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1. (WO2010079253) BIO-MARKERS FOR DIAGNOSING FIBROSIS
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BIOMARCADORES PARA EL DIAGNOSTICO DE FIBROSIS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo del diagnóstico y, más en particular, al diagnóstico de enfermedades asociadas con un aumento en la deposición de tejido conjuntivo en un órgano o tejido, preferiblemente en el hígado. El diagnóstico se lleva a cabo usando biomarcadores cuyo nivel de expresión se correlaciona con la aparición de enfermedades fϊbróticas.

ANTECEDENTES TÉCNICOS

La fibrosis hepática es una característica central de la mayoría de las lesiones crónicas del hígado debidas a enfermedades metabólicas, genéticas, víricas, y colestásicas. Las enfermedades inflamatorias crónicas del hígado producen la destrucción del parénquima del hígado y su cambio por tejido cicatricial (fibrosis). La fibrosis se caracteriza por el exceso de deposición de matriz extracelular (MEC) que implica la reorganización molecular e histológica de varios tipos de colágenos, proteoglicanos, glicoproteínas estructurales y ácido hialurónico (hialuronano). La fibrosis es una marca de cirrosis hepática, que se asocia con perturbación de la función del hígado y morbilidad y mortalidad significativas.

La deposición de MEC en el espacio de Disse (fibrosis perisinusoidal), la generación de membranas básales subendoteliales (incompletas), y la estrangulación de hepatocitos por la matriz adyacente deterioran no sólo el flujo de sangre a través del órgano, sino también la función biosintética de los hepatocitos y la capacidad de depuración de estas y otras células, por ejemplo de factores de coagulación y proteínas de transporte en el plasma, hormonas, y amoniaco.

De esta manera, el diagnóstico, seguimiento y evaluación terapéutica de la fϊbrosis y fϊbrogénesis, es decir, el proceso activo de la generación de tejido conjuntivo nuevo en el hígado enfermo, es de gran importancia clínica.

El diagnóstico de la fϊbrosis hepática se ha hecho en el pasado y se practica actualmente mayoritariamente mediante el procedimiento agresivo de biopsia por punción y evaluación histológica consecutiva basada en varios sistemas de puntuación numérica que producen graduación de actividad necroinflamatoria y estadificación (extensión) de fϊbrosis. Sin embargo, este "estándar de oro" tiene muchos inconvenientes además de la agresividad tal como error de muestreo, calidad irreproducible de la muestra dependiendo de la longitud y tamaño de la muestra de tejido y una evaluación histológica estrictamente dependiente de la experiencia del patólogo.

Actualmente, el método serológico más fiable para la evaluación de fibrosis hepática utiliza un panel de 5 marcadores: α2-macroglobulina, haptoglobulina, apolipoproteína Al, γ-glutamil transpeptidasa, y bilirrubina (Imbert-Bismut et al. Lancet 2001; 357:1069-1075 y WO0216949). Sin embargo, esta prueba elimina la necesidad de biopsia en sólo el 26% de los pacientes y no predice de forma exacta la presencia o ausencia de fibrosis.

WO0373822 proporciona un método de diagnóstico de la presencia o gravedad de fibrosis hepática en un individuo basado en la presencia o nivel de α-MG, HA y TIMP-1.

WO2005116901 divulga varios métodos para diagnosticar la presencia y/o gravedad de una patología hepática basados en diferentes combinaciones de marcadores tal como α-2 macroglobulina, ácido hialurónico, apoliproteína Al, propéptido N-terminal de colágeno de tipo III, γ-glutamiltranspeptidasa, bilirrubina, γ-globulinas, plaquetas, tiempo de protrombina, aspartato amino-transferasa, alanina aminotransferasa, urea, sodio, glucemia, triglicéridos, albúmina, fosfatasas alcalinas, YKL-40 (glicoproteína de cartílago humana 39), Inhibidor tisular de metaloproteinasa de matriz 1 (TIMP-I), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2) y ferritina.

EPl 811041 divulga métodos para el diagnóstico de fibrosis y/o cirrosis hepática basados en el uso de marcadores identificados en un modelo de rata para fibrosis hepática (ratas tratadas con dimetilnitrosamina) mediante perfiles de expresión de ARNm en micromatrices y perfiles cuantitativos de proteínas de muestras de hígado y suero.

WO2007003670 divulga métodos para el diagnóstico de alteraciones fibróticas mediante el uso de cualquiera de cuatro marcadores detectables en orina: uromodulina, MAC2BP, AGP 1 y catepsina A.

WO2008031051 divulga un método para la detección y diagnóstico de fibrosis hepática usando un panel de proteínas biomarcadoras de suero humano. Estos métodos también se han divulgado en Gangadharan et al. [Clinical Chemistry 2007; 53:1792-1799].

Otra aproximación alternativa no agresiva para la evaluación de la fibrosis hepática es la elastografϊa transitoria con Fibroscan® (Echosens, Paris, Francia) que opera midiendo la rigidez del hígado (Sandrin L et al. Ultrasound Med. Biol. 2003; 29:1705-1711). Se genera un pulso mecánico en la superficie de la piel, que se propaga a través del hígado. Se mide la velocidad de la onda por ultrasonido. La velocidad se correlaciona directamente con la rigidez del hígado, que a su vez refleja el grado de fibrosis - cuanto más rígido está el hígado mayor es el grado de fibrosis.

Aunque hay una necesidad importante de biomarcadores sistémicos no agresivos, específicos de órgano y enfermedad para la fibrosis hepática (y fibrosis de otros órganos también), actualmente no hay un parámetro individual o combinación de ellos disponible, que satisfaga todos los criterios de diagnóstico requeridos para un uso extendido, rentable, y fiable. Las medidas individuales de marcadores bioquímicos en suero, plasma o incluso orina actualmente no son lo suficientemente válidas para remplazar a la biopsia hepática.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se refiere al uso de la menos un biomarcador para la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis o para seguir la eficacia de un tratamiento para fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis en un sujeto en donde dicho biomarcador se selecciona del grupo que consiste en SLURPl, HAMP, GSN, APOD, SPPl, DEFBl y MASP2.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis o para seguir la eficacia de un tratamiento para fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis que comprende comparar la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de un sujeto con un estándar predeterminado para cada uno de dichos uno o más biomarcadores; en donde dicho uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en SLURPl, HAMP, GSN, APOD, SPPl, DEFBl y MASP2; y en donde una diferencia significativa en la expresión de dicho uno o más biomarcadores en dicha muestra comparado con el estándar predeterminado de cada uno de dicho uno o más biomarcadores es indicativo de inicio, fase, evolución de fibrosis y/o enfermedad asociada con fibrosis o de la eficacia de un tratamiento para la fibrosis y/o enfermedad asociada con fibrosis.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar al menos dos o más biomarcadores seleccionados del grupo de SLURPl, HAMP, GSN , APOD, SPPl, DEFBl y MASP2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. GeI de muestra control. Se recogieron las manchas marcadas con círculos y se identificaron mediante LC-MS/MS. La mancha en el círculo blanco se identificó como gelsolina, y la mancha en el círculo negro se identificó como apolipoproteína D.

Figura 2. Los niveles disminuidos de las proteínas identificadas ApoD y gelsolina en muestras de orina cirrótica se confirmaron mediante inmunotransferencia. (A) Las proteínas de la orina se separaron en un gel de SDS-acrilamida y las proteínas se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Los niveles de ApoD y gelsolina se detectaron usando anticuerpos específicos para estas proteínas. (B) Se cuantificó y representó la intensidad de las bandas. El valor medio de los niveles de proteína mostró un descenso de dos veces en las muestras cirróticas para ambas proteínas.

Figura 3. Se representan las intensidad de hepcidina-25 (pico de 2793 Da), hepcidina-20 (pico de 2193) y SLURP-I (pico de 8855 Da) para las muestras cirróticas, control y de baja fibrosis. Los niveles de esta proteína están significativamente disminuidos en los pacientes cirróticos, por otra parte el grupo de baja fibrosis muestra un nivel de expresión intermedio.

Figura 4. Disminución de los niveles de la proteína SLURPl en muestras de orina de pacientes cirróticos con respecto a los controles detectada mediante Western Blot. (A) Las orinas controles (C1-C8) y ocho orinas de pacientes cirróticos (P1-P8) se sometieron a electroforesis en gel de SDS-acrilamida y las proteínas se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Los niveles de SLURPl se detectaron usando anticuerpos específicos para estas proteínas. (B) Gráfico de la densidad óptica correspondiente a las bandas de SLURP-I obtenidas en las orinas controles y de pacientes cirróticos.

Figura 5. Se representan las intensidades de Osteopontina (pico de 7655 Da) y su forma fosforilada (pico de 7735 Da) para las muestras cirróticas, control y de baja fibrosis. Los niveles de esta proteína están significativamente disminuidos en los pacientes cirróticos, por otra parte el grupo de baja fibrosis muestra un nivel de expresión intermedio.

Figura 6. Se representan las intensidades de Defensina Beta 1 (pico de 4623 Da) y MASP2 (pico de 5804 Da) para las muestras cirróticas, control y de baja fibrosis. Los niveles de esta proteína están significativamente disminuidos en los pacientes cirróticos, por otra parte el grupo de baja fibrosis muestra un nivel de expresión intermedio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado biomarcadores proteicos en muestras de orina humana cuya expresión se correlaciona con la presencia de cirrosis y fϊbrosis hepática. En particular, los autores han identificado gelsolina, apoliproteína D, hepcidina (25 y 20), SLURP-I, Osteopontina (SPPl, OPN ó OSTP), Beta 1 Defensina

(DEFBl) y Serina proteasa asociada a lectina unida a mañosa (MASP2) como proteínas cuyos niveles disminuyen significativamente en las muestras de orina de pacientes cirróticos cuando se comparan con muestras control. Estas proteínas son marcadores potenciales de estados avanzados de fibrosis hepática.

De esta manera, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso de un biomarcador para la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad que implica fibrosis o para seguir la eficacia de un tratamiento para fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis en un sujeto en donde dicho biomarcador se selecciona del grupo que consiste en SLURPl, HAMP, GSN, APOD, SPPl, DEFBl y MASP2.

El término "biomarcador" o, de forma alternativa, "marcador molecular", como se usa aquí, se usa para referirse a una molécula o al producto de expresión de un gen o fragmentos y variantes del mismo que muestran cambios sustanciales en una enfermedad determinada y que se pueden usar tanto para la detección como para el diagnóstico de una enfermedad detectando la aparición de dichos cambios en el biomarcador y/o para seguir la eficacia de un tratamiento para esa enfermedad detectando cambios en el biomarcador en oposición a aquellos que se dan en la enfermedad o situación clínica.

En una forma de realización preferida, los cambios en el biomarcador son cambios en los niveles de expresión. El término "expresión", como se usa aquí, se refiere a un proceso mediante el cual se produce un polipéptido a partir del ADN. Este proceso implica la transcripción del gen a un ARN mensajero (ARNm), y la traducción de este ARNm al polipéptido. En el contexto de la invención "cambios en los niveles de expresión" se refiere a cualquier cambio en la producción del ARNm, del polipéptido o de ambos que produce niveles relativos alterados del ARNm, proteína o ambos en una muestra con respecto a otras moléculas en la misma muestra. Se apreciará que los niveles de expresión de un biomarcador se pueden determinar mediante la determinación de los niveles de ARNm en una muestra o mediante la determinación de los niveles del polipéptido correspondiente. De forma alternativa, los biomarcadores polipeptídicos pueden ser variantes resultantes de modificaciones postraduccionales, incluyendo fragmentos de los mismos.

Los términos "diagnóstico", "detección" y "evaluación", se usan aquí de forma intercambiable, y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.

