Processing

Please wait...

Settings

Settings

Goto Application

1. WO1999049830 - ANTIVIRAL EFFECT OF PROPOLIS BY INHIBITING VIRAL NUCLEIC ACID POLYMERASES

Considered void:  25.08.2000
Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters

[ DE ]

ANTI-VIRALE WIRKUNG VON PROPOLIS DURCH INHIBITION VIRALER NUKLEINSÄURE POLY- MERASEN
Beschreibung

Stand der Wissenschaft und Technik
Nukleinsäure Polymerasen sind spezifische Enzyme, die aus Monomeren von Nukleotid-triphosphaten oligo- oder polymere Nukleinsäuren synthetisieren und bei der Replikation von genetischem Material (RNA, DNA) in allen biologischen Systemen eine wichtige Rolle spielen. Es gibt Hinweise, daß der enzymatische Mechanismus der Nukleinsäurepolymerisation (DNA, RNA) in der Natur einen eher universellen Charakter hat (Steitz 1998) wobei sich jedoch die Polymerasen in ihrer dreidimensionalen Proteinstruktur außerhalb ders aktiven Zentrums entsprechend den jeweiligen Spezies (Säugetiere, Bakterien, Viren) mehr oder weniger unterscheiden.
Eine besondere Bedeutung finden virale Polymerasen als Zielmoleküle zur Entwicklung von Wirkstoffen, die diese in Ihrer enzymatischen Aktivität hemmen und als Therapeutika bei viralen Erkrankungen (z.B. AIDS, Krebs, Hepatitis, Herpes, Grippe, etc.) eingesetzt werden können. AIDS ist gegenwärtig eine der größten medizinischen Herausforderungen an Wissenschaftler, Ärzte, Gesellschaft und Politik. Die Krankheit ist infektiös und wird nach dem jetzigen Stand der Wissenschaft durch ein Retrovirus, das HIV- Virus, verursacht (Levy 1993, Pantaleo & Fauci 1996, De Vita et al. 1997). Retroviren haben die unangenehme Eigenschaft, sich in das Genom von Wirtszellen irreversibel einzuschleusen, sich mit der „Zellmaschinerie" des Wirts zu vermehren und dadurch Krankheiten zu induzieren.
Das HIV- Virus infiziert vorwiegend die Zellen des Irnmunsystems (T-Lymphozyten, Makro-phagen), welches dadurch außer Kontrolle gerät und in Folge abgeschwächt und anfälliger wird für weitere Krankheiten, die letztendlich zum Tode des Menschen führen (Pantaleo & Fauci 1996).
Gegenwärtig ist es nicht möglich die Krankheit AIDS zu heilen. Der Wissenschaft und Pharmaindustrie ist es bislang unter großen und langjährigen Anstrengungen (ca. 15 Jahre) gelungen, Wirkstoffe und Kombinations-Therapien zu finden, die die Vermehrung des HIV- Virus hemmen, die Virus-Belastung im Körper zeitweise bis unter die Nachweisgrenze (im Blut) senken und das Leben eines AIDS-Patienten verlängern bzw. dessen Lebensqualität verbessern. Die z.Z. verwendeten Wirkstoffe sind Inhibitoren der HI -Reversen Transkriptase und HlV-Protease, die entweder als Substrat-Analoga (kompetitiv) oder als allosterische Hemmer (nichkompetitiv, inkompetitiv) auf die retroviralen Enzyme wirken und deren Aktion im Replikationszyklus des Virus hemmen (De Clercq 1995). Für die Inhibition der Reversen Transkriptase gibt es die sogenannten Nukleosid-RT-Inhibitoren (NRTI) und die Non-Nukleosid-RT-Inhibitoren (NNRTI). Als Substrat-Analoga können die o.g. Enzyminhibitoren keine totale und irreversibele Hemmung bewirken, auf Grund ihrer Kompetition mit den natürlichen Enzym-Substraten. Dadurch ist eine vollständige Inhibition des Virus in seinem Infektionszyklus auch nicht möglich.
Eine Übersicht der gegenwärtig als Therapeutika eingesetzten Inhibitoren zeigt die folgende Tabelle.


