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1. (WO2010075960) METHOD FOR PRODUCING RIBOFLAVIN
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Verfahren zur Herstellung von Riboflavin

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur biotechnologisch fermentativen Herstellung von Riboflavin (im folgenden auch als Vitamin B2 bezeichnet) sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens, besonders eine modifizierte mikrobielle Wirtszelle mit gesteigerter Riboflavinausbeute. Die Erfindung stellt somit neue Verfahren und Mittel zur Regulation der Expression von an der Riboflavinproduktion der Wirtszelle beteiligten Enzymaktivitäten bereit.

Riboflavin ist ein Vorläufermolekül Flavin Mononukleotid (FMN) und Flavin Adenin Dinukleotid (FAD). Dies sind essentielle Co-Faktoren für eine Vielzahl enzymatischer Redox-Reaktionen in biologischen Zellen und Organismen. Riboflavin ist somit ein wichtiger Zusatzstoff in der Lebens- und Futtermittelindustrie. In Mikroorganismen und Pflanzen wird Riboflavin in der Regel über sieben enzymatische Reaktionen aus Guanosintriphosphat (GTP) aus dem Purinmetabolismus und Ribulose-5-Phosphat aus dem Pentosephosphat- Weg synthetisiert. Jährlich werden ca. 4000 Tonnen Riboflavin biotechnologisch in verschiedenen Mikroorganismen produziert. Wichtigste Wirtsorganismen sind Bazillen, besonders Bacillus subtilis. Daneben werden auch andere Mikrobenzellen, eingeschlossen niedere Eukaryoten, eingesetzt. Beispiele sind die Organismen Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii und Candida famata. Bekannte biotechnologische Verfahren zur Riboflavinsynthese sind verbesserungswürdig, vor allem in Bezug auf die Ausbeute beziehungsweise Produktionsrate von Riboflavin. Es besteht daher der Bedarf, verbesserte Herstellverfahren und verbesserte Wirtszellen, besonders auf Basis des Mikroorganismus Bacillus subtilis bereitzustellen. Dabei geht es insbesondere um die Bereitstellung von Mitteln, die eine besonders einfache und wirkungsvolle Steuerung der Stoffwechselaktivitäten und insbesondere Enzymaktivitäten,

BESTATIGUNGSKOPIE die im Zusammenhang mit der Riboflavinsynthese stehen, in der Wirtszelle ermöglichen. Weiterhin geht es um die Bereitstellung von modifizierten Wirtzellen mit insbesondere im Vergleich zum Wildtyp gesteigerter Riboflavinsynthese.

Die Erfinder fanden überraschenderweise, dass der Transkriptionsfaktor CcpC positiven Einfluss auf die Riboflavinproduktionsrate hat. CcpC gehört zur Familie der LysR

Transkriptionsfaktoren und reguliert bekanntermassen Gene, die für Enzymaktivitäten des Tricarbonsäurezyklus (TCA) kodieren, vor allem citB und citZ. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Riboflavinausbeute unmittelbar abhängig von der Aktivität und/oder intrazellulären Konzentration des Transkriptionsfaktors CcpC ist. Eine reduzierte Aktivität von CcpC führt zu einer Steigerung der Ausbeute. Dieser Effekt war überraschend und aus dem Stand der Technik nicht vorhersehbar, da die bekanntermassen von CcpC regulierten Enzymaktivitäten im TCA in keinem direkten Zusammenhang mit den Stoffwechselwegen der Riboflavinsynthese stehen.

Weiter überraschend war, dass die Biomasseproduktion, das heisst insbesondere die Wachstumsrate der erfindungsgemäss modifizierten Zellen, insbesondere CcpC-depletierte Zellen, beispielsweise ccpC knock out-Transformanten von Bacillus subtilis, im Wesentlichen unverändert bleibt.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine modifizierte Riboflavin-produzierende Zelle oder Zelllinie, Prokaryoten- oder Eukaryotenzelle, insbesondere eine Mikrobenzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aktivität oder Konzentration des in der Zelle vorhandenen und/oder exprimierten Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC und/oder eines Homologs oder Orthologs davon modifiziert, insbesondere reduziert, ist. Durch diese Modifikation ist die Zelle bzw. Zelllinie zu einer gesteigerten Riboflavinproduktion befähigt. Insbesondere wird ein modifizierter Riboflavin-produzierender Mikroorganismus beansprucht, in dem die Expression und/oder die Aktivität des Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC reduziert ist, bevorzugt um mindestens 25%, im Vergleich zu einem nicht-modifizierten oder Wildtyp-Mikroorganismus.

Bevorzugt ist die oben-genannte Zelle bzw. Zelllinie so modifiziert, dass das für CcpC-kodierende Gen entweder gar nicht exprimiert wird (Suppression der Expression) oder zumindest eine reduzierte Expression (Unterexpression) aufweist, was zu einer fehlenden bzw. verminderten/reduzierten Aktivität des CcpC-Proteins in besagter Zelle/Zelllinie führt. Die Zelle/Zelllinie ist bevorzugt eine CcpC-depletierte Mutante oder Transformante, insbesondere eine knock out-Mutante von mindestens einem für CcpC kodierenden Gens und/oder einem Homolog und/oder Ortholog davon.

In diesem Zusammenhang wird unter "reduziert" sowohl eine verminderte und insbesondere fehlende Aktivität des CcpC-Proteins, beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon, in der Funktion als Transkriptionsfaktor, als auch eine verminderte und insbesondere fehlende Expression des ccpC-Gens beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon, die in Folge einer geringen Kopienzahl oder Konzentration des Genprodukts CcpC in der Zelle führt, verstanden, insbesondere eine CcpC-depletierte Zelle. Unter reduzierter Expression wird eine Verringerung um mindestens 25%, bevorzugt mindestens 50, 75, 80, 90, 95, 98, 100% bezogen auf die Expression des ccpC-Gens in einer nicht-modifizierten (CcpC- Wildtyp) Zelle/Zelllinie verstanden. Diese Reduktion bezieht sich sowohl auf die Aktivität des Gens als auch des entprechenden Genproduktes. In einer erfindungsgemässen oder erfindungsgemäss modifizierten Zelle ist also vor allem das ccpC-Gen und/oder sein Genprodukt unterdrückt, "ausgeschaltet" oder in seiner Funktion (Aktivität) beeinträchtigt, insbesondere im Vergleich zum CcpC-Wildtyp, wie er beispielsweise in Bazillen, bevorzugt im Organismus Bacillus subtilis, exprimiert wird.

Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren zur Messung der Gen- bzw. Proteinaktivität bekannt. Geeignete Verfahren sind z.B. ein Northern Blot oder der Einsatz von "gene-chip" -Verfahren zur Messung der Aktivität des ccpC-Gens sowie ein Western Blot mittels spezifischen Antikörpern gegen CcpC oder eines quantitativen "2-D SDS-PAGE-GeIs" zur Bestimmung der Proteinkonzentration in der Zelle. Die Aktivität eines Transkriptionsfaktors, insbesondere CcpC, kann auch indirekt über "gel-shift" Experimente bestimmt werden, bei denen die Menge an gebundenem CcpC an die entsprechenden Bindungsstellen der zu regulierenden Gene, wie z.B. citB oder citZ, gemessen wird. Durch Verringerung der Genexpression von ccpC wird auch die Menge an gebundenem CcpC sinken, was mittels quantitativer Messung des Signals auf dem Polyacrylamid-Gel analysiert werden kann. Diese und weitere Messmethoden sind dem Fachmann bekannt und können zur Bestimmung der Aktivität von CcpC im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Geeignete Zellen oder Zelllinien (zusammengefasst als Wirtszellen) zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind alle bekannten Riboflavin-produzierenden Zellen, in denen die Expression des ccpC-Gens bzw. Homologs oder Orthologs davon reduziert werden kann. Beispiele sind Prokaryoten- oder Eukaryotenzelle, bevorzugt Gram-negative oder Gram-positive Bakterien, insbesondere eine Mikrobenzelle wie z.B. Bacillus, Corynebacterium oder Pseudomonas. Bevorzugt sind Zellen der Gattung Bacillus, z.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus halodurans, Bacillus amyloliquifaciens oder Bacillus subtilis, wobei Bacillus subtilis besonders bevorzugt ist, wie z.B. B. subtilis 168.

