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1. (WO1998049137) OXIDATIVE COLORING REAGENTS
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明細書

酸 化発色試薬

技術分野

本発明は酸化発色試薬に関するものである。より詳しく言うと、本発明は、酵 素ィムノアッセィ法によるペルォキシダーゼ活性の測定試薬などに有用な酸化発 色試薬に関するものである。

背景技術

バイオメディカル領域においける生体成分などの高感度微量分析には、主とし て酵素ィムノアツセィ法(EIA 法)が用いられている。この方法は非放射性ィム ノアッセィ法の中では最も感度に優れる方法の一つであり、一般的には、標識酵 素を用レ、て抗原抗体反応を定量的に追跡し、抗原あるいは抗体を定量する工程を 含んでいる。標識酵素としてはペルォキシダーゼ(POD)が汎用されており(全体 の約 50%) 、ペルォキシダーゼ活性を吸光光度法で測定するための発色試薬が数 多く市販されている。このような発色試薬としては酸化発色試薬が最も多く用い られており、例えば、 0-トリジン、 0-フエ二レンジァミン(0PD) 、 3, 3',5, 5' -テ トラメチルベンジジン(TMBZ)などが用いられている。

また、臨床化学分析においても、目的成分を認識して過酸化水素を発生する各 種の酵素を用いる方法が利用されている。この方法では、発生させた過酸化水素 をペルォキシダーゼの触媒作用にって酸化発色試薬と反応させ、吸光度を測定す ることによって目的成分を定量するのが一般的である。 3, 3', 5, 5' -テトラメチル ベンジジン(TMBZ)は臨床化学分析においても用いられている。

しかしながら、これらの酸化発色試薬はいずれも水溶性に乏しく、反応液の濃 度調節が困難であったり、予め溶液を調製して保存すると沈殿が生じる場合があ つた。溶解性を改善するために界面活性剤を用いる方法もあるが、ピペット操作

の際に発泡することがあり、界面活性剤が酵素反応に影響を及ぼす可能性がある ので一般的な方法ではない。また、これらの試薬は光ゃ溶存酸素によってペルォ キシダーゼ活性のない状態においても発色してしまい、バックグラウンドの上昇 を招いて測定精度を低下させてしまうという問題も有している。さらに、生成す る色素の安定性が乏しく、経時的に退色や沈殿を生じる場合があり、反応終了後 の時間管理が煩雑になるという問題もあった。

臨床化学分析においては、 3, 3', 5, 5' -テトラメチルベンジジン (TMBZ)を用いる 場合には、各種ォキシダーゼと基質とを反応させることにより発生した過酸化水 素をペルォキシダーゼの存在下で反応させ、生成する青色色素(650 nm付近)の 吸光度測定を行うのが一般的であるが、この色素のモル吸光係数はそれほど大き くないので十分な感度が得られないという問題がある。従って、これらの問題を 解決した酸化発色試薬の開発が求められていた。ベンジジン誘導体として、アミ ノ基上にスルホアルキル基を有する 3, 3' , 5, 5' -テトラアルキルべンジジン誘導体 が提案されているが(特開昭 61- 52300号公報)、この化合物も上記の問題点を解 決しているとはいえない。

発明の開示

本発明の課題は、酵素ィムノアッセィ法及び臨床化学分析などの分析方法に用 いられる酸化発色試薬を提供することにある。より具体的には、水溶性が改善さ れており、保存中における光分解や酸化分解に対して高い抵抗性を有する酸化発 色試薬を提供することが本発明の課題である。

また、本発明の別の課題は、反応後の色素の安定性に優れる酸化発色試薬を提 供することにある。

本発明のさらに別の課題は、通常測定に用いられる波長において大きなモル吸 光係数を有する色素を与える酸化発色試薬を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、下記の一般式で表わ される 3, 3' -ジアルキルべンジジン化合物が上記の特徴を備えており、酸化発色