La expresión "seguir la eficacia de un tratamiento" se refiere a la valoración de los resultados de una terapia en un paciente que padece fibrosis o una enfermedad asociada con fibrosis. Las terapias adecuadas para el tratamiento de fibrosis incluyen el tratamiento con inhibidores de PCP, IFN-γ o mesilato de imatinib (Gleevec). La utilidad de los biomarcadores de la invención para seguir la eficacia de un tratamiento también se puede aplicar a métodos para seleccionar y cribar fármacos con potencial actividad antifibrosante. Este proceso comprende a) administrar al sujeto (preferiblemente un animal) el fármaco a estudiar; b) a diferentes puntos del estudio (antes, durante y/o después de la administración) coger muestras biológicas del animal y determinar los niveles de marcador según la presente invención; y c) comparar las determinaciones realizadas en las muestras obtenidas en las diferentes fases del tratamiento y compararlas a animales control, por ejemplo sin tratar.

El término "SLURP-I", como se usa aquí, se refiere al gen conocido como "que contiene el dominio LY6/PLAUR secretado 1", también identificado mediante el número de acceso HGNC ID. 18746 (Comité de Nomenclatura de Genes de HUGO, Organización del Genoma Humano), que está localizado en la región cromosómica 8q24.3. La proteína codificada por SLURP-I se identifica en la base de datos Entrez mediante el número de acceso GeneID:57152 (actualizado el 27 de julio de 2008) y también se conoce como "componente B de ARS" (ARS, ArsB), "proteína urinaria antineoplásica" (ANUP), MDM, "similar al antígeno 6 de linfocitos secretado" (LY6LS). En una forma de realización particular el producto de expresión del gen SLURPl comprende SEQ ID NO: 1, que es un polipéptido de 103 aminoácidos identificado con el número de acceso UniProt ID P55000 (última modificación 22 de julio, 2008. Versión 75) (SEQ ID NO: 1) así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido. En otra forma de realización preferida, el biomarcador es un fragmento de dicho polipéptido que comprende los aminoácidos 22-103 (SEQ ID NO:2), correspondiente al polipéptido maduro secretado.

El término "HAMP", como se usa aquí, se refiere al gen "péptido antimicrobiano hepcidina", identificado mediante el número de acceso HGNC ID. 15598, y que está localizado en la región cromosómica 19ql3.1. El "péptido antimicrobiano hepcidina"

(HAMP) se identifica en la base de datos Entrez con GeneID:57817 (actualizado el 12 de octubre de 2008) y también se conoce como "péptido antimicrobiano expresado en hígado" (LEAP-I), hepcidina, HEPC, HFE2B, LEAPl, y "regresor tumoral putativo de hígado" (PLTR). En una forma de realización particular, el producto de expresión del gen HAMP comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO :3, que es la pre-pro-proteína de 84 aminoácidos identificada por el número de acceso de UniProt ID.

P81172 (última modificación 22 de julio, 2008. Versión 82); SEQ ID NO:4 (aminoácidos 60-84, conocido como hepcidina 25 o Hepc25); SEQ ID NO:5 (aminoácidos 65-84, conocido como hepcidina 20 o Hepc20); así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido. En una forma de realización preferida el producto de expresión de HAMP es Hepc25, Hepc20 o ambos.

El término "GSN", como se usa aquí, se refiere al gen "gelsolina (amiloidosis, de tipo finlandés), identificado mediante el número de acceso HGNC ID. 4620, y que está localizado en la región cromosómica 9q33. El producto de expresión del gen también se identifica en la base de datos Entrez como GeneID: 2934 (actualizado el 28 de septiembre de 2008) o DKFZp313L0718. La proteína se conoce como gelsolina, y de forma alternativa como "factor despolimerizador de actina" (ADF), brevina o AGEL. Se han descrito diversas variantes transcripcionales para GSN que codifican diferentes isoformas. En una forma de realización particular el producto de expresión de GSN comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:6, que corresponde al polipéptido precursor secretado identificado mediante UniProt ID. P06396 (última modificación 14 de octubre, 2008. Versión 114) así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido.

El término "APOD", como se usa aquí, se refiere al gen "apoliproteína D", también identificado mediante el número de acceso HGNC: 612, que está localizado en la región cromosómica 3q26.2-qter. APOD también se identifica mediante "Entrez GeneID: 347" (actualizado el 12 de octubre de 2008), En una forma de realización particular el producto de expresión de APOD comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:7, un precursor del polipéptido identificado como UniProt ID. P05090 (última modificación 22 de julio, 2008. Versión 107) así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido.

El término "SPPl", como se usa aquí, se refiere al gen "Osteopontina" ó "fosfoproteína secretada tipo 1"; OPN, y conocido de forma alternativa como BNSP; BSPI; ETA-I;

MGCl 10940, correspondiente al polipéptido identificado mediante el número de acceso

HGNC: 11255 que está localizado en la región cromosómica 4q21-q25. SPPl también se identifica mediante "Entrez Gene ID: 6696" (actualizado el 4 de diciembre de 2009). En una forma de realización particular el producto de expresión del gen SPPl comprende la SEQ ID NO: 8, que es un polipéptido de 314 aminoácidos identificado con el número de acceso UniProt P 10451 (última modificación 24 de noviembre, 2009. Versión 120); así como ortólogos, iso formas y fragmentos de dicho polipéptido, incluyendo las isoformas de SPPl identificadas como SEQ ID NO:8, 9, 10 y 11.

El término "DEFBl", como se usa aquí, se refiere al gen "Beta 1 defensina o Defensina beta 1" y conocido de forma alternativa como BDl; HBDl; DEFB-I; DEFB101; MGC51822, correspondiente al polipéptido identificado mediante el número de acceso HGNC:2766, que está localizado en la región cromosómica 8p23.2-p23.1. DEFBl también se identifica mediante "Entrez GeneID: 1672" (actualizado el 4 de diciembre de 2009). En una forma de realización particular, el producto de expresión de DEFBl comprende la secuencias SEQ ID NO:9, identificada como UniProt P60022.1 (última modificación 3 de noviembre, 2009. Versión 72) así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido.

El término "MASP2", como se usa aquí, se refiere al gen "Serina proteasa asociada a lectina unida a mañosa" del inglés "Mannan-binding lectin serine peptidase 2" y de forma alternativa, sMAP; MAP 19; MASP-2, también identificado mediante el número de acceso HGNC:6902, que está localizado en la región cromosómica Ip36.3-p36.2. MASP2 también se identifica mediante "Entrez GeneID: 10747" (actualizado el 4 de diciembre de 2009). En una forma de realización particular el producto de expresión de SPPl comprende la secuencia SEQ ID NO:10, identificada como UniProt O00187.3 (última modificación 24 de noviembre, 2009. Versión 118); así como ortólogos, isoformas y fragmentos de dicho polipéptido, incluyendo las isoformas identificadas en SEQ ID NO: 13 y 14 de la presente invención.

El término "fibrosis", como se usa aquí, se refiere un exceso de deposición de matriz extracelular (MEC) que implica reorganización molecular e histológica de varios tipos de colágenos, proteoglicanos, glicoproteínas estructurales y ácido hialurónico

(hialuronano). Aunque la fibrosis es una marca de muchas enfermedades del hígado, otros órganos también pueden sufrir un exceso de deposición de tejido conjuntivo. En una forma de realización preferida, la fϊbrosis es fϊbrosis hepática.

El término "enfermedad asociada con fϊbrosis", se refiere a cualquier enfermedad en donde uno o más órganos padecen una deposición excesiva de tejido conjuntivo fibroso. Estas enfermedades incluyen fibrosis quística del páncreas y pulmones, fibrosis por inyección, que puede ocurrir como complicación de inyecciones intramusculares, especialmente en niños, fibrosis endomiocardiaca, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis mediastinal, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, una complicación de la pneumoconiosis de los mineros, fibrosis nefrogénica sistémica, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, síndrome de dolor post-vasectomía, la tuberculosis (TB) puede producir fibrosis de los pulmones, la anemia falciforme puede producir aumento y por último fibrosis del bazo y artritis reumatoide y cirrosis, que pueden causar fibrosis hepática. En una forma de realización preferida, la enfermedad asociada con la fibrosis es cirrosis.

La invención también se refiere a un método para la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis o para seguir la eficacia de un tratamiento para fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis que comprende comparar la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de un sujeto con un estándar predeterminado para cada uno de dichos uno o más biomarcadores; en donde dicho uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en SLURPl, HAMP, GSN, APOD, SPPl, DEFBl y MASP2; y en donde una diferencia significativa en la expresión de dicho uno o más biomarcadores en dicha muestra comparado con el estándar predeterminado de cada uno de dicho uno o más biomarcadores es indicativo de inicio, fase, evolución de fibrosis y/o enfermedad asociada con fibrosis o de la eficacia de un tratamiento para la fibrosis y/o enfermedad asociada con fibrosis.

Los términos y expresiones "diagnóstico", "seguir la eficacia de un tratamiento", "fibrosis", "enfermedad asociada con fibrosis", "biomarcador", "SLURPl", "HAMP", "GSN", "APOD", "SPPl", "DEFBl" y "MASP2"se han descrito previamente en relación con el uso de la invención.

El método de la invención permite la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis así como el seguimiento de la eficacia de un tratamiento para fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis. El método de la invención comprende la determinación de la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de SLURPl, HAMP, GSN, APOD, SPPl, DEFBl, MASP2 en una muestra biológica de un individuo.

El término "muestra", como se usa aquí, significa cualquier tejido o líquido biológico tomado de un sujeto. En una forma de realización preferida es líquido biológico, por ejemplo, sangre, suero o, más preferiblemente orina.

La expresión de un biomarcador de la invención se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de una molécula transcrita o su proteína correspondiente. Si los biomarcadores son moléculas de ácido nucleico, la expresión del polinucleótido marcador se puede detectar usando métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, métodos de amplificación de ácidos nucleicos y similares. En una forma de realización preferida, la expresión de un gen marcador se evalúa preparando ARNm/ ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) de células en una muestra de un paciente, y mediante la hibridación del ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es complementario a un polinucleótido que comprende el gen marcador, y fragmentos del mismo. El ADNc se puede, opcionalmente, amplificar usando cualquiera de varios métodos de la reacción en cadena de la polimerasa antes de la hibridación con el polinucleótido de referencia aunque se prefiere que no se amplifique.

En una forma de realización preferida, los biomarcadores son polipéptidos, en cuyo caso la detección se puede llevar a cabo usando métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteína. En una forma de realización preferida, la expresión de una proteína marcadora se evalúa usando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo radio-marcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, o marcado con enzima), un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par proteína-ligando (por ejemplo, biotina-estreptavidina), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, el dominio hipervariable de un anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente con una proteína correspondiente al gen marcador, tal como la proteína codificada por el marco abierto de lectura correspondiente al gen marcador o tal proteína que ha sufrido toda o una parte de su modificación postraduccional normal.

El inmunoensayo más normal es el "enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA)". El ELISA es una técnica para detectar y medir la concentración de un antígeno usando una forma marcada (por ejemplo unida a enzima) del anticuerpo. Hay diferentes formas de

ELISA, que son bien conocidas para los expertos en la materia. Las técnicas estándar conocidas en la técnica para ELISA se describen en "Methods in Immunodiagnosis", 2a

Edición, Rose y Bigazzi, eds. John Wiley AND Sons, 1980; Campbell et al, "Methods and Immunology", W. A. Benjamín, Inc., 1964; y Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem.

Clin. Biochem., 22:895-904.

En un "ELISA sandwich", un anticuerpo (por ejemplo anti-enzima) está unido a una fase sólida (es decir, a una placa de microtitulación) y se expone a una muestra biológica que contiene antígeno (por ejemplo, enzima). La fase sólida se lava después para eliminar el antígeno no unido. Después se une un anticuerpo marcado (por ejemplo, unido a enzima) al antígeno unido (si está presente) formando un sandwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Los ejemplos de enzimas que se pueden unir al anticuerpo son fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, luciferasa, ureasa, y B-galactosidasa. El anticuerpo unido a enzima reacciona con un sustrato para generar un producto de reacción coloreado que se puede medir.

En un "ELISA competitivo", el anticuerpo se incuba con una muestra que contiene antígeno (es decir, enzima). La mezcla antígeno-anticuerpo se pone en contacto después con una fase sólida (por ejemplo, una placa de microtitulación) que está recubierta con antígeno (es decir, enzima). Cuanto más antígeno haya presente en la muestra, menos anticuerpo libre estará disponible para unirse a la fase sólida. Se añade después un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, unido a enzima) a la fase sólida para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido a la fase sólida.