Eine besonders bevorzugte Wirtszelle, die für die vorliegende Erfindung geeignet ist, ist B. subtilis RB50::[pRF69]n, die multiple Kopien (z.B. ca. 5 bis ca. 20 Kopien) des Plasmids pRF69 enthält, welches für ein modifiziertes Riboflavin (ήb) operon kodiert, wobei die Modifikation im Einsetzen eines starken Promoter Pspoi5 besteht, wodurch es zur Verstärkung der Transkription der Riboflavin-Gene kommt (siehe z.B. EP 405370 sowie Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-18, 1999 für die Konstruktion des Stamms und die Kultivierungsbedingungen zur Steigerung der Riboflavinsynthese). B. subtilis RB50 und das Plasmid pRF69 sind gemäss der Bestimmungen des Vertrages von Budapest bei "Agricultural Research Culture Collection" (NRRL), Peoria, IL, USA, Culture Collection Division unter der Nummer ("accession number") B 18502 beziehungsweise bei "American Type Culture Collection" (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA unter der Nummer ("accession number") ATCC 68338 hinterlegt.

In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die Modifikation im ccpC-Gen in einem Stamm der Gattung Bacillus vorgenommen, insbesondere Bacillus subtilis. Besonders bevorzugt ist dabei ein im Riboflavin-Operon deregulierter Bacillus- Stamm als Wirtszelle, insbesondere B. subtilis Stamm. Beispiele für ein dereguliertes Riboflavin-Operon sind bekannt und schliessen sogenannte "ribO" bzw. "ribC" Mutationen ein. Die Deregulation bewirkt eine verstärkte Genexpression der rib Gene. Insbesonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, insbesondere Bacillus subtilis, in dem das Gen, welches für den Transkriptionsregulator SpoOA kodiert, (über)exprimiert wird. So wird die vorliegende Erfindung in einer am meisten bevorzugte Ausführungsform in B. subtilis RB50 ausgeführt, der dahingehend mutiert ist, dass eine aktive Form des spoOA-Gen exprimiert wird.

Weitere, für die vorliegende Erfindung geeignete Mikroorganismen sind öffentlich verfügbar über beispielsweise die folgenden Hinterlegungsstellen: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124

Braunschweig, Deutschland, "NITE Biological Resource Center", 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan (früher bekannt als "Institute for Fermentation", Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome,Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japan) oder das "Bacillus Genetic Stock Center" (BGSC), The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210 USA.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schliessen die oben-genannten Mikroorganismen auch deren Synonyme und Basonyme ein mit den gleichen physiologischen Eigenschaften, die vom "International Code of Nomenclature of Prokaryotes" festgelegt werden. Die Nomenklatur der Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung ist diejenige, wie sie offiziell durch das " International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies" akzeptiert und offiziell publiziert wurde im "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology" (IJSEM) zum Zeitpunkt der Prioritätsanmeldung.

Die Erfindung betrifft mutierte und insbesondere nicht-funktionale Gene. Die Erfindung betrifft mutierte und insbesondere nicht-funktionale Transkripte daraus. Die Erfindung betrifft auch mutierte und insbesondere nicht-funktionale Polypeptide daraus. Solche mutierten Strukturen sind im Sinne der Erfindung besonders geeignet, um genetisch modifizierte Wirtszellen bereitzustellen, worin die Funktion des CcpC-Wildtyps oder eines Homologs oder Orthologs davon reduziert oder verhindert ist.

Wesentliches Element der erfindungsgemässen Lehre ist es deshalb, zur Steigerung der Riboflavinbiosynthese in einer Wirtszelle die effektive, das heisst wirksame Konzentration des ccpC-Gens, des CcpC-Transkripts beziehungsweise des translatierten Transkriptionsfaktors in der Zelle zu reduzieren. Die Verminderung der Aktivität und/oder der intrazellulären Konzentration von CcpC bzw. seiner Homologe oder Orthologe kann in an sich bekannter Weise erreicht werden. Der Fachmann kennt dazu einschlägige biotechnologische Verfahren und Mittel, um so genannte CcpC-depletierte oder ccpC knock out Mutanten oder Transformanten zu erhalten. Die Erfindung ist daher nicht auf die hierin näher beschriebenen bevorzugten Varianten und Ausführungen beschränkt.

Unter dem Begriff "Mutation" wird gemäss der Erfindung jegliche genetische Modifikation, das heisst insbesondere Abwandlung auf molekularer Ebene, eines Nukleinsäuremoleküls, verstanden, welches zu einem nicht-funktionalen "mutierten" Genprodukt führt. Besonders wird darunter ein Veränderung im Genom eines Mikroorganismus verstanden, welche mit der Synthese des Genprodukts, das heisst vorliegend mit der Synthese des Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC interferiert und/oder zur Expression eines "mutierten" oder modifizierten Polypeptids führt, welches eine veränderte "mutierte" Aminosäuresequenz aufweist und dessen Funktion im Vergleich zum CcpC-Wildtyp teilweise oder vollständig verloren gegangen ist. Eine erfindungsgemässe Mutation im Gen beziehungsweise im Genprodukt führt zu Veränderungen in mindestens einer Stufe der Expression ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Modifikation. Bevorzugt ist diese Mutation ausgewählt aus: Punktmutation, Deletion, Substitution, Insertion und Inversion mindestens eines Nukleotids innerhalb der Gensequenz. Die Massnahmen der genetischen Mutation sind aber nicht auf diese bevorzugten Ausführungen beschränkt. Der Fachmann kennt weitere Möglichkeiten, Mutationen in einem Gen zu platzieren. Ziel der erfindungsgemässen Mutationen ist die Suppression der Expression mindestens eines Gens kodierend für CcpC. Ein damit verbundenes Ziel ist die Expression eines modifizierten Transkriptionsfaktors, welcher gegenüber dem Wildtyp eine verminderte Aktivität, insbesondere regulatorische Aktivität in der Zelle aufweist.