Nach dem bisherigen Stand der Wissenschaft hat sich erwiesen, daß die hohe Mutationsrate, -bedingt durch die fehlerhaften Reaktionen der Reverse Transkriptase und der ineffizienten HIV-Inhibition, zur Entwicklung und Selektion von Wirkstoff-resistenten Virusstämmen führt, welche gegen die eingesetzten Revers Transkriptase oder Protease Inhibitoren unwirksam werden (Richman 1993, Erickson & Burt 1996). Dies hat zur Folge, daß die resistenten HIV-Stämme im Organismus wieder verstärkt replizieren können, die Virusbelastung im Körper ansteigt und es dem AIDS -Patienten gesundheitlich wieder schlechter geht.
Weiterhin zeigen die bislang entwickelten Therapeutika physiologische Nebenwirkungen und belasten durch Menge, Dosis und Einnahmevorschriften den normalen Tagesablauf des Patienten (z.B. 18-22 Tabletten pro Tag bei einer sogenannten Triple Therapie, einer Dreier-Kombination von Inhibitoren).

ERSÄTZBLÄTT (REGEL 26) Aus diesen Gründen ergibt sich der Bedarf nach einem weiteren und besseren anti-viralen

Wirkstoffen und Leitstrukturen sowie einem größeren Spektrum von Therapeutika mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen, um die Virusbelastung wieder zu senken, Resistenz-bildung zu verzögern oder sogar zu vermeiden und physiologische Nebenwirkungen und Toxizität zu minimieren.
Die Anforderungen von neuen Wirkstoffen, Leitstrukturen und Therapeutika gegen retrovirale Enzyme (Reverse Transkriptase, Protease, RNAse, Integrase) müssen nach dem heutigen Kenntnisstand folgende Merkmale und Kriterien erfüllen:

a) eine totale und irreversible Hemmung des HIV- Virus in minimalen Konzentrationen (nM Bereich)
b) gute Bio- Verfügbarkeit und Pharmakokinetik
c) Verzögerung oder sogar Vermeidung von Resistenz-Entwicklung des HIV- Virus d) die zu entwickelnden Wirkstoffe sollten oral applizierbar sein,
e) keine toxischen Nebenwirkungen hervorrufen und
f) niedermolekular sein um die Blut-Hirn Schranke passieren zu können.

Eine der Haupt-Strategien der Pharmakonzerne war es bislang, große verfügbare Sammlungen von biologischen oder chemischen Stoffen auf antivirale Wirkung zu untersuchen, - ein sehr risiko-reiches, zeitaufwendiges und kostenintensives Vorhaben-, da ein Vor-Screening dieser Stoffe ohne jegliche Anhaltspunkte und mit Ungewissem Ausgang nötig war.
Um die Risiken und Kosten zu reduzieren, werden z.Z. weitere eher rationale Strategien weiterverfolgt:

a) molekularbiologische Ansätze zur ABDS-Therapie mit genombasierter Produktentwicklung (z.B. antisense-Moleküle, gentherapeutische Ansätze), deren Einsatz und Therpie-wirkung noch in weiterer Zukunft liegt bzw. ungewiss ist

b) rationales Wirkstoffdesign auf Computerebene auf Grund bekannter Kristall-Strukturen der retroviralen Enzyme (z.B. Protease Inhibitoren) und anderer Wirkstoffe. Letztere Entwicklung hat aber insofern Mängel, daß komplexe Wirkstoffstrukturen nur auf der Basis bekannter Komponenten modifiziert werden können.

c) Vakzine-Entwicklung auf der Basis rekombinanter retroviraler Proteine, Zytokine, Nukleinsäuren etc., deren therapeutische Erfolge auch noch auf sich warten lassen. Chemokine und deren zelluläre Rezeptoren, die eine wesentliche Rolle bei dem Eintritt des HIV- Virus in die Zelle spielen (Premack & Schall 1996) bieten einen völlig neuen Ansatz zur AIDS Therapie bzw. der Entwicklung von Vakzinen. Da diese therapeutische Alternative jedoch in der Anfangsphase ist, können deren Erfolgschancen noch nicht realistisch eingeschätzt werden.

d) antivirale Naturstoffe: Eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung neuer Therapeutika spielt die Vielzahl biologischer Wirkstoffe und Strukturen aus der Natur, die durch die Entwicklung von natürlichen Abwehrmechanismen (Wirkungs-Prinzipien) bei Tieren