試薬として極めて有用であることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完 成されたものである。

すなわち本発明は、下記の一般式:


(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に C 6アルキル基を示し; R3及び R4はそれぞれ独 立に水素原子又は _6アルキル基を示し; R5及び R6はそれぞれ独立に水素原子、 1 個若しくは 2個以上の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換 ( 6アルキ ル基、 1個若しくは 2個以上の水酸基を有することもあるカルボキシ置換 C 6ァ ルキル基、又は 1個若しくは 2個以上の水酸基を有する C 6アルキル基を示すが、 R5及び R6が同時に水素原子であることはない)で表わされる化合物又はその塩を 提供するものである。

この発明の好ましい態様によれば、 R1及び R2がそれぞれ独立に ( 6アルキル基で あり; R3及び R4がそれぞれ独立に水素原子又は _6アルキル基であり; R5及びが それぞれ独立に 1個若しくは 2個以上の水酸基を有することもあるモノスルホン 酸置換 C,_6アルキル基である上記化合物又はその塩が提供される。さらに好まし い態様によれば、 R1及び R2がそれぞれ独立に _4アルキル基であり、 R3及び R4がそ れぞれ独立に水素原子又はアルキル基であり、 R5及び R6がそれぞれ独立に 1個 の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換 C24アルキル基である上記化合 物又はその塩が提供される。

本発明の別の観点からは、上記化合物またはその塩を含む酸化発色試薬が提供 され、その好ましい態様によれば、過酸化水素測定用試薬又はペルォキシダーゼ 測定用試薬として用いる上記酸化発色試薬が提供される。この試薬は粉末状また は溶液状などの各種の形態で提供される。

図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の化合物を用いて過酸化水素濃度測定を行った結果を示す図 である。

第 2図は、本発明の化合物を用いて過酸化水素濃度測定を行った結果(ストツ パーとして硫酸の存在下)を示す図である。

第 3図は、本発明の化合物から形成される色素の安定性を示した図である。 第 4図は、本発明の化合物を用いてペルォキシダーゼ活性を測定した結果を示 す図である。

発明を実施するための最良の形態

上記の一般式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に ( 6アルキル基、好ましくはそれぞ れ独立に C 4アルキル基を示す。アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のいずれを 用いてもよい。例えば、メチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基などを用いることができるが、 R1及 び R2がともにメチル基であることが好ましい。 R3及び R4はそれぞれ独立に水素原 子又は アルキル基、好ましくはそれぞれ独立に水素原子又は C 4アルキル基を 示す。アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のいずれを用いてもよく、例えば上記 に例示したものを用いることができる。及び R4がともに水素原子である力、、又 は、 R3及び R4がともにメチル基又はェチル基である場合が好ましい。

R5及び R6はそれぞれ独立に水素原子、 1個若しくは 2個以上の水酸基を有する こともあるモノスルホン酸置換アルキル基、 1個若しくは 2個以上の水酸基 を有することもあるカルボキシ置換 d— 6アルキル基、又は 1個若しくは 2個以上 の水酸基を有する < 6アルキル基を示すが、 R5及び R6が同時に水素原子であること はない。 R5及び R6が示す置換基において、 _6アルキル部分は直鎖又は分枝鎖のい ずれでもよく、例えば、ェチル基、 n-プロピル基、 η-ブチル基、 n-ペンチル基、 又は n-へキシル基、好ましくはェチル基又は n-プロピル基を用いることができる。 モノスルホン酸置換 ( 6アルキル基におけるスルホン酸基の置換位置は特に限 定されないが、 c 6アルキノレ基の末端に置換していることが好ましレ、。該モノス ルホン酸置換 _6アルキル基は 1個又は 2個以上の水酸基を有していてもよレ、。 このような水酸基の置換位置および個数は特に限定されないが、一例として、 _6 アルキル基上においてスルホン酸基が置換する炭素原子に隣接する炭素原子上に

