Herstellung und Verwendung des Konjugats Methotrexat-Albumin als
Mittel zur Immunsuppression bei GVHD
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Wirkstoff-Protein-Konjugaten zur Modulierung und insbesondere zur Vermeidung von Transplantation-assoziierten Immunreaktionen. Weiterhin werden neue, vorteilhafte Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäß einsetzbaren Konjugate bereitgestellt.
Wirkstoff-Protein-Konjugate werden verwendet, um durch Kopplung von kör-perfremden Wirkstoffen an ein körpereigenes Protein längere Halbwertszeiten bei Verabreichung von therapeutischen oder/und diagnostischen Wirkstoffen zu erhalten (vgl. DE 41 22 210 A1 oder WO96/32133). Bei der Behandlung von Tumorerkrankungen wird die Aufnahme von Proteinen durch proliferierende Tumorzellen ausgenützt, um den an Proteine ge-bundenen Wirkstoff in solchen Zellen anzureichern, während gesundes Gewebe keine Veranlassung zur Proteinaufnahme hat. Dadurch kann eine Anreicherung der Wirkstoffe in Tumorzellen erhalten werden.
So beschreibt DE 41 22 210 A1 Konjugate aus einer tumoraktiven Verbindung, die mindestens eine Carboxylgruppe aufweist, und einem Protein, das vom Organismus nicht als fremd angesehen wird, wobei das Protein in nativer Form vorliegt. Diese Konjugate werden zur Behandlung von Tumorerkrankungen, jedoch nicht bei Transplantations-assoziierten Immunreaktionen eingesetzt. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate beschrieben.
Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 879 604 A1 sind Konjugate, umfassend einen Folsäureantagonisten und einen Träger, bevorzugt natives
Protein, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen, Entzündungen und/oder Autoimmunerkrankungen, jedoch nicht zur Behandlung von Transplantations-assoziierten Immunreaktionen bekannt.
Allogene Knochenmarktransplantationen (KMT) werden in zunehmenden Maß bei der hochdosierten Strahlentherapie, Therapie haematologisch-on-kologischer Erkrankungen, beispielsweise von Leukämien, Lymphomen, aplastischer Anämie oder Nierenzellkarzinomen eingesetzt. Sie sind jedoch nach wie vor, insbesondere bedingt durch immunologische Komplikationen, beispielsweise in Form der Graft-Versus-Host-Krankheit (GVHD) mit einer erheblichen direkten und indirekten Morbidität und Mortalität assoziiert, was ihre breitere Anwendbarkeit einschränkt.
Levy offenbart in seiner Veröffentlichung (Chem. Abstracts 83 in Agents and Actions, 1975, 5. Ausgabe, Nr. 3, S. 268 - 271) die immunsuppressive Wirkung von Cyclophosphamid und Methotrexat, welche immunmodulierende Medikamente sind, auf die Graft-Versus-Host-Krankheit (GVHD) im Ratten- und Mausmodell.
Die bis zum jetzigen Zeitpunkt eingesetzten immunmodulierenden Medi-kamente konnten zwar die Mortalität der akuten und chronischen GVHD zum Teil vermindern, versagen jedoch bei einem Teil der Patienten und sind teilweise auch mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Hier dominiert als Folge einer breiten Immunsuppression die Gefahr der systemischen Infektion. Dazu kom mt eine Reihe Medikamenten-spezifischer Organtoxizitäten der bisher eingesetzten Medikamente, die insbesondere unter der häufig langwierigen Anwendung über Wochen oder Monate zu Komplikationen führen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereitzustellen, mit dem die im Stand der Technik auftretenden Schwierigkeiten überwunden werden können und mit dem insbesondere die Ü erlebensrate bei allogenen Knochenmarktransplantationen verbessert werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Konjugats, umfassend eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion.