En un "ensayo de inmunohistoquímica" se prueba una sección de tejido para proteínas específicas exponiendo el tejido a anticuerpos que son específicos para la proteína que se está ensayando. Los anticuerpos se visualizan después mediante cualquiera de un número de métodos para determinar la presencia y cantidad de la proteína presente. Los ejemplos de los métodos usados para visualizar anticuerpos son, por ejemplo, por medio de enzimas unidas a los anticuerpos (por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, o beta-galactosidasa), o métodos químicos (por ejemplo, cromógeno DAB/sustrato). La muestra se analiza después de forma microscópica, lo más preferiblemente mediante microscopía óptica de una muestra teñida con un colorante que se detecta en el espectro visible, usando cualquiera de una variedad de tales métodos y reactivos de tinción conocidos para el experto en la materia.

De forma alternativa, se pueden emplear "radioinmunoensayos". Un radioinmunoensayo es una técnica para detectar y medir la concentración de un antígeno usando una forma marcada (por ejemplo, marcada de forma radioactiva o fluorescente) del antígeno. Los ejemplos de marcas radioactivas para antígenos incluyen 3H, 14C, y 125I. Se mide la concentración de enzima antígeno en una muestra biológica haciendo que el antígeno en la muestra biológica compita con el antígeno marcado (por ejemplo radioactivamente) para la unión a un anticuerpo para el antígeno. Para asegurar la unión competitiva entre el antígeno marcado y el antígeno no marcado, el antígeno marcado está presente en una concentración suficiente para saturar los sitios de unión del anticuerpo. Cuanto mayor sea la concentración del antígeno en la muestra, menor será la concentración del antígeno marcado que se unirá al anticuerpo. En un radioinmunoensayo, para determinar la concentración del antígeno marcado unido al anticuerpo, el complejo antígeno-anticuerpo se debe separar del antígeno libre. Un método para separar el complejo antígeno-anticuerpo del antígeno libre es precipitar el complejo antígeno-anticuerpo con antisuero anti-isotipo. Otro método de separar el complejo antígeno-anticuerpo del antígeno libre es precipitar el complejo antígeno-anticuerpo con S. aureus aniquilada con formalina. Aún otro método para separar el complejo antígeno-anticuerpo del antígeno libre es realizar un "radioinmunoensayo de fase sólida" donde el anticuerpo está unido (por ejemplo, de forma covalente) a bolas de Sepharosa, pocilios de poliestireno, pocilios de policloruro de vinilo, o pocilios de microtitulación. Comparando la concentración de antígeno marcado unido al anticuerpo con una curva patrón basada en muestras que tienen una concentración de antígeno conocida, se puede determinar la concentración de antígeno en la muestra biológica.

Un "ensayo inmunorradiométrico" (IRMA) es un inmunoensayo en el que el reactivo anticuerpo está marcado radioactivamente. Un IRMA requiere la producción de un conjugado antigénico multivalente, mediante técnicas tales como conjugación a una proteína por ejemplo, seroalbúmina de conejo (RSA). El conjugado antigénico multivalente debe tener al menos 2 residuos de antígenos por molécula y los residuos de antígeno deben estar separados a una distancia suficiente para permitir la unión de al menos dos anticuerpos al antígeno. Por ejemplo, en un IRMA el conjugado antigénico multivalente puede estar unido a una superficie sólida tal como una esfera de plástico. Se añaden antígeno "muestra" no marcado y anticuerpo para el antígeno que está marcado radioactivamente a un tubo de ensayo que contiene la esfera recubierta con el conjugado antigénico multivalente. El antígeno en la muestra compite con el conjugado antigénico multivalente por los sitios de unión del anticuerpo al antígeno. Después de un periodo de incubación apropiado, los reactivos no unidos se eliminan lavando y se determina la cantidad de radioactividad en la fase sólida. La cantidad de anticuerpo radioactivo unido es inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra.

Se pueden usar otras técnicas para detectar los niveles de proteína de un biomarcador en una muestra biológica, se pueden realizar según las preferencias del que practica, y basado en la presente divulgación y el tipo de muestra biológica (es decir, plasma, orina, muestra de tejido etc.). Una de tales técnicas es la inmunotransferencia (Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)), en donde una muestra tratada de una forma adecuada se corre en un gel de SDS-PAGE antes de ser transferida a un soporte sólido, tal como un filtro de nitrocelulosa. Se pueden usar después anticuerpos anti-enzima marcados de forma detectable para evaluar los niveles de enzima, donde la intensidad de la señal de la marca detectable corresponde a la cantidad de enzima presente. Los niveles se pueden cuantificar, por ejemplo mediante densitometría.

En una forma de realización, los niveles de biomarcadores como se divulgan aquí, y/o de sus polipéptidos se pueden detectar en una muestra de tejido mediante espectrometría de masas tal como MALDI/TOF (tiempo de vuelo), SELDI/TOF, cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas (HPLC-MS), electroforesis capilar- espectrometría de masas, espectrometría de resonancia magnética nuclear, o espectrometría de masas en tándem (por ejemplo MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS, etc.). Ver por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. Nos: 20030199001, 20030134304, 20030077616, que se incorporan aquí mediante referencia.

Los métodos de espectrometría de masas son bien conocidos en la técnica y se han usado para cuantificar y/o identificar biomoléculas, tal como proteínas (ver, por ejemplo, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; y Kuster y Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Además, se han desarrollado técnicas de espectrometría de masas que permiten la secuenciación de novo al menos parcial de proteínas aisladas. Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); revisado en Bergman, EXS 88:133-44 (2000).

En ciertas formas de realización, se usa un espectrómetro de iones en fase gaseosa. En otras formas de realización, se usa espectrometría de masas por desorción/ionización láser para analizar la muestra. Se puede llevar a cabo espectrometría de masas por desorción/ionización láser ("LDI-MS") moderna en dos variaciones principales: espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz ("MALDI") y desorción/ionización láser aumentada por superficie ("SELDI"). En MALDI, el analito se mezcla con una solución que contiene una matriz, y se coloca una gota de líquido en la superficie de un sustrato. La solución de la matriz co-cristaliza entonces con las moléculas biológicas. El sustrato se inserta en el espectrómetro de masas. La energía láser se dirige a la superficie del sustrato donde desorbe e ioniza las moléculas biológicas sin fragmentarlas significativamente. Ver, por ejemplo la patente de EE.UU. No. 5118937, y la patente de EE.UU. No. 5045694.

En SELDI, la superficie del sustrato se modifica de modo que es un participante activo en el proceso de desorción. En una variante, la superficie se deriva con un adsorbente y/o reactivos de captura que se unen selectivamente a la proteína de interés. En otra variante, la superficie se deriva con moléculas que absorben energía que no se desorben cuando son alcanzadas por el láser. En otra variante, la superficie se deriva con moléculas que se unen a la proteína de interés y que contienen un enlace fotolítico que se rompe tras la aplicación del láser. En cada uno de estos métodos, el agente de derivación generalmente se localiza en una localización específica en la superficie del sustrato donde se aplica la muestra. Ver, por ejemplo la patente de EE.UU. No. 5719060 y WO 98/59361. Los dos métodos se pueden combinar mediante, por ejemplo, el uso de una superficie de afinidad SELDI para capturar un analito y adición de un líquido que contiene matriz al analito capturado para proporcionar el material absorbente de energía.

Para información adicional respecto a espectrómetros de masas, ver, por ejemplo, Principies of Instrumental Analysis, 3a edición., Skoog, Saunders College Publishing, Filadelfia, 1985; y Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4a ed. VoI. 15 (John Wiley AND Sons, Nueva York 1995), pp. 1071-1094.

La detección de los niveles del biomarcador típicamente dependerá de la detección de la intensidad de señal. Esto, de hecho, puede reflejar la cantidad y carácter de un polipéptido unido al sustrato. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, se puede comparar la fuerza de la señal de valores pico de los espectros de una primera muestra y una segunda muestra (por ejemplo, visualmente, mediante análisis por ordenador, etc.), para determinar las cantidades relativas de biomoléculas particulares. Se pueden usar programas de software tal como el programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.) como ayuda en el análisis de los espectros de masa. Los espectrómetros de masa y sus técnicas son bien conocidos para los expertos en la materia. De forma alternativa, los niveles de un biomarcador polipéptido se pueden determinar obteniendo un espectro de espectrometría de masas por desorción/ionización láser aumentada por superficie tiempo de vuelo (SELDI-TOF MS) de la muestra.

El experto en la materia apreciará que la detección, diagnóstico y evaluación se llevará a cabo detectando un descenso en la expresión de uno o más de los biomarcadores de la invención con respecto al valor de referencia. Un descenso en la expresión con el valor de referencia se considera en donde la diferencia entre la muestra de ensayo y la muestra de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos.

Si el método de la invención se lleva a cabo para la detección, diagnóstico y evaluación de fibrosis y/o de una enfermedad asociada con fibrosis, entonces el valor de referencia es el nivel de expresión del biomarcador en un muestra de referencia que se obtiene combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. En general, las muestras de referencia típicas se obtendrán de sujetos que están clínicamente bien documentados y que están libres de la enfermedad. En tales muestras, las concentraciones normales (de referencia) del biomarcador se pueden determinar, por ejemplo proporcionando la concentración media sobre la población de referencia. Al determinar la concentración de referencia del marcador se toman en cuenta varias consideraciones. Entre tales consideraciones están el tipo de muestra implicada (por ejemplo tejido o LCR), la edad, peso, sexo, estado físico general del paciente y similares. Por ejemplo, se toman como grupo de referencia cantidades iguales de un grupo de al menos 2, al menos 10, al menos 100 a preferiblemente más de 1000 sujetos, preferiblemente clasificados según las consideraciones anteriores, por ejemplo de varias categorías de edad.

Si el método de la invención se lleva a cabo para determinar la eficacia de una terapia para el tratamiento de fibrosis o de una enfermedad asociada con fibrosis, entonces el valor de referencia usado para determinar si una terapia es eficaz normalmente es el nivel de expresión del biomarcador o biomarcadores en consideración con una muestra del paciente antes del inicio de la terapia. Según este método de la invención, la variación con respecto al valor de referencia es un aumento en la expresión por encima del valor de referencia. El nivel de expresión se considera aumentado en donde la diferencia entre la muestra de ensayo y la muestra de referencia es al menos 1,1 veces,

1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces,

80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más.

