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1. WO2007137733 - WOUND DRESSING COMPRISING POLYACRYLATES AND THE USE THEREOF

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Titel: Wundauflage mit Polyacrylaten und ihre Verwendung

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Proteasen-Inhibitoren insbesondere zur Wundbehandlung sowie eine Wundauflage und deren Verwendung in der modernen Wundbehandlung.

Die Aktivität eines Enzyms kann auf verschiedenste Art und Weise beeinflusst werden. So kann beispielsweise die Aktivität des Enzyms durch Einflussnahme auf das Enzymprotein selbst, auf das Coenzym oder auf das Substrat herauf oder herab gesetzt werden. Diese Einflussnahme kann nicht nur durch Inhibitoren oder Aktivatoren erfolgen, sondern auch durch äußere Faktoren wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke oder die Polarität des Lösungsmittels. Eine Beeinflussung durch die zuletzt genannten Faktoren erfolgt unspezifisch durch Modifikation der Enzymstruktur über Oberflächeneffekte z.B. Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen oder Störungen der Hydrathülle. Das aktive Zentrum wird dabei nicht gezielt beeinflusst.

Unter Enzymhemmung (Inhibition) ist die negative Beeinflussung der Enzymaktivität bzw. die Herabsetzung der katalytischen Aktivität eines Enzyms oder Coenzyms durch spezifische oder unspezifische Hemmstoffe oder Inhibitoren zu verstehen. Hierbei kann die Inhibition reversibel oder irreversibel erfolgen.

Eine irreversible Enzyminhibition ist in der Regel die Folge einer kovalenten Verknüpfung des Inhibitors mit dem aktiven Zentrum des Enzyms. Bei diesen irreversiblen Inhibitoren handelt es sich um Substanzen, welche zunächst vom Enzym als Substrat erkannt und in das aktive Zentrum aufgenommen werden. Dort gehen die Inhibitoren eine feste kovalente Bindung mit Aminosäureresten des aktiven Zentrums ein, wodurch dieses dauerhaft blockiert wird. Ein bekannter irreversibler Inhibitor ist das Antibiotikum Penicillin, welches ein Enzym der bakteriellen Zellwandsynthese irreversibel ausschalten kann.

Die so genannte reversible Enzymhemmung ist grundsätzlich umkehrbar und spielt bei der Feinregulation des Stoffwechsels in lebenden Organismen eine entscheidende Rolle. Die reversible Hemmung wird weiterhin in die kompetitive Hemmung und die nicht-kompetitive Hemmung unterschieden. Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert das Substrat mit dem Hemmstoff um die Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms. Da das Substrat und der Inhibitor nicht gleichzeitig an das Enzym binden können und der Inhibitor im Gegensatz zum Substrat nicht enzymatisch umsetzbar ist, wird die messbare Enzymaktivität vermindert. Mit zunehmender Konzentration des Inhibitors findet eine zunehmende Verdrängung des Substrats statt, wodurch eine Verminderung der Enzymaktivität erfolgt. Eine Erhöhung der Substratkonzentration kehrt diesen Vorgang um und ermöglicht eine vermehrte
Substratumsetzung. Im Fall der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Hemmstoff außerhalb des aktiven Zentrums sowohl an das freie Enzym als auch an den
Enzym/Substrat-Komplex. Die Bindung des Inhibitors führt nicht zur Inhibition der
Substratbindung, sondern zu einer Konformationsänderung des Enzyms, das dadurch inaktiviert wird. Die Bindung des Inhibitors und die Inaktivierung des Enzyms finden unabhängig vom Vorhandensein von Substrat statt.

Proteasen (Peptidasen, Peptid-Hydrolasen) sind Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung einer Peptid-Bindung in Proteinen und Peptiden (Proteolyse) katalysieren. Proteasen gehören damit systematisch zu der Gruppe der Hydrolasen. Proteasen werden hinsichtlich des Spaltungsortes im Substrat unterteilt. So wird die Spaltung von Peptidbindungen im Inneren von Peptiden oder Proteinen durch Endopeptidasen (Proteinasen) katalysiert, wogegen Peptidbindungen am Ende eines Peptid- oder Proteinmoleküls durch
Exopeptidasen (früher Peptidasen) gespalten werden.

Eine weitere Unterscheidung der Proteasen wird hinsichtlich ihrer im aktiven Zentrum für die Katalyse verantwortlichen Gruppen getroffen. So werden beispielsweise a) Serin-Proteasen, b) Cystein-Proteasen, c) Aspartat-Proteasen und d) Metallo-Proteasen voneinander unterschieden. Die Gruppe der Metallo-Proteasen (Metallo-Peptidasen) weisen
beispielsweise in ihrem aktiven Zentrum Metallionen auf, die an dem katalytischen
Mechanismus der Proteolyse beteiligt sind. Diese Metallionen, insbesondere divalente Metallkationen wie Magnesium, Zink, Calcium, Eisen u.a., werden auch als Coenzym betrachtet. Gemäß dem oben beschriebenen Unterscheidungsmerkmal gibt es weiterhin a) Metallo-Endopeptidasen (Metallo-Proteinasen) und b) Metallo-Exopeptidasen.

Matrix-Metallo-Proteasen (MMP) - auch Matrixine genannt - gehören zu einer Familie von Proteasen, die durch strukturelle Homologien definiert worden sind. Ihre enzymatische Aktivität ist abhängig von Metallionen im aktiven Zentrum. Metallo-Proteasen wurden zuerst durch ihre Rolle beim Gewebe-Umbau identifiziert, insbesondere durch den Abbau der extrazellulären Matrix. Systematisch gehört diese Gruppe der Proteasen zu den Metallo-Endopeptidasen (Metallo-Proteinasen). Zu den Matrix-Metallo-Proteinasen gehören unter anderem die Collagenasen, Gelatinasen, Stromeolysine, Matrilysin u.a.. Eine Übersicht und Einteilung ist in der Fachliteratur bei Parks, Matrix Metalloproteinases, Biology of
Extracellular Matrix Series, Ed. Mecham, R. P., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1998) und in der unten stehenden Tabelle 1 zu finden. In dieser Tabelle 1 sind Synonyme und gegebenenfalls, die Nummerierung der Enzyme gemäß der Enzym Commision (EC) angegeben. Die Matrix-Metallo-Proteinasen werden als inaktive Vorstufen synthetisiert und sezemiert. Durch komplexe, derzeit noch nicht im Detail endgültig geklärte Mechanismen werden sie in die aktive Form überführt. Alle Metallo-Proteasen können durch
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gehemmt werden.

