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1. (WO2004009809) PROCESS FOR PRODUCING OXYGENATED PHOSPHOLIPID ENDOPLASMIC RETICULUM
Latest bibliographic data on file with the International Bureau   

Pub. No.:    WO/2004/009809    International Application No.:    PCT/JP2003/005798
Publication Date: 29.01.2004 International Filing Date: 08.05.2003
IPC:
C12N 9/02 (2006.01)
Applicants: JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY [JP/JP]; 4-1-8, Honcho, Kawaguchi-shi, Saitama 332-0012 (JP) (For All Designated States Except US).
YOSHIKAWA, Shinya [JP/JP]; (JP) (For US Only).
OGURA, Takashi [JP/JP]; (JP) (For US Only)
Inventors: YOSHIKAWA, Shinya; (JP).
OGURA, Takashi; (JP)
Agent: SHIMODA, Akira; 4kai, Kyobashi-Nichiei Biru, 3-4, Kyobashi 3-chome, Chuo-ku, Tokyo 104-0031 (JP)
Priority Data:
2002-211028 19.07.2002 JP
Title (EN) PROCESS FOR PRODUCING OXYGENATED PHOSPHOLIPID ENDOPLASMIC RETICULUM
(FR) PROCEDE PERMETTANT DE PRODUIRE UN RETICULUM ENDOPLASMIQUE PHOSPHOLIPIDIQUE OXYGENE
(JA) 酵素含有リン脂質小胞の製法
Abstract: front page image
(EN)Leak-free reconstructed membrane is provided by optimizing a method of reconstructing an enzyme, especially cytochrome c oxidase, into phospholipid endoplasmic reticulum. Cytochrome c oxidase and phospholipid are dispersed in an aqueous solution in order to form a reconstructed membrane, and the dispersion is dialyzed under specified conditions with the use of a buffer solution as an external fluid. This step of dialysis is characterized in that the concentration of buffer solution as the external fluid is reduced gradually through at least three stages within the range of 0.1 to 300 mM and that after reaching the lowest concentration, the concentration is increased over the lowest concentration. When a mixture of an enzyme solubilized with a surfactant and a phospholipid suspension is dialyzed under the above condition, the concentration of surfactant is gradually decreased, so that the solubility of enzyme is decreased with the result that the enzyme is incorporated in phospholipid vesicles. The hydrogen ion transport activity of phospholipid endoplasmic reticulum prepared by the above process, referring to Fig. 3, is steadied after the addition of reduced cytochrome c, meaning that the membrane restricts infiltration of hydrogen ions.
(FR)L'invention concerne une membrane reconstituée étanche obtenue par optimisation d'un procédé permettant de reconstituer un réticulum endoplasmique phospholipidique à partir d'un enzyme, en particulier à partir de la cytochrome c oxydase. Ce procédé consiste à disperser la cytochrome c oxydase et le phospholipide dans une solution aqueuse afin de former une membrane reconstituée, et à dialyser cette solution aqueuse dans des conditions prédéfinies, en utilisant une solution tampon en tant que fluide externe. Cette étape de dialyse est caractérisée par une réduction progressive de la concentration de la solution tampon constituant le fluide externe, en au moins trois étapes, pour la faire passer de 0,1 à 300 mM suivie, après que la concentration la plus faible a été atteinte, par une augmentation de la concentration à une valeur plus élevée. Lorsqu'un mélange d'enzymes solubilisés avec un tensioactif et d'une suspension de phospholipides est dialysé dans les conditions décrites, la concentration en tensioactif est progressivement réduite, ce qui entraîne une réduction de la solubilité de l'enzyme conduisant à l'incorporation de ce dernier dans les vésicules phospholipidiques. La fonction de transport du réticulum endoplasmique phospholipidique préparé au moyen du processus décrit, illustré dans la fig. 3, est stabilisée après l'addition du cytochrome c réduit, donnant ainsi une membrane limitant l'infiltration des ions hydrogène.
(JA)酵素、特にチトクロムc酸化酵素をリン脂質小胞に再構成する方法を最適化して、漏れのない再構成膜を提供する。 再構成膜を形成させるために水溶液中にチトクロムc酸化酵素とリン脂質とを分散させ、この分散液を緩衝液を外液として特定の条件で透析する。この透析段階において、外液である緩衝液の濃度を0.1~300mMの間で少なくとも3段階で徐々に低濃度とし、この濃度が最低となった後に最低濃度よりも高濃度とすることを特徴とする。本発明の条件で、界面活性剤で可溶化した酵素とリン脂質懸濁液の混合液を透析すると、界面活性剤の濃度が次第に減少し、酵素の溶解度が低下し、そのためにリン脂質ベシクルに取り込まれる。本発明の方法により作製したリン脂質小胞の水素イオン輸送活性は、第3図に示すように、還元型チトクロムcの添加後一定値をとり、膜が水素イオンを透過させにくいことを意味する。
Designated States: US.
European Patent Office (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK, TR).
Publication Language: Japanese (JA)
Filing Language: Japanese (JA)