1個の水酸基が置換している場合を挙げることができる。水酸基を有しないモノ スルホン酸置換 ( 6アルキル基も本発明に好適に用いることができる。

1個又は 2個以上の水酸基を有することもあるカルボキシ置換アルキル基 に存在するカルボキシル基の個数は特に限定されないが、好ましくは 1個又は 2 個、より好ましくは 1個である。カルボキシル基の置換位置は特に限定されない 力 少なくとも 1個のカルボキシル基が C 6アルキル基の末端に置換しているこ とが好ましい。カルボキシ置換 C 6アルキル基は 1個又は 2個以上の水酸基を有 していてもよい。このような水酸基の置換位置および個数は特に限定されないが、 一例として、 C 6アルキル基上においてカルボキシル基が置換する炭素原子に隣 接する炭素原子上に 1個の水酸基が置換している場合を挙げることができる。力 ルポキシ置換 ( 6アルキル基として、例えば、 3-カルボキシ -1-プロピル基などを 挙げることができる。

1個又は 2個以上の水酸基を有する _6アルキル基に存在する水酸基の個数は、 好ましくは 1個又は 2個である。水酸基の置換位置は特に限定されないが、 2個 の水酸基を有する場合には _6アルキル基の隣接する炭素原子上にそれぞれ 1個 の水酸基が存在していることが好ましく、 1個の水酸基を有する場合にはァ ルキル基の末端に置換していることが好ましい。 1個又は 2個以上の水酸基を有 する _6アルキル基として、例えば、 2,3-ジヒドロキシ- 1-プロピル基、 3-ヒドロ キシ- 1 -プロピル基などを挙げることができる。

本発明の化合物は塩の形態で存在する場合もあるが、いかなる形態の塩も本発 明の範囲に包含される。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などの 金属塩、アンモニゥム塩、トリェチルァミン塩などの有機ァミン塩などの塩基付

加塩、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、 P-トルエンスルホン酸などの有機酸塩を挙 げることができる。これらのうち、ナトリゥム塩を好適に用いることができる。ま た、本発明の化合物は置換基の種類により 1個又は 2個以上の不斉炭素を有する 場合があるが、これらの 1個又は 2個以上の不斉炭素原子に基づく任意の光学活 性体や、 2個以上の不斉炭素に基づく任意のジァステレオ異性体などの任意の異 性体、またはラセミ体などの異性体混合物はいずれも本発明の範囲に包含される。 さらに、任意の水和物、任意の溶媒和物も本発明の範囲に包含される。

本発明の化合物の特に好ましい例を以下に示すが、本発明の化合物はこれらの 化合物に限定されることはない。

化合物 A

化合物 B

化合物 C

化合物 D

化合物 E

本発明の化合物の製造方法は特に限定されず、任意の製造方法を採用すること ができる。本明細書の実施例には、本発明の代表的な化合物について製造方法の 具体例を示したが、本発明の化合物の製造方法はこれらの製造方法に限定される ことはない。これらの具体例の記載を参考にして、必要に応じて出発原料や反応 条件などを適宜修飾ないし変更することにより、本発明の上記一般式に包含され る任意の化合物を製造できることが当業者には理解されよう。

本発明の化合物は、例えば、酸化発色試薬として用いることができ、例えば、 過酸化水素濃度やペルォキシダーゼ活性の測定に用いることができる。酸化発色 試薬としての使用方法の具体例を本明細書の実施例に示したが、本発明の化合物 の用途はこれらの特定の用途に限定されることはなく、また、使用方法も実施例 の細部に限定されることはない。本発明の化合物を上記の測定試薬として用いる 場合には 2種以上の化合物を適宜組み合わせて用いてもよい。