Se entenderá que el método de la invención se puede llevar a cabo determinando el nivel de un número variable de los biomarcadores. Por ejemplo, el/los nivel(es) de un biomarcador, dos o más biomarcadores, tres o más biomarcadores o cuatro o más biomarcadores como se definen en la presente invención. La determinación de niveles de combinaciones de biomarcadores puede permitir mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de la fibrosis y/o una enfermedad asociada con fibrosis o puede permitir mejor diferenciación de fibrosis de otras enfermedades que pueden tener biomarcadores similares o solapantes. De esta manera, la presente invención comprende la determinación simultánea de los siguientes grupos de biomarcadores:

SLURPl y el fragmento SLURPl,

SLURPI y HAMP,

SLURPl y Hepc25,

SLURPl y Hepc20, SLURPI y GSN;

SLURPI y APOD;

SLURPI y SPPl,

SLURPI y DEFBl,

SLURPl y MASP2; fragmento SLURPl y HAMP, fragmento SLURPl y Hepc25, fragmento SLURPl y Hepc20, fragmento SLURPl y GSN, fragmento SLURPl y APOD, fragmento SLURP 1 y SPP 1 , fragmento SLURPl y DEFBl, fragmento SLURPl y MASP2;

HAMP y Hepc25,

HAMP y Hepc20,

HAMP y GSN,

HAMP y APOD, HAMPySPPl,

HAMPyDEFBl,

HAMP y MASP2;

Hepc25 y Hepc20,

Hepc25 y GSN, Hepc25yAPOD,

Hepc25ySPPl,

Hepc25yDEFBl,

Hepc25 y MASP2;

Hepc20 y GSN, Hepc20yAPOD,

Hepc20ySPPl,

Hepc20yDEFBl,

Hepc20 y MASP2

GSN y APOD; GSNySPPl,

GSNyDEFBl,

GSN y MASP2,

APODySPPl,

APODyDEFBl, APOD y MASP2,

SLURPl, fragmento SLURPl y HAMP;

SLURPl, fragmento SLURPl y Hepc25;

SLURPl, fragmento SLURPl y Hepc20;

SLURPl, fragmento SLURPl y GSN; SLURP 1 , fragmento SLURP 1 y APOD;

SLURPl, fragmento SLURPl y SPPl;

SLURPl, fragmento SLURPl y DEFBl;

SLURPl, fragmento SLURPl y MASP2;

SLURPl, HAMP y Hepc25;

SLURPl, HAMP y Hepc20;

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SLURPl5 HAMP y SPPl

SLURPl, HAMP y DEFBl

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SLURPl, Hepc25 y Hepc20; SLURP 1 , Hepc25 y GSN;

SLURPl, Hepc25 y APOD;

SLURPl, Hepc25 y SPPl

SLURPl, Hepc25 y DEFBl

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SLURPl, Hepc20 y APOD;

SLURPl, Hepc20 y SPPl

SLURPl, Hepc20 y DEFBl

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SLURPI5 GSN y SPPl;

SLURPl5 GSN y DEFBl;

SLURPl5 GSN y MASP2; fragmento SLURPl5 HAMP y Hepc25; fragmento SLURP 1 , HAMP y Hepc20; fragmento SLURPl5 HAMP y GSN; fragmento SLURPl5 HAMP y APOD; fragmento SLURPl5 HAMP y SPPl; fragmento SLURPl5 HAMP y DEFBl; fragmento SLURP 1 , HAMP y MASP2; fragmento SLURPl5 Hepc25 y Hepc20; fragmento SLURPl5 Hepc25 y GSN;

fragmento SLURPl, Hepc25 y APOD; fragmento SLURPl, Hepc25 y SPPl fragmento SLURPl, Hepc25 y DEFBl fragmento SLURPl, Hepc25 y MASP2 fragmento SLURP 1 , Hepc20 y GSN; fragmento SLURPl, Hepc20 y APOD; fragmento SLURPl, Hepc20 y SPPl fragmento SLURPl, Hepc20 y DEFBl fragmento SLURPl, Hepc20 y MASP2 fragmento SLURP 1 , GSN y APOD; fragmento SLURPl, GSN y SPPl; fragmento SLURPl, GSN y DEFBl; fragmento SLURPl, GSN y MASP2;

HAMP, Hepc25 y Hepc20; HAMP, Hepc25 y GSN;

HAMP, Hepc25 y APOD;

HAMP, Hepc25 y SPPl;

HAMP, Hepc25 y DEFBl;

HAMP, Hepc25 y MASP2; HAMP, Hepc20 y GSN;

HAMP, Hepc20 y APOD;

HAMP, Hepc20 y SPPl;

HAMP, Hepc20 y DEFBl;

HAMP, Hepc20 y MASP2; HAMP, GSN y APOD;

HAMP5 GSN y SPPl;

HAMP5 GSN y DEFBl;

HAMP, GSN y MASP2;

Hepc25, Hepc20 y GSN; Hepc25, Hepc20 y APOD;

Hepc25, Hepc20 y SPPl;

Hepc25, Hepc20 y DEFBl;

Hepc25, Hepc20 y MASP2;

Hepc25, GSN y APOD;

Hepc25, GSN y SPPl;

Hepc25, GSN y DEFBl; Hepc25, GSN y MASP2;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP y Hepc25;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP yHepc20;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP y GSN;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP y APOD; SLURP 1 , fragmento SLURP 1 , HAMP y SPP 1 ;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP y DEFBl;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP y MASP2;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc25 y Hepc20;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc25 y GSN; SLURP 1 , fragmento SLURP 1 , Hepc25 y APOD;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc25 y SPPl;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc25 y DEFBl;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc25 y MASP2;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc20 y GSN; SLURP 1 , fragmento SLURP 1 , Hepc20 y APOD;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc20 y SPPl;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc20 y DEFBl;

SLURPl, fragmento SLURPl, Hepc20 y MASP2;

SLURPl, HAMP, Hepc25 y Hepc20; SLURP 1 , HAMP, Hepc25 y GSN;

SLURPl, HAMP, Hepc25 y APOD;

SLURPl, HAMP, Hepc25 y SPPl;

SLURPl, HAMP, Hepc25 y DEFBl;

SLURPl, HAMP, Hepc25 y MASP2; SLURPl, HAMP, Hepc20 y GSN;

SLURPl, HAMP, Hepc20 y APOD;

SLURPl, HAMP, Hepc20 y SPPl;

SLURPl, HAMP, Hepc20 y DEFBl;

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SLURPl, HAMP, GSN y APOD;

SLURPl, HAMP, GSN y SPPl; SLURP 1 , HAMP, GSN y DEFB 1 ;

SLURPl, HAMP, GSN y MASP2; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y Hepc20; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y GSN; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y APOD; fragmento SLURP 1 , HAMP, Hepc25 y SPP 1 ; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y DEFBl; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y MASP2; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc20 y GSN; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc20 y APOD; fragmento SLURP 1 , HAMP, Hepc20 y SPP 1 ; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc20 y DEFBl; fragmento SLURPl, HAMP, Hepc20 y MASP2; fragmento SLURPl, HAMP, GSN y APOD; fragmento SLURPl, HAMP, GSN y SPPl; fragmento SLURP 1 , HAMP, GSN y DEFB 1 ; fragmento SLURPl, HAMP, GSN y MASP2; fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20 y GSN; fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20 y APOD; fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20 y SPPl; fragmento SLURP 1 , Hepc25 , Hepc20 y DEFB 1 ; fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20 y MASP2; fragmento SLURPl, Hepc20, GSN y APOD; fragmento SLURPl, Hepc20, GSN y SPPl; fragmento SLURPl, Hepc20, GSN y DEFBl; fragmento SLURP 1 , Hepc20, GSN y MASP2;

HAMP, Hepc25, Hepc20 y GSN;

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HAMP, Hepc25, Hepc20 y SPPl;

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Hepc25, Hepc20, GSN y APOD Hepc25, Hepc20, GSN y SPPl

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SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y SPPl;

SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25 y DEFBl;

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fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20, GSN y DEFBl; fragmento SLURPl, Hepc25, Hepc20, GSN y MASP2

HAMP, Hepc25, Hepc20, GSN y APOD;

HAMP, Hepc25, Hepc20, GSN y SPPl; HAMP, Hepc25, Hepc20, GSN y DEFBl;

HAMP, Hepc25, Hepc20, GSN y MASP2;

HAMP, Hepc20, GSN y APOD;

Hepc25, Hepc20, GSN y APOD;

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Hepc25, Hepc20, GSN y MASP2;

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SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP, Hepc25, Hepc20 y SPPl; SLURP 1 , fragmento SLURP 1 , HAMP, Hepc25 , Hepc20 y DEFB 1 ;

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SLURPl, fragmento SLURPl, HAMP, Hepc20, GSN y MASP2;

Además, el experto en la materia apreciará que los métodos de la invención se pueden combinar con otros métodos conocidos en la técnica para la detección de fibrosis o de una enfermedad asociada a fibrosis y para la determinación de la eficacia de una terapia para fibrosis o una enfermedad asociada a fϊbrosis. En particular, los biomarcadores de la invención se pueden medir simultáneamente con la serie de 5 biomarcadores definida en WO0216949 (α2-macroglobulina, haptoglobulina, apolipoproteina Al, γ-glutamil transpeptidasa, y bilirrubina), con la serie de tres biomarcadores descrita en WO0373822 (α-MG, HA y TIMP-I), con las diferentes series de biomarcadores descritas en WO2005116901 (que comprenden α-2 macroglobulina, ácido hialurónico, apolipoproteina Al, propéptido N-terminal de colágeno de tipo III, γ-glutamiltranspeptidasa, bilirrubina, γ-globulinas, plaquetas, tiempo de protrombina, aspartato amino-transferasa, alanina aminotransferasa, urea, sodio, glucemia, triglicéridos, albúmina, fosfatasas alcalinas, YKL-40 (glicoproteína de cartílago humana 39), Inhibidor tisular de metaloproteinasa de matriz 1 (TIMP-I), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2) y ferritina); con uno o más de los marcadores descritos en WO2007003670 (que incluye uromodulina, MAC2BP, AGPl y catepsina A), con uno o más de los biomarcadores de suero descritos en WO2008031051.

Además, el método de la invención se puede usar junto con otros métodos para detectar fibrosis no basados en la determinación de los niveles de expresión de uno o más biomarcadores, tal como biopsia hepática y elastografía como se describe en Sandrin L et al. (Ultrasound Med. Biol. 2003; 29:1705-1711).

La invención también proporciona kits que comprenden reactivos para detectar al menos dos o más biomarcadores seleccionados del grupo de SLURPl, HAMP, GSN,, APOD, SPPl, DEFBl, MASP2. Las diferentes combinaciones de biomarcadores que se pueden detectar usando el kit de la invención se han definido anteriormente. En una forma de realización preferida, los biomarcadores son polipéptidos y de esta manera, los reactivos que forman el kit pueden ser cualquier compuesto capaz de unirse con alta afinidad a los biomarcadores polipeptídicos anteriores. Los reactivos del kit pueden ser, sin limitación, cualquier tipo de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina o fragmento de los mismos tal como anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos o humanizados o recombinantes así como anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo construcciones scFv, o anticuerpos sintéticos como tal y que pueden pertenecer a cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgE, IgA, y donde sea aplicable, una subclase de cualquiera de las clases mencionadas anteriormente, por ejemplo las subclases de la clase IgG tal como IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgGM. Además, el kit, también puede comprender fragmentos de anticuerpo tal como fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 o fragmentos de cadena sencilla tal como scFv. Los fragmentos de cadena doble tal como Fv, Fab o F(ab')2 son preferidos. Los fragmentos Fab y F(ab')2 no tienen fragmento Fc contenido en los anticuerpos intactos. Como consecuencia beneficiosa, tales fragmentos se transportan más rápido en el sistema circulatorio, y muestran menos unión no específica a tejido en comparación con las especies de anticuerpos completas. Tales fragmentos se pueden producir a partir de anticuerpos intactos mediante digestión proteo lítica usando proteasas tales como papaína (para la producción de fragmentos Fab) o pepsina (para la producción de fragmentos F(ab')2), u oxidación química.

Los anticuerpos pueden estar unidos a un soporte sólido formando matrices de anticuerpos o chips de proteína. Las matrices de proteína son sistemas de ensayos unión de ligandos en fase sólida que usan proteínas inmovilizadas sobre superficies que incluyen vidrio, membranas, pocilios de microtitulación, placas de espectrómetro de masas, y bolas u otras partículas. Las matrices son altamente paralelas (multiplexadas) y con frecuencias miniaturizadas (micromatrices, chips de proteína). Sus ventajas incluyen que son rápidos y automatizables, capaces de gran sensibilidad, económicos en reactivos, y dan abundancia de datos para un solo experimento. El soporte bioinformático es importante; el manejo de datos demanda software sofisticado y análisis de comparación de datos. Sin embargo, el software se adapta del usado para matrices de ADN, como puede ser gran parte del hardware y sistemas de detección.

Uno de los formatos principales es la matriz de captura, en el que se usan reactivos de unión a ligandos, que normalmente son anticuerpos pero que también pueden ser alternativamente esqueletos proteicos, péptidos o aptámeros de ácido nucleico, para detectar moléculas diana en mezclas tal como plasma o extractos de tejido. En diagnóstico, se usan las matrices de captura para llevar a cabo múltiples inmunoensayos en paralelo, probando tanto para varios analitos en sueros individuales por ejemplo como probando muchas muestras de suero de forma simultánea. En proteómica, las matrices de captura se usan para cuantificar y comparar los niveles de proteínas en diferentes muestras en salud y enfermedad, es decir perfil de expresión de proteínas. Se usan proteínas diferentes de las que unen los ligandos específicos en el formato de la matriz para cribados funcionales in vitro tal como proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-fármaco, receptor-ligando, enzima- sustrato, etc. Los reactivos de captura mismos se seleccionan y criban contra muchas proteínas, opcionalmente en formato de matriz multiplex contra muchas proteínas diana.