Tabelle 1 : Matrix-Metallo-Proteasen (MMP)


- A - Serin-Proteasen weisen im aktiven Zentrum einen für die Katalyse essentiellen L-Serin-Rest auf, der durch Diisopropylflüorophosphat inhibiert werden kann. Auch diesen Proteasen wird in der Wundheilung eine entscheidende Funktion zugeschrieben. Zu der Gruppe der Serin-Proteasen behören beispielsweise Chromotrypsin, Elastase, Kallikrein, Plasmin, Trypsin, Thrombin u.a.. Die meisten bekannten Serin-Proteasen weisen neben dem L-Serin-Rest in ihrem aktiven Zentrum die Reste der Aminosäuren L-Histidin und L-Asparagin auf. Alle drei Aminosäurereste nehmen bei der Protolyse an einer Kaskade von Reaktionen teil, in der ein Proton des L-Serin-Restes auf das Substrat übertragen wird. Insoweit sich ein Serin-abhängiger Mechanismus bei Proteinasen findet, spricht man auch von Serin-Proteinasen.

Matrix-Metallo-Proteasen wird in der Wundheilung eine entscheidende Funktion
zugeschrieben. So benötigen beispielsweise Keratinozyten zur Migration über die
provisorische Matrix mit dem Ziel des epithelialen Wundschlusses Matrix-Metallo-Proteasen (Pilcher et al., 1997; Beare et al., 2003; Mirastschijski et al., 2004). Diese Metallo-Proteasen werden in Zellen als inaktive Proform gebildet, aus der Zelle sezerniert und im
extrazellulären Milieu aktiviert. Sie sind durch strukturelle Gemeinsamkeiten gekennzeichnet und benötigen für die proteolytische Aktivität divalente Ionen im aktiven Zentrum. Erst nach Aktivierung und in Gegenwart von z.B. Ca2+- oder Zn2+-lonen können sie die jeweiligen Substrate abbauen (Übersicht in Nagase und Woessner 1999).

In neueren Arbeiten auf dem Gebiet der Wundbehandlung konnte festgestellt werden, dass mit einer pathologischen Wundheilung eine überschießende Proteaseaktivität im Wundsekret assoziiert ist (Trengove et al., 1999; Wysocki et al., 1993; Weckroth et al., 1996).
Experimentell konnte weiterhin gezeigt werden, dass eine erhöhte MMP-Expression in der Haut die Wundheilung deutlich verzögert (Di Colandrea et al., 1998). Weiterhin hat sich gezeigt, dass mit einer exzessiven Proteaseaktivität eine Abnahme der Wachstumsfaktoren zu verzeichnen ist (Tengrove et al., 2003). Es hat sich darüber hinaus gezeigt, dass in chronischen Wunden die extrazelluläre Matrix (Wysocki et al., 1990), Wachstumsfaktoren (Duckworth et al., 2004; Lauer et al., 2000) und deren Rezeptoren abgebaut werden, so dass im Wundareal ein relatives Defizit an diesen Stoffen entsteht. Damit behindert eine exzessive Protease-Aktivität, insbesondere eine exzessive Metallo-Proteasen-Aktivität die Wundheilung in außerordentlichem Maß. Versuche, diese Proteaseaktivität durch spezifische Inhibitoren pharmakologisch zu reduzieren, waren bislang nicht erfolgreich.

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Mittel zur
Behandlung von chronischen Wunden bereitzustellen. Darüber hinaus soll ein Mittel bereitgestellt werden, das den pathologischen Zustand einer Wunde derart beeinflusst, dass ein normaler, natürlicher Wundheilungsverlauf stattfinden kann. Zudem soll ein Verfahren zur Behandlung von chronischen Wunden sowie eine Verwendung zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt werden.

Überraschenderweise wird diese Aufgabe durch Metallo-Proteasen-Inhibitoren aus der Gruppe der Polyacrylate gelöst. Insbesondere hat sich gezeigt, dass diese Polyacrylate Metallo-Proteasen über diffusible Mechanismen inhibieren als auch durch direkte Bindung kompartmentieren und damit dem Wundexsudat bzw. der Wunde entziehen können. Damit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe der Polyacrylate zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden. Insbesondere ist die Verwendung von Polyacrylaten zur Inhibition von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden und die Verwendung von Polyacrylaten zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden Gegenstand der Erfindung.

Zudem hat sich gezeigt, dass Metallo-Proteasen durch Polyacrylate gebunden oder kompartimentiert werden, so dass diese Metallo-Proteasen mit den Polyacrylaten aus einer Wundflüssigkeit oder einer Wunde entfernt werden können. Somit kann mittels der
Polyacrylate ein Überschuss an Metallo-Proteasen in chronischen Wunden derart
abgefangen werden, dass ein natürlicher Heilungsverlauf stattfinden kann. Damit ist auch die Verwendung von Polyacrylaten zur Inhibition durch Kompartimentierung von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden und die Verwendung von Polyacrylaten zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition durch Kompartimentierung von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Besonders bevorzugt können somit chronische Wunden mittels eines topischen Mittels behandelt werden, da hiermit die an den Polyacrylaten gebundenen Metallo-Proteasen zusammen mit den Polyacrylaten entfernt werden können. Damit ist auch die Verwendung von Polyacrylaten in topischen Mitteln zur Inhibition von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Heilung von Wunden beruht auf der Fähigkeit der Haut zur Regeneration von Epithelen sowie von Binde- und Stützgewebe. Sie ist als ein komplexes Geschehen ineinander übergreifender Zellaktivitäten gekennzeichnet, die den Heilungsprozess schrittweise vorantreiben. So werden in der Literatur unabhängig von der Art der Wunde drei wesentliche Heilungsphasen einer Wunde beschrieben. Hierzu gehört die inflammatorische oder exsudative Phase zur Blutstillung und Wundreinigung (Phase 1 , Reinigungsphase), die proliferative Phase zum Aufbau von Granulationsgewebe (Phase 2, Granulationsphase) und die Differentierungsphase zur Epithelisierung und Narbenbildung (Phase 3,
Epithelisierungsphase). Ein Überschuss an Metallo-Proteasen ist insbesondere in der Granulationsphase der Wundheilung störend, da durch das gestörte Gleichgewicht von Metallo-Proteasen zu neu aufgebauten Bindegewebe kein ausreichender Gewebeaufbau stattfinden kann. Der Gewebeaufbau ist dabei kritisch von einer Stabilisierung neu synthetisierter extrazellulären Matrix-Moleküle abhängig, die zu einem dreidimensionalen Gewebe zusammengebaut werden, worauf parallel und in weiteren Schritten die
Angiogenese und die Proliferation von Zellen in das Wundareal erfolgt.