Die "Mutation" betrifft nicht nur die unmittelbare Modifikation der codierenden Sequenz eines Gens, sondern auch die Modifikation anderer Strukturen oder Sequenzen, die mit der Expression in Zusammenhang stehen. Dazu zählen bevorzugt Strukturen des Operons des Gens, insbesondere regulierende Strukturen, bevorzugt ausgewählt aus Promotoren, Regulatoren, -Operatoren, Transkriptionsfaktorbindestellen, Terminatoren und Co-faktoren dazu, ohne ausschliesslich darauf beschränkt sein zu wollen.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird und unter "Funktion", besonders im Zusammenhang mit den Begriffen "funktionsrelevant", "funktionsanalog" und "funktionierend", die Transkriptionsfaktorfunktion des CcpC- Wildtyps, beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon zur Regulation der Expression von Operons oder Genen, die eine Operatorstruktur aufweist, woran der Transkriptionsfaktor bindet, verstanden. Die Funktion eines Proteins, insbesondere eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise CcpC, wird erfindungsgemäss auch als Aktivität ausgedrückt, wobei die Transkriptionsfaktorfunktion des CcpC-Wildtyps einer Transkriptionsfaktoraktivität von 100% entspricht. Eine Auswahl bekannter geeigneter Methoden zur Bestimmung der Aktivität sind oben beschrieben.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das ccpC-Gen repräsentiert, sowie dessen Homologe und Orthologe. Die Erfindung betrifft besonders dieses Gen wie es in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 dargestellt ist und wie es z.B. im Organismus Bacillus subtilis vorkommt. Die Erfindung betrifft auch dessen Genprodukt (CcpC-Protein), dargestellt beispielsweise mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2. Das Gen ccpC ist insbesondere Teil eines Operons in einem der oben-genannten geeigneten Wirtszellen, bevorzugt in Bacillus subtilis. Verfahren zum Auffinden von homologen/orthologen CcpC- Sequenzen sind dem Fachmann bekannt, so z.B. die Durchführung einer "BLAST"-Suche in einer geeigneten Datenbank wie z.B. EMBL,

Genbank, SwissProt, etc. Diese Sequenzen dienen als CcpC-Wildtyp, die dann gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, was in einem entsprechenden Wirtsorganismus zur Steigerung der Riboflavin-Biosynthese führt. Ein Mikroorganismus, der diese Wildtyp-Sequenz enthält, wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Wildtyp-Mikroorganismus bezeichnet.

Die Erfindung betrifft somit ein - bevorzugt isoliertes - mutiertes (modifiziertes) Nukleinsäuremolekül, das für einen "mutierten" Transkriptionsfaktor, der insbesondere von dem Typ CcpC oder seinem Homolog oder Ortholog abgeleitet ist, kodiert, wobei das nicht-mutierte (Wildtyp) Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekülen, welche die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 enthalten oder daraus bestehen; b) Nukleinsäuremolekülen, welche für ein Polyaminosäuremolekül (Protein) kodieren enthaltend oder bestehend aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2; c) Nukleinsäuremoleküle, welche eine Homologie zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäuremolekülen von mindestens 70% aufweisen; d) Nukleinsäurenmoleküle, welche unter stringenten Bedingungen zu einem der in a) oder b) genannten Nukleinsäurenmoleküle hybridisieren; und c) Fragmente und/oder Analoga der Nukleinsäuremoleküle gemäss a) oder b), welche für Proteine mit Funktion/ Aktivität eines Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC kodieren, wobei das mutierte Nukleinsäuremolekül mindestens eine genetische Mutation aufweist, welche zu einer reduzierten Aktivität des CcpC-Proteins führt im Vergleich zur Aktivität des CcpC- Wildtyps.

Wie oben beschrieben, ist in einer bevorzugten Ausführungsform das ccpC-Gen komplett ausgeschaltet (sogenannte knock-out Mutation).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Polyaminosäuremolekül (Protein oder Polypeptid), bevorzugt als isoliert vorliegendes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polyaminosäuremolekülen, welche mindestens die Aminosäuresequenz SEQ ID NO :2 enthalten oder daraus bestehen; b) Polyaminosäuremolekülen, welche durch ein vorstehend charakterisiertes Nukleinsäuremolekül kodiert werden; c) Polyaminosäuremolekülen, welche eine Homologie von mindestens 70% zu den unter a) oder b) genannten Molekülen aufweisen; und d) Fragmenten und/oder Analoga mindestens eines der Polyaminosäuremoleküle von a) oder b), welches die Funktion eines Transkriptionsfaktors des Typs CcpC aufweist, wobei das unter a) bis d) genannte Protein den Wildtyp-CcpC darstellt, der - wie oben beschrieben - modifiziert wird, was eine Reduktion der Aktivität als Transkriptionsfaktor zur Folge hat.

Die Erfindung betrifft auch solche Nukleinsäuremoleküle beziehungsweise Proteine, welche gegenüber den in den bevorzugten Sequenzen SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 2 weitgehende Sequenzübereinstimmmungen, das heisst insbesondere weitgehende "Homologie" aufweisen. Darunter wird erfindungsgemäss eine Homologie von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% und mindestens 98% Sequenzübereinstimmung verstanden. Bevorzugt betrifft die Sequenz Übereinstimmungen wie SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO:2 in gesamter Länge. In einer bevorzugten Variante betrifft die vorgenannte Sequenzübereinstimmung ausschliesslich die funktionsrelevanten Abschnitte der Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO:2. Beispiele für solche Abschnitte sind die DNA-Bindungsdomänen im ccpC-Gen. Der Fachmann kennt Programme, um diese Gen-Abschnitte zu identifizieren.

Bezüglich der "Homologie" von Nukleinsäuremolekülen zueinander wird beispielsweise hierin das Kriterium der Hybridisierung unter „stringenten Bedingungen" verstanden. Unter "stringenten Bedingungen" wird auf die bekannten technischen Zusammenhänge, wie sie beispielsweise in Maniatis et al., 1989: „Molecular cloning, a laboratory manual", 2. Auflage, CoId Spring Harbours Laboratory, N. Y. beschrieben sind, verwiesen.

"Stringente Bedingungen" sind abhängig von der konkreten Sequenz. In der Regel wird darunter eine Hybridisierungstemperatur verstanden, welche 5 bis 10 K geringer ist als der Schmelzpunkt einer spezifischen Sequenz, bei dem 50% sequenzidentischer komplementärer Sonden an die Zielsequenz hybridisieren. Bevorzugt sind Bedingungen, bei denen Nukleinsäuresequenzen von mindestens 50%, 60, 70% oder besonders bevorzugt von mindestens 80%, am bevorzugsten von mindestens 85% bis 90%, insbesondere von mindestens 95% zueinander homolog sind.

In einer exemplarischen Ausführungsform einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen wird die Reaktion in 6x Natriumchlorid/Natriumzitrat (SSC) bei ca. 45°C durchgeführt mit anschliessendem Waschen in Ix SSC, 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt 55°C, besonders bevorzugt 60°C, insbesondere bevorzugt bei 65°C.

Bevorzugt ist eine Hybridisierung unter "hochstringenten Bedingungen", wie z.B. eine Inkubation bei 42°C für mehrere Tage, so z.B. 2 bis 4 Tage, unter Verwendung einer markierten Sonde, wie z.B. einer mit Digoxygenin (DIG) markierten Sonde, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 2x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und mindestens 1 Waschschritt in 0,5x SSC, 0,1% SDS oder in 0,1 x SSC, 0,1% SDS bei 65 bis 68°C. Insbesondere umfassen "hochstringente Bedingungen" z.B. eine Inkubation für 2 Stunden bis 4 Tage bei 42°C unter Verwendung einer DIG-markierten Sonde (hergestellt z.B. mittels dem "DIG labeling system", Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Deutschland) in einer Lösung wie z.B. "DigEasyHyb Solution" (Roche Diagnostics GmbH) und der optionalen Zugabe von 100 μg/ml Lachsspermium Nukleinsäure, oder in einer Lösung enthaltend 50% Formamid, 5x SSC, 0,02% SDS, 0,1% N-Laurylsarcosin und 2% "blocking reagent" (Roche Diagnostics GmbH), gefolgt von zweimaligem Waschen für 5 bis 15 Minuten in 2x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und zweimaligem Waschen für 15 bis 30 Minuten in 0,5x SSC, 0,1% SDS oder in 0,Ix SSC, 0,1% SDS bei 65 bis 68°C.

