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1. MXPA/a/2000/012525 - NOVEL THIOLESTERS AND USESTHEREOF

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[ ES ]

NUEVOS TIOLESTERES Y USOS DE LOS MISMOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de las terapéuticas de virología y anti-viral. En particular, esta invención pertenece al descubrimiento de una nueva familia de tiolesteres y usos de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los virus, especialmente los retrovirus tales como

HIV, pueden volverse rápidamente resistentes a los fármacos utilizados para tratar la infección. Esta adaptabilidad extrema de los retrovirus se debe a la alta tasa de error de la enzima transcriptasa inversa responsable de transcribir su genoma de ARN. El HIV es un ejemplo de tales virus hiper-mutables. Este se ha diversificado en __dos principales especies, HIV-1 y HIV-2, cada una de las cuales tiene muchas clases, sub-tipos y variaciones resistentes a los fármacos.
Las estrategias para detener ~~con emergencia las sepas virales resistentes a los fármacos incluyen la combinación de terapias de fármacos. Lange (1996) AIDS 10 Suppl 1:S27-S30) . Los fármacos contra diferentes proteínas virales y los fármacos contra sitios múltiples sobre la misma proteína se utilizan comunmente coo una estrategia para superar la adaptabilidad del virus. La combinación de terapias para retrovirus, que utilizan, por ejemplo, inhibidores de proteasa y análogos de nucleósido, tales como AZT, ddl, ddC y d4T, pueden volverlos ineficaces; El virus desarrolla resistenciaa completa en un relativamente corto período de tiempo (Birch (1998) AIDS 12:680-681; Roberts (1998) AIDS 12:453-460; Yang (1997) Leukemia 11 Suppl 3:89-92; Demeter (1997) J". Acq ir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol . 14 (2) : 136-144 ; Kuritzkes (1996) AIDS 10 Suppl 5:S27-S31). Además no se encuentra actualmente disponible ninguna vacuna anti-retroviral (Bolognesi (1998) Nature 39:638-639; Bangham (1997) Lancet 350:1617-1621).
El HIV-1 que causó AIDS epidémico empezó aproximadamente hace 18 años. Desde entonces el número de nuevos casos se han incrementado a través del tiempo. Para fines de 1994, se han reportado 1,025,073 casos de AIDS a la WHO, con un 20% de incremento en el número de casos desde diciembre de 1993 (Galli (1995) Q. J. Nucí . Med. 39:147-155). Para el año 2000, La WHO predice que habrá en el mundo de 30 a 40 millones de infecciones de HIV-1 acumulables (Stoneburner (1994) Acta Paediatr. Suppl . 400:1-4). Así, existe una gran necesidad de compuestos efectivos contra los retrovirus tales como HIV-1. La presente invención cumple esta y otras necesidades.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un nuevo género de composiciones que comprenden un tiolester que tiene una estructura química seleccionada del grupo que consiste de: un tiolester que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste de Modelo I y Modelo II, en donde el Modelo I y el Modelo II tienen las siguientes estructuras



Modelo I Modelen
en donde X es un miembro seleccionado del grupo que consiste de grupos alquilo, alquilo substituido, arilo y arilo substituido; Rx es -Y-Z,
en donde Y se selecciona del grupo que consiste de -(CH2)m-/ en donde m es un entero de 1 a 6,


CH3
CH2 — H — C— CH2 - — C— NH — C— CH
I II

CH3 O

en donde Z se selecciona del grupo que consiste de dialquilo o arilo o alquilarilo sulfonio (Zl) , trialquilo o arilo o alquilarilo amonio (Z2) , trialquilo o arilo o alquilarilo fosfonio (Z3) , o piridinio (Z4) que tiene la estructura

en donde Ri2, Ri3, Ri4, RX5 y Ris, son miembros independientemente seleccionados del grupo que consiste de H-, -C(=0)NH2, y grupos carboxamida substituidos o,
Ri se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilo substituido, -arilo, arilo substituido, -arilalquilo,