100 und Pflanzen gegen Krankheitserreger (Viren, Bakterien, Parasiten etc.) über Jahrmillionen selektiert und optimiert wurden und zum größten Teil noch unerforscht sind. Nur etwa 5% von ca. 2 Millionen weltweit existierenden Organismenarten sind bislang auf biologisch aktive Wirkstoffe untersucht. Darin liegt noch ein enormes therapeutisches Potential und ein wichtiger Schlüssel für die Medikamente der Zukunft.
105 Die Isolierung und Reindarstellung von natürlichen Wirkstoffen und Leitsubstanzen aus pflanzlichen Drogen (Arzneipflanzen) stellt eine große Herausforderung dar. Da aber viele täglich verwendete Arzneimittel auch heute noch eine natürliche Strukturbasis besitzen, die durch geringfügige chemische Modifikation eine bessere Wirkung (Verträglichkeit, Wirksamkeit, Applizierbarkeit und auch biologische Abbaubarkeit u.v.m.) als der reine

110 pflanzliche Wirkstoff haben, sollte hier in der fast unerschöpflichen Struktur- Vielfalt der jarirmillionenalten Evolution die Grundlage neuer Arzneimittel gesucht werden. Die bisherige Erfahrung hat gezeigt, daß nur aufgrund des Grundlagenwissens der Wirkung von Naturstoffen viele Wirkstoff-Analoga synthetischer Natur optimiert werden konnten, die heute als Arzneimittel im Handel sind.
115 Das Bestreben, Naturstoffe mit anti-retroviraler Wirkung zu finden und in der AIDS Therapie anzuwenden ist am Beispiel des Hypericins und seiner Derivate aus Johanniskraut dokumentiert (Merueln et. al. 1992) sowie durch Berichte auf dem internationalen AIDS Kongreß 1996 in Vancouver von der Firma Arkopharma über ein eigenes Präparat SV30 aus Buchsbaum.
120
Propolis ist ein Gemisch pflanzlicher Naturstoffe, das von den Bienen aus Knospen von Laubbäumen, Nadelbäumen oder Sträuchern gesammelt und zur Abdichtung der Waben und deren Abwehr gegen Befall mit Bakterien, Pilzen, Viren und anderen Krankheitserregern verwendet wird.
125 Die anti-bakterielle Wirkung von Propolis ist in der Naturheilkunde seit langem bekannt sowie die Beobachtung, daß bislang keinerlei bakterielle Resistenzen gegen Propolis aufgetreten sind (Hill 1995, Apimondia 1990). Die antivirale Wirkung in Bezug auf Herpes- EBV bzw. Varicella Zoster Viren wurde gleichwohl beschrieben ohne jedoch Zielmoleküle oder Mechanismus der Wirkung zu untersuchen (WO 91/13626, Apimondia 1990).
130 Die anti-virale Wirkung auf enzymatische Polymerase-Aktivität bei Retroviren und anderen Polymerase haltigen Viren wurde bislang jedoch weder untersucht noch beschrieben. Weiterhin läßt die bisherige Erfahrung, daß bislang keine bakterielle Resistenzen gegen Propolis beobachtet wurden, hoffen, daß auch virale Resistenzen gegen Propolis weniger wahrscheinlich sind bzw. möglicherweise gar nicht auftreten.

Problemlösung
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Arzneimittel auf natürlicher Basis zur Behandlung von viralen Erkrankungen bereitzustellen.
140 Diese Aufgabe wird erfindungsmäßig dadurch gelöst, daß Propolis in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zur Inhibierung der Replikation von Polymerase enthaltenen Viren bereitgestellt wird.

Beispiel
145
Ausgehend vom o.g. Stand der Wissenschaft und Technik wurde Propolis-Rohextrakt biochemisch und zellbiologisch auf die Inhibition von HIV-1 getestet.

a) Propolis Extraktion: Trockensubstanz von Propolis wurde mit gleichen Volumina 150 DMSO, Äthanol oder PBS versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die dunkelbraune Lösung wurde anschließend filtriert und als Stammlösung bei den Untersuchungen eingesetzt.

b) Die molekulare Wirkung des Propolis-Extrakts auf die HIV Reverse Transkriptase wurde 155 biochemisch mittels der RETRO-KIT/RTA Reversen Transkriptase Technologie getestet (siehe Anlage, Faff et al. in preparation sowie PCT/DE97/00391). Hierfür wurde gereinigtes Enzym der HIV Reversen Transkriptase mit dem Propolis-Extrakt in verschiedenen Konzentrationen bzw. Verdünnungen vorinkubiert und anschließend in enzymatischer Reaktion getestet. Als Referenzinhibitor wurde AZT-TP (Azidothymidin-triphosphat) (Fig.2a-2b) sowie 160 entsprechende Lösungsmittelkontrollen, Blanc etc. eingesetzt.

