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1. WO2006092530 - METHOD FOR PROGNOSIS OF A RESPONSE TO AN INFLIXIMAB TREATMENT OF PATIENTS SUFFERING FROM RHEUMATOID ARTHRITIS

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[ FR ]

PROCEDE POUR LE PRONOSTIC D' UNE REPONSE A UN TRAITEMENT PAR L' INFLIXIMAB DES PATIENTS ATTEINTS DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE

La présente invention concerne la polyarthrite rhumatoïde, et notamment un procédé pour déterminer la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement 5 dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une affection chronique qui se caractérise par l'inflammation et la déformation de plusieurs articulations avec, en outre, un risque de complications extra- articulaires. La connaissance concernant le rôle de cytokines dans des

10 interactions de cellule- cellule a mené au développement raisonnable de traitement avec des agents anticytokine.
La gravité de l'affection varie d'un sujet à l'autre, mais elle est associée à long terme à une augmentation de la morbidité et de la mortalité. Le traitement symptomatique fait appel à des anti- inflammatoires non stéroïdiens, et éventuellement à des corticostéroïdes.

15 Actuellement, le méthotrexate apparaît comme le traitement de référence. Des traitements inhibiteurs des cytokines proinflammatoires sont également proposés pour le traitement de fond de la polyarthrite rhumatoïde. On peut citer à ce titre, l'étanercept et l'Infliximab®, qui sont deux inhibiteurs dirigés contre le TNF (Tumor Necrosis Factor), une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la polyarthrite rhumatoïde. De telles

20 molécules sont qualifiées d' anti- TNF. D'une manière plus générale, le facteur TNF alpha est apparu comme une cible principale thérapeutique basée sur des études cliniques avec des inhibiteurs biologiques comme des anticorps monoclonaux ou des récepteurs solubles. A ce titre, l'Infliximab® est prescrit pour réduire l'inflammation mais également pour ralentir l'évolution de la polyarthrite rhumatoïde lorsque d'autres médicaments sont insuffisants.

25 Toutefois, tous les patients ne répondent pas d'une manière comparable à un traitement par l'Infliximab®. Ainsi, des radiographies d'articulations de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et traités par l'Infliximab®, prises après un an ont révélé que, si un nombre important de patients a bénéficié d'amélioration, un plus petit nombre avait subi une détérioration articulaire. D'une manière comparable, tous les patients ne répondent pas d'une manière comparable à un traitement par l'étanercept.
H est donc important d'un point de vue clinique de déterminer, avant toute prescription, si le patient répondra ou non au traitement proposé par le médecin.
A l'heure actuelle, il n'existe aucun procédé permettant de déterminer, préalablement à un traitement par un anti-TNF, quel pourra être la réponse d'un patient pris individuellement. La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil biologique pour améliorer le traitement d'un patient contre la polyarthrite rhumatoïde. La présente invention permet en effet de déterminer la réponse d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoïde à un traitement tel que l'Infliximab®.

La présente invention est également très pertinente pour le suivi de réponse d'un patient soumis à un traitement tel que l'Infliximab®.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la réponse d'un patient envers un tel traitement peut être déterminée par l'analyse de l'expression du gène codant la synovioline, notamment dans le sand périphérique. Les inventeurs ont également démontré que la suivi de réponse d'un patient à un traitement tel que l'Infliximab® peut être réalisée par le suivi de l'expression du gène codant la synovioline.

A cet effet, l'invention concerne un procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps caractérisé en ce qu'on mesure l'expression du gène codant la synovioline.
Préférentiellement, le traitement est dirigé contre la cytokine TNF alpha. On peut citer à ce titre un traitement bloquant l'action du TNF, tels que notamment l'Infliximab®, l'étanercept et radalimumab.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la mesure de l'expression du gène codant la synovioline est réalisée de la manière suivante :
a) on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique,
b) on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline;
c) on détermine l'expression du gène codant la synovioline
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de tissu, de synoviocytes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin.
Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques connus de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible.
A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : - une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet WO 00/05338, WO 99/53304, WO 99/15321. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809).
- une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou co valence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO-A- 97/45202 et WO-A- 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes ou magnétiques. D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique. Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique.