Die Begriffe "Homologie" oder "Prozent Identität" werden in der vorliegenden Anmeldung austauschbar verwendet. Um zu bestimmen, mit wieviel Prozent zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zueinander "homolog" oder "identisch" sind, werden beide Sequenzen zum optimalen Vergleich angeglichen (so werden in eine Sequenz z.B. Lücken eingeführt zum optimalen Ausrichten beider Sequenzen). Die Nukleotide an korrespondierenden Positionen werden dann verglichen. Sobald eine Position in der ersten Nukleinsäuresequenz mit demselben Nukleotid besetzt ist an der entsprechenden Position in der zweiten Sequenz, sind beide Moleküle identisch an dieser Position, was einer Homologie bzw. einer Identität von 100% entspricht. Der prozentuale Wert der Identität (Prozent Identität) zwischen zwei Sequenzen kann als Funktion einer Vielzahl von identischen Positionen, die beide Sequenzen gemeinsam haben, dargestellt werden [d.h. % Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen (d.h. überlappende Positionen) x 100]. Die zu vergleichenden Sequenzen haben bevorzugt dieselbe Länge. Zur Bestimmung der Homologie stehen dem Fachmann verschiedene bekannte Computerprogramme zur Verfügung, so z.B. das Programm "GAP" als Bestandteil des GCG Software Pakets (verfügbar unter http://accelrys.com/) welches nach dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 444-453, 1970) arbeitet. Unter dem Begriff "Orthologe" sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Gene verschiedener Gattungen zu verstehen, die alle ausgehend von einem gemeinsamen Ursprungsgen entstanden sind. Normalerweise bleibt die Funktion dieser orthologen Gene während der Evolution erhalten. Die Identifizierung von Orthologen ist wichtig, um eine verlässliche Vorhersage der Genfunktion in bisher nicht-sequenzierten Genomen vornehmen zu können.

Im Gegensatz dazu werden als "Analoge" im Sinne dieser Erfindung Gene bezeichnet, die zwar von einem gemeinsamen Gen abstammen, aber im Laufe der Evolution eine andere Funktion bekommen haben.

In einer bevorzugten Ausführung sieht die Erfindung zur Beeinflussung, insbesondere zur Reduktion der Aktivität, vor, die Bindungsaffinität des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise seines Homologs oder Orthologs, und/oder dessen Interaktion mit einem Operon des regulierten Gens, insbesondere der Transkriptionsfaktorbindestruktur, und/oder eines Co-Faktors davon zu beeinflussen, insbesondere zu reduzieren, so dass modifizierte oder "mutierte" von CcpC, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, abgeleitete Genprodukte, das heisst Proteine, mit verminderter oder ohne

Bindungsaktivität und/oder Interaktion mit den Operatorstrukturen, die in Verbindung mit dem regulierten Gen oder Operon stehen, erhalten werden.

In einer bevorzugten Variante erfolgt dies durch unmittelbare genetische Modifikation des ursprünglichen ccpC-Gens (Wildtyp) bzw. seiner Homologe oder Orthologe, so dass ein Genprodukt mit veränderter "mutierter" Aminosäuresequenz und damit vor allem veränderter Proteinstruktur erhalten wird.

In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante erfolgt dies durch Beeinflussung mindestens eines Vorgangs, ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Prozessierung, bevorzugt vor allem von mindestens einer mit diesen Vorgängen verbundenen molekularen Struktur oder eines Co-Faktors dazu. Dies erfolgt insbesondere durch Verwendung mindestens einer Struktur oder eines Konstrukts, die oder das an mindestens eine an diesen Vorgängen beteiligte Struktur oder Sequenz bindet und/oder inaktiviert. Diese Struktur oder das Konstrukt ist bevorzugt ausgewählt aus antisense-Konstrukten und Antiköφern, ohne ausschließlich darauf beschränkt sein zu.

Bevorzugt wird unmittelbar die Aktivität und/oder Konzentration des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, mittels spezifischer Inhibitoren reduziert. Beispiele solcher spezifischer Inhibitoren sind

Antisense-Konstrukte des CcpC-Gens, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, oder eines anderen erfindungsgemässen damit strukturverwandten Nukleinsäuremoleküls welche transient oder stabil in die Wirtszelle in an sich bekannter Weise eingebracht werden und dort exprimiert werden. In einer anderen bevorzugten Ausführung sieht die Erfindung zur Beeinflussung, insbesondere zur Reduktion der Konzentration/ Aktivität, das heisst vor allem der Kopienanzahl, des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise seines Homologs oder Orthologs, vor, dessen Expression und/oder gegebenenfalls die Expression eines Co-Faktors davon zu beeinflussen und insbesondere zu reduzieren oder vollständig zu unterdrücken. In einer bevorzugten Variante erfolgt dies durch unmittelbare genetische Modifikation des Operons des ccpC-Gens bzw. seiner Homologe oder Orthologe. In einer bevorzugten Variante ist dazu die Modifikation des die Expression des Gens steuernden Promotors vorgesehen, und zwar bevorzugt so, dass eine Unterexpression erfolgt oder die Expression bevorzugt vollständig ausbleibt, das heisst "abgeschaltet" ist. In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante erfolgt dies durch Beeinflussung mindestens eines Vorgangs, ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Prozessierung, bevorzugt vor allem von mindestens einer mit diesen Vorgängen verbundenen molekularen Struktur oder eines Co-Faktors dazu. Dazu zählen vor allem knock out-Mutationen, die beispielsweise mittels homologer Rekombination erhalten werden können, sowie der Einsatz von antisense-Konstrukten in an sich bekannter Weise.

Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren bzw. antisense-Konstrukte können nach allgemein bekannten Methoden in die Wirtszelle eingeschleust werden. Bevorzugte Verfahren sind die Desintegration der Zellwand und/oder -membran der Wirtszelle bevorzugt durch Elektroporation, Detergenzien oder analoge Mittel sowie alternativ oder bevorzugt zusätzlich durch ballistische Verfahren (z.B. "gene gun") oder analoge Verfahren, ohne dass die Erfindung auf diese Verfahren und Mittel beschränkt wäre.

Ein Aspekt der Erfindung ist somit ein extern und insbesondere synthetisch hergestelltes DNA- oder RNA-Molekül mit erfindungsgemässer Nukleotidsequenz in antisense-Orientierung, das in die Wirtszelle einschleusbar ist. Dies umfasst insbesondere Vektoren, die eine oder mehrere Kopien dieses Nukleinsäuremoleküls in antisense-Orientierung enthalten.

Demgemäss ist ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung eine modifizierte mikrobielle Zelle, welche modifiziert ist zur Suppression der Expression von CcpC, beziehungsweise seiner Homologe oder Orthologe. In einer Variante ist die Zelle modifiziert zur Unterexpression von CcpC, beziehungsweise seiner Homologe oder Orthologe. In einer bevorzugten Ausführung ist die Zelle eine knock out-Mutante von mindestens einem Gen, welches für CcpC kodiert. Die Erfindung umfasst also auch modifizierte Zellen, die knock out Mutanten von Homologen des CcpC kodierenden Gens von Bacillus subtilis sind. Die Erfindung umfasst also auch knock out Mutanten von Orthologen des CcpC kodierenden Gens von Bacillus subtilis. Die Erfindung umfasst auch knock out Mutanten anderer Funktionsanaloga von CcpC und deren Gen(e).