-pH-CH3, arilalcoxy, pH-OCH3, nitroarilo, -pH-N02 y grupos - (CH2)n-X, en donde X es un halógeno y n es un entero de 1 a 6;
R2 se selecciona del grupo que consiste de -H, -CH3, -C(=0)NH2 y grupos -C(=0)OCH3;
R3, R4 y R5 son miembros independientemente seleccionados del grupo que consiste de H, un halógeno, -N02, -C(=0)ONH2, y grupos -C(=0)OCH3;
Rs se selecciona del grupo que consiste de -H, alquilo, -CH3, alquilo substituido, arilo, arilo substituido y grupos alquilo;
R7, R8, R9, Rio, Y Rii son H excepto cualquiera de R7,

Rs, o R9 que pueden ser (0=S=0)-G' en donde G' se selecciona del grupo que consiste de -NH2, -NH-alquilo, -NH-arilo, -NH-acilo, arilo-NH2, nitroarilo, arilo-NH-acilo y grupos arilo-NH-alquilo;

un tiolester que tiene una formula seleccionada del grupo que consiste del Modelo III y del modelo IV, en donde el Modelo III y el Modelo IV tienen las estructuras

Modelo m



Modelo m.


en donde G se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido y grupos alquilarilo,

R6 se selecciona del grupo que consiste de -H, alquilo, -CH3, alquilo substituido, arilo, arilo substituido y grupos arilalquilo;
R7, R8, R9, Rio, y Rn son H excepto cualquiera de R7, Rs, o Rg que pueden ser (0=S=0)-G' en donde G' se selecciona del grupo que consiste de -NH2, -NH-alquilo, -NH-arilo, -NH-acilo, arilo-NH2, nitroarilo, arilo-NH-acilo y grupos arilo-NH-alquilo;
un tiolester que tiene una formula seleccionada del grupo que consiste del Modelo V y del modelo VI, en donde el Modelo V y el Modelo VI tienen las estructuras
Modelo V



Modelo VI


en donde n es cualquier entero, R2 a R5, R6, y Rι a Ri6 se definen como anteriormente, Y es como se definió arriba, Rι7 es -H o -CH3, RX8 es -H, -CH3, alquilo, arilo. arilalquilo o una cadena lateral de aminoácidos, en donde la configuración estereoquímica alrededor del átomo de carbono al cual RX8 se une puede ser R o S, RX9 es -OH, -NH2, amida de nitrógeno N-substituido o un grupo ester (-0R) ;
un tiolester que tiene la fórmula del Modelo VII con la estructura
Modelo MI


en donde R0 es cualquier sistema de anillo de arilo o heteroarilo substituido o no substituido unido directamente al átomo de azufre, —
Y y RX2 a Rxs se definen como anteriormente; y
un piridinioalcanoilo tiolester que tiene la fórmula


en donde m es un entero de 1 a 6, n es 0 o un entero de 1 6 y R se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, alquilarilo, carboxamida, carboxamido, carboxamida substituida, carboxamido substituido, grupos -NH2 y grupos -NH2 substituidos .
En modalidades alternativas, en el tiolester, X es un miembro seleccionado del grupo que consiste de -(CH2)m-, en donde m es un entero de 1 a 6 y -CH2 (C=0) NH- ; Rx se selecciona del grupo que consiste de -CH3, - (CH2)n-CH3,