Es wurde nun festgestellt, dass Konjugate aus Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindungen und Proteinen, insbesondere Albumin oder Transferrin auch erfolgreich zur Modulierung von Transplantations-assozi-ierten Immunreaktionen eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate enthalten eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, bei der es sich insbesondere um einen Wirkstoff, mehr bevorzugt um einen niedermolekularen Wirkstoff mit einem Molekulargewicht ≤ 1000 Da und mehr bevorzugt ≤ 500 Da handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Wirkstoff um ein Cytostatikum bzw. um ein Immunsuppressivum. Besonders bevorzugt wird Methotrexat bzw. Aminopterin, am meisten bevorzugt Methotrexat eingesetzt. Der Fol-säure-Antagonist Methotrexat oder 4-Amino-4-desoxy-10-methylfolsäure (C20H22N8O5) ist ein Cytostatikum. Dieser Wirkstoff ist ein bewährter niedermolekularer Wirkstoff bei der Prophylaxe von GVHD und hat eine Dosisabhängige immunsuppressive Wirkung. In der erfindungsgemäß verabreichten Konjugatform kann bei insgesamt geringer und somit nebenwirkungsfreier Verabreichung eine hohe Konzentration und insbesondere eine immun-suppressive Menge des Wirkstoffs am gewünschten Wirkort erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Konjugat umfasst Proteine in nativer Form. Das Protein weist bevorzugt als Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, mehr bevor-zugt ≥ 50.000 Da auf. Günstigerweise wird, je nach Patient, dem das Konjugat verabreicht werden soll, ein entsprechendes natives Protein, insbesondere Albumin ausgewählt, also beispielsweise für die Verabreichung an Menschen ein humanes Protein und bei der Verabreichung an Tiere, bei- spielsweise Mäuse, entsprechend ein rvlaus-Protein. Geeignete Proteine sind z.B. Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin (HSA) oder Trans-ferrin. Besonders bevorzugt wird Albumin als Protein eingesetzt.
Die kovalente Bindung niedermolekularer Wirkstoffe an das Makromolekül Albumin wird beispielsweise in der DE 41 22 210 A1 oder in der WO 96/32133 beschrieben, wobei dort das Konjugat zur Behandlung von Tumorerkrankungen bzw. zur Behandlung von EΞntzündungs-, Infektions- und/oder Hauterkrankungen eingesetzt wird. Es wurde nun festgestellt, dass sich sol-ehe Konjugate auch hervorragend zur Prophylaxe bzw. Behandlung von Transplantations-assoziierten Immunreaktionen, wie beispielsweise GVHD eignen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ermöglichen eine deutlich gezieltere und optimierte Wirku ng, insbesondere von Cytostatika und anderen Wirkstoffen in entzündlichem Gewebe und proliferierenden Stoffwechsel-aktiven Zellen. Bei einer Transplantation sind die relevanten Zellen reaktive Lymphozyten und Zellen des monozyten Phagozytensystems (MPS), hier insbesondere die dendritischen Zellen der reaktiven lymphatischen Gewebe. Es wurde zudem überraschenderweise festgestellt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate nicht eine generelle Immun-suppression im gesamten Organismus verursachen sondern vielmehr eine selektive Modulierung und insbesondere Suppression von Transplantations-assoziierten Immunreaktionen und bevorzugt von GVHD bewirken.
Die optimierte Aufnahme wird insbesondere durch eine günstige Kinetik von Albumin, beispielsweise mit einer Plasma halbwertszeit von ca. 19 Tagen im Menschen, und durch die Bedeutung von Albumin als potenzieller Nährstoff für proliferierende Zellen bewirkt. Währen bei der Verabreichung von freien Wirkstoffen der Anteil der Wirkstoffe, die in den für Transplantations-assozi-ierte Immunreaktionen relevanten Zellen nur kurzzeitig zur Wirkung gekom-men sehr gering ist, ermöglichen die erfindungsgemäßen Konjugate eine Anreicherung des Wirkstoffs in den relevanten Zellen über einen langen Zeitraum.
Aufgrund der langen biologischen Halbwertszeit ist z.B. der Aktivitätsanteil im Blut des Konjugats MTX-HSA etwa 300 mal größer als der des niedermolekularen MTX alleine.
Im Organismus werden unbekannte Substanzen üblicherweise schnell ausgeschieden bzw. abgefangen, beispielsweise wasserlösliche Verbindungen über die Nieren ausgeschieden oder wasserunlösliche Verbindungen innerhalb weniger Minuten von der Leber abgefangen. Körpereigene Eiweiße, beispielsweise Albumin haben dagegen eine lange Verweilzeit im Organis-mus. Es ist in hohen Mengen in Geweben vorhanden und nicht immunogen. Durch Kopplung von an sich schnell aus dem K örper entfernt werdenden Wirkstoffen an solche körpereigene Eiweiße werden die Wirkstoffe vor den Ausscheidungs- bzw. Abfangmechanismen des Körpers verborgen und können somit ebenfalls eine lange Halbwertszeit im Körper erreichen. Da-durch ist es aber möglich, nur geringe Mengen an Wirkstoff zu verabreichen und somit gegebenenfalls auftretende Nebenwirkungen praktisch vollkommen auszuschalten. Toxische Effekte auf gesundes Gewebe oder Organe erfolgt praktisch nicht, da normale Zellen keine Veranlassung zur Proteinaufnahme haben. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass die er-findungsgemaßen Konjugate nicht nur in Tumorzellen sondern auch in für Transplantations-assoziierten Immunreaktionen relevanten Zellen aufgenommen werden und somit zu einer Wirkstoffanreicherung in diesen Zellen führen.