In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante der genetischen Modifikation der Wirtszelle findet die genetische Modifikation an mindestens einer und bevorzugt mehreren Bindungsstrukturen sowie Fragmenten davon des CcpC Transkriptionsfaktors statt. Dies sind bevorzugt die Operatorstrukturen der durch CcpC regulierten Gene in der Wirtszelle. Regulierte Gene sind vor allem citB und citZ, ohne dass die Erfindung auf diese beschränkt sein soll. Durch die mindestens eine erfindungsgemäss bevorzugt vorgesehene Mutation nahe des Operator-Abschnitts des durch CcpC regulierten Gens soll erfindungsgemäss die Bindung des Transkriptionsfaktors an den Operator verhindert oder vermindert werden, so dass der regulierende Effekt bezüglich der Transkription des Gens nicht oder vermindert eintritt. Verfahren zur Modifikation der Operator-Abschnitte der durch Transkriptionsfaktoren regulierten Gene und insbesondere deren Bindesequenzen für Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt. Bindungssequenzen der regulierten Gene citB und citZ sowie im ccpC-Gen selbst sind beispielsweise publiziert/referenziert in der "database of transcriptional regulation in Bacillus subtilis" (DBTBS; siehe http://dbtbs.hgc.jpΛ. Beispiele bekannter Bindungssequenzen in regulatorischen Sequenzen des ccpC-Gens selbst sind an Position -10 bis +15 (SEQ ID NO:3), insbesondere Position -5 bis +10 (SEQ ID NO:8), relativ zum Startcodon lokalisiert. Bekannte Bindungssequenzen von citB sind an Position -75 bis -52 (SEQ ID NO :4), insbesondere Position -73 bis -68 (SEQ ID NO:9) oder Position -64 bis -60 (SEQ ID NO:10), sowie an Position -35 bis -22 (SEQ ID NO:5) oder Position -35 bis -17 (SEQ ID NO: 11), insbesondere Position -27 bis -22 (SEQ ID NO: 12), relativ zum Startcodon lokalisiert, bekannte Bindungssequenzen von citZ sind an Position -11 bis +5 (SEQ ID NO:6), insbesondere Position -11 bis -8 (SEQ ID NO: 13), sowie an Position +21 bis +44 (SEQ ID NO:7), insbesondere Position +23 bis +26 (SEQ ID NO: 14) oder Position +34 bis +37 (SEQ ID NO: 15), relativ zum Startcodon lokalisiert. Die oben-genannten bekannten Bindungssequenzen und die dazugehörigen Operons sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Tabelle 1 : Liste bekannter Gene sowie deren Operons, die von CcpC reguliert werden. Die "absolute Position" wurde kalkuliert aufgrund der Position im "NCBI sequence file (accession no. NC 000964)". Die exakte Bindungssequenz (cis-Element) ist unterstrichen. Quelle: http://dbtbs.hgc.jp/.


Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine modifizierte Wirtszelle, die eine

Modifikation/Mutation im ccpC-Gen enthält, die zu einer reduzierten Expression des Gens führt (s. oben). Die Wirtszelle kann in einer weiteren Ausführungsform aber auch dahingehend modifiziert sein, dass sie eine Modifikation/Mutation in einer Bindungssequenz für das ccpC-Genprodukt enthält, bevorzugt in einer der oben beschriebenen Bindungssequenzen gemäss SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15, wodurch die Bindung von CcpC reduziert ist. Diese reduzierte Bindung ist als reduzierte Aktivität von CcpC, wie oben beschrieben, zu verstehen, wobei eine reduzierte Aktivität von mindestens 25% im Vergleich zur Aktivität des Wildtyp bevorzugt ist, was einer reduzierten Bindung um mindestens 25% entspricht. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Transkripten davon und den daraus synthetisierbaren Proteine sowie deren antisense-Konstrukte zur Regulation, insbesondere zur Steigerung der Riboflavinsynthese in Wirtszellen im Sinne der hierin beschriebenen Lehre. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt zur Einführung von Mutationen und anschliessender Messung der Bindungsaktivität, wie z.B. die Durchführung eines "gel-shift" Experiments oder eines "footprint" Experiments (s. z.B. Maniatis et al., 1989: „Molecular cloning, a laboratory manual", 2. Auflage, CoId Spring Harbours Laboratory, N.Y.).

Die Erfindung betrifft auch an die vorgenannten Moleküle und Strukturen bindende Moleküle. Solche Moleküle sind gemäss der Erfindung geeignet, die Funktion oder Aktivität von CcpC, beziehungsweise der Homologe oder Orthologe zu modifizieren, insbesondere zu unterdrücken. Bevorzugt binden solche Moleküle an mindestens eine der durch die Nukleotidsequenzen, ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, und SEQ ID NO: 15 definierbaren Strukturen oder Moleküle, insbesondere Operatorstrukturen. Bevorzugt sind die bindenden Moleküle spezifische Antikörper gegen die so definierbaren Strukturen.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein, monoklonaler oder polyklonaler, Antikörper, der spezifisch an eine gemäss der oben-genannten Polyaminosäuresequenzen oder Moleküle binden kann. Durch Bindung des Antikörpers an CcpC wird eine Bindung des Transkriptionsfaktors an die Operatorsequenzen in den zu regulierenden Genen, wie z.B. citB oder citZ, verhindert.

Die oben-beschriebenen modifizierten Nukleinsäuremoleküle und modifizierten Wirtszellen werden zur Steigerung der Riboflavinsynthese verwendet. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur biotechnologischen Synthese von Riboflavin, welches insbesondere die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer modifizierten Wirtszelle gemäss der vorliegenden Erfindung, b) Kultivieren der modifizierten Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen, welche die Synthese von Riboflavin in der Wirtszelle ermöglichen, und optional c) Isolieren des Riboflavins aus der modifizierten Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium.

Ein besonderer Aspekt der Erfindung ist die fermentative Herstellung von Riboflavin mittels der oben-genannten modifizierten Wirtszellen. Gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Riboflavin" sowohl Riboflavin, als auch Flavin Mononukleotid (FMN) und Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) sowie deren Vorläufermoleküle ("Precursor"), Derivate und/oder Salze von Riboflavin, FMN oder FAD. Beispiele von Salzen sind insbesondere Riboflavin-5 -Phosphat und Natrium Riboflavin-5-Phosphat. Vorläufermoleküle und Derivate von Riboflavin, FMN oder FAD umfassen beispielsweise DRAPP, 5-Amino-6-Ribosylamino-2,4 (lH,3H)-Pyrimidinedione-5'-Phosphat, 2,5-Diamino-6-Ribitylamino-4 (3H)-Pyrimidinone-5'-Phosphat, 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4 (lH,3H)-Pyrimidinedione-5'-Phosphate, 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4 (1H,3H)-Pyrimidinedione, 6,7-Dimethyl-8-Ribityllumazine (DMRL) und Flavoproteine. Allgemeine Verfahren zur fermentativen Synthese von Riboflavin sowie die an der Riboflavin-Biosynthese beteiligten Gene, insbesondere die fermentative Synthese in Bacillus, sind bekannt (siehe z.B. EP 405370 oder "Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 7th Edition, 2007, Chapter Vitamins). Diese Verfahren können auch auf die Riboflavinsynthese mittels der hierin beschriebenen modifizierten Wirtszellen angewendet werden.

Verschiedene Substrate können als Kohlenstoffquelle in dem erfindungsgemässen Verfahren zur Riboflavinsynthese eingesetzt werden. Besonders geeignete

Kohlenstoff quellen können ausgewählt werden aus Verbindungen mit 3, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, so z.B. D-Glucose, Glyzerin, "thick juice", Dextrose, Stärke, Saccharose oder Ribose. Vorzugsweise ist die Kohlenstoffquelle D-Glucose. Die Begriffe "Kohlenstoffquelle", "Substrat" und "Produktionssubstrat" in Zusammenhang mit dem hierin beschriebenen Verfahren werden untereinander auswechselbar verwendet.