Lors de l'étape b), et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 7O0C, en particulier entre 35 et 650C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide, soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Préférentiellement, on utilise une amorce comprenant tout ou partie d'une séquence de SEQ ID N0I ou 2, préférentiellement un couple d'amorces comprenant la SEQ ID N0 et la SEQ ID N°2. Par réaction d'amplification enzvmatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :
- PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US

4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159,
LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184,
RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995,
NASBA (Nucleic Acid Séquence- Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et
- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491.
Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques du gène cible, afin de permettre l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Préférentiellement, on utilise une amorce comprenant tout ou partie d'une séquence de SEQ ID N0I ou 2. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation.
Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant au moins 5 motifs nucléotidiques, tel que de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I.
Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détectioa Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection «molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2 780 059. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par co valence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A- 94/12670, d'une particule. Ces étapes d'hybridation sur support peuvent être précédées d'une étape de réaction d'amplification enzymatique, telle que définie précédemment, pour augmenter la quantité de matériel génétique cible.

Lors de l'étape c) la détermination de l'expression du gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier.

D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.
L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible.
Lorsque le réactif spécifique comprend une ou des amorces d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).
2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' « ADNc spécifiques du gène cible » ou d' « ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment.
3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces techniques d' électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA, J Mol Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).
2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L' ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.
3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybrides les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.

Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type 17 polymérase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.
2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment.
3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybride un grand nombre de sondes.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être notamment mise en oeuvre par «NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment, pour déterminer la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps. Préférentiellement, le traitement est dirigé contre la cytokine TNF alpha. On peut citer à ce titre un traitement bloquant l'action du TNF, tels que notamment l'Infliximab®, l'étanercept et l'adalimumab.

L'invention concerne enfin un kit de pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, ledit traitement étant tel que défini ci dessus, comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment.

L'invention concerne également un kit pour le suivi de réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, ledit traitement étant tel que défini ci dessus, comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment.

L'analyse de l'expression de la synovioline permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie. On peut par exemple analyser l'expression du gène cible chez un patient dont on ne connaît pas sa réaction à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients répondant audit traitement et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients non répondant audit traitement. Ceci permet de déterminer si le patient est répondant ou non répondant, ce qui permet de lui proposer un traitement adapté ou d'adapter son traitemnt tout au long de sa thérapie.

L'exemple suivant est donné à titre illustratif et n'a aucun caractère limitatif. Il permettra de mieux comprendre l'invention.

Exemple - Etude de l'expression du gène codant la synovioline pour le diagnostic / pronostic de la polyarthrite rhumatoïde
Patients - L'étude a été réalisée sur des patients contrôles (C, n = 23) ou atteint de polyarthrite rhumatoïde (PR, n =47). Les groupes de patients PR et C avaient un sex-ratio et une moyenne d'âge similaire. Les patients PR étaient classés selon les critères révisés du Collège Américain de Rhumatologie (Arnett et al. Arthirtis Rheum 1988;31:315-324). Les échantillons sanguins étaient prélevés et collectés dans des tubes

PAXGeneTM Blood RNA (PreAnalytix, Hilden, Germany).
Traitement - Tous les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde recevaient une injection intraveineuse de 3 mg/kg d' Infliximab® aux semaine 0, 2, 6, 14, et 22.