Para la construcción de matrices, las fuentes de proteínas incluyen sistemas de expresión basados en células para proteínas recombinantes, purificación de fuentes naturales, producción in vitro mediante sistemas de traducción libres de células, y métodos sintéticos para péptidos. Muchos de estos métodos están automatizados para producción de alto rendimiento. Para las matrices de captura y análisis de la función de proteínas, es importante que las proteínas estén correctamente plegadas y sean funcionales; este no es siempre el caso, por ejemplo, donde se extraen las proteínas recombinantes de bacterias en condiciones desnaturalizantes. Sin embargo, las matrices de proteínas desnaturalizadas son útiles en el cribado de anticuerpos para reactividad cruzada, identificación de autoanticuerpos y selección de proteínas que se unen a ligandos.

Se han diseñado matrices de proteínas como una miniaturización de métodos de inmunoensayo familiares tal como ELISA y transferencia en gota, utilizando con frecuencia lectores fluorescentes, y facilitada por robótica y sistemas de detección de alto rendimiento para permitir que se lleven a cabo múltiples ensayos en paralelo. Los soportes físicos incluyen portaobjetos de vidrio, silicona, micropocillos, membranas de nitrocelulosa o PVDF, y microbolas magnéticas y otras. Mientras que el formato más familiar son microgotas de proteína de que dejan sobre superficies planares, las arquitecturas alternativas incluyen dispositivos de centrifugación de CD basados en desarrollo en microfluidos (Gyros, Monmouth Junction, NJ) y diseños especializados de chip, tal como los microcanales construidos en una placa (por ejemplo, The Living Chip™, Biotrove, Woburn, MA) y postes 3D minúsculos sobre una superficie de silicona (Zyomyx, Hayward CA). También se usan partículas en suspensión como base para las matrices, siempre que estén codificadas para identificación; los sistemas incluyen códigos de colores para microbolas (Luminex, Austin, TX; Bio-Rad Laboratories), nanocristales semiconductores (por ejemplo, QDOTS™, Quantum Dot, Hayward, CA), código de barras para bolas (bolas ULTRAPLEX™, SmartBead Technologies Ltd, Babraham, Cambridge, RU) y microbastones multimetálicos (por ejemplo, partículas NANOBARCODES™, Nanoplex Technologies, Mountain View, CA). Las bolas se ensamblan opcionalmente en matrices planares en chips semiconductores (tecnología LEAPS™, BioArray Solutions, Warren, NJ).

La inmovilización de proteínas implica tanto el reactivo de acoplamiento como la naturaleza de la superficie a la que se acopla. Una superficie soporte de matriz de proteínas buena es químicamente estable antes y después de los procedimientos de acoplamiento, permite buena morfología de las manchas, muestra unión no específica mínima, no contribuye al fondo en sistemas de detección, y es compatible con diferentes sistemas de detección. El método de inmovilización usado es reproducible, aplicable a proteínas de diferentes propiedades (tamaño, hidrofílica, hidrofóbica), manejable a alto rendimiento y automatización, y compatible con la retención de actividad de proteína completamente funcional. La orientación de la proteína unida a la superficie se reconoce como un factor un importante al presentarla al ligando o sustrato en un estado activo; para las matrices de captura los resultados de unión más eficaces se obtienen con reactivos de captura orientados, que generalmente requieren mareaje específico de sitio de la proteína. Se usan tanto métodos covalentes como no covalentes de inmovilización de proteínas y tienen varios pros y contras. La adsorción pasiva a superficies es metodológicamente sencilla, pero permite poco control cuantitativo o de orientación. Puede alterar o no las propiedades funcionales de la proteína, y la reproducibilidad y eficacia son variables. Los métodos de acoplamiento covalente proporcionan una unión estable, se aplican a un rango de proteínas y tienen buena reproducibilidad. Sin embargo, la orientación es variable. Además, la derivación química puede alterar la función de la proteína y requiere una superficie interactiva estable. Los métodos de captura biológicos que utilizan una etiqueta en la proteína proporcionan una unión estable y se unen a la proteína específicamente y en orientación reproducible, pero los reactivos biológicos se deben inmovilizar primero de forma adecuada, y la matriz puede requerir manejo especial y tener estabilidad variable. Se han descrito varias químicas de inmovilización y etiquetas para la fabricación de matrices de proteína. Los sustratos para la unión covalente incluyen portaobjetos de vidrio recubiertos con reactivos de silanos que contienen amino o aldehido. En el sistema VERSALINX™ (Prolinx, Bothell, WA) se alcanza acoplamiento covalente reversible mediante interacción entre la proteína derivada con ácido fenildiborónico, y ácido salicilhidroxámico inmovilizado en la superficie del soporte. Ésto también tiene unión de fondo baja y fluorescencia intrínseca baja y permite que las proteínas inmovilizadas retengan la función. La unión no covalente de proteínas no modificadas sucede con estructuras porosas tal como HYDROGEL™ (PerkinElmer, Wellesley, MA), basado en un gel tridimensional de poliacrilamida; se ha descrito que este sustrato da un fondo particularmente bajo en micromatrices de vidrio, y gran capacidad y retención de función de las proteínas. Los métodos de acoplamiento biológico ampliamente usados son por medio de interacciones biotina/estreptavidina o hexahistidina/Ni, habiendo modificado la proteína de forma adecuada. La biotina se puede conjugar a un esqueleto de polilisina inmovilizado sobre una superficie como dióxido de titanio (Zyomyx, Inc., Hayward, CA) o pentóxido de tantalio (Zeptosens, Witterswil, Suiza). Los métodos de fabricación de matrices incluyen impresión de contacto robótica, inyección de tinta, punteo piezoeléctrico y fotolitografía. Están disponibles un número de fabricantes de matrices comerciales [por ejemplo, Packard Biosciences, Affymetrix Inc. y Genetix] así como equipo manual [por ejemplo, V and P Scientific]. Las colonias de bacterias opcionalmente se ponen en rejillas robóticamente sobre membranas de PVDF para inducción de la expresión de la proteína in situ. En el límite del tamaño de mancha y densidad están las nanomatrices, con manchas en la escala espacial de nanómetros, que permiten que se realicen miles de reacciones en un solo chip de menos de 1 mm cuadrado. BioForce Nanosciences Inc. y Nanolink Inc., por ejemplo, han desarrollado nanomatrices comercialmente disponibles.

Los métodos de mareaje y detección con fluorescencia se usan ampliamente. Los mismos instrumentos que se usan para la lectura de micromatrices de ADN son aplicables para matrices de proteínas. Para la presentación diferencial, las matrices de captura (por ejemplo, anticuerpos) se prueban con proteínas marcadas fluorescentemente de dos estados celulares diferentes, en las que los usados celulares se conjugan directamente con fluoróforos diferentes (por ejemplo, Cy-3, Cy-5) y se mezclan, de modo que el color actúa como un lector para cambios en la abundancia de la diana. La sensibilidad de lectura fluorescente se amplifica 10-100 veces mediante amplificación de señal de tiramida (TSA) (PerkinElmer Lifesciences). La tecnología planar de ondas guiadas (Zeptosens) permite detección fluorescente ultrasensible, con la ventaja adicional de no tener procedimientos de lavado intermedios. La alta sensibilidad se alcanza con la suspensión de bolas y partículas, usando ficoeritrina como marca (Luminex) o las propiedades de nanocristales semiconductores (Quantum Dot). Se han desarrollado un número de lectores alternativos, especialmente en el área de la biotecnología comercial. Estos incluyen adaptaciones de resonancia de plasmón nuclear (HTS Biosystems, Intrinsic Bioprobes, Tempe, AZ), amplificación de ADN en círculo rodante (Molecular Staging, New Haven, CT), espectrometría de masas (Intrinsic Bioprobes; Ciphergen, Fremont, CA), dispersión de luz por resonancia (Genicon Sciences, San Diego, CA) y microscopía de fuerza atómica [BioForce Laboratories].

Las matrices de captura forman la base de los chips de diagnóstico para el perfil de expresión. Emplean reactivos de captura de alta afinidad, tal como anticuerpos convencionales, dominios individuales, esqueletos construidos, péptidos o aptámeros de ácidos nucleicos, para unirse y detectar ligandos dianas específicos en una manera de alto rendimiento.

Las matrices de anticuerpos tienen las propiedades requeridas de especificidad y fondo aceptable, y algunas están comercialmente disponibles (BD Biosciences, San José, CA; Clontech, Mountain View, CA; BioRad; Sigma, St. Louis, MO). Los anticuerpos para las matrices de captura se producen bien mediante inmunización convencional (sueros policlonales e hibridomas), o como fragmentos recombinantes, normalmente expresados en E. coli, después de la selección de bibliotecas de presentación en fagos o ribosomas (Cambridge Antibody Technology, Cambridge, RU; Biolnvent, Lund, Suecia; Affitech, Walnut Creek, CA; Biosite, San Diego, CA). Además de los anticuerpos convencionales, los fragmentos Fab y scFv, dominios V individuales de camélidos o equivalentes humanos construidos (Domantis, Waltham, MA) son opcionalmente útiles en matrices.

El término esqueleto se refiere a dominios de proteína de unión a ligando, que se construyen en múltiples variantes capaces de unirse a diversas moléculas diana con propiedades de especificidad y afinidad similares a anticuerpo. Las variantes se producen en formato de biblioteca genética y se seleccionan contra dianas individuales mediante presentación en fago, bacteria o ribosoma. Tales esqueletos o marcos que se unen a ligando incluyen Affybodies basados en proteína A de S. aureus (Affibody, Bromma, Suecia), Trinectins basado en fibronectinas (Phylos, Lexington, MA) y Anticalins basado en la estructura de la lipocalina (Pieris Proteolab, Freising-Weihenstephan, Alemania). Éstos se usan en matrices de captura de una manera similar a los anticuerpos y tienen las ventajas de la consistencia y facilidad de producción.

Las moléculas de captura no proteicas, notablemente los aptámeros de ácido nucleico de cadena sencilla que se unen a ligandos proteicos con alta especificidad y afinidad, también se usan en matrices (SomaLogic, Boulder, CO). Los aptámeros se seleccionan de bibliotecas de oligonucleótidos mediante el procedimiento Selex™ (SomaLogic, Boulder, CO) y su interacción con proteínas aumenta mediante unión covalente, por medio de la incorporación de desoxiuridina brominada y entrecruzamiento activado por UV (fotoaptámeros). El fotoentrecruzamiento a ligandos reduce la reactividad cruzada de los aptámeros debido a los requerimientos estéricos específicos. Los aptámeros tienen las ventajas de facilidad de producción mediante síntesis automatizada de oligonucleótidos y la estabilidad y consistencia del ADN; en las matrices de fotoaptámeros, se usan colorantes de proteínas fluorescentes universales para detectar la unión.

Los analitos proteicos que se unen a matrices de anticuerpos se detectan de forma directa o indirecta, por ejemplo, a través de un anticuerpo secundario. Se usa el mareaje directo para la comparación de diferentes muestras con diferentes colores. Donde están disponibles pares de anticuerpos dirigidos al mismo ligando proteico, los inmunoensayos en sandwich proporcionan alta especificidad y sensibilidad y por lo tanto son el método de elección para proteínas de baja abundancia tal como citoquinas; también dan la posibilidad de detección de modificaciones de proteína. Los métodos de detección sin marca, incluyendo espectrometría de masas, resonancia de plasmón de superficie y microscopía de fuerza atómica, evitan la alteración del ligando. Lo que se requiere de cualquier método es sensibilidad y especificidad óptimas, con fondo bajo para dar una señal a ruido alta. Puesto que las concentraciones de analito cubren un amplio rango, la sensibilidad tiene que adaptarse apropiadamente. La dilución en serie de la muestra o el uso de anticuerpos de diferentes afinidades son soluciones para este problema. Las proteínas de interés con frecuencia son aquellas en concentraciones bajas en los líquidos corporales y extractos, que requieren detección en el intervalo de pg o menor, tal como citoquinas o los productos de baja expresión en células. Una alternativa a una matriz de moléculas de captura es una hecha por medio de la tecnología de huella molecular, en la cual se usan péptidos (por ejemplo, de las regiones C-terminales de las proteínas) como moldes para generar cavidades estructuralmente complementarias, específicas de secuencia en una matriz polimerizable; las cavidades pueden después capturar específicamente proteínas (desnaturalizadas) que tienen la secuencia primaria de aminoácidos apropiada (ProteinPrint™, Aspira Biosystems, Burlingame, CA).