Es hat sich nun gezeigt, dass Polyacrylate insbesondere in der proliferativen Phase der Wundheilung eingesetzt werden können. In dieser Phase sind eventuelle Entzündungen soweit abgeklungen oder nicht vorhanden, dass eine Granulation und damit ein
Zellwachstum stattfinden könnten, sofern kein Überschuss an Metallo-Proteasen vorliegt. Dieser Überschuss kann nun mittels Polyacrylaten abgefangen werden. Somit wird der Gewebeaufbau durch die Ausschaltung der die Wundheilung störenden Mechanismen gefördert, was sich klinisch in einer Besserung des Wundzustandes sowie der
Wundverkleinerung durch Abnahme des Wundvolumens und/ oder der Wundgröße bemerkbar macht. Damit ist die Verwendung von Polyacrylaten zur Inhibition von Metallo-Proteasen zum Gewebeaufbau und/ oder zur Regulierung des Gewebeaufbaus in chronischen Wunden und die Verwendung von Polyacrylaten zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Metallo-Proteasen zum Gewebeaufbau und/ oder zur Regulierung des Gewebeaufbaus in chronischen Wunden ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Hierbei wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem Polyacrylat ein
synthetisches Polymer umfassend als Monomer (M 1) Acrylsäure (2-Propensäure, CH2=CH-CO2H) und/ oder ein Salz hiervon verstanden, das einen Monomeranteil von mehr als 70 Gew.-% Acrylsäure und/oder eines Salzes hiervon (bezogen auf das Gesamtgewicht des Polyacrylats) aufweist. Insbesondere weisen erfindungsgemäße Polyacrylate einen
Monomeranteil von mehr als 80 Gew.-% Acrylsäure und/oder eines Salzes hiervon und ganz besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-% Acrylsäure und/oder eines Salzes hiervon bezogen auf das Gesamtgewicht des Polyacrylats auf. Dabei kann das Polyacrylat als Homopolymer, Copolymer oder Blockpolymer vorliegen. Falls das Polyacrylat als Copolymer oder Blockpolymer vorliegt, so liegt in jedem Fall der Monomeranteil des Monomers M1 in dem Polymer bei mehr als 70 %, insbesondere bei mehr als 80 % und ganz besonders bevorzugt bei mehr als 95 % bezogen auf das Gesamtgewicht des Polyacrylats. In diesen copolymeren Polyacrylaten oder blockpolymeren Polyacrylaten können neben dem Monomer M1 als Comonomere M2 insbesondere α.ß-ungesättigte Ether (Vinylether), α,ß-ungesättigte Carbonsäuren oder α,ß-ungesättigte Carbonsäureester (Vinylester) enthalten sein. Von den Comonomereη M2 der α,ß-ungesättigten Carbonsäuren werden besonders Methacrylsäure (2-Methylpropensäure), Ethacrylsäure (2-Ethylpropensäure), Crotonsäure (2-Butensäure), Sorbinsäure (frans-frans-2,4-Hexadiensäure), Maleinsäure (c/s-2-Butendisäure) oder Fumarsäure (frans-2-Butendisäure) bevorzugt. In einer besonders bevorzugten Form der Erfindung kann jedoch auch vorgesehen sein, dass das Polyacrylat aus a) einem
Homopolymer aus Acrylsäure und/oder b) einem Copolymer aus i) Acrylsäure und einem Salz der Acrylsäure, ii) aus Methacrylsäure und einem Salz der Methacrylsäure oder iii) aus Acrylsäure und Methacrylsäure und deren Salze besteht. Weiterhin kann jedoch auch vorgesehen sein, dass es sich bei dem Polyacrylat um eine Mischung von verschiedenen Polyacrylaten handelt.

Hierbei können insbesondere die α,ß-ungesättigten Carbonsäuren als auch die Acrylsäure in neutralisierter Form als Salz, in nicht-neutralisierter Form als freie Säure oder in Mischungen hiervon vorliegen. Insbesondere haben sich Polyacrylate, die aus Acrylsäure und Salzen der Acrylsäure aufgebaut sind als besonders wirksam gezeigt. Dabei sind insbesondere
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze hervorzuheben. Insbesondere zeigten sich
Polyacrylate, die aus Homopolymeren und/oder aus Copolymeren bestehen, die als
Monomere Acrylsäure und/ oder Natrium- oder Kaliumacrylat umfassen, als besonders wirksam.

Weiterhin hat sich in überraschender weise gezeigt, dass die vorliegende Aufgabe in besonderes hervorzuhebender Weise durch Metallo-Proteasen-Inhibitoren aus der Gruppe der vernetzen und/ oder quervernetzten Polyacrylate gelöst wird. Diese Polyacrylate umfassen vorzugsweise a) ein Homopolymer, das aus den Monomeren M1 besteht und mittels eines Vernetzers vernetzt und/ oder quervernetzt ist, und/ oder b) ein Copolymer, das aus den Monomeren M1 und M3 besteht, wobei das Monomer M1 Acrylsäure und/ oder ein Salz hiervon ist und das Monomer M3 aus der Gruppe der Vernetzer gewählt wird. Das heißt, dass diese Polyacrylate ein mittels eines Vernetzers nachträglich vernetztes
Polyacrylat und/ oder ein Polyacrylat umfassen, das aus Acrylsäure und/ oder einem Salz hiervon und einem Vernetzer copolymerisiert ist.

Damit ist auch die Verwendung eines Polyacrylats, das a) ein Homopolymer umfasst, das aus den Monomeren M1 besteht und mittels eines Vernetzers vernetzt und/ oder
quervernetzt ist, und/ oder b) ein Copolymer umfasst, das aus den Monomeren M1 und M3 besteht, wobei das Monomer M1 Acrylsäure und/ oder ein Salz hiervon ist und das Monomer M3 aus der Gruppe der Vernetzer gewählt wird, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Insbesondere hat sich gezeigt, dass vernetze und/ oder quervernetzte Polyacrylate, die als Vernetzer Verbindungen V1 enthalten, die mindestens zwei ethylenisch ungesättigte
Gruppen innerhalb eines Moleküls aufweisen, oder Verbindungen V2, die mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweisen, die mit funktionellen Gruppen der Acrylsäure oder/ und eines Salzes hiervon in einer Kondensationsreaktion, in einer Additionsreaktion oder in einer Ringöffnungsreaktion reagieren können, oder Verbindungen V3, die mindestens eine ethylenisch ungesättigte Gruppe und mindestens eine funktionelle Gruppe, die mit funktionellen Gruppen der Acrylsäure und/ oder eines seiner Salze und/ oder den α,ß-ungesättigte Comonomere in einer Kondensationsreaktion, in einer Additionsreaktion oder in einer Ringöffnungsreaktion reagieren kann, besonders wirksam sind. Dabei wird durch die Verbindungen V1 eine Vernetzung der Polymere durch die radikalische Polymerisation der ethylenisch ungesättigten Gruppen des Vernetzermoleküls mit den monoethylenisch ungesättigten Monomeren Acrylsäure und/ oder eines seiner Salze und/ oder einer der α,ß-ungesättigte Comonomere erreicht, während bei den Verbindungen V2 eine Vernetzung der Polymere durch Kondensationsreaktion der funktionellen Gruppen mit den funktionellen Gruppen der Acrylsäure und/ oder eines seiner Salze oder einer α,ß-ungesättigte der Comonomere erreicht wird. Bei den Verbindungen V3 erfolgt dementsprechend eine
Vernetzung des Polymers sowohl durch radikalische Polymerisation der ethylenisch ungesättigten Gruppe als auch durch Kondensationsreaktion zwischen der funktionellen Gruppe des Vernetzers und den funktionellen Gruppen der Monomeren.