L'Infliximab® est un inhibiteur du TNF alpha. Les inhibiteurs du TNF alpha apportent une amélioration rapide des signes cliniques et biologiques dans la polyarthrite rhumatoide refractaire aux autres traitements, notamment au methotrexate. L'Infliximab® ou remicade ® est un anticorps anti-TNF alpha chimérique. Un traitement au methotrexate (MTX) était prescrit également. La réponse clinique était évaluée après la première injection (semaine 0) et immédiatement après la cinquième injection (semaine 22) par l'utilisation des critères suivants: douleurs articulaires, gonflements articulaires, évaluation de la douleur du patient, évaluation globale de la maladie du point de vue du patient, l'évaluation globale de la maladie du point de vue du médecin, un Questionnaire d'Évaluation de Santé, le niveau sérique de la C réactive protéine (CRP) et le taux de vitesse de sédimentation (ESR). On distinguait les patients bons répondeurs (BR) au traitement et les mauvais répondeurs (MR) au traitement.
Culture de synoviocytes - Une lignée cellulaire de synoviocytes fibroblast-like (FLS) était obtenues à partir d'un prélèvement de patients (PR). Des cellules contrôles issus d'un prélèvement de peau des patients PR étaient également analysée (CT). Les FLS et CT étaient isolées par une enzyme de digestion et mises en culture dans un milieu RPMI comprenant 10% de sérum fœtal de veau (Invitrogen) à 370C dans un incubateur humide comprenant 5% de CO2 tel que décrit précédemment (Toh et al. Arthritis Rheum 2004 Oct ;50(10) :3118-3128). Les synoviocytes, ainsi que les cellules contrôles ont ensuite été cultivés dans des microplaques de 96 puits (10 000 cellules par puits) dans un volume final de 200 μl dans un milieu de culture complété avec 10 % FCS et traité avec de l'IL- 1 β (0.1 ng/ml, Immunotools, Friesoythe, Germany) ou du TNFα? (1 ng/ml, Immunotools, Friesoythe, Germany).
Analyse de l'expression du gène codant la synovioline - L'expression du gène codant la synovioline a été mesurée par PCR en temps réelle dans le sang périphérique de patients contrôles (C) et de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (PR) avant et après 6 mois de traitement à l'Infliximab®. L'expression du gène codant la synovioline a été également mesurée dans la lignée cellulaire FLS et les cellules contrôles CT. Le gène codant la cyclophiline B (PPIP) était utilisé comme gène de ménage pour les échantillons sanguins, et le gène codant la beta actine était utilisé comme gène de ménage pour les lignées cellulaires FLS et les cellules contrôles CT tels que décrit précédemment (Pachot et al, J. Biotechnology 2004;114:121- 124 ; Toh et al, Arthritis Rheum 2004;50:3118-3128.). Les ARN totaux étaient extraits du sang total par l'utilisation du kit PAXGeneTM Blood RNA kit (PreAnalytix) et étaient purifiées par l'utilisation d'un kit RNA- easy (Qiagen, Hilden, Germany). Les ARN étaient extraits des cellules FLS et CT par l'utilisation de TRIzol (Gibco BRL) et étaient purifiées par l'utilisation d'un kit RNA- easy (Qiagen, Hilden, Germany). Les cDNA étaient préparés à partir d'un 1 μg d'ARN totaux par l'utilisation d'un système Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, California, USA). Une quantité de 1 μg d'ARN était reverse- transcrit par l'utilisation du système Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, California, USA) et une amplification par PCR étaient réalisée sur LightCycler (Roche) par l'utilisation du kit Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I real-time PCR (Roche Molecular Biochemicals). Les amorces spécifiques pour la synovioline qui ont été utilisés étaient les suivants :
SEQ ID N0I: 5'- GTT TAC AGG CTT CAT CAA GG-3' et
SEQ ID N°2: 5'-CAT GAT GGC ATC TGT CAC AG -3' .
Pour la cyclophiline B, les primers étaient obtenus auprès de LC-Search (PPIB, accession number: M60857, amplicon 105 to 338). Pour la beta actine, les primers utilisés étaient les suivants (Toh et al, Arthritis Rheum. 2004 Oct ;50(10) :3118-3128) :
SEQ ID N°3 : 5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT- 3' et
SEQ ID N°4' -GATGTCACGCACGATTTCC-5'
Un volume de 10 μl de ADNc standard et de dilutions d'ADNc provenant des échantillons étaient additionnés aux tubes capillaires. L'amplification était réalisée dans un volume final de 20 μl comprenant une concentration en amorces de 10 μM, 25 mM de chlorure de magnésium (MgC12), ainsi que l'enzyme Taq et le marqueur SYBR Green I contenu dans le kit LightCycler Fast start DNA Master SYBR green I (Roche). La PCR était réalisée pendant 45 cycles d'amplification (10 secondes à 950C, 10 secondes à 680C et 16 secondes à 720C). Pour chacun des gènes d'intérêt, un standard a été préparé par une amplification PCR (polymerase chain reaction) conduite jusqu'à saturation. Les amplicons obtenus ont été purifiés (PCR purification kit, Qiagen Ltd) et la présence d'un amplicon unique a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d'éthidium. L'expression des ARNm était déterminé par l'utilisation du logiciel LightCycler. Analyses statistiques - Les résultats étaient exprimés par la moyenne ± SEM.