Als (Kultur)Medium für das erfindungsgemässe Verfahren zur Riboflavinsynthese mittels modifizierter Wirtszellen können alle für die Riboflavinsynthese geeigneten Medien verwendet werden. Typischerweise handelt es sich um ein wässriges Medium, das z.B. Salze, Substrat(e) enthält und einen spezifischen pH besitzt. Das Medium, in dem das Substrat in Ribofiavin umgewandelt wird, wird auch als Produktionsmedium bezeichnet.

"Fermentation" oder "Produktion" oder "Fermentationsprozess" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sowohl die Verwendung von wachsenden Zellen in einem Medium unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, als auch die Verwendung von nicht mehr wachsenden Zellen (sogenannte "resting cells"), nachdem diese in dem entsprechenden Medium unter dem Fachmann bekannten Bedingungen gewachsen sind. Diese wachsenden oder nicht mehr wachsenden Zellen werden für die Umwandlung eines geeigneten Substrats in Ribofiavin verwendet, unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind.

Das synthetisierte Ribofiavin kann aus den Wirtszellen durch geeignete Methoden gewonnen/isoliert werden. Dies kann z.B. die Abtrennung des Riboflavins vom

Produktionsmedium bedeuten. Optional kann das gewonnene Ribofiavin anschliessend weiterverarbeitet werden, so z.B. gereinigt werden.

In Zusammenhang mit dem oben-genannten Verfahren zur Herstellung von Ribofiavin mittels modifizierter Wirtszellen erfolgt die Wachstumsphase der Mikroorganismen in einem wässrigen Medium unter Zusatz von entsprechenden Nährstoffen normalerweise unter aeroben Bedingungen. Die Kultivierung kann beispielsweise in einem Batch, Fed-Batch, halbkontinuierlich oder in einem kontinuierlichen Verfahren erfolgen, wobei Fed-Batch oder halbkontinuierlich bevorzugt ist.

Die Dauer der Kultivierung beträgt in Abhängigkeit der Wirtszellen, des pH, der Temperatur und des Nährmediums beispielsweise ca. 10 Stunden bis ca. 10 Tage, bevorzugt ca. 4 bis ca. 7 Tage, besonders bevorzugt ca. 2 bis ca. 6 Tage. Der Fachmann kennt die für die gewählte Wirtszelle optimalen Bedingungen.

Das Kultivieren wird beispielsweise bei einem pH von ca. 7,0 durchgeführt, bevorzugt zwischen ca. 6 bis ca. 8, besonders bevorzugt zwischen ca. 6,5 bis 7,5 und einer geeigneten Temperatur von ca. 13°C bis ca. 70°C, bevorzugt von ca. 35°C bis ca. 39°C, besonders bevorzugt von ca. 30°C bis ca. 39°C, insbesondere von ca. 36°C bis ca. 39°C. Das Kulturmedium enthält normalerweise D-Glucose, Glyzerin, "thick juice", Dextrose, Stärke, Saccharose oder Ribose als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, wie z.B. Pepton, Hefeextrakt oder Aminosäuren. Zusätzlich können Salze vorhanden sein, so z.B. Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kalziumphosphat oder Kalziumkarbonat. Ein Beispiel für eine fermentative Herstellung von Riboflavin mittels Zellen von Bacillus subtilis ist in WO 04/113510 (VF-medium) beschrieben, die hierin als Referenz inkorporiert ist. Diese Methode ist für die vorliegende Erfindung bevorzugt zu verwenden.

Durch die Modifikation in der Aktivität des Transkriptionsfaktors CcpC, wie oben beschrieben, ist die (modifizierte) Wirtszelle zu einer gesteigerten Riboflavinsynthese fähig. Die Riboflavinausbeute einer erfindungsgemässen Wirtszelle, insbesondere vom Stamm Bacillus subtilis, kann um mindestens 10% gesteigert werden, verglichen mit der Ausbeute an Riboflavin einer nicht-modifizierten oder Wildtypzelle. Bevorzugt sind Steigerungen um mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 80% und mehr. Analysemethoden zur Bestimmung der Ausbeute/Produktivität von Riboflavin sind bekannt. Beispiele sind HPLC oder die Verwendung von Indikatorstämmen (siehe z.B. Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999). Nach erfolgter Fermentation wird das produzierte Riboflavin von den übrigen Bestandteilen (Kulturmedium, Biomasse, etc.) abgetrennt, aufgereinigt und die Konzentration nach den bekannten Verfahren bestimmt, wobei eine Kontrollreaktion mit einem Wildtyp-Stamm durchgeführt wird. Begriffe wie "Produktion" oder "Herstellung" sowie "Produktivität" sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Konzentration an Riboflavin, welche in einer vorgegebenen Zeit . und einem vorgegebenen Fermentationsvolumen (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter) gebildet wird. Der Begriff "Ausbeute" ist dem Fachmann bekannt und umfasst die Effektivität der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt, d.h. Riboflavin. Die Ausbeute wird im allgemeinen ausgedrückt als kg Produkt per kg Kohlenstoff quelle. Eine "Erhöhung der Ausbeute und/oder der Produktivität" heisst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der Menge an gewonnenen Molekülen in einem vorgegebenen Kulturvolumen in einer vorgegebenen Zeitspanne.

Beispiele Alle nicht aufgeführten, benutzten Medien sind in WO2007/051552 beschrieben.

100X Spurenelementlösung A: 12,5 g MgCl2-OH2O; 0,55 g CaCl2; 1,35 g FeCl2-OH2O; 0,1 g MnCl2-4H2O; 0,17 g/l ZnCl2; 0,043 g CuCl2-2H2O; 0,06 g CoCl2-OH2O; 0,06 g Na2MoO4-2H2O; ad 1 1 H2O, autoklaviert.

5X Minimal Salz Lösung: 0,057 M K2SO4; 0,31 M K2HPO4 SH2O; 0,22 M KH2PO4; 0,017 M Na-citrat-7H2O; 0,004 M MgSO4 H2O, pH 7.0, autoklaviert.

100X Spurenelementlösung B: 0,55g CaCl2; 0,17g ZnCl2; 0,043g CuCl2-2H2O; 0,06 CoCl2-OH2O; 0,06g Na2MoO4-2H2O; ad 1 1 H2O, autoklaviert.

Riboflavin Screening Medium (RSM): 200 ml 1OX Spizizen Salze; 10 ml 100X Spurenelement Lösung A; 2 ml 50% Glucose; 36 ml 25% Raffinose; 10 ml 10% Hefeextrakt; ad 1 1 H2O.

Spizizen Minimalmedium (SMM): 100 ml 1OX Spizizen Salze; 10 ml 50% Glucose; 1 ml 40% Natriumglutamat; 10 ml Spurenelementlösung A; ad 1 1 H2O.