また、必要に応じて、例えば、緩衝剤、溶解補助剤、酸化防止剤などの安定ィ匕 剤、防腐剤などの成分の 1種又は 2種以上と組み合わせて、粉末や凍結乾燥品な どの形態の固形組成物、または溶液状の組成物を製造して用いてもよい。粉末状 又は溶液状などのいかなる形態の試薬も本発明の範囲に包含されることろ理解す べきである。本発明の化合物は保存安定性に優れるという特徴を有しているが、 溶液状態で長期保存する場合には、一般的には遮光容器内に保存することが望ま しい。もっとも、試薬の組成や形態、及び保存形態はこれらに限定されることは なく、当業者が適宜選択可能であることは言うまでもない。

実施例

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下 記の実施例に限定されることはない。なお、実施例中の化合物 A〜Cは、上記に 好ましい化合物として例示した化合物 A〜Cに対応している。

例 1 :化合物 Cの製造

オルトトリジン 3 g (14. 1 mmol) , 炭酸力リウム 3 g (28. 3 mmol)、 3-クロロヒ ドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム 5. 6 g (28. 5 mmol)の混合物にイソプロ パノール 30 mlを加え、 70°Cで 16時間攪拌した。その後、反応液を濃縮乾固し、 残さにクロロホルムを加えて未反応物を除去した。水相を濃縮してゲル濾過に付 し、目的物のフラクションを分離して濃縮乾固し、白色粉末 4. 8 g (9. 01 匪 ol) を得た (収率 63. 9%) 。

薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲルプレート、展開溶媒:アンモニ ァ飽和ブタノール、検出 UV 吸収): Rf=0. 35

元素分析理論値(for C2。H26N2Na208S2) C : 45. 11%, H: 4. 92%, N: 5. 26%; 実測値 C : 45. 22%, H: 4. 89%, N: 5. 17%.

IR (cm一1) 3500 (OH) , 3410 (NH) , 1622 (C=C) , 1255 (CN) , 1210 (S03), 1050 (S03) .

例 2 :化合物 D及び化合物 Fの製造

オルトトリジン 3 g (14. 1 mmol) , 1, 4-ブタンスノレトン 3. 9 g (28, 6 mmol)の混 合物にイソプロパノール 30 mlを加え、 60°Cで 20時間攪拌した。その後、反応液 を濃縮乾固し、残さにクロ口ホルムを加えて未反応物を除去した。水相を 1N水 酸化ナトリゥムで中和した後に濃縮してゲル濾過に付した。目的物のフラクショ ンを分離して濃縮乾固し、白色粉末 5. 3 g (10. 0 mmol)を得た(収率 71. 1%) 。 薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲルプレート、展開溶媒:アンモニ ァ飽和プタノール、検出 UV 吸収): Rf=0. 30

元素分析理論値(for C22H3。N2Na206S2) C : 49. 99%, H: 5. 72%, N: 5. 30%;実測値 C : 49. 33%, H: 5. 77%, N: 5. 20%.

IR (cm-1) 3400 (NH) , 1615 (C=C) , 1240 (CN) , 1200 (S03), 1040 (S03) .

同様にして、 R1及び R2がメチル基であり、 R3及び R4が水素原子であり、 R5及び R6が 3 -ヒドロキシ- 1-プロピル基である化合物 Fを製造した。

オルトトリジン 3 g (14.1 匪 ol)をイソプロパノール 150 ml、純水 50 mlの混合 溶媒に溶解し、 100°Cに加温して溶解後、 3_クロ口プロパノール 3 g (31.7腿 ol) を加えた。 100°Cを保ちながら、この混合物に lN-NaOH溶液を 30ml滴下し、滴下終 了後、 100°Cを保ちながら、 2時間撹拌を続けた。その後、反応混合物を室温まで 放冷し、濃縮乾固して白色粉末を得た。その粉末をメタノールに溶解して、シリ 力ゲルカラムにより分離精製して、目的物 3.1 g (9.45 mmol)を白色粉末として 得た。(収率 67%)

薄層クロマトグラフィー(メルク製シリカゲルプレート、展開溶媒:クロ口ホル ム /メタノール =7: 3) Rf=0.45

元素分析 理論値(for C2QH28N202) C: 73.14%, H:8.59%, N:8.53%; 実測値 C: 73.35%, H:8.42%, N:8.60%