Otra metodología que es útil diagnósticamente y en el perfil de expresión es la matriz ProteinChip® (Ciphergen, Fremont, CA), en la que superficies cromatográficas en fase sólida se unen a proteínas con características similares de carga o hidrofobicidad de mezclas tales como plasma o extractos de tumores, y se usa espectrometría de masas SELDI-TOF para la detección de las proteínas retenidas.

Se han construido chips funcionales a gran escala inmovilizando grandes números de proteínas purificadas y se usan para ensayar un amplio intervalo de funciones biológicas, tal como interacciones de proteínas con otras proteínas, interacciones fármaco-diana, enzima-sustrato, etc. En general requieren una biblioteca de expresión, clonada en E. coli, levadura o similar a partir de la cual se purifican las proteínas expresadas, por ejemplo, a través de una etiqueta de His y se inmovilizan. La transcripción/traducción de proteínas libre de células es una alternativa viable para la síntesis de proteínas que no se expresan bien en sistemas bacterianos u otros sistemas in vivo.

Para detectar interacciones proteína-proteína, las matrices de proteína son alternativas in vitro al sistema de los dos híbridos de levadura basado en célula y son útiles donde el último es deficiente, tal como interacciones que implican proteínas secretadas o proteínas con puentes disulfúro. Se ha descrito el análisis de alto rendimiento de actividades bioquímicas en matrices para proteínas quinasas de levadura y para varias funciones (interacciones proteína-proteína y proteína-lípido) del proteoma de levadura, donde se expresó una gran proporción de todos los marcos abiertos de lectura de levadura y se inmovilizó en una micromatriz. Los chips de proteoma a gran escala también son útiles en la identificación de interacciones funcionales, cribado de fármacos, etc. (Proteometrix, Branford, CT).

Como una presentación bidimensional de elementos individuales, se usa una matriz de proteínas para cribar bibliotecas de presentación en fagos o ribosomas, para seleccionar compañeros de unión, incluyendo anticuerpos, esqueletos sintéticos, péptidos y aptámeros. De esta manera, se lleva a cabo un cribado de biblioteca contra biblioteca. El cribado de fármacos candidatos en bibliotecas químicas combinatorias contra una matriz de proteínas diana identificadas de proyectos genómicos es otra aplicación de esta aproximación.

Los ensayos multiplexados con bolas usan una serie de partículas espectralmente discretas que se usan para capturar y cuantificar analitos solubles. El analito se mide después mediante detección de una emisión basada en fluorescencia y análisis por citometría de flujo. Los ensayos multiplexados con bolas generan datos que son comparables a ensayos basados en ELISA, pero en una forma multiplexada o simultánea. Se calcula la concentración de desconocidos para la matriz citométrica de bolas como con cualquier ensayo en formato sandwich, es decir, por medio del uso de estándares conocidos y representando los desconocidos contra la curva patrón. Además, los ensayos multiplexados con bolas permiten la cuantificación de analitos solubles en muestras nunca antes consideradas debido a las limitaciones de volumen de la muestra. Además de los datos cuantitativos, se generan imágenes visuales poderosas que revelan perfiles únicos o firmas que proporcionan al usuario información adicional de un vistazo.

El kit de la invención puede contener adicionalmente instrucciones para el uso en determinar los niveles de proteína de los biomarcadores presentes en la muestra. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de modo que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios electrónicos de almacenamiento (discos ópticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden contener de forma adicional o alternativa páginas de Internet que proporcionan dichas instrucciones.

La invención se describe aquí en más detalle como los siguientes ejemplos que se deben considerar como meramente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.

EJEMPLOS

MATERIALES Y MÉTODOS

MUESTRAS

Se obtuvieron un total de 80 muestras de orina de la Clínica Universitaria de Navarra. La recogida de muestras fue aprobada por el Comité de Ética para Ensayos Clínicos local de la Clínica Universitaria de Navarra, y todos los pacientes dieron consentimiento informado para participar. Las muestras de orina eran de 35 pacientes con cirrosis F4 (índice de Metavir), 10 pacientes con fibrosis Fl (índice de Metavir), y 35 controles sanos. El criterio usado para clasificar el daño en el hígado fue la biopsia hepática para los pacientes con cirrosis y fibrosis, y el análisis de sangre estándar para los individuos control. El 81,5% de los pacientes eran hombres y el 18,5% mujeres y todos tenían entre 38 y 75 años de edad.

DIGE

Las muestras de orina se centrifugaron a 4000xg durante 5 minutos a 40C, y los sobrenadantes de 30 mi se concentraron usando dispositivos de filtros de centrifugación

Amicon Ultra-15 (5000 NMWL) de Millipore. Las proteínas concentradas se precipitaron con el kit ReadyPrep 2-D Cleanup (Bio-Rad) y los precipitados resultantes se resuspendieron en urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%, Tris/HCl 30 mM pH 8. La concentración de proteína se determinó usando el kit del ensayo de Bradford (BioRad), usando seroalbúmina bovina como proteína estándar. Se marcaron las muestras de proteína (50 μg) con 400 pmoles de colorantes fluorescentes Cy3 y Cy5 en N ,N-dimetilformamida. Se preparó una muestra de referencia mezclando 25 μg de proteína de cada condición experimental y el conjunto resultante se marcó posteriormente con Cy2. Se realizaron análisis en triplicado alternando el mareaje fluorescente de las muestras del estudio. La primera dimensión se realizó en un Ettan IPGphor (GE Healthcare) usando Immobiline DryStrips pH3-l l NL, 24 cm (GE Healthcare). Las muestras se cargaron en el extremo ácido de la tira con un dispositivo de carga de copa. Las condiciones de isoelectroenfoque fueron las recomendadas por el fabricante para el tipo de tira usada. El SDS-PAGE (12,5%) se desarrolló en un Ettan DALTsix (GE Healthcare) a 250C y lW/gel durante 12 horas. Las imágenes de los geles se capturaron con un Typhoon Trio (GE Healthcare) a una resolución de 100 μm con λex/λem de 488/520, 532/580, y 633/670 nm para Cy2, Cy3, and Cy5 respectivamente. El análisis de imágenes y estadística se realizaron con el software DeCyder Differential versión 6.5 (GE Healthcare) usando el módulo Biological Variation Analysis (BVA). Sólo se aceptaron diferencias con p<0,05 (prueba t).

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES POR DIGE

Los geles preparativos se corrieron con 400 μg de proteína siguiendo el mismo procedimiento indicado anteriormente. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con tinción de gel de proteínas SYPRO Ruby (Bio-Rad) y las imágenes se adquirieron con un Typhoon Trio usando λex/λem 532/560 nm. Las manchas diferencialmente representadas se cortaron de forma manual y las muestras de gel se procesaron con una estación MassPrep (Waters). La digestión tríptica en el gel se realizó con 12,5 ng/μl de tripsina en bicarbonato de amonio 50 mM durante 12 horas a 370C. Se realizó CL en fase reversa microcapilar con un sistema capilar CapLC™ (Waters). La separación en fase reversa de los digeridos trípticos se realizó con una columna capilar de sílice fusionada Atlantis, C 18, 3 μm, 75 μmx lO cm Nano Ease™ (Waters) equilibrada en acetonitrilo al 5%, ácido fórmico al 0,2%. Tras la inyección de 6 μl de muestra, la columna se lavó durante 5 minutos con el mismo tampón y los péptidos se eluyeron usando un gradiente lineal de acetonitrilo del 5-50% en 45 minutos a una velocidad de flujo constante de 0,2 μl/min. La columna se acopló en línea a un Q-TOF Micro (Waters) usando una fuente de ionización por nanospray PicoTip (Waters). La temperatura del capilar calentado fue de 8O0C y la diferencia de potencial del spray fue de 1,8-2,2 kV. Los datos de MS/MS se recogieron en un modo automatizado dependiente de los datos. Los tres iones más intensos en cada estudio se fraccionaron secuencialmente mediante disociación inducida por colisión (CID) usando una anchura de aislamiento de 2,0 y una energía relativa de colisión del 35%. El procesamiento de datos se realizó con MassLynx 4.0. La búsqueda en las bases de datos se hizo con Phenyx 2.2 (GeneBio, Ginebra, Suiza) contra la base de conocimiento Uniprot Reléase 12.3 que consiste en UniprotKB/Swiss-Prot Reléase 54.3 y UniprotKB/TrEMBL Reléase 37.3 con las entradas 285.335 y 4.932.421, respectivamente. La búsqueda se restringió enzimáticamente para tripsina y se permitió un sitio de corte fallado. Los parámetros de búsqueda adicionales fueron como sigue: sin restricción en el peso molecular y punto isoeléctrico; modificación fija, carbamidometilación de cisterna; modificación variable, oxidación de metionina.

SELDI TOF

En el método SELDI, se aplican soluciones de proteína a las manchas de matrices de ProteinChip, que se han derivado con químicas cromatográficas planares. Las proteínas interaccionan activamente con la superficie de la matriz cromatográfica, y son secuestradas según su potencial de interacción de superficie así como separadas de sales y otras contaminantes de la muestra mediante lavado posterior en la mancha con las soluciones tampones adecuadas. Como en la técnica MALDI, las proteínas a ser analizadas se cocristalizan con componentes que absorben UV y se volatilizan mediante un haz de láser UV pulsado. Las proteínas ionizadas se aceleran después en un campo eléctrico, y las relaciones de la masa a la carga de las diferentes especies iónicas de las proteínas se pueden deducir a partir de su velocidad.

Las muestras se procesaron y analizaron en duplicado. Las muestras de orina se centrifugaron brevemente a 10000 g durante 5 minutos a 40C para eliminar restos y se diluyeron 2:3 en urea 9 M, CHAPS al 2%. Todas las muestras de orina desnaturalizadas se analizaron sin más fraccionamiento mediante dilución 1 :10 con los tampones de unión correspondientes antes de aplicarlas a la superficie del chip. Las proteínas se analizaron usando chips CMlO (intercambio catiónico), IMAC30 (afinidad a metal), QlO (intercambio aniónico) y H5 (interacción hidrofóbica) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usaron los siguientes tampones de unión para cada tipo específico de chip: tampón de CMlO poco fuerte (acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0); tampón de H50 (la superficie se cargó inicialmente con ACN al 50% y la unión se realizo en ACN al 10%, TFA al 0,1%); tampón de QlO (Tris HCl 100 mM pH 9); tampón de IMAC30 (la superficie se cargó inicialmente con sulfato cúprico 0,1 M, se neutralizó con acetato de sodio 0,1 M pH 4,0, y la unión se realizó en fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,5 M pH 7,0). El perfil de SELDI-TOF se realizó como sigue: los chips se equilibraron dos veces con 150 μl del tampón de unión apropiado durante 5 minutos y se cargaron dos veces (30 minutos cada carga) con 25 μl de muestra mezclada con 175 μl de tampón de unión. Las proteínas no unidas se eliminaron lavando los chips tres veces con 150 μl de tampón de unión y tres veces con 200 μl de agua desionizada. Después de secar la superficie cargada, se aplicó 1 μl de ácido sinapínico (Bio-Rad, Hercules, CA) disuelto en ACN al 50% y TFA al 0,5% dos veces y se dejó secar. El análisis de las proteínas/péptidos unidos se realizó usando ProteinChip System, Series 4000 (Bio-Rad, Hercules, CA). Los espectros se recogieron en modo de ion positivo entre el intervalo de masas de 1-100 kDa con una masa foco de 48 kDa y 8 kDa. Los espectros obtenidos se procesaron, normalizaron y compararon con el Ciphergen Express, un programa de análisis de grupos de datos, usando los parámetros por defecto. El análisis estadístico elegido fue la prueba univariante no paramétrica U-Mann-Whitney. Además, se usaron modelos lineales usando el paquete LIMMA de Bioconductor que permitió la selección de péptidos usando una corrección del valor de p basado en FDR o la estadística B (logaritmo del cociente probabilidad de que un péptido se exprese diferencialmente/probabilidad de que no sea diferencial). La capacidad discriminadora de los péptidos seleccionados se evaluó con la curva ROC (sensibilidad frente a especificidad) y particularmente con el valor AUC (área bajo la curva). Una vez establecidos los marcadores individuales más fiables, se realizó un análisis multivariante para evaluar la combinación que proporciona la clasificación más eficaz de las muestras.