Riboflavin Produktion in Schüttelkolben wurden folgendermassen getestet: 5 ml VY Medium wurden ausgehend von einem gefrorenen Glyzerinstock inokuliert und 6 - 8 h bei 37 C unter Schütteln (280 Upm) kultiviert. Die 5 ml Kulturen wurden direkt zur

Inokulation von 25 ml RSM Medium in 250 ml Kolben verwendet. Nach 48 h Inkubation bei 39 C unter Schütteln (220 Upm) wurden 500 μl Kulturflüssigkeit mit 35 ml 4 N NaOH versetzt und für eine Minute stark geschüttelt. Die Proben wurden mit 465 ml Kaliumphosphat Puffer (pH 6,8) versetzt und für 5 min bei 13200 Upm zentrifugiert. Der Riboflavin-, 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DMRL) und Oxolumazinegehalts wurde mittels HPLC bestimmt. Eine zweite Kulturprobe wurde zentrifugiert (5 min, 13200 Upm) und der Überstand wurde für die Bestimmung von verbleibender Glucose und Raffinose verwendet. Die Ermittlung der Werte erlaubte die Errechung des Ausbeute.

Schüttelkulturproben wurden mittels HPLC analysiert. Die Chromatographie wurde auf einem Agilent 1100 HPLC System, das mit einem temperierten Autosampier, einem Dioden-Array- und einem Fluoreszenzdetektor ausgestattet war, durchgeführt. Die Trennung erfolgte auf einer Supelcosil LC-8DB 5μ Säule (150 mm x 4,6 mm), die mit einer 4 mm LC-8DB Guard-Säule ausgestattet war. Ein Gemisch von 0,1 M Essigsäure und Methanol wurde als mobile Phase benutzt. Die Elution wurde mittels Gradienten ausgeführt. Nach 5 min bei einer Konzentration von 2% Methanol wurde die

Methanolkonzentration in 15 min auf 50% erhöht. Die Säule war auf 20 C temperiert. Ein UV-Signal bei 280 nm wurde zur Detektion verwendet. Riboflavin wurde als isolierter Peak nach 15,2 min detektiert. Die Kalibrierung der Methode wurde mit Riboflavin von Fluka ausgeführt und war von 10 mg/1 bis 1 g/l linear. Für die Bestimmung von Glucose und Raffinose aus der Kulturbrühe wurde ebenfalls ein Agilent 1100 HPLC System, an das eine quarternäre Pumpe, ein Autosampier, und Refraktionsindex Detektor angeschlossen war, verwendet. Die Trennung wurde auf einer CAPCELL PAK NH2 UG80 Säule (4.6 mm x 250 mm, 5μ) von Shiseido erreicht. Die optimale Säulentemperatur war 35 C. Die mobile Phase war ein Gemisch aus Acetonitril und deionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 65/35. Die Durchflussgeschwindigkeit war auf 1 ml/min eingestellt. Das Injektionsvolumen betrug 5 μl. Das Brechungsindexdetektorsignal wurde zur Detektion verwendet. Die Methode konnte für Konzentrationen von 0.5 g/l bis 30 g/l eingesetzt werden.

Beispiel 1: Simulation der Riboflavinausbeute bei Aktivitätsänderung von CcpC

Um die Stoffflussverteilung bei der Riboflavinsynthese in einer Wirtszelle bei einer erfindungsgemässen Aktivitätsänderung, insbesondere Verringerung der Aktivität, des Transkriptionsfaktors CcpC vorherzusagen, wird in einem ersten Schritt mit der "Network Component Analysis" (NCA) und Genexpressionszeitreihen Aktivitätsänderungen von CcpC identifiziert und deren Einfluss auf die durch CcpC regulierten Gene quantifiziert. Zur Vorhersage des Einflusses der Transkriptionsfaktoraktivität werden regulierte Flüsse der Ausgangsflussverteilung ausgelenkt und anschliessend über eine quadratische konvexe Optimierung eine neue Stoffflussverteilung berechnet. Die Simulation wurde am Beispiel des riboflavinproduzierenden Bacillus subtilis Stamm bei aerobem Wachstum auf Glucose durchgeführt.

Eine Mutante mit einer Aktivität von CcpC kleiner als 1 (AF < 1, z.B. knockout Mutante), zeigt eine deutlich erhöhte Riboflavinausbeute gegenüber dem Wildtyp (AF = 1), und zwar eine Ausbeute von 0,05 im Vergleich zu 0.02 (g Riboflavin per g Glucose).

Beispiel 2: Erzeugung eines CcpC-defizienten Stammes

Zur Herstellung einer knockout Mutante für den Transkriptionsfaktor CcpC in der Wirtszelle Bacillus subtilis wurde eine Antibiotikaresistenz-Genkassette an den ursprünglichen ccpC-Lokus des Genoms von B. subtilis eingeführt. Zwei DNA-Fragmente, welche mittels PCR von der genomischen DNA von B. subtilis 168 amplifiziert wurden, wurden mit einer Neomycinresistenz-Genkassette in einer dritten PCR kombiniert. (Itaya et al., 1989, A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy State in the Bacillus subtilis chromosome, Nucleic Acids Res. 17: 4410). Zur Herstellung der beiden Fragmente, die homolog zum 5' und zum 3' Bereichs des Gens ccpC waren, wurden folgende PCRs ausgeführt: 5 '-Homologiefragment, 100 ng genomische DNA von B. subtilis 168, 1 μl einer 100 μM Lösung von Primer p436 (SEQ ID NO: 16), 1 μl einer 100 μM Lösung von Primer p439 (SEQ ID NO: 17), 1 μl einer 10 mM dNTP Lösung, 5 μl 10x Puffer, und 0.5 μl Pfu Polymerase (Stratagene) in 50 μl. Die PCR Reaktion bestand aus 35 Zyklen: (i) Denaturierung bei 94°C für 30 sec; (ii) Annealing bei 52°C für 30 sec; (iii) Amplifikation bei 72°C für 1 min. Vor der eigentlichen PCR Reaktion wurde die Template DNA für 3 min bei 95 °C denaturiert. Im Falle des 3' DNA Fragments wurde das Primerpaar Primer p437 (SEQ ID NO: 18) und Primer p438 (SEQ ID NO: 19) verwendet. Das DNA-Fragment, das für Neomycin- Resistenzgenkassette codierte, wurde unter den gleichen Bedingungen mit dem Primerpaar p9 (SEQ ID NO:20) und plO (SEQ ID NO:21) hergestellt. In einer vierten PCR wurden nun die drei DNA-Fragmente über ihre homologen, überlappenden Bereiche miteinander verbunden. Hierzu wurden je 50 ng der über eine Agarosegelelektrophorese gereinigten DNA-Fragmente eingesetzt. Gegenüber den oben aufgeführten PCR Bedingungen wurde die Amplifikationszeit auf 2,5 min erhöht. Alle anderen Parameter blieben unverändert. Als Primerpaar wurden Primer p45 und p51 verwendet. Das erzeugte PCR Produkt wurde mit Hilfe des QiaQuick PCR Reinigungskit von Qiagen gereinigt. Mit 2 μg gereinigtem Produkt wurden kompetenten B. subtilis 168 Zellen transformiert. Auf TBAB Medium, das 2 mg/1 Neomycin enthielt, wurde auf Neomycin-resistente Kolonien selektiert. Mit Hilfe einer weiteren PCR (Primerpaar p45 und plO unter den oben genannten Bedingungen) wurde der Genotyp ausgewählter, neomycin-resistenter Transformanten bestätigt. Einer positiven Transformante wurde die Bezeichnung BS5878 gegeben. Beispiel 3: Transfer des ccpC knockouts in ausgewählte Riboflavin- überproduzierende Stämme