Die Ergebnisse zeigen eine vollständige Inhibition der RT- Aktivität bei bis zu ca. 700μg/ml Propolis-Extrakt (Verdünnung 1:3.500) sowie eine weiterhin signifikante Inhibition der RT- Aktivität bis zu einer Konzentration von 7μg/ml Propolis-Extrakt bzw. einer Verdünnung von 165 1: 35.000 (Fig.la).
Entsprechend dem Hemmunggrad ausgedrückt in % Inhibition läßt sich eine IC50 Konzentration von ca. 150μg/ml Propolis-Extrakt feststellen (Fig. lb).

c) Die zellbiologische Wirkung des Propolis-Extrakt auf HIV wurde anhand der Infektion 170 von Zellen uzw. PBL Periphären Blutlymphozythen mit HIV-1 (Isolat Illb, m.o.i. 0,001) in

Gegenwart des RT-Rohextrakts in verschiedenen Konzentrationen/ Verdünnungen (1/100; 1/1.000; 1/10.000) getestet sowie dessen toxische Wirkung (MTT-Test) auf die o.g. Zellen untersucht (Triplikate). Die Replikation von HIV in den Zellen wurde mittels p24 Antigen im Zellkulturüberstand nach 4 Tagen Inkubation gemessen.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Propolis-Extrakt in hohen Konzentrationen (1/100 bzw. 1/1000) toxisch wirkt und nur ca. 4% der Zellen überleben (Tab. 1). In der lOx niedrigeren Konzentration (Verdünnung 1/10.000) überleben ca. 65% der Zellen.
Wird der Überstand dieser Zellen auf p24 Antigen untersucht, kann man eine nahezu totale 180 Abnahme der p24 Menge auf ca. 0,2 pg/ml im Vergleich zur Kontrolle (39,3 ng/ml) messen. Dies entspricht einem Inhibitionsgrad von ca. 99,5 % verglichen mit der Wirkung des Referenzinhibitors Azidothymidin (Tab. 2).

185 Tab. 1 : Toxizitätsuntersuchung von HIV Infizierten Lymphozyten
(PBL's) in Gegenwart des Propolis-Extrakt
(MTT-Test nach T. Mossmann, J. Immunol.Methds. 65, 55-63, 1983)
Verdünnung % lebender Zellen v. Kontrolle
1/100 0 %
1/1.000 4 %
1/10.000 65 %

190
Tab. 2: Inhibition der HIV Infektion & Replikation von Lymphozyten
(PBL's) in Gegenwart des Propolis-Extrakt
(p24 Test nach Müller et al.: Fresenius Z. Anal.Chem. 330, 352-353, 1988)
Inhibitor ng HIV -p24/ml % Inhibition
AZT (ng/ml)
100 0,00 100,0
10 8,70 77,9
1,0 33,50 14,8
0,1 40,60 0,0
Propolis-Extrakt
1/10.000 0,20 99,5
Kontrolle 39,30 0,0
kein Inhibitor
195

Die experimentellen Daten zeigen, daß das Propolis-Extrakt eine komplette Inhibition von HIV- 1 sowohl auf molekularer als auch auf zellulärer Ebene hat (Fig.1-2, Tab-2).
Die anti-HIV Wirkung kann in beiden Test-Systemen bis zu niedrigen Konzentrationen (hohen 200 Verdünnungen 1/35000, 1/10.000) gemessen werden wo Lösungsmittel- oder toxische Effekte ausgeschlossen werden können (Fig.1-2, Tab.l).

Der hohe anti-retrovirale Effekt wurde in einem Rohextrakt gemessen, daß ein Gemisch aus vielen (tausenden) Komponenten ist und weder in der Extraktion optimiert noch teilgereinigt ist.

