z = CHO, oder COOH ist; oder

n = 1 und Z = OH ist; oder

n = 2 und Z = C(O)CH3; COOH, C(CH2)-CH=CH2; C(CH3)=CH-CH=CH2;

oder ein Rest der Formel C(CH3)=CH-CH2Y ist

worin Y für OH, CH2OH, COOH, oder CH2C(O)CH3 steht;

und "a" ggf. E- oder Z-Konfiguration aufweist;

oder der Formel IVb


worin R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzt; und insbesondere für CH2CHO steht;

oder der Formel IVc


worin

R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, und insbesondere für CH-CHO steht; und einer der Reste R7 und R8 für H und der andere für C1-C4-Alkyl,wobei insbesondere R7für Ethyl steht und die Doppelbindung "a" und "d" Z-Konfiguration aufweisen.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin die Verbindung der Formel IV ausgewählt ist unter Citronellal; Citral; Farnesol; Homofarnesol; Homofarnesolderivaten, wie Homofarnesylsäure; Geranylaceton, Melonal; Nonadienal; und Trimethyldecatetraen.

24. Verwendung eines Enzyms aus der EC Klasse EC 5.4.99, insbesondere der EC Klasse EC 5.4.99.17 zur Cyclisierung von Terpenen, insbesondere zur Umsetzung von Citronellal zu Isopulegol, sowie zur U msetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel IV.

25. Verwendung einer Enzymmutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, einer Nukleinsäure nach Anspruch 13, eines Expressionskonstruktes nach Anspruch 14, eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 15 oder eines rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 1 zur Cyclisierung von Terpenen und/oder Terpenoiden, sowie zur Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel IV gemäß der Definition in einem der Ansprüche 20 bis 23.

26. Verwendung nach Anspruch 25 zur Umsetzung von Citronellal zu Isopulegol; oder zur Umsetzung von Squalen zu Höpen.