Bevorzugte Verbindungen V1 sind Polyacrylsäureester oder Polymethacrylsäureester, die beispielsweise durch die Umsetzung eines Polyols, wie beispielsweise Ethylenglykol (1 ,2-Ethandiol), Propylenglykol (1 ,2-Propandiol), Trimethylolpropan (2-Ethyl-2-hydroxymethyl-1 ,3-propandiol), 1 ,6-Hexandiol, Glycerin (1 ,2,3-Propantriol), Pentaerythrit (2,2-Bis(hydroxymethyl)propan-1 ,3-diol), Polyethylenglykol (HO-(CH2 - CH2- O)n-H mit n = 2 bis 20) mit n = 1 bis 20), Polypropylenglykol (HO-(CH(CH3) - CH2- O)n-H mit n = 2 bis 20), eines Aminoalkohols, eines Polyalkylenpolyaminens, wie beispielsweise Diethylentriamin oder Triethylentetraamin, oder eines alkoxylierten Polyols mit Acrylsäure oder Methacrylsäure gewonnen werden. Besonders bevorzugt kann es sich bei dem vernetzten Polyacrylaten um ein Polyacrylat handeln, das mittels einer Verbindung V1 vernetzt ist, die ein Di-, Tri- oder Tetraester der Polyacrylsäure oder Polymethacrylsäure ist, der durch die Umsetzung eines alkoxylierten Polyols, insbesondere eines ethoxylierten Polyols, insbesondere ethoxyliertes Ethylenglycol, ethoxyliertes Propylenglycol, ethoxyliertes
Trimethylolpropan, ethoxyliertes 1 ,6-Hexandiol oder ethoxyliertes Glycerin, mit einer durchschnittlichen Anzahl an Ethylenoxideinheiten n pro Hydroxygruppe von n = 1 bis 10 mit Acrylsäure oder Methacrylsäure gewonnen werden. Als Verbindungen V1 sind des Weiteren Polyvinylverbindungen, Polyallylverbindungen, Polymethylallylverbindungen, Acrylsäureester oder Methacrylsäureester einer Monovinylverbindung, Acrylsäureester oder
Methacrylsäureester einer Monoallylverbindung oder Monomethylallylverbindung, vorzugsweise der Monoallylverbindungen oder Monomethylallylverbindungen eines Polyols oder eines Aminoalkohols, bevorzugt. In diesem Zusammenhang wird auf DE 195 43 366, DE 195 43 368 verwiesen.

Überraschenderweise wird die oben aufgeführte Aufgabe auch durch Metallo-Proteasen-Inhibitoren aus der Gruppe der Polyacrylat-Superabsorber gelöst. Hierbei wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem Polyacrylat-Superabsorber ein Polyacrylat mit den oben aufgeführten Merkmalen verstanden, das in der Lage ist, mindestens das 15-fache seines Eigengewichtes an physiologischer Kochsalzlösung (0,9 %-ige NaCI-Lösung,
Wasser) zu absorbieren. Damit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe der Polyacrylat-Superabsorber zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden.

Superabsorber sind in der modernen Wundbehandlung lange Zeit bekannt. Diese werden jedoch lediglich als Wundflüssigkeit aufsaugendes Medium verwendet. Werden diese Superabsorber in dieser Art und Weise eingesetzt, wird einzig und allein der
Flüssigkeitshaushalt der Wunde oder des Wundbetts reguliert. Überraschenderweise wurde daher festgestellt, dass Polyacrylat-Superabsorber in der Lage sind Metallo-Proteasen zu inhibieren und damit eine Wundheilung aktiv zu fördern. Insbesondere hat sich auch gezeigt, dass Polyacrylate-Superabsorber, insbesondere vernetzte Polyacrylat-Superabsorber Matrix-Metallo-Proteasen inaktivieren. Damit wird die Aufgabe in bevorzugter Weise von Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitoren gelöst. Besonders bevorzugt sind dabei Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitoren ausgewählt aus der Gruppe der Polyacrylat-Superabsorber und insbesondere aus der Gruppe der vernetzten Polyacrylat-Superabsorber.

In jedem Fall kann der Polyacrylat-Superabsorber in Form von Fasern, Partikeln oder Gelen vorliegen. Dabei kann der Polyacrylat-Superabsorber in trockener oder in bereits gequollener Form vorliegen. In gequollener Form liegt das Polymer in gelförmigen, diskreten Fasern oder Partikeln vor. Dabei kann ein erfindungsgemäßer Metallo-Proteasen-Inhibitor aus der Gruppe der Polyacrylat-Superabsorber in Form von Partikeln vorliegen, die mit Wasser, physiologischer Kochsalz-Lösung oder Ringer-Lösung versetzt sind, wobei die Partikel bereits in gequollener Form vorliegen.

Dabei zeigten sich zudem Polyacrylat-Superabsorber und insbesondere vernetzte
Polyacrylat-Superabsorber als besonders bevorzugt, die als Partikel vorliegen und eine Partikelgrößenverteilung aufweisen, deren Anteil an Partikel zwischen 850 μm und 300 μm mindestens 55 %, insbesondere mindestens 65 % und ganz besonders mindestens 70 % beträgt (gemessen nach EDANA 420.2-02). Weiterhin bevorzugt sind vernetzte und/ oder quervernetzte Polyacrylat-Superabsorber. Insbesondere sind auch superabsorbierende Polyacrylate bevorzugt, deren Partikelanteil an Partikeln kleiner als 850 μm mindestens 85 %, besonders mindestens 90 % und ganz besonders mindestens 95 % bezogen auf alle Partikel beträgt (gemessen nach EDANA 420.2-02).

Überraschenderweise wird die oben aufgeführte Aufgabe insbesondere durch Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitoren aus der Gruppe der Polyacrylate insbesondere der vernetzen und/ oder quervernetzten Polyacrylate gelöst. Als Polyacrylate sind hierbei Polyacrylate mit den oben beschriebenen Merkmalen zu verstehen. Damit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe der
Polyacrylate, insbesondere der vernetzten und/ oder quervernetzten Polyacrylate zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden. Insbesondere ist die Verwendung von Polyacrylaten zur Inhibition von Matrix-Metallo-Proteasen in chronischen Wunden und die Verwendung von Polyacrylaten zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Matrix-Metallo-Proteasen in chronischen Wunden Gegenstand der Erfindung.

In einer weiteren vorteilhaften Verwendung werden die Polyacrylate zur Inhibition durch Kompartimentierung von Matrix-Metallo-Proteasen in chronischen Wunden und zur
Herstellung eines Mittels zur Inhibition durch Kompartimentierung von Matrix-Metallo-Proteasen in chronischen Wunden eingesetzt. Diese Polyacrylate können zudem
vorzugsweise zur Inhibition von Matrix-Metallo-Proteasen zum Gewebeaufbau und/ oder zur Regulation des Gewebeaufbaus in chronischen Wunden und zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Metallo-Proteasen zum Gewebeaufbau und/ oder zur Regulation des Gewebeaufbaus in chronischen Wunden eingesetzt werden.