Aufgrund der langen Verweildauer der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate im Körper kann eine Prophylaxe oder/und Behandlung von GVHD erfolgreich durchgeführt werden, auch wenn die Intervalle zwischen den einzelnen Verabreichungen des Konjugats mehr als 5 Tage, vorzugsweise mehr als 10 Tage, insbesondere mehr als 13 Tage oder sogar mehr als 20 Tage betragen. Auf diese Weise ist es möglich, Patienten ohne das Auftreten von Nebenwirkungen über Jahre hinweg z.B. alle 2 bis 3 Wochen eine entsprechende Erhaltunsdosis zu verabreichen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate enthaltend einen kovalent an ein Protein, insbesondere an Albumin gebundenen Wirkstoff, bevorzugt Methotrexat, eignen sich zur Modulierung und insbesondere zur Vermeidung von Transplantation-assoziierten Immunreaktionen. Unter Modulierung wird dabei hierin jede Beeinflussung bzw. Veränderung der Immunreaktionen verstanden und insbesondere eine Verstärkung oder Verringerung der Immunreaktion, insbesondere um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 20 %. Besonders bevorzugt wird eine wesentliche Verringerung um z.B. mindestens 50 %, mehr bevorzugt um mindestens 70 % oder eine Vermei-düng der Transplantations-assoziierten Immunreaktionen erreicht. Diese Wirkung eröffnet ein breites Einsatzspektrum für die erfindungsgemäßen Konjugate zur Vermeidung immunologischer Kom plikationen bei Transplantationen, insbesondere bei allogenen ode r autologen Knochenmarktransplantationen aber auch zur Vermeidung von Empfänger-ver-mittelten Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen, insbesondere bei Fremdspender-Organtransplantationen von beispielsweise Niere, Herz oder Leber.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können deshalb vorteilhafterweise zur Behandlung oder/und Prophylaxe von GVHD und insbesondere von akuter oder chronischer GVHD eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich insbesondere zur Verabreichung an Menschen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate erfolgt in der Regel intravenös. Für eine wirksame Behandlung werden als Dosiseinheit vorzugsweise 0,1 bis 1000 mg Konjugat pro kg Körpergewicht, insbesondere 1 bis 100 mg Konjugat pro kg Körpergewicht verabreicht. Mit den erfindungsge-mäßen Konjugaten kann bei geringer Dosierung von z.B. ≤ 5 mg und insbesondere ≤ 3 mg Konjugat pro kg Körpergewicht bereits eine Wirkung erzielt werden. In den Konjugaten beträgt das Molverhältnis von Wirkstoff zu Trägerprotein vorzugsweise 1:1000 bis 2:1, insbesondere 1 :100 bis 1,1 , besonders bevorzugt 0,9 bis 1,1 :1. So zeigt z.B. Albumin bei einer 1 :1 Beladung mit Methotrexat immer noch natives Verhalten. Eine Dosiseinheit an Wirkstoff beträgt vorzugsweise 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht, insbesondere 1 bis 10 mg pro kg Körpergewicht, wobei oftmals geringe Dosiseinheiten von ≤ 5 mg, insbesondere ≤ 2 oder < 1 mg pro kg Körpergewicht besonders bevorzugt sind. Aufgrund der langen Verweilzeit der Konjugate im Menschen ist dabei eine Gabe von höchstens einer Dosiseinheit pro Tag, bevorzugt pro Woche, mehr bevorzugt pro 2 Wochen ausreichend. Für Tiere, z.B. Mäuse, wird bevorzugt eine Dosiseinheit pro Tag verabreicht.