Für der Transfer des ccpC Knockouts in ausgewählte B. subtilis Stämme, die Riboflavin überproduzieren, wurde die Transduktion mit dem Phagen PBS-I verwendet (siehe WO 07/051552, Beispiel 6). Es wurde ein PBS-I Phagen Lysat des Stammes BS5878 hergestellt. Die zur Transduktion verwendeten Riboflavinproduzenten BS3914 und BS3917 wurden folgendermassen hergestellt: Stamm BS3914 und BS3917 sind Abkömmlinge des Riboflavin-überproduzierenden Stammes BS3534 (für die Konstruktion von BS3534 siehe WO 2007/051552). BS3534 basiert auf dem Stamm B. subtilis RB50, welcher im Patent EP 405370 beschrieben wurde und unter der Nummer NRRL B-18502 hinterlegt wurde. In den Stämmen BS3914 und BS3917 wurde das im Riboflavin-Lokus integrierte Plasmid pRF69 durch eine Neomycinresistenz-Genkassette ersetzt. Zur Herstellung des dazugehörigen PCR-Produktes wurde die oben beschriebene PCR Methode eingesetzt. Das PCR Produkt bestand aus einem 526 bp langem 3' Bereich stromaufwärts vom Riboflavin Operon Promotor (Primerpaar p50; SEQ ID NO:22 und p51 ; SEQ ID NO:23) auf der genomischen DNA von B. subtilis 168 und einem 502 bp langen 5' Bereich im ribD Gens (Primerpaar p44; SEQ ID NO:24 und p45; SEQ ID NO:25) auf der genomischen DNA von B. subtilis 168 die mit der Neomycinresistenz-Genkassette (Primer p9 und plO auf dem Plasmid pUBl 10) mittels PCR fusioniert wurden. Die genauen Reaktionsbedingungen sind weiter oben beschrieben. Das gereinigte PCR Produkt wurde zur Transformation kompetenter B. subtilis 168 Zellen eingesetzt. Die Selektion fand auf TBAB-Platten statt, die 100 mg/1 Riboflavin und 2 mg/1 Neomycin enthielten. Der Genotyp gewachsener Kolonien wurde mittels PCR und Sequenzierung bestätigt. Einer bestätigten, isolierten Transformante wurde mit BS3813 bezeichnet. Ein von BS3813 hergestellte PBS-I Phagenlysat wurde für den Transfer des Konstrukts in Stamm BS3534 verwendet. Dem so hergestellten Stamm wurde die Bezeichnung BS3798 gegeben.

Die Neomycin-Resistenzkassette des Riboflavin-auxotrophen Stammes BS3813 wurde im nächsten Schritt wieder durch ein funktionelles Riboflavin-Operon ersetzt. Zur Selektion positiver Transformanten/Transduktanten wurden Minimalmedium-Platten (2 g/l Glucose gelöst in der Ix Mineralsalzlösung-Spurenelementlösung) verwendet. In der modifizierten Promotor/mRNA Leader Sequenz wurde der native Promotor gegen den Promotor des veg Genes von B. subtilis ausgetauscht. Darüber hinaus wurde ein Cytosin im Leaderbereich gegen ein Thymidin ausgetauscht (SEQ ID NO:26). Kompetente Zellen des Stammes BS3813 wurden mit einem DNA Fragment, das die Sequenz gemäss SEQ ID NO:26 besass, transformiert. Transformierte Zellen besassen wieder die Fähigkeit, in einem Medium ohne Zusatz von Riboflavin zu wachsen. Der Genotyp gewachsener Kolonien wurde durch PCR und nachfolgende Sequenzierung bestätigt. Eine bestätigte Kolonie wurde mit BS3953 bezeichnet. Ein PBS-I Phagenlysat des Stammes BS3953 wurde zur Transduktion von BS3798 verwendet. Die Selektion wurde, wie oben beschrieben, ausgeführt. Zwei Typen von Transduktanten wurden isoliert. In dem ersten Fall war das inaktivierte spoOA Gen von BS3798 nicht gegen das Wildtyp Allel ersetzt worden. Eine bestätigte Transduktante erhielt die Bezeichnung BS3914. Im zweiten Fall war das inaktivierte spoOA Gen aufgrund des Transfers eines grosseren Stückes DNA während der Transduktion gegen die aktive Wildtypform ersetzt worden. Eine getestete, SpoOA-positive Mutante wurde BS3917 genannt.

BS3914 und BS3917 wurden nun mit dem Lysat von BS5878 transduziert. Die Selektion fand abermals auf TB AB-Platten, die 2 mg/1 Neomycin enthielten, statt. Der Genotyp selektierter Transduktanten wurde mit der oben erwähnten PCR bestätigt. Fünf bestätigte Transduktanten aus der Transduktion des Stammes BS3914 wurden mit den Bezeichnungen BS5891, BS5893, BS5894 und BS5895 versehen. Vier Transduktanten, die von BS3917 abstammten, erhielten die Bezeichnung BS5887 bis BS5890.

Die Riboflavinproduktion der neu erzeugten Stämme wurde, wie oben beschrieben, im Schüttelkolben gestestet. Nach 48 h wurde den Kulturen eine Probe von 500 μl entnommen, mit 4 N NaOH, versetzt, neutralisiert, und die Riboflavinkonzentration der Probe nach erfolgter Zentrifugation per HPLC bestimmt. Für die Berechnung der Ausbeute wurde ebenfalls die Zuckerkonzentration in der Endprobe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2A und 2B zusammengestellt. Tabelle 2 A: Riboflavinausbeute des Schüttelkolbentest der neuhergestellten ccpC-knockout Stämme basierend auf BS3914. Die Riboflavinausbeute der neuen Stämme wurden mit der Riboflavinausbeute des Wirtsstamms BS3914 verglichen.


Tabelle 2B: Riboflavinausbeute des Schüttelkolbentest der neuhergestellten ccpC-knockout Stämme basierend auf BS3917. Die Riboflavinausbeute der neuen Stämme wurden mit der Riboflavinausbeute des Wirtsstamms BS3917 verglichen.


Transduktanten, die sich vom Stamm (BS3914) herleiten, produzierten Riboflavin mit der gleichen Ausbeute wie der Wirtsstamm BS3914. Die ccpC knockout Stämme des SpoOA-plus Stammes BS3917 produzierten Riboflavin mit einer deutlich verbesserten Ausbeute als der Wirtsstamm BS3917. Auch BS3917 selbst zeigte eine signifikant bessere Ausbeute (25%) als der SpoOA-minus Stamm BS3914 unter den gegebenen Bedingungen.

Man kann also festhalten, dass die Inaktivierung von ccpC in einem Riboflavin-produzierenden B. subtilis Stamm, der ein aktives spoOA Gen besitzt, eine Verbesserung der Ausbeute von mindestens 20% unter Schüttelkolbenbedingungen bewirkt.

Bei einer teilweisen Inaktivierung von ccpC, d.h. das Einführen von Mutationen in die Gensequenz, die zu einer Verringerung der Transkriptionsfunktion führen, so z.B. zu einer Verringerung der Aktivität um 75%, 50% oder 25%, und anschliessender Bestimmung der Riboflavinkonzentration im Vergleich zum Wildtyp-Stamm kann eine Steigerung um ca.

10 bis maximal 20% festgestellt werden. Diese Resultate können auch bei Einfügen von Mutationen in die Bindungssequenzen für CcpC (siehe Tabelle 1) erzielt werden, wobei je nach Verringerung der Bindungsaffinität, Steigerungen in der Riboflavinkonzentration im Bereich von ca. 25% erreicht werden können. Die oben-beschriebenen Mutationen werden gemäss Standardprotokoll eingefügt, danach kann die Bindungsaffinität bzw. der Rückgang der Bindungsaffinität mittels bekannter Methoden (siehe Beschreibung) bestimmt werden sowie die Menge an Riboflavin, wie oben beschrieben, bestimmt werden.