Chronische Wunden können definiert werden als Wunden, deren Heilungsverlauf in einem oder allen Stadien der Wundheilung von der normalen Wundheilung abweichen. So kann aus akuten, normal heilenden Wunden z.B. durch eine Wundinfektion eine chronische Wunde entstehen, die durch eine verzögerte Heilungsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist. Der Übergang von einer akuten zu einer chronischen Wunde kann dabei in jedem Stadium der Wundheilung erfolgen. Klinisch werden chronische Wunden definiert als Wunden, deren Heilung mehr als 6-8 Wochen benötigen, wobei diese Definition nicht alle Krankheitsbilder korrekt abdeckt. Es handelt sich bei chronischen Wunden mehr um eine Diagnose, die sich auf die klinische Erfahrung des medizinischen Personals stützt.

Chronische Wunden entstehen insbesondere aufgrund einer mechanischen Belastung (Dekubitus, Druck-Ulzera, Druckgeschwür), einer venösen Insuffizienz (Ulcus cruris venosum, venöse Ulzera), einer artheriosklerotischen Gefäßveränderung (Ulcus cruris arteriosum, arterielle Ulzera), einer neuropathischen Veränderungen (diabetisches
Fußsyndrom, neuropathische Ulzera), aber auch in Folge von Autoimmunerkrankungen, von Tumoren (exulzierende Tumore) oder Strahlenschäden bei der Tumortherapie.

Der Dekubitus ist definiert als durch äußere (längerfristige) Druckeinwirkung mit
Kompression von Gefäßen und lokaler Ischämie hervorgerufene trophische Störung von Geweben (v. a. Haut und Unterhautgewebe) mit Nekrose, Mazeration, evtl. Infektion.
Dekubitalulcera entstehen vor allem bei Bettlägerigkeit, insbesondere an Körperstellen, an denen die Haut dem Knochen unmittelbar anliegt, aber auch z.B. unter schlecht sitzenden Prothesen und zu engen Gipsverbänden.

Der Dekubitus wird in folgende Stadien eingeteilt. Hierbei sind als chronische Wunden insbesondere Dekubita der Stufe II, Stufe III und Stufe IV bekannt:
- Dekubitus - Stufe I: Hierbei handelt es sich um eine persistierende, umschriebene Hautrötung, die auch bei Entlastung bestehen bleibt. Die Rötung ist scharf umgrenzt und kann verhärten oder überwärmt sein. Die Haut ist noch intakt.
- Dekubitus - Stufe II: In dieser Phase kommt es zu Blasenbildung und Hautabschürfung und damit zu Teilverlust der Haut. Die Epidermis bis hin zu Anteilen der Dermis ist geschädigt. In dieser Phase liegt eine oberflächige Wunde oder flaches Geschwür vor. - Dekubitus - Stufe IM: In diesem fortgeschrittenen Stadium ist bereits ein Verlust aller Hautschichten zu beobachten. Darüber hinaus sind eine Schädigung der subkutanen Gewebe und eventuell Nekrosen zu beobachten, die bis auf das darunter liegende Muskelgewebe reichen können. Erfahrungsgemäß muss es erst zu einer Abgrenzung des nekrotischen Gewebes kommen bis das ganze Ausmaß des Gewebeschadens erkennbar wird. Der Dekubitus III zeigt sich klinisch als offenes, tiefes Geschwür.
- Dekubitus - Stufe IV: In diesem äußerst kritischen Stadium ist ein Verlust aller
Hautschichten mit ausgedehnter Zerstörung, Gewebsnekrose oder Schädigung von Muskeln, Knochen oder unterstützenden Strukturen (Sehnen, Gelenkkapseln) zu verzeichnen. Der Dekubitus IV zeigt sich klinisch als großflächiges, offenes und tiefes Geschwür.

Damit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors, insbesondere eines Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitors, aus der Gruppe der Polyacrylate, insbesondere der vernetzten und/ oder quervernetzten Polyacrylate, zur Behandlung von und zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Dekubitus, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum oder diabetisches Fußsyndrom. Dabei wird der Gewebeaufbau durch die Ausschaltung der die Wundheilung störenden Mechanismen gefördert, was sich klinisch in einer Besserung des Wundzustandes sowie der
Wundverkleinerung bemerkbar macht.

In einer weiteren vorteilhaften Verwendung werden die Polyacrylate zur Inhibition durch Kompartimentierung von Matrix-Metallo-Proteasen und zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition durch Kompartimentierung von Matrix-Metallo-Proteasen bei Dekubitus, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum oder diabetisches Fußsyndrom eingesetzt. Diese Polyacrylate können zudem vorzugsweise zur Inhibition von Metallo-Proteasen und/ oder Matrix-Metallo-Proteasen zum Gewebeaufbau und/ oder zur Regulation des Gewebeaufbaus bei diesen Krankheiten eingesetzt werden.

Gemäß einem weiterführenden Gedanken der vorliegenden Erfindung, ist auch eine
Wundauflage umfassend einen Metallo-Proteasen-Inhibitor, insbesondere ein Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe der Polyacrylate, insbesondere der vernetzten und/ oder quervernetzten Polyacrylate, Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Hierbei können alle Polyacrylate der weiter oben beschriebenen Art zum Einsatz gebracht werden. Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass der Inhibitor in fester Form als Partikel oder in vorgequollener, gelförmiger Form auf ein Trägermaterial, insbesondere ein
Fasermaterial auf- oder eingebracht ist.

Damit ist auch die Verwendung einer Wundauflage umfassend ein Trägermaterial, insbesondere ein Fasermaterial, und einen Metallo-Proteasen-Inhibitor, insbesondere einen Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe der Polyacrylate,
insbesondere der vernetzten und/ quervernetzten Polyacrylate, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Zudem ist eine Wundauflage umfassend ein Trägermaterial, insbesondere ein Fasermaterial, und mindestens ein Polyacrylat, insbesondere ein vernetztes und/ oder quervernetztes
Polyacrylat, in Form von Partikeln, Fasern oder einem Gel zur Inhibition von Matrix-Metallo-Proteasen in chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Wie sich gezeigt hat, wird durch das Polyacrylat, das essentieller Bestandteil der
Wundauflage ist, und das insbesondere in Form von Partikeln, Fasern oder einem Gel vorliegend kann, Metallo-Proteasen, insbesondere Matrix-Metallo-Proteasen, gebunden oder kompartimentiert. Dies hat den Vorteil, dass durch die Wundauflage ein Überschuss an Metallo-Proteasen, insbesondere an Matrix-Metallo-Proteasen, auf ein für eine natürliche Wundheilung benötigte, reduzierte Menge gebracht werden kann. Diese gebundenen Metallo-Proteasen stehen nicht weiter als Inhibitoren der Wundheilung zur Verfügung. Durch einen Verbandwechsel können zudem diese Metallo-Proteasen nachhaltig entfernt werden. Damit weist eine erfindungsgemäße Wundauflage mindestens ein Polyacrylat als Metallo-Proteasen-Inhibitor auf, wobei die Metallo-Proteasen durch das Polyacrylat gebunden und/ oder kompartimentiert werden.