205 Diese sehr starke HIV Inhibition bei einem sehr schlechten Reinheitsgrad des Propolis-Extrakt läßt auf einen hohen quantitativen Anteil der Wirkungskomponenten und/oder eine sehr gutes Dosis/Wirkung Verhältnis schließen.

Die Inhibition der HIV-Reversen Transkriptase und das Wissen um den Wirkungs-210 mechanismus durch kinetische Studien eröffnen die Möglichkeit prognostische Untersuchungen über Resistenzentwicklungen durchzuführen und auch die Wirkung des Propolis- Extrakt an anderen Spezies von Retro- oder andere Viren zu untersuchen, die das Enzym Reverse Transkriptase oder andere Nukleionsäure Polymerasen besitzen. Somit könnten die Extrakt- Wirkstoffe möglicherweise auch bei anderen retro virus- bedingten Krankheiten z.B. 215 Leukämie, Autoimmunerkrankungen, Krebs, Hepatits etc. eingesetzt werden.

Die Inhibition der HIV Replikation in Zellkulturen von Lymphozythen zeigt, daß die Wirkstoffkomponenten des Propolis-Extrakts das HIV- Virus an einer oder mehreren Stationen des Replikationszyklus hemmen. Daß dies bei der Reversen Transkription der retroviralen RNA

220 erfolgt, liegt auf Grund der molekularen Untersuchungen am Reversen Transkriptase Enzym nahe, schließt jedoch nicht aus, daß die Inhibition auch an anderen viralen Zielmolekülen (RNAseH, Protease, Integrase etc.) erfolgt.
Weiterhin zeigt die zelluläre HIV Inhibition durch Propolis, daß dessen Komponenten die Plasmamembran der Zellen passieren können, was auf eine gute zelluläre B io verfü - 225 barkeit hinweist und eine chemische Derivatisierung der Wirkstoffe zumindest für den Angfang überflüssig macht.

Somit weisen die starke zelluläre HIV-Inhibition (Bio Verfügbarkeit) sowie die Wirkung bei niedrigen Konzentrationen (Dosis/Wirkungsverhältnis) auf gute Voraussetzungen für 230 die erfolgreiche Entwicklung eines potenten anti-viralen Therapeutikums.

Literaturverzeichnis
1. Apimondia (1990): Propolis, I. T. E.A, Apimondia, Bucuresti
235
2. De Clercq E. (1995): Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for
Intervention with HIV infections. J. Med. Chem.: 38, 2491-517
3. Erickson J.W. & Burt S.K. (1996): Structural mechanisms of HIV drug resistence. Ann. 240 Rev. Pharmacol. Toxicol.: 36, 545-571
4. Faff O. & G. Hiszem (1996): Verfahren und Test-Kit zum nichr-radioaktiven enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase (DPA 196 08687.6-41, PCT/DE9700391)
245 5. Hill, R.(1995): Propolis, Kittharz.Verlag Ehrenwirth, M.
6. Hiroaki Mitsuya, M.D., Ph.D.(1997): Anti-HIV nucleosides: past, present and future.
Springer-Verlag
250 7. Levy JA. (1993): Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection.
Microbiol. Rev: 57,183-289.
8. Merueln D., G. Lavie, D. Lavie. (1988): Therapeutie agents with dramtic antiretroviral activity and littel toxicity in effective doses. Proc. Natl. Acad. SCI. USA 85, 5230-5234.

255
9. Müller et al. (1988): Fresenius Z. Anal.Chem. 330, 352-353,
10. Premack, B.A. & T.J. Schall (1996): Chemokine receptors: gateways to inflammation anf infection. Nature medicine: 2, 1174-1178.
260
11. G. Pantaleo and A. S. Fauci (1996): Immunopathogenesis of HIV Infection
Annu. Rev. Microbiol.: 50,825-54
12. Richman DD. (1993): HIV drug resistance. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.:
265 32,149-64
13. Steitz T. A. (1998): A mechanism for all polymerases.Nature: 391, 231-232.
14. Vachy R. et al. (1990): Therapeutic composition containing a phenol compound and 270 propolis useful against lipidic capside viruses, especially the herpes viruses (WO 91/13626)
15. Vincent T. De Vita, Jr., M.D. et al. (1997): AIDS - Etiology, Diagnosis, Treatment and
Prevention. Lippincott - Raven Publishers