IR (cm—1) 3520 (OH), 3400 (NH), 1628 (C=C) , 1255 (CN)

例 3 :本発明の化合物を用いた過酸化水素濃度測定

バッファー溶液 3 ml (50 mM-リン酸緩衝液、 pH 7.0) にペルォキシダーゼ(3.3 U/ml) と化合物 A〜C又は 3,3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMBZ) (各 100 μ Μ)を加えて 37°Cで 5分間プレインキュペートした。その後、過酸化水素を 1, 2, 5, 10, 20 μΜ になるように加え、 37°Cで 1分間反応させた。各々の化合物の極 大吸収波長(化合物 A: 660 nm;化合物 B : 672 nm;化合物 C : 674 nm; TMBZ: 650 nm) での吸光度を測定した。結果を第 1図に示す。本発明の化合物から生成 する色素が通常測定に用いられる波長において TMBZ よりも大きなモル吸光係数 を有していることが明らかである。

例 4 :本発明の化合物を用いた過酸化水素濃度測定(硫酸存在下)

バッファー溶液 3 ml (50 mM-リン酸緩衝液、 pH 7.0) にペルォキシダーゼ(3.3 U/ml) と化合物 C又は 3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMBZ) (各 100 //M)を 加えて 37°Cで 5分間プレインキュペートした。その後、過酸化水素を 1, 2, 5,

ΙΟμΜになるように加え、 37°Cで 1分間反応させた。ストッパーとして硫酸を各々 2%になるように加え、各々の化合物の極大吸収波長(化合物 C : 674 nm; TMBZ: 650 nm) での吸光度を測定した。結果を第 2図に示す。本発明の化合物から生成 する色素は酸の存在下においても安定であり、大きなモル吸光係数を有している ことが明らかである。

例 5 :本発明の化合物から形成される色素の安定性

バッファー溶液 3 ml (50 mM-リン酸緩衝液、 pH 7,0) にペルォキシダーゼ(3.3 U/ml) と化合物 C又は 3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMBZ) (各 ΙΟΟμΜ)を 加えて 37°Cで 5分間プレインキュペートした。過酸化水素を 10/zM になるように 加えて 37°Cで 1分間反応させ、硫酸を各々 2% になるように加え、再び 37°Cでィ ンキュベートして一定時間毎に各々の化合物の極大吸収波長(化合物 C :674 nm; TMBZ: 650 nm) での吸光度を測定した。結果を第 3図に示す。本発明の化合物か ら生成する色素は TMBZ 力ら生成する色素に比べて安定性に優れていることが明 らかである。

例 6 :本発明の化合物を用いたペルォキシダーゼ活性の測定

96穴マイクロプレートにバッファー溶液 700 μΐ (50mM-リン酸緩衝液、 ρΗ4.0) を 加え、化合物 A〜Cの保存溶液 ΙΟΟμΙ (各 10 mM)と過酸化水素溶液 100 μ 1 (3 mM) を加えた。ペルォキシダーゼ溶液 ΙΟΟμΙ (1.67 X 10"2 IU/ml, 7.80X10"3 IU/ml, 3.90X10—3 IU/ml, 1.67X10— 3 IU/ml, 6.60X10 IU/ml, 3.30X104 IU/ml) を 加えて室温で 30分間放置した後、濃硫酸を 2μ1 加えてマイクロプレートリーダ 一により 490 nm の吸光度を測定した。結果を第 4図に示す。

産業上の利用可能性

本発明の化合物は過酸化水素の測定及びペルォキシダーゼの測定用試薬として用 いることができる。本発明の化合物は高い水溶性を有しており、光分解や酸化分 解に対して高い抵抗性を示すという特徴がある。また、測定試薬として用いた場

合には、反応後に安定で大きなモル吸光係数を有する色素を生成できるという特 徴がある。