Insbesondere sind auch nicht-wundverklebende Wundauflagen umfassend einen Metallo-Proteasen-Inhibitor, insbesondere ein Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe der Polyacrylate Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Diese Wundauflagen unterstützen in besonderem Maße eine Wundheilung in der Granulationsphase der
Wundheilung, da sie einerseits durch den Gehalt an Metallo-Proteasen-Inhibitor einen Überschuss an Metallo-Proteasen insbesondere durch Kompartimentierung oder Bindung abfangen, und andererseits neu gewachsenes Gewebe bei einem Verbandwechsel nicht beschädigen. Diese nicht-wundverklebenden Wundauflagen umfassen als
Wundkontaktschicht insbesondere ein nicht-wundverklebendes Gestrick, Gewirk, Gewebe oder Nonwoven, das weiterhin bevorzugt aus einem hydrophoben Fasermaterial besteht. Insbesondere kann die Wundkontaktschicht ein Gestrick, Gewirk oder Gewebe aus einem hydrophoben Polyethylen-, Polypropylen-, Polyester- oder Viskose-Polymermaterial bestehen. Durch die Ausgestaltung als Gestrick, Gewirk oder Gewebe kann die
Wundkontaktschicht in einer oder mehreren Richtungen gedehnt oder verformt werden, ohne dass sie sich von selbst wieder zusammenzieht oder ausrichtet. Die Oberfläche einer derartigen Wundkontaktschicht gleicht sich zudem passgenau an die Oberfläche der zu behandelnden Haut oder Wunde an.

Alternativ kann die Wundauflage auch ein Polyacrylat, ein vernetzes und/ oder
quervernetztes Polyacrylat oder einen Polyacrylat-Superabsorber und ein hydrophiles Fasermaterial umfassen. Hierbei können als hydrophiles Fasermaterial insbesondere wasserunlösliche Fasern aus Cellulose, insbesondere weitgehend delignifizierte technische Zellstofffasern, insbesondere Holzzellstofffasern, insbesondere einer Faserlänge von < 5 mm Verwendung finden. Das Fasermaterial kann auch hydrophiles Fasermaterial aus regenerierter Cellulose, Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose,
Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose enthalten. Es kann auch vorgesehen sein eine Fasermischung aus Cellulose-, regenerierter Cellulose, Carboxymethylcellulose-, Carboxyethylcellulose-, Hydroxymethylcellulose- oder Hydroxyethylcellulose-Fasern und Fasern aus Polyethylen, Polypropylen oder Polyester vorzusehen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Wundauflage eine Mischung aus Cellulosefasem, Polypropylenfasern und einen partikelförmigen, vernetzten Polyacrylat-Superabsorber.

Eine erfindungsgemäße Wundauflage ist insbesondere zur Behandlung von vergleichsweise tiefen chronischen Wunden geeignet. So lassen sich beispielsweise tiefe dermale Ulzera behandeln, die sehr häufig stark nässend sind. Darüber hinaus können mit einer
vorliegenden Wundauflage aber auch trockene Wunden wie beispielsweise trockener Ulcus cruris behandelt werden. Hierbei zeigt die Wundauflage seine Fähigkeit, der Wunde
Flüssigkeit zuzuführen und gleichzeitig unerwünschten Substanzen, Belägen und Nekrosen durch eine schonende Debridierung zu gewährleisten. Unterstützt wird der
Wundheilungsprozess durch einen semi-occlusiven Abschluss mittels eines sekundären Wundverbandes wie beispielsweise eines Filmverbandes, wodurch unerwünschte
Kontaminationen verhindert werden. Andere Kategorien von Wunden, für die die
Wundauflage angewendet werden kann, umfassen ohne darauf beschränkt zu sein
Dekubitus Stufe II, III, IV (Druckgeschwür), Ulcus cruris (Unterschenkelgeschwür, offenes Bein), diabetisches Fußsyndrom, insbesondere chronische Formen dieser Wunden. Damit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Wundauflage umfassend einen Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor aus der Gruppe der Polyacrylat-Superabsorber zur Herstellung eines Mittels zur Wundheilung, insbesondere zur Behandlung von Dekubitus Stufe II, III, IV (Druckgeschwür) oder Ulcus cruris (Unterschenkelgeschwür, offenes Bein) oder diabetisches Fußsyndrom, insbesondere chronische Formen dieser Wunden.

Im Folgenden soll die Wirksamkeit der Polyacrylate anhand von einigen Testungen dargestellt werden. Mit den Figuren sind folgende Zusammenhänge näher erläutert:

Figur 1 : Inhibition von MMP-Aktivität im Wundexsudat durch ein Polyacrylat
Figur 2: Inhibition der MMP-Aktivität durch direkte Bindung an ein Polyacrylat
Figur 3: Inhibition von MMP-Aktivität ohne direkte Bindung an ein Polyacrylat

Stellvertretend für biologische Flüssigkeiten einschließlich Exkrementen wird Wundexsudat im Folgenden behandelt. Wundexsudat mit hoher Proteaseaktivität wurde von Patienten mit chronischen Wunden gewonnen und mit Flüssigkeit voraktivierten Polyacrylaten für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Im folgenden Beispiel erfolgte die Voraktivierung durch Mischung von 0,2 g vernetztem Polyacrylat (Favor Z3034, Fa. Stockhausen, Krefeld - Deutschland) mit 36,94 ml
Ringerlösung (8,6 g NaCI, 0,3 g KCl, 0,33 g CaCI2 • 2 H2O ad 1000 ml Wasser), wobei die Mischung für 24 Stunden in einem abgeschlossenen Gefäß stehen gelassen wird. 100 μg Wundflüssigkeitsprotein einer chronischen Wunde (Ulcus cruris) mit erhöhter Metallo-Proteasen-Aktivität wurde mit Ringerlösung auf 150 μl verdünnt und mit dem gleichen Volumen voraktiviertem Polyacrylat versetzt, wobei näherungsweise die Masse des voraktivierten Polyacrylat-Superabsorber dem Volumen gleichgesetzt werden kann
(Anmerkung: Wundflüssigkeit enthält je nach Patient unterschiedliche Konzentrationen an Protein. Für jede Untersuchung wurde der Gehalt an Protein in der jeweiligen Wundflüssigkeit (WF) bestimmt und davon ein Aliquot 100 μg Protein entnommen und mit Ringerlösung auf 150 μl aufgefüllt). Nach der Inkubation wird der Überstand mittels eines Enzymsubstrats ((GIy-PrO-HyP^5-GIy-PrO-LyS(MCa)-GIy-PrO-PrO-GIyIVaI-VaI-GIy-GIu-LyS(DnP)-GIy-GIu-GIn-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2) *Hyp = 4-hydroxy-L-proline) für Metallo-Proteasen und
fluoreszenzphotometrischer Messung auf das Vorliegen von Gelatinase-Enzymaktivität gegen einen Standard oder geeignete Kontrollen untersucht. Hierzu wurde ein kommerziell erhältliches Kit InnoZyme® Gelatinase Activity Assay Kit (Katalog-Nr. CAB003, Fa.
Calbiochem, San Diego - USA) verwendet. Abweichend von der Vorschrift des Herstellers wurde auf die Aktivierung des Enzyms durch APMA (p-aminophenylmercuric acetate) verzichtet, um die vorhandene MMP-Aktivität zu erfassen. Die modifizierte Vorschrift lautete: - 90 μl Probe (Wundflüssigkeit, Polyacrylat-Superabsorber oder EDTA vorbehandelte Wundflüssigkeit) oder Standard (Standard wurde mit Aktivierungspuffer, der APMA enthielt) oder Kontrolle, die nur aus Aktivierungspuffer bestand, wurden mit 10 μl der fertigen Substratlösung (laut Vorschrift des Herstellers) versetzt.