Für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ist «ine effiziente kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägermolekül (also das Protein) von Bedeutung. Bei der Kopplung darf es insbesondere nicht zu einer unerwünschten Veränderung des Trägerproteins oder/und de>s Wirkstoffes kommen. Die bisher übliche Aktivierung Carboxylgruppen-haltiger organischer Verbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfordert bei Raumtemperatur oder bei +4 °C mehr als 12 Stunden (DP 41 22210 A1; EP 0 879 604 A1 ; EP 0 820 308). Bei diesem Verfahren bilden sich zudem bei der Aktivierung unlösliche Substanzen, die zum Teil bereits während der Aktivierung und zum Teil beim Eintragen des aktivierten Wirkstoffs in eine wässrige Proteinlösung ausfallen und, damit das Konjugat medizinisch verabreicht werden kann, durch zeitaufwändige und teure Filtrationsschritte zusätzlich zu der eigentlichen Produktreinigung abgetrennt werden müssen und nie 100 %-ig sind (wegen der lipophilen Domänen im Albumin).
Es bestand deshalb der Bedarf ein Verfahren zur Herstellung von V\ irkstoff-Protein-Konjugaten bereitzustellen, bei dem diese Probleme nicht a uftreten und bei dem insbesondere keine wasserunlöslichen Nebenprodukte gebildet werden.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, insbesondere Methotrexat und
ii) ein Protein, insbesondere Albumin,
welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1 -Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und von N-Hydroxysucciπimid umsetzt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), insbesondere in Form des Hydrochlorids, eine Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung und eine Umsetzung mit einem Trägerprotein erreicht werden kann, ohne dass wasserunlösliche Nebenprodukte gebildet werden, die zeit- und kostenaufwändig abzutrennen wären . Durch dieses Verfahren werden Zwischenreinigungsschritte überflüssig und die Präpara-tionszeit und damit auch die Herstellungskosten werden wesentlich reduziert. Weiterhin werden Probleme, die bei der Injektion des Konjuats in einen menschlichen oder tierischen Körper durch unlösliche Substanzen oder Nebenprodukte hervorgerufen werden, vermieden.
Die Aktivierung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 °C, mehr bevorzugt 20 bis 70 °C und noch mehr bevorzugt 40 bis 65 °C für eine Reaktionszeit von 1 Minute bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 10 bis 30 Minuten. Die Umsetzung des aktivierten Wirkstoffes mit dem Trägerprotein erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 u nd 50 °C, ins-besondere zwischen 20 und 40 °C.
Bevorzugt wird die Aktivierung der Carboxyl-haltigen Verbindung, insbesondere von Methotrexat mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid in einem organischen Lösungsmittel , bevorzugt in Dimethylacetamid durchgeführt. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind z.B. DMSO (Dimethylsulfoxid) oder Dioxan. Die Aktivierung wird vorzugsweise unter Ausschluss von Wasser durchgeführt, insbesondere in Gegenwart von ≤ 5 Gew.-% Wasser, mehr bevorzugt ≤ 1 Gew.-% Wasser und am meisten bevorzugt vollständig wasserfrei. Durch Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen Verbindung mit eingesetzten Substanzen EDC und N-Hydroxysucchinimid in einem organischen, wasserfreien Lösungsmittel reagieren diese nicht mit Protein, z.B. Albumin und verändern auch nicht dessen Struktur.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens besteht darin, dass die eingesetzten Aktivierungsreagenzien, also 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid sowie N-Hydroxysuccinimid eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen. Dadurch können bei der Umsetzung nicht verbrauchte Kopplungsreagenzien auf einfache Weise aus dem gewonnen Produkt, beispielsweise durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Im Gegensatz dazu verbleibt bei den im Stand der Technik verwendeten Kopplungsreagenzien, beispielsweise bei der Verwendung von Di-cyclohexyl-carbodi-imid (DCC) ein nicht auftrennbarer Rest an Kopplungsreagenz im Konjugat. So ist bei einem Methotrexat-Albumin-Konjugats und Verwendung von DCC ein nicht abtrennbarer Rest von etwa 13 bis 15 Gew.-% an DCC im Konjugat zu beobachten, der wahrscheinlich an eine lipophile Domäne im Albumin gebunden ist. Dieser Rest kann nur mit Hilfe von HPLC nachgewiesen und nur unter erheblichem Aufwand präparativ abgetrennt werden.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein optimiertes Herstellungsverfahren eines erfindungsgemäßen Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ii) ein Protein, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine
Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid umsetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung bevorzugt um ein
Cytostatikum oder Immunsuppressivum, besonders bevorzugt um
Methotrexat, Aminopterin und/oder N-Phthaloyl-L-Glutaminsäure, insbesondere bevorzugt um Methotrexat. Beim Protein handelt es sich bevorzugt um Albumin.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich das optimierte Verfahren, welches ohne N-Hydroxysuccinimid arbeitet, bei der Reinigungsprozedur positiv auf die Vereinfachung der Herstellung auswirkt. Durch die Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) zur Aktivierung ohne den Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (HSI) beträgt die Aktivierungszeit von Aminopterin (AMPT), Methotrexat (MTX) bzw. N-Phthaloyl-L-glutaminsäure (NPLG) nur noch 10 Minuten. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass nach Zugabe der aktivierten Wirkstoffe AMPT, MTX oder NPLG zu dem vorgelegten Protein, insbesondere Albumin, ohne N-Hydroxysuccinimid eine direkte Kontrolle der Kopplungseffizienz erfolgen kann. Bei Verwendung von N-Hydroxysuccinimid besitzt dieses bei der HPLC bei einer Einstellung der UV-Messzelle auf 280 nm ebenfalls eine hohe UV-Absorption und stört oder erschwert durch seine Retentionszeit von etwa 11,5 Minuten, bei der auch andere niedermolekulare Verbindungen erscheinen, eine direkte Bestimmung der Kopplungsausbeute. Dies bedeutet, dass in vielen Fällen eine Ausbeutebestimmung erst am Ende der Reinigung des Konjugats möglich ist. Durch das optimierte Verfahren ohne Einsatz von N-Hydroxysuccinimid kann dieser Faktor nun ausgeschlossen werden. Dies ist auch für die Produktsicherheit von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass die Kopplungsausbeute überraschenderweise durchschnittlich bei 98 bis 99 % liegt.
Somit sind die Gesamtkosten des jeweiligen Konjugats durch diese Vereinfachung der Herstellung deutlich gesenkt.
Erfindungsgemäß werden bei der Umsetzung die Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, insbesondere Methotrexat und das Protein, insbesondere Albumin, in einem Molverhältnis von 10:1 bis 1:10, insbesondere 1,5:1 bis 1:1,5 eingesetzt.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate können aufgrund ihrer hohen Reinheit für zahlreiche Verwendungen und insbesondere für eine intravenöse Verabreichung vorgesehen werden. Somit können solche Konjugate, beispielsweise bei Verwendung einer Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung mit immunsuppressiver Wirkung vorteilhafterweise zur Herstellung von Arzneimitteln zur Modulierung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion, insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder/und Behandlung von GVHD eingesetzt werden. Es ist aber auch möglich unter Verwendung von Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindungen mit cytostatischer Wirkung ein Arzneimittel zur Behandlung oder/und Prophylaxe oder/und Diagnose von Tumorerkrankungen herzustellen. Erfindungsgemäß hergestellte Konjugate eignen sich auch zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder/und Diagnose von Entzündungs-, Infektions- und/oder Hauterkrankungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des gemäß Beispiel 1 hergestellten Methotrexat-Humanserumalbumin (MTX-HSA) Konjugats, das nach dem Herstellungsverfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid (NHSI) und damit der Synthese eines reaktiven Esters als Zwischenstufe arbeitet.
Figur 2 zeigt das Chromatogramm des gemäß Beispiel 3 hergestellten MTX-HSA-Konjugates ohne Verwendung von NHSI, wobei die mit 1-Ethyl-3-(3-dimeethylaminopropyl)carbodiimid-hydroxychlorid (EDC) aktivierte Carboxylgruppe direkt zur Kopplung des MTX benutzt wird.
Beispiel 1
Herstellungsbeispiel:
Methotrexat (MTX) wird mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi-imid-hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (HSI) aktiviert und an-schließend mit Albumin (HSA) zu MTX-HSA umgesetzt.
M ethotrexat-Akti vi eru ng :
20 mg Methotrexat (MTX; FG: 454, 45; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) werden zusammen mit 25 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydro-Chlorid (EDC, FW: 191,7, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und 60 mg N-Hydroxysuccinimid (HSI, FW: 115,1 ; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in 2 ml Dime-thylacetamid (DMAA) gelöst. Die Reaktionsmischung wird in ein auf 60 °C vorgeheiztes Wasserbad gebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 30 min wird die Aktivierungslösung, nach Abkühlung auf Raumtemperatur, langsam in eine 5 %-ige HSA-Lösung (10 ml 20 %-ige HSA-Originallösung werden mit 30 ml H2O dest. verdünnt) eingetragen.