Les différences de valeurs étaient calculés par un test ANOVA, et les valeurs ayant une probabilité inférieure à 0.05 était considérés comme significativement différentes.
Résultats
Analyse de l'expression de la synovioline chez des patients témoins et des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci après.


Tableau 1
Ce tableau 1 présente le niveau d'expression des ARNm du gène codant la synovioline chez des patients contrôles (C) et patients atteint de polyarthrite rhumatoide (PR). Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 1 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05.
Les patients PR présentaient un niveau d'expression des ARNm de la synovioline significativement augmenté par rapport aux patients contrôles.

Analyse de l'expression de la synovioline dans les lignées cellulaires FLS et les cellules contrôles CT
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 et 4 ci dessous.



Tableau 2
Le tableau 2 présente le rapport le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules FLS mises en culture en présence de ILl beta (0.1 ng/ml) ou de TNF alpha (lng/ml). Le TNF augmentait l'expression de synovioline pendant 6h. L'ILl augmentait également l'expression de synovioline qui restait élevée jusqu'à 24h.



Tableau 3
Le tableau 3 présente le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules FLS mises en culture en présence de différentes concentrations de ILl beta ou de TNF alpha. Le rapport était dépendant de la concentration en ILl beta et de TNF alpha
Ces résultats démontrent que l'upregulation de la synovioline par le TNF alpha et l'ILl beta peut contribuer à la dérégulation de la prolifération de FLS dans la polyarthrite rhumatoïde.



Tableau 4 Le tableau 4 présente le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules contrôles CT mises en culture en présence de ILl beta (0.1 ng/ml) ou de TNF alpha (lng/ml). Aucune augmentation significative d'expression de synovioline n'était observé en présence de ILl ou de TNF.

Analyse de l'expression de la synovioline chez des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide répondant à un traitement à l'Infliximab® et chez des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide ne répondant pas à un traitement à l'Infliximab® Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5 ci dessous.


Tableau 5
Ce tableau 4 présente le niveau d'expression des ARNm du gène codant la synovioline chez des patients répondeurs (BR) et des patients non répondeurs (MR), avant et 6 mois après traitement. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophiline B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 5 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les patients MR présentaient un niveau d'expression des ARNm de la synovioline signiflcativement augmenté avant et après le traitement par rapport aux patients BP. L'expression des ARNm de la synovioline était diminuée après 6 mois de traitement chez des patients BP mais pas chez les patients MR. L'expression de la synovioline était signiflcativement augmentée chez les patients BP par comparaison aux patients contrôles.

Conclusion - L'étude de l'expression des ARNm des gènes codant la synovioline 3 partir de prélèvements de sang total permet ainsi de discriminer très efficacement les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde de patients contrôles, mais permet également de discriminer les patients bons répondeurs, des patients mauvais répondeurs à un traitement par l'Infliximab®. La synovioline est donc un excellent marqueur de diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde, mais surtout de pronostic quant à la réponse d'un patient vis à vis d'un traitement. La synovioloine est également un excellent marqueur pour le suivi d'un patient sous traitement à l'Infliximab®. Ceci permet au médecin d'identifier rapidement les patients qui ne répondent par à l'Infliximab®, ce qui permet de leur donner un autre traitement plus adapté.