CH(CH3)2, -C(CH3)3, -(CH2)n-Cl, -(CH2)n-Br, y grupos -(CH2)n-I; G se selecciona del grupo que consiste de CH(CH3)2, C(CH3)3; y grupos 2, 6-dimetil fenil; y, el grupo R de piridinioalcanoilo tiolester se selecciona del grupo que consiste de -NHC(=0)CH3, -C6H4N02, -C6H4NHS02CH2C6H4N02 y grupos C6HNHCOCH3. El piridinioalcanoilo tiolester puede tener una estructura en donde m es el entero 4 y n = 0 o el entero 1 o 2.
En una modalidad, el tiolester de la invención es capaz de disociar un ion de metal de un indicador de zinc in vi tro . En otra modalidad el tiolester de la invención tiene actividad antiviral.
La invención proporciona un método para disociar un ion de metal de una proteína que contiene un indicador de zinc, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto el indicador de zinc con el tiolester de la invención. En modalidades alternativas, el ion de metal es un ion de zinc; El indicador de zinc comprende una proteína viral; la proteína viral es una proteína nucleocápsida, una proteína Gag o una proteína Gag-Pol; y la proteína que contiene el indicador de zinc se incorpora en un virus intacto.
En una modalidad, en el método para disociar un ion de metal a partir de una proteína que contiene un indicador de zinc, el poner en contacto los virus con el compuesto se lleva a cabo in vi tro. El poner en contacto el virus con el compuesto también puede realizarse in vivo . El indicador de zinc puede comprender una proteína retroviral derivada de un sarcoma avian y del grupo retroviral leucosis, un grupo retroviral tipo B de mamífero, una leucemia de célula T humana y un grupo retroviral de leucemia bovina, un grupo retroviral tipo D, un grupo relacionado a la leucemia murina, o un grupo lentivirus . La proteína retroviral puede ser proveniente de un retrovirus HIV-1, un HIV-2, un SIV, un BIV, un EIAV, un Visna, un CaEV, un HTLV-1, un BLV, un MPMV, un MMTV, un RSV, un MuLV,un FeLV, un BaEV o un SSV. Este método puede además comprender detectar la disociación del ion de metal proveniente del indicador de zinc de la proteína viral. La detección de la disociación del ion de metal proveniente del indicador de zinc puede llevarse a cabo utilizando un método seleccionado del grupo que consiste de electroforesis ~ capilar, inmuno-manchado, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , detección por liberación de zinc-65 radioactivo, detección de fluorescencia y detección de cambio de movilidad del gel.
La invención también proporciona un método para inactivar virus, comprendiendo el método el poner en contacto el virus con el compuesto de la invención, en donde el poner en contacto el virus con el compuesto inactiva el virus. En este método el compuesto puede desasociar un ion de zinc proveniente de un indicador de zinc . El virus puede ser un retovirus derivado de un sarcoma avian y del grupo retroviral leucosis, un grupo retroviral tipo B de mamífero, una leucemia de célula T humana y un grupo retroviral de leucemia bovina, un grupo retroviral tipo D, un grupo relacionado a la leucemia murina, o un grupo lentivirus. El retrovirus puede ser un retrovirus HIV-1, un HIV-2, un SIV, un BIV, un EIAV, un Visna, un CaEV, un HTLV-1, un BLV, un MPMV, un MMTV, un RSV, un MuLV,un FeLV, un BaEV o un SSV.
En el método para inactivar el virus, el poner en contacto el virus con el compuesto puede realizarse in vivo . En esta modalidad, el compuesto puede administrarse para-inhibir la transmisión del virus. El compuesto puede administrarse intra-vaginalmente o intra-rectalmente para inhibir la transmisión del virus. El compuesto puede administrarse a un humano como una formulación farmacéutica.