Die Abtrennung der für die Kopplung von MTX erforderlichen Begleitstoffe (DMAA, HSI, Dimethylharnstoff und nicht gebundenes Methotrexat) erfolgt über Ultrafiltration (Dialyse) mit einer Ausschlussgrenze von 30 KD (YM 30).
Reinheitskontrolle (HPLC):
Vorsäule: 25 x 10 mm LiChrospher DIOL, 5 μm
Säule: 250 x 10 mm LiChrospher DIOL, 5 μm
Laufmittel: Na-Citrat, 02 M, pH 7,4
Fluss: 1,0 ml/min
Druck: etwa 95 bar
UV-Monitor 280 nm
Retentionszeiten:
dimere SA-Fraktion 5,8 min
monomere SA-Fraktion 7,0 min
niedermolekulares MTX 33,8 min Chromatogramm: siehe Figur 1
Beispiel 2
s Tierversuche: (Genehmigungs Nr. LVL M-V310-4/7221.3-1.2-015/03 Landesveterinäramt Mecklenburg-Vorpommern Rostock)
Mit dem lang zirkulierenden, makromolekularen MTX-HSA wurden erste statistisch signifikante Versuche mit GVHD-Tieren an der Universitätsklinik 0 Rostock in der Abteilung von Prof. Dr. M. Freund unter der Leitung von PD.Dr.G. Härtung und Dr. D. Wolff durchgeführt. Dabei wurden 20 weibliche F1 hybrid BN/Lew-Ratten nach einer Ganzkörperbestrahlung mit 7,5 Gy (n = 10) oder 9 Gy (n = 10) mit 40 Millionen Knochenmarkszellen und 15 Millionen T-Lymphozyten von weiblichen Lew-Ratten transplantiert. 10 5 Ratten erhielten am Tag 0, 4, 8 und 12 jeweils 2 mg/kg Methotrexat-Albumin intraperitoneal, während 10 weitere Ratten lediglich die äquivalente Menge Albumin zu den identischen Zeitpunkten intraperitoneal erhielten. Im Ergebnis konnte nachgewiesen werden, dass lediglich eine Ratte aus der Gruppe, welche Methotrexat-Albumin erhielt, eine akute GVHD entwickelte, 0 wärend in der Kontrollgruppe alle Tiere an den Folgen einer akuten GVHD verstarben. Signifikante Nebenwirkungen von Methotrexat-Albumin waren nicht nachweisbar, während beiden mit äquieffektiven MTX-Dosen behandelten Tieren deutliche Nebenwirkung zu beobachten waren.
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Beispiel 3
Optimiertes Herstellungsbeispiel:
Methotrexat (MTX) wird zusammen mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 0 carbodiimid-hydrochlorid (EDC) in DMSO gelöst, durch Erwärmung zur Reaktion gebracht (aktiviert) und anschließend mit Albumin (HSA) zu MTX- HSA umgesetzt.
Methotrexat-Akti vierung:
20 mg Methotrexat (MTX; FG: 454, 45; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) werden zusammen mit 25 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDC, FW: 191,7, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Reaktionsmischung wird in ein auf 65 ° C vorgeheiztes Wasserbad gebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 10 Minuten wird die Aktivierungslösung, nach Abkühlung auf Raumtemperatur, langsam in eine 5 %ige HSA-Lösung (10 ml 20 %ige HSA-Originallösung werden mit 30 ml Aqua dest. verdünnt) eingetragen.
Die Abtrennung der für die Kopplung von MTX (AMPT bzw. NPLG) erforderlichen Begleitstoffe (DMSO, Ethyl-3-dimethylaminopropylharnstoff und nicht gebundener Wirkstoff) erfolgt durch Ultrafiltration (Dialyse) mit einer Ausschlussgrenze von 30 KD (YM 30, Millipore).
Reinheitskontrolle (HPLC):
Vorsäule: Reprosil 200 SEC, 5 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Säule: Reprosil 200 SEC, 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Laufmittel: Na2HPO4, 0,19 M, pH 7,4 mit 5 % Methanol
Fluss: 0,3 ml/min
Druck: etwa 51 bar
Retentionszeiten:
dimere SA-Fraktion 8,2 min
monomere SA-Fraktion 9,1 min
niedermolekulares MTX 13,3 min
Chromatogramm: siehe Figur 2