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1. (WO1992010761) METHOD AND REAGENTS FOR THE DETERMINATION OF THE ENZYMIC ACTIVITY OF TRANSGLUTAMINASE (EC 2.3.2.13)
Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters

Λ V
P a t e n t a n s p r ü c h e

Verfahren zur Bestirnmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutamxnase) und anderer Transglutaminasen der Enzyπigruppe EC 2.3.2.13, wobei

a) Microtiterplatten aus Kunststoffen oberflächlich mit
einem Substrat der Transglutaminase beschichtet werden und

b) mit einer Lösung die ein weiteres Substrat der Transglutaminase, Calciumchiorid, eine als Reduktionsmittel wirkende Thioverbindung sowie eine Transglutaminase- haltige Probe auf der beschichteten Microtiterplatte zur Reaktion gebracht werden, wobei gegebenenfalls Thrombin zur proteolytischen Aktivierung der Transglutaminase zugefügt wird, dadurch gekennzeichnet, daß

c) das auf die Microtiterplatten beschichtete Substrat ein Glutamin enthaltendes Protein oder Peptid ist,

d) das in Lösung befindliche Substrat eine Verbindung mit einer primären Aminogruppe der allgemeinen Formel I


in welcher n eine ganze Zahl, von 4 - 8 und X
eine inerte, mit spezifischen Antikörpern
koppelnde Gruppe bedeutet, ist.

e) die durch Transglutaminase an die Platte gebundenen
Amine mit einem markierten Antikörper gegen die Gruppe X umgesetzt, f ) die Menge des gebundenen Amins bzw. des Antikörpers
mittels eines geeigneten Nachweisreagenzes bestimmt

g ) und jeweils zwischen den einzelnen Schritten gelöste
Reagenzreste ausgewaschen werden .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin der Formel I Dinitrophenylcadaverin ist und mit einem enzymmarkierten Antikörper gegen Dinitrophenylgruppen umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit alkalischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease markiert ist und mit einem Phosphatase-, Peroxidase- bzw. Urease- Reagenz bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper radioaktiv markiert ist und die Radioaktivität gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin oder der Antikörper mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist und die Fluoreszenz gemessen wird.

6. Verfahren nach der Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in gepufferten Lösungen bei pH- Werten von 7.0 bis 8.5, vorzugsweise bei pH 7.4, und Temperaturen von 20 - 40°C, vorzugsweise 20 - 37°C, durchgeführt werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Microtiterplatten mit Caseinlösung beschichtet werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Thioverbindung Dithioerythritol (DTE, erythro-l,4-Dimer- capto-2,3-butandiol) oder Dithiothreitol (DTT, threo-l,4-Dimercapto- 2,3-butandiol) ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombin Rinderthrombin oder Humanthrombin ist.

10. Reagenzkit zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13 bestehend aus:

a) Microtiterplatte aus Kunststoff

b) Beschichtungslösung mit Proteinen oder Peptiden, welche Glu- tamin enthalten, in gepufferter Lösung,

oder

Microtiterplatten, welche mit Proteinen oder Peptiden, die Glu- tamin enthalten, vorzugsweise Casein, beschichtet sind

c) einer Reagenzlösung aus Calciumchiorid, einer Thioverbindung und einem primären Amin der Formel I

NH2-(CH2)n-X (I)

d) gegebenenfalls einer Thrombinlösung zum Nachweis throm- binabhängiger Transglutaminasen

e) einer markierten Antikörperlösung gegen die Gruppe X der Amins der Formel I

f) einem Nachweisreageπz für die Markierung des Antikörpers e)

g) Pufferlösungen zum Waschen

h) gegebenenfalls Eichlösungen mit normierter Trans- glutaminase-Aktivität.