- Die Mischung wurde bei 37 0C für 24 Stunden inkubiert.
- Die Fluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von 320 nm (Anregung) und 405 nm (Emission) gemessen und die Werte gegen den Standard aufgetragen.

Figur 1 zeigt die Inhibition von MMP Aktivität im Wundexsudat durch ein Polyacrylat. Hierbei wurden 100 μg Wundexsudat-Protein (Wound Fluid) mit Ringerlösung auf 150 μl aufgefüllt und mit 150 μg mit Ringerlösung voraktiviertem Polyacrylat für 2 Stunden inkubiert. Danach wurde der Überstand mit dem MMP-Peptidsubstrat versetzt und die Enzymaktivität nach 24 Stunden Inkubation fluoreszenzphotometrisch gemessen. Als biologische Kontrollen wurde Wundflüssigkeit ohne Polyacrylat-Behandlung (als 100 % gesetzt) und Wundflüssigkeit, deren MMP-Aktivität durch EDTA Zugabe (10 mM Endkonzentration) blockiert wurde, als Negativkontrolle herangezogen.

Hierbei wurden die Polyacrylat-behandelten Wundflüssigkeiten gegen unbehandelte
Wundflüssigkeit des gleichen Patienten (Kontrolle) gemessen, die als 100 % Enzymaktivität gesetzt wurden. Die Aktivität der Polyacrylat-behandelten Wundflüssigkeiten erreichte nach Messung Werte, die deutlich unter den Werten der Kontrolle lagen. Die Inhibition mit 10 mM EDTA, einem starken Inhibitor der Metalloproteasen, konnte die Restaktivität der Polyacrylat-behandelten Wundflüssigkeiten nur noch um wenige Prozentpunkte hemmen (Figur 1). Diese Versuche wurden mit Wundflüssigkeit verschiedener Patienten reproduziert.

Anschließend wurde analysiert, ob MMP-Aktivität aus Wundflüssigkeit an Polyacrylat bindet. Wundsekret chronischer Wunden wurde analog den obigen Experimenten mit Polyacrylat für 2 Stunden inkubiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und mit dem gleichen Volumen 2x SDS-GeI Probenpuffer (siehe unten) versetzt, bei 95 0C für 10 Minuten im Wasserbad aufgekocht und anschließend bis zu seiner Verwendung bei - 20 0C gelagert. Der so behandelte Polyacrylat-Superabsorber wurde nach der Inkubation 3x mit einem Überschuss (5 w/w) Waschpuffer (10g Bovine Serum Albumin (Sigma A-2153), 8,6 g NaCI, 0,3 g KCl, 0,33 g CaCI2 - 2 H2O ad 1000 ml Wasser) gewaschen. Das so behandelte
Polyacrylat wurde mit 1 Volumen (v/w) 2x SDS-GeI Probenpuffer versetzt, bei 95 0C für 10 Minuten im Wasserbad aufgekocht und anschließend bei -20 0C gelagert oder direkt der Gelatine-Zymographie unterzogen. Dazu wurde ein Aliquot der Wundflüssigkeit, des mit Polyacrylat behandelten Überstandes and der Polyacrylat gebundenen Proteine auf ein Gelatine enthaltendes SDS Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

Diese Technik ist äußerst sensitiv und basiert auf einer Auftrennung der Proteasen in einem SDS-GeI, welches gleichzeitig ein Proteasesubstrat (Gelatine) enthält.

Das Gel setzt sich zusammen aus (alle Chemikalien Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim - Deutschland):
- 3,3 ml Gelatinelösung (Gelatine, porcine skin (CAS-Nr. 9000-70-8), 3 mg/ ml H2O),

- 0,85 ml destilliertes H2O,
- 2,5 ml 1 ,5M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) /
HCl/ 0,4% SDS-Lösung (Sodiumdodecylsulfat-Lösung), pH 8,8,
- 3,35 ml 30% Acrylamid/ 0,8% Bisacrylamid Lösung,
- 50 μl (10%, w/v) Ammoniumpersulfat und
- 5 μl TEMED (N, N, N\ Λ/'-Tetramethylendiamin);
das Obergel entspricht
- 3,075 ml destilliertes H2O,
- 0,625 ml 0,5M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) /
HCl/ 0,4% SDS-Lösung (Sodiumdodecylsulfat-Lösung), pH 6.8,
- 0,75 ml 30% Acrylamid/ 0,8% Bisacrylamid Lösung,
- 50 μl (10%, w/v) Ammoniumpersulfat und
- 5 μl TEMED (N, N, N', Λ/'-Tetramethylendiamin)

Die Gele können als so genannte Minigele oder in anderen Apparaturen als konventionelle Zymogramme zur Auftrennung des Proteingemisches verwendet werden. Dem Fachmann sind dies Apparaturen und Methoden bekannt.