INMUNOTRANSFERENCIA

Las muestras de orina se mezclaron con tampón de carga 5x (Tris-HCl 250 mM pH 6,8, SDS al 10%, glicerol al 50%, mercaptoetanol al 5%, EDTA 62,5 mM, azul de bromo fenol al 0,1%) y se cargaron 1,2 μg de proteína y se corrieron en un gel de glicina-dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida al 12,5%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia húmeda (100 V a 40C durante 1 hora). Después de bloquear en leche al 5% en solución salina tamponada con fosfato más Tween (PBST), las membranas se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-gelsolina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California), (diluido 1 :1000) y anticuerpo policlonal de conejo apolipoproteína D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California), en PBST que contenía leche al 1%, a 40C durante la noche. Después de lavar en PBST las bandas de proteínas inmunoreactivas se visualizaron incubando las membranas con anticuerpo anti-conejo conjugado a peroxidasa (diluido 1 :5000 en leche al 5% en PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Usando un sistema de análisis ECL Western blotting, las bandas inmunoreactivas se representaron en una película quimioluminiscente mediante revelado de película normal.

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES POR SELDI-TOF

Cromatografía de retenido (perfil de SELDI): Para ensayar las proteínas de interés durante la purificación, se hizo el perfil de las fracciones en matrices de ProteinChip CMlO y/o QlO. Las matrices se equilibraron primero en tampón de unión (Tris 50 mM, pH 9,0 para matrices QlO y acetato de Na 100 mM, pH 4,0 para matrices CMlO). Se diluyeron alícuotas de cada muestra 10 veces en tampón de unión y se dejaron unir a la superficie de la matriz durante 30 minutos. La matriz se lavó tres veces con 150 μl de tampón de unión, se aclaró con agua desionizada, y se dejó secar antes de la adición de matriz. Para evaluar contenido y pureza total de proteína, alícuotas de 1-2 μL también se unieron a matrices NP20 y se dejaron secar antes de añadir la matriz. Se usaron SPA o CHCA como matrices.

Fraccionamiento de intercambio aniónico: Se desnaturalizaron 10 mL de orina con 16 mi de urea 9 M Tris 50 mM, pH 9,0. Se equilibró resina Q HyperD® F (PaIl Corporation) con tampón Ul (urea 1 M, CHAPS al 0,2%, Tris-HCl 50 mM, pH 9) y se incubó con cada muestra de orina. Las muestras de orina desnaturalizadas se incubaron por lotes durante 1 hora a temperatura ambiente con 800 μL de resina Q HyperD® F. Se recogió la fracción no unida y la resina se lavó con 1 mL de Tris 50 mM, pH 9 en OGP al 0.1%. Las proteínas unidas se eluyeron sucesivamente con 1 mL de tampones de pH 7, 6, 5, 4, y 3 en OGP al 0,1% y por último con una solución de isopropanol al 33%/ ACN al 17%/ TFA al 0,1%. Se hizo el perfil de una alícuota de cada fracción sobre matrices de ProteinChip CMlO y/o QlO para ensayar para las proteínas de interés.

Fraccionamiento en fase reversa: Se equilibraron 100 μL de bolas de RPC Poly-Bio

(BioSepra) con ACN al 5% /TFA al 0.5%. Para la purificación e identificación de los marcadores de 2193 y 2793 Da, la reducción y alquilación fue antes que la cromatografía de fase reversa (ver la sección de reducción y alquilación más adelante). Para la cromatografía en fase reversa, se ajustó un volumen apropiado de cada muestra a una concentración final de ACN al 5% /TFA al 0.5% y se mezcló durante 1 hora con las bolas de RPC a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó y el sobrenadante se eliminó mediante aspiración. Las proteínas unidas se eluyeron sucesivamente con 400 μL de ACN al 20%, (al 25%), al 30%, (al 35%), al 40% y al 50% en TFA al 0,1% (ACN al 25% y al 35% se usaron sólo para la purificación de los péptidos de 2193 y 2793 Da). Se hizo el perfil de una alícuota de 2 μL de cada fracción en una matriz de ProteinChip NP20 para determinar el patrón de elución de los marcadores de interés. También se hizo el perfil de alícuotas de las fracciones seleccionadas en una matriz de ProteinChip CMlO.

Fraccionamiento mediante sistema proteominer: Para enriquecer el pico 4.6 kDa antes de su purificación, se utilizó como paso preliminar, el fraccionamiento mediante el sistema proteominer: Se equilibró 1 mi de resina Proteominer en PBS, se añadió 40 mi de orina y se incubó a 4o C toda la noche en rotación. La fracción no unida se recogió y la resina se transfirió a una columna para su elución. La fracción unida se eluyó sucesivamente en 1 mi de 1) 2.2 M tiourea, 7.7 M urea, 4.4% CHAPS, 2) 9 M urea, 25 mM ácido cítrico, pH 3.8 and 3) 33.3% alcohol isopropilo, 16.7% acetonitrilo, 0.5% ácido trifluoroacético. La columna se incubó 10 minutos a temperatura ambiente en rotación antes de recoger cada elución para asegurar la máxima eficacia.

Fraccionamiento IMAC-Cu: La resina IMAC HyperCel se cargó con 100 mM de sulfato de cobre y se equilibró en PBS, 0.5 M NaCl. Las muestras se diluyeron con PBS/0.5 M NaCl, y se incubaron con la resina a 4o C durante toda la noche en rotación. Para la purificación del pico 4.6 kDa, la fracción no unida del proteominer se diluyó 1 :3 en PBS/0.5 M NaCl y se incubó con 1.5 mi de resina cargada con cobre. Para la purificación de los picos 5.8 y 7.6/7.7 kDa, la orina fue diluida 1 :2 en PBS/0.5 M NaCl. Las muestras de pacientes se juntaron (25 mi) y se incubaron en 1.25 mi de resina IMAC-Cu y la muestra control (25 mi) se incubó con 2 mi de resina IMAC-Cu. La fracción no unida se recogió y las resinas se transfirieron a dos columnas, donde se realizó un lavado con PBS/0.5 M NaCl. Las proteínas unidas se eluyeron con 1.5 volúmenes de columna de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, y 200 mM imidazol en 50 mM Hepes, pH 7.0. Una alícuota de cada elución se diluyó 1 :10 y sus perfiles peptídicos se analizaron en chips CMlO y QlO. Las fracciones que contenían los picos 7.6/7.7 kDa (20 y 30 mM imidazol) se juntaron y se diluyeron 1 :2 en 50 mM Tris-HCl pH 9, y se incubaron con 0.25 mi de resina Q durante toda la noche a 4o C. La elución de las proteínas unidas se realizó tal y como se ha indicado en el apartado de fraccionamiento de intercambio aniónico.

Purificación en resina 18: La purificación del péptido 5.8 kDa incluye un paso de purificación mediante intercambio hidrofóbico en resina 18. Esta resina se equilibró en tampón de unión ((150 mM NaCl in 100 mM Acetato sódico pH 5) y se incubó durante toda la noche a 4o C. La orina de pacientes y la orina control se incubó con 100 ul y 200 ul de resina 18 respectivamente. La fracción no unida se recogió y las proteínas unidas a la resina se eluyeron sucesivamente con 1.5 volúmenes de los siguientes tampones: El) 4.5 M Urea, E2) 9 M urea, E3) 9 M urea, 0.6% hidróxido amónico, E4) 9 M urea, 1.2% hidróxido amónico, and E5) 9 M urea, 2.4% hidróxido amónico. Las fracciones provenientes de la elución con hidróxido amónico se neutralizaron con ácido acético 5 M. Una alícuota de cada fracción se diluyó 1 :10 y sus perfiles peptídicos se analizaron en chips CMlO.

Electroforesis en gel: Una vez que se estimó que la proteína de interés estaba lo suficientemente enriquecida y purificada, las fracciones se concentraron en un evaporador de centrifugación CentriVap (Labconco) y se redisolvieron en 20 μL del tampón de carga de gel apropiado antes de la electroforesis en gel. Se usaron geles de acrilamida al 18%/Tris SDS-PAGE (Bio-Rad). Se incluyeron estándares de proteína Precisión Plus y/o estándares preteñidos Kaleidoscope (Bio-Rad) en cada gel con el fin de determinar el tamaño de las bandas de proteína. Los geles de proteína se tiñeron usando el kit de tinción Colloidal Blue siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Extracción analítica: Las bandas de proteínas seleccionadas se cortaron del gel de poliacrilamida con una pipeta pasteur y se extrajeron para confirmar la m/z de la proteína y preparar la muestra para digestión. Los trozos de geles se lavaron dos veces con 200 μL de metanol al 50% /ácido acético al 10% durante 20 minutos, se deshidrataron con 100 μL de ACN durante 15 minutos, y se extrajeron con 70 μL de ácido fórmico al 50% /ACN al 25% /IPA al 15% incubando 2 horas a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Se hizo el perfil de una alícuota de 1-2 μL del extracto en una matriz de ProteinChip NP20.

Identificación de proteínas:

Identificación de los picos 8.85, 2.19 y 2.79 kDa: Los trozos de geles se lavaron dos veces con 200 μL de metanol al 50% /ácido acético al 10% durante 20 minutos, se deshidrataron con 100 μL de ACN durante 15 minutos, y se extrajeron con 70 μL de ácido fórmico al 50% /ACN al 25% /IPA al 15% incubando 2 horas a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Se hizo el perfil de una alícuota de 1-2 μL del extracto en una matriz de ProteinChip NP20.

El marcador de 8,85 kDa se redujo y alquiló después de la extracción del gel. El extracto analítico se secó en un concentrador de centrifugación CentriVap (Labconco), se enjuagó dos veces con hidróxido de amonio, y se secó. El precipitado se resuspendió después en 10 μL de DTT 2,5 mM, bicarbonato de amonio 50 mM pH 8 y se incubó a 600C durante 15 minutos. Se añadió entonces un exceso de yodoacetamida a la reacción y se incubó durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción de alquilación se extinguió con un exceso de DTT durante 15 minutos en la oscuridad. Antes de la digestión con tripsina, esta muestra se secó de nuevo en el CentriVap. Para el enriquecimiento de los marcadores de 2193 y 2793 Da, las muestras se redujeron y alquilaron antes de la purificación. Se añadió DTT a las muestras a una concentración de 5 mM y se incubaron durante 1 hora a 220C. Se añadió entonces un exceso de yodoacetamida a la reacción y se incubó durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción de alquilación se extinguió con un exceso de DTT durante 15 minutos en la oscuridad. La digestión en solución para los digeridos de tripsina, los extractos de geles secos alquilados se rehidrataron con 20 μL de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8) que contenía 5 ng/μL de tripsina modificada (Roche Applied Science) y se incubaron durante 3 horas a 370C. La identificación de las proteínas mediante fragmentación de péptidos usando un espectrómetro de masas en tándem. Los espectros MS individual y MS/MS se adquirieron en un espectrómetro de masas en tándem. Se mezclaron volúmenes iguales de digeridos de tripsina y CHCA saturado y se dirigieron a la diana de MALDI. Los digeridos también se unieron a μC18 Zip-Tips (Millipore), se eluyeron en ACN al 50%/TFA al 0,1%, se mezclaron con un volumen igual de y CHCA saturado y se dirigieron a la diana de MALDI. Se recogieron los espectros de 600 a 4000 Da en modo MS individual. Después de revisar los espectros, se seleccionaron iones específicos para análisis de MS/MS. Los espectros de MS/MS se enviaron a la herramienta de extracción de base de datos Mascot (Matrix Sciences) para su identificación.