Der Probenauftragspuffer kann ein beliebiger Proteinauftragspuffer sein, der keine reduzierenden Substanzen erhalten darf. Nach der Auftrennung werden die Proteasen renaturiert (waschen für 2x15 Min. in 2,5% Triton-X-100 in H2O, dann waschen für 2x15 Min. in 50 mM Tris/ HCl pH 7,4; 5 mM CaCI2) und für 24-48 Std. in dem letzten Waschpuffer inkubiert. Die renaturierten Metallo-Proteasen bauen das Gelatinesubstrat in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft ab. Färbt man diese Zymogramme mit einem Proteinfarbstoff (Coomassie CAS-Nr. 6104-59-2, Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim -Deutschland), gefolgt von der Entfärbung nach Standardprotokollen, stellt sich die nicht abgebaute Gelatine homogen blau im Gel dar (in der Abbildung Figur 2 grau/ schwarz dargestellt). Nur an Stellen an denen sich proteolytische Aktivität befindet und die Gelatine abgebaut wurde, imponieren klare, durchsichtige Banden, sogenannte „Fressbanden" (in der Abbildung Fig. 2 weiß auf grauem/ schwarzen Grund dargestellt). An Hand des typischen Musters und des durch einen Proteinmarker ermittelten Molekulargewichtbereichs (hier nicht dargestellt) konnte die Art des Enzyms bestimmt werden. Die hier beschriebene Methode und Variationen davon (z.B. Herron et al., J Biol Chem. 1986 261 :2814-8) sind dem
Fachmann geläufig.

In diesen Experimenten war eine deutliche Bindung der MMP an den Polyacrylat-Superabsorber festzustellen. Einhergehend war eine Abreicherung der MMP-Aktivität in der mit Polyacrylat behandelten Wundflüssigkeit festzustellen. Die Bindung und Immobilisation am Polyacrylat kann als hochaffin angesehen werden, da sie trotz Waschschritten erhalten blieb. Die Resultate sind in Fig. 2 dargestellt, wobei in der ersten Kolonne (1) die MMP-2-und MMP-9-Aktivität in der unbehandelten Wundflüssigkeit dargestellt ist. In der zweiten und dritten Kolonne ist die Aktivität der mit dem oben genannten Polyacrylat behandelten Wundflüssigkeit derselben Wunde gezeigt. In der dritten Kolonne (3) sind die Aktivitäten der an das voraktivierte Polyacrylat gebundenen MMP aufgetragen (die MMP wurden durch Erwärmen im Auftragspuffer von dem Polyacrylat abgelöst), wogegen in der zweiten Kolonne (2) die Aktivität der im Überstand verbliebenen MMP gezeigt ist.

Schließlich wurde untersucht, ob Polyacrylat auch ohne direkten Kontakt die MMP-Aktivität inhibieren kann. Dazu wurde Wundflüssigkeit mit hoher MMP-Aktivität in einem Gelatine-Zymographie Gel dreimal nebeneinander mit Marker aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gelatine-Zymogramm wurde in drei Teile (jeweils Marker und
Wundflüssigkeit-Protein enthaltend) geschnitten und der erste Teil entsprechend der Standardvorschrift renaturiert und entwickelt. Der zweite Teil wurde identisch behandelt, nur dass dem Entwicklungspuffer (50 mM Tris/HCI pH 7,4, 5 mM CaCI2) während der
Entwicklung mit Ringerlösung-voraktivierter Polyacrylat zugegeben wurde (15 g
Ringerlösung-voraktiviertes Polyacrylat / 30 ml Entwicklungspuffer). Der dritte Teil wurde in Gegenwart von 50 mM EDTA (Endkonzentration) im Entwicklungspuffer entwickelt. Die drei Zymogrammteile wurden gemeinsam gefärbt und die MMP-Aktivität anhand der klaren Banden bewertet, wobei das Zymogramm (1) die positive Kontrolle, die Aktivität von MMP-2 und MMP-9 ohne Behandlung mit oben genanntem Polyacrylat, Zymogramm (2) die Aktivität der MMP aus mit Polyacrylat behandeltem Wundsekret (der nicht von dem Polyacrylat gebundene Anteil) und im Zymogramm (3) die Aktivität der MMP aus mit EDTA behandeltem Wundflüssigkeit gezeigt ist (vgl. Figur 3). In Figur 3 zeigt eine klare Hemmung der MMP-Aktivität in dem mit Ringerlösung-voraktivierter Polyacrylat Gelteil. EDTA, ein bekannter Hemmstoff der MMP-Aktivität, hat, wie erwartet, die MMP-Aktivität in diesen Experimenten komplett blockiert.

Die Experimente belegen eindeutig, dass Polyacrylate die MMP-Aktivität direkt durch Kompartimentierung aber auch durch Hemmung über eine Distanz und ohne direkten Kontakt stark und effektiv reduzieren. Im biologischen Kontext verschiebt sich das Verhältnis von Granulationsgewebeabbau durch exzessive MMP-Aktivität in chronischen Wunden und Granulationsgewebeaufbau im Rahmen der Wundheilung zugunsten des Aufbaus und einer verbesserten Heilung.

Die Inhibierung der Matrix-Metallo-Proteasen mit der Folge der Heilung von chronischen Wunden konnte in klinischen Untersuchungen gezeigt werden. In dieser Untersuchung wurden drei repräsentative Patienten, die an einem offenen Druckgeschwür (Ulcus cruris) leiden, mit einer Polyacrylat in Form von Partikeln enthaltenen Wundauflage (TenderWet activ - Fa Hartmann) behandelt. Die Wunden sind als chronische Wunden einzustufen. Während der Behandlung wurde über einen Zeitraum von 4 Wochen ein Verbandwechsel täglich durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde der Wundverband gewechselt und die gebrauchten Verbände zur späten Untersuchung bei - 80 °C gelagert. Zur Untersuchung jeder Wundauflage wurde jeder Wundauflage 300 mg Polyacrylat-Partikel entnommen, mit 225 μl Probenpuffer (vgl. oben) inkubiert und bei 95 0C für 5 Minuten im Wasserbad aufgekocht. Eine Serien-Verdünnungsreihe jeder Probe (jeder Wundauflage) wurde durchgeführt. Exemplarisch ist mit Figur 4 das Ergebnis einer dieser Untersuchungen gezeigt, wobei A eine Verdünnungsreihe einer Probe darstellt, die Polyacrylat aus einer am ersten Behandlungstag verwendeten Wundauflage enthält und B eine Verdünnungsreihe einer Probe darstellt, die Polyacrylat aus einer am zwölften Behandlungstag verwendeten Wundauflage enthält. Die Coomassie Färbung zeigt den Gesamtproteingehalt der Probe an und die Zymographie die darin enthaltene Matrix-Metalloprotease Aktivität auf. Die
Untersuchungsmethoden Coommassie und Zymography sind dieselben, die oben
beschrieben sind. Mit dieser in-vivo-Untersuchung kann gezeigt werden, dass die Metallo-Proteasen MMP-2 oder MMP-9 durch Polyacrylat gebunden werden. Durch die
Kompartimentierung der Metalloproteasen und dem täglichen Verbandwechsel wurde den Wunden ein die Wundheilung behindernder Überschuss an Metallo-Proteasen entzogen. Der einhergehende klinische Befund der Behandlung ist, dass die Behandlung mit einer
Polyacrylat enthaltenen Wundauflage eine chronische Wunde in einen normalen
Wundheilungsverlauf überführt werden kann. Klinisch zeigte sich dies an einer Verringerung des Defektvolumens (Wundtiefe und/ oder Wundgröße).