Identificación de los picos 7.7, 7.6, 5.8 y 4.6 kDa: Las bandas correspondientes de los respectivos geles se recortaron y se les añadieron 100 μl de DTT 5 mM, y se incubaron durante 30 minutos a 37 0C. Seguidamente se retiró el DTT, se añadieron 100 μl de iodoacetamida y se incubaron otros 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La bandas de gel se lavaron dos veces con bicarbonato amónico pH8 50 mM y se secaron en un evaporador CentriVap, para su posterior digestión.

Las bandas cortadas se trataron para eliminar la tinción de Coomassie y el SDS, incubando sucesivamente con 400 μl de metanol 50% / ácido acético 10% (una hora para la primera incubación y 30 minutos para la segunda) y con 400 μl de acetonitrilo 50% / bicarbonato amónico pH8 100 mM durante 30 minutos, y con 100 μl de acetronitrilo durante 10 minutos. Las bandas de gel se secaron en un evaporador CentriVap. Para la digestión, las bandas secas se rehidrataron en 20 μl de bicarbonato de amonio pH8 50 mM con, 5 ng/μl de tripsina o 10 ng /μl de AspN. Algunas digestiones se unieron a Zip/Tips (Millipore), se lavaron dos veces con acetonitrilo 5% / trifluoroacético 0.1% y se eluyeron en acetonitrilo 50% / trifluoroacético 0.1%. La identificación se realizó mediante fragmentación peptídica en un espectrómetro de masas en tándem. Las muestras se aplicaron en el espectrómetro MALDI utilizando el siguiente método: se añadió 0.5 μl de CHCA saturada al 25% en la placa, seguidamente se aplicó 1-2 μl de muestra y otros 0.5 μl de CHCA saturada al 25%. Los espectros se recogieron en el modo reflectron de 500 a 6000 Da. Los iones específicos se seleccionaron para el análisis MS/MS. Los espectros de fragmentación se enviaron a la herramienta de extracción de base de datos Mascot (Matrix Sciences) para su identificación.

RESULTADOS

DIGE

Después del procesamiento de las muestras, se obtuvieron los geles DIGE de cinco controles sanos y cinco pacientes cirróticos (Fig. 1). Las manchas se detectaron y compararon usando el software DeCyder con el análisis estadístico prueba T independiente. En este análisis se encontraron dieciocho manchas diferenciales con un valor de P menor de 0,05 y un cociente medio mayor de 1,5. Diecisiete de estas proteínas disminuían en los pacientes cirróticos y sólo una de ellas aumentaba en los pacientes. Para identificar las proteínas diferenciales, se hizo un gel preparativo juntando varias muestras control, y las proteínas se tiñeron con la tinción Sypro Ruby

(Biorad). Las manchas se cogieron, se digirieron con tripsina y se analizaron mediante

ESI-MS/MS. No fue posible coger algunas de las proteínas diferenciales, debido a la baja sensibilidad del gel preparativo. Los perfiles peptídicos y las secuencias de cada mancha se analizaron con las máquinas de búsqueda tanto Phenix 2.3 como

ProteinLynx Global Server 2.3 en la base de datos Uniprot Global Server. Se identificaron dos proteínas:

El precursor de apolipoproteína D se produce en varios tejidos y se secreta al plasma, está implicado en la unión y transporte de bilina.

El precursor de gelsolina despolimerizante de plasma f es una proteína moduladora de actina secretada al plasma que se une a actina y fϊbronectina. Puede fomentar el ensamblaje de monómeros en filamentos así como separar filamentos ya formados.

Las muestras usadas en el estudio de 2D-DIGE se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos comerciales para estas dos proteínas, confirmando que los datos obtenidos en análisis por DIGE eran debidos a una caída en los niveles totales de proteína en los pacientes cirróticos (Fig. 2).

SELDI TOF Se realizaron dos estudios usando la técnica SELDI-TOF. El primero se realizó en Centro Nacional de Biotecnología (CNB) español, y el segundo en el Centro de Investigación de Biomarcadores en los laboratorios de Bio-Rad.

ESTUDIO DEL CNB En este estudio, se compararon 15 muestras de fϊbrosis hepática con 15 casos control en los chips CMlO (intercambio catiónico), e IMAC-Cu (afinidad a metal). El análisis de los espectros dio cinco péptidos significativamente diferentes (P <0,01). Uno de estos marcadores era el péptido de 8855 Da con un valor de P = 5,7 x 10"4 y un ROC de 0,74.

ESTUDIO DE BIORAD

El propósito de este estudio era obtener información adicional, aumentando tanto el número de muestras como los tipos de chips. El número de muestras se aumentó a 35 pacientes con cirrosis y 35 controles sanos. Además, se añadió un grupo de 10 pacientes con fϊbrosis baja (índice de Metavir Fl). El número de chips usados también aumentó a cuatro: CMlO (intercambio catiónico), IMAC30 (afinidad a metal), QlO (intercambio aniónico) y H5 (intercambio hidrofóbico).

El análisis de los datos produjo 61 picos que mostraron diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01) entre pacientes cirróticos y controles sanos. El grupo de fibrosis era demasiado pequeño para un análisis estadístico consistente, pero proporcionó alguna información sobre la especificidad de los marcadores, mostrando un comportamiento intermedio entre las muestras cirróticas y controles (Figs. 3, 5 y 6).

Este segundo estudio proporcionó la confirmación de cuatro marcadores detectados en el análisis del CNB. Uno de estos marcadores confirmados es el péptido de 8855 Da, detectado con un valor de P = l,lx 10" y un valor ROC = 0,74.

En conclusión, el análisis de péptidos realizado en los laboratorios de Bio-Rad proporciona, primero, confirmación de uno de los péptidos identificados en el estudio previo, y segundo, nuevos marcadores candidatos identificados por medio del chip QlO.

La prevalencia de los marcadores negativos encontrados en el estudio de DIGE fue confirmada ya que la mayoría de los marcadores candidatos (57 de 61) disminuían en pacientes con cirrosis.

Además, se aplicó otro modelo estadístico a los datos: el modelo lineal. En este caso, la prueba aplicada era el paquete LIMMA de Bioconductor. En este análisis, se encontraron dieciséis péptidos significativamente disminuidos en las muestras cirróticas (B>0).

Los péptidos que se consideraron significativamente diferentes en ambos estudios estadísticos univariantes se eligieron para realizar el análisis estadístico multivariante para mejorar el éxito de la clasificación de las muestras combinando marcadores individuales.

La Tabla 1 recoge aquellos péptidos identificados en los dos estudios estadísticos univariantes que mostraban niveles de expresión significativamente diferentes entre controles y pacientes cirróticos. La tabal indica la proteína que se ha asignado a cada péptido y los valores p y ROC obtenidos a la hora de discriminar entre pacientes controles y cirróticos. Tabla 1

Las muestras usadas en el estudio de SELDI se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos comerciales para la proteína SLURPl, confirmando que los datos obtenidos en análisis por SELDI eran debidos a una caída en los niveles totales de proteína en los pacientes cirróticos. La figura 4 muestra la disminución de los niveles de la proteína SLURPl en muestras de orina de pacientes cirróticos con respecto a los controles detectada mediante Western Blot.

Una herramienta útil para evaluar la capacidad diagnóstica de una prueba cuantitativa, es la denominada curva ROC. También nos servirá para comparar diferentes pruebas. Para obtener la curva ROC, se calcula la sensibilidad (proporción de verdaderos positivos) y especificidad (proporción de verdaderos negativos) para cada uno de los diferentes valores observados en nuestros datos y se representan en una gráfica, con la Sensibilidad en el eje de las Y, (1 -Especificidad) en el eje de las X. Por lo tanto, cuanto más desplazada esté la curva ROC hacia el vértice superior izquierdo, mejor es la capacidad discriminatoria de la prueba. Precisamente una forma de evaluar de manera global esa capacidad de discriminación consiste en calcular el área del polígono que queda debajo de la curva ROC, y se denomina área bajo la curva, sirviendo como índice de comparación entre pruebas diagnósticas, cuanto mayor es el área mejor es la capacidad diagnóstica.

El análisis estadístico multivariante de la combinación de los marcadores 4623 / 7655 / 7735 / 8853 / 2193 / 2793 / 5804 produjo un patrón para diferenciar individuos cirróticos de sanos, con un valor ROC de 0,91.

El análisis estadístico multivariante de la combinación de los marcadores 4623 / 7655 / / 8853 / 2193 / 2793 / 5804 produjo un patrón para diferenciar individuos cirróticos de sanos, con un valor ROC de 0,87.

El análisis estadístico multivariante de la combinación de los marcadores 4623 / 7655 / 7735 / 8853 / 2193 / 2793 / produjo un patrón para diferenciar individuos cirróticos de sanos, con un valor ROC de 0,90.

El análisis estadístico multivariante de la combinación de los marcadores 4623 / 7655 / 8853 / 2793 produjo un patrón para diferenciar individuos cirróticos de sanos, con un valor ROC de 0,87.

La hepcidina se traduce como un péptido de 84 aminoácidos y se procesa para obtener la hepcidina-25 (residuos C-terminales 60-84 del péptido) o la hepcidina-20 (residuos C-terminales 65-84). Se ha demostrado que la hepcidina está implicada en el mantenimiento de la homeostasis de hierro. Regula tanto la absorción intestinal de hierro como el almacenamiento de hierro en macrófagos y hepatocitos. La hepcidina aumenta en respuesta a niveles aumentados de hierro e inflamación, y disminuye en respuesta a hipoxia, anemia y estrés oxidativo. Además, la hepcidina también tiene una actividad antimicrobiana fuerte contra varios microorganismos.

Se ha encontrado que SLURP-I es un marcador de la diferenciación tardía de la piel y se ha mostrado que tiene actividad antitumoral. Está implicado en el mantenimiento de la integridad fisiológica y estructural de las capas de queratinocitos de la piel, defectos en SLURP-I son una causa del Mal de Meleda.

La proteína MASP2 es una serina proteasa que se une a la lectina de unión a la mañosa (MBL), produciendo la activación de la vía del complemento. La MBL es capaz de unirse con estructuras repetidas de azúcares presentes en una amplia variedad de bacterias y otros microorganismos promoviendo su eliminación. Stengaard et al. (New Eng. J. Med. 349: 554-560, 2003) han descrito que la deficiencia congénita en el gen que codifica MASP2 produce una mayor susceptibilidad a infecciones y a enfermedades inmunes.

Las defensinas funcionan como antibióticos naturales que se hallan en la superficie de la piel. Son activas contra bacterias, hongos y virus con envuelta. Las beta-Defensinas tienen de 36 a 42 aminoácidos. La beta-Defensina humana 1 (hBD-1) ó DEFBl se expresa constitutivamente a nivel del tracto génito urinario y respiratorio . Se trata de un péptido antimicrobiano implicado en la resistencia de las superficies epiteliales a la colonización microbiana. Estos péptidos interactúan con varios receptores de las CDi y linfocitos, con lo cual se activan los mecanismos de la inmunidad adaptativa.

La osteopontina (SPPl) es una glicoproteína multifuncional con efecto estimulante sobre los fibroblastos y la síntesis de matriz extracelular. La Osteopontina se encuentra en diversos tejidos y tiene diversas funciones como la biomineralización del tejido óseo y la reparación de tejidos, fibrosis y calcificaciones distróficas tras lesiones inmunológicas, también participa en el crecimiento tumoral, en el desarrollo de cáncer y metástasis. Participa también en la iniciación de la respuesta inmune en la activación temprana de linfocitos T y macró fagos.