El compuesto puede administrarse a un animal como una formulación farmacéutica veterinaria. El método puede comprender además poner en contacto el virus con un agente anti-retroviral no-tiolester . El agente anti -retroviral puede ser un análogo de nucleotido o un inhibidor de proteasa. El análogo de nucleotido puede ser AZT, ddCTP o DDl.
En el método para inactivar el virus, el poner en contacto el virus con el compuesto puede realizarse in vitro. En esta modalidad del método, el poner en contacto el retrovirus con el compuesto puede realizarse en un producto sanguíneo, plasma sanguíneo, medio nutriente, proteína, un farmacéutico, un cosmético, un esperma o una preparación de oocito, células, cultivos celulares, bacteria, virus alimentos y bebidas.
La invención también proporciona un virus aislado e inactivado, en donde el virus se inactiva por un método que comprende poner en contacto el virus con un tiolester de la invención, en donde el poner en contacto el virus con el tiolester inactiva al virus. El virus aislado e inactivado puede comprender además una formulación de vacuna. El virus aislado e inactivado puede ser un retrovirus derivado de un sarcoma avian y del grupo retroviral de leucosis, del grupo retroviral tipo B de mamífero, una leucemia de célula T humana y un grupo retroviral de leucemia bovina, un grupo retroviral tipo D, un grupo relacionado a la leucemia murina, o un grupo lentivirus. El virus puede ser un retrovirus HIV-1, un HIV-2, un SIV, un BIV, un EIAV, un Visna, un CaEV, un HTLV-1, un BLV, un MPMV, un MMTV, un RSV, un MuLV,un FeLV, un BaEV o un SSV.
La invención también proporciona un método de seleccionar un compuesto capaz de disociar un ion de metal quelado con un indicador de zinc de una proteína viral , comprendiendo el método: poner en contacto el indicador de zinc con el tiolester; y detectar la disociación del ion de metal proveniente del indicador de zinc de la proteína viral . En este método el ion de metal puede ser un ion de zinc . En este método la detección de la disociación del ion de metal proveniente del indicador de zinc puede llevarse a cabo utilizando electroforesis capilar, inmuno-manchado, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , detección por liberación de zinc- 65 radioactivo, detección de fluorescencia y detección de cambio de movilidad del gel .
La invención también proporciona un equipo para seleccionar un compuesto capaz de disociar un ion de metal proveniente de un indicador de zinc de una proteína viral, comprendiendo el equipo una proteina retroviral e instrucciones para detectar la disociación del ion de metal proveniente de la proteína viral, comprendiendo las instrucciones, direcciones para la selección de un tiolester de la invención. En el equipo la proteína viral puede suministrarse con un ion de zinc quelado con el indicador de zinc de la proteína viral . La proteína viral puede incorporarse en un retrovirus completo. El indicador de zinc puede derivarse de un sarcoma avian y del grupo retroviral de leucosis, del grupo grupo retroviral tipo B de mamífero del grupo retroviral de leucemia de célula T y de leucemia bovina, del grupo retroviral tipo D, del grupo relacionado a la leucemia murina o del grupo lentivirus. El indicador de zinc puede derivarse del retrovirus de un HIV-1, un HIV-2, un SIV, un BIV, un EIAV, un Visna, un CaEV o un SSV. En el equipo las instrucciones pueden estar dirigidas para detectar la disociación del ion de metal proveniente de la proteína utilizando electroforesis capilar, inmuno-manchado, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , detección por liberación de zinc-65 radioactivo, detección de fluorescencia o detección del desplazamiento de movilidad de gel.
La invención también proporciona una composición virucida que comprende un tiolester de la invención. En una modalidad la composición virucida comprende además plasma sanguíneo, medio nutriente, proteína, un fármaco, un cosmético, una preparación de esperma u oocito, células, cultivos celulares, bacteria, virus, alimento o bebida.

La invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un tiolester de la invención. La formulación farmacéutica puede comprender además un excipiente farmacéutico.
Un entendimiento adicional de la naturaleza y ventajas de la presente invención puede comprenderse por referencia a las porciones restantes de la especificación y las reivindicaciones.
Todas las publicaciones, bases de datos electrónicas, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente, se incorporan expresamente para referencia para todos los propósitos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La eficiencia de la mayoría de los agentes antivirales es limitada debido a que es común que, bajo presión de selección, los virus muten a cepas resistentes al fármaco. El desarrollo de resistencia al fármaco es una estrategia de supervivencia particularmente notable entre los retovirus debido a su habilidad para mutar rápidamente. Las estructuras virales necesarias para la viabilidad y crecimiento son buenos objetivos de los fármacos debido a que su inactivación no puede superarse fácilmente por mutación. Las estructuras virales esenciales para la replicación y viabilidad son buenos objetivos para el desarrollo de los fármacos. La utilidad de estos objetivos puede mejorarse además si las estructuras son mutacionalmente intolerantes. Además, estas estructuras pueden conservarse y/o mantenerse entre familias de virus, grupos o géneros.
La invención proporciona un nuevo género de composiciones de tiolester. Estos tiolésteres son capaces de inactivar los virus mediante una variedad de mecanismos, particularmente al formar complejos con los indicadores de zinc que forman complejos con el ion metal. En una modalidad preferida las composiciones de tiolester de la invención-inactivan los retrovirus. Típicamente esta inactivación se efectúa cuando el tiolester contacta la nucleocápside del virus, u otros indicadores de zinc que contienen proteínas. Un aspecto importante de estas nuevas composiciones es que no se afectan (es decir su actividad no se disminuye grandemente in vivo) por la reducción del ambiente de fluidos biológicos. Así, son importantes reactivos terapéutico en el tratamiento de agentes virales, especialmente retovirales. La actividad viricida de las composiciones de la invención también es útil en aplicaciones in vi tro, tales como por ejemplo, haciendo virus inactivos para utilizarse como, por ejemplo, reactivos o vacunas, y como reactivos de esterilización.
Un motif "indicador de zinc" es una estructura esencial y altamente conservada encontrada en muchos virus, especialmente los retrovirus. Las proteínas Gag y Gag-Pol en el Retroviridae, excepto por los Spumaviruses, contienen un motif de indicador de zinc altamente conservado (CCHC) dentro la porción de proteína de la nucleocápside p7 (NCp7) de la poliproteína (ver definiciones a continuación) . La conservación absoluta de la cisteína quelante de metal y los residuos de histidina junto con otros residuos de la proteína y esta en participación en funciones esenciales durante las replicaciones tempranas y tardías del virus identifica esta característica como un objetivo antiviral. Las mutaciones de los residuos quelantes en los indicadores de zinc produjeron un virus no infeccioso. Debido a que los indicadores de zinc son idénticos en la mayoría de los retrovirus, los reactivos capaces de inhibir su función tienen el potencial de ser fármacos terapéuticos de amplio espectro anti-viral.
La proteína de nuclecápside HIV-1 (NC) , NCp7, contiene dos indicadores de zinc separados por solo siete aminoácidos (Henderson (1992) J. Virol . 66:1856) . Ambos indicadores son esenciales para la infectividad (Aldovini

(1990) J. Virol . 64:1920; Gorelick (1990) J. Virol . 64:3207).

Así, la nucleocápside HIV-1 es un objetivo particularmente vulnerable para los reactivos que inactivan el indicador de zinc. Todas las evidencias apuntan hacia la completa conservación de los residuos quelantes y a algunos otros residuos clave dentro del indicador. La mutación de cualquiera de estos residuos da como resultado la pérdida o grave compromiso de infectividad del virus. Aún las mutaciones que mantienen propiedades quelantes de iones de metal del indicador (CCHC a CCHH o CCCC) dan como resultado la pérdida de infectividad. Así, no existe evidencia conocida para una trayectoria mutacional de mutaciones únicas o múltiples que conduzcan a la restauración de la actividad de la proteína.
Diversos compuestos C-nitrosos y compuestos que contienen disulfuro, tales como cistamina, disulfuro de tiamina y disulfiram, pueden oxidizar los tiolatos de cisteína del indicador de zinc e inducir la degradación de disulfuro intra e inter-molecular, ver por ejemplo Me Donnell (1997) J. Med. Chem. 40:1969-1976; Rice (1997) Nature Medicine 3:341-345; Rice (1997) Ant imicrob .Agents and Chemotherapy 41:419-426; Rice (1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616; Rice (1996) Science 270:1194-1197; Rice (1993) Proc . Nati .Acad. Sci . USA 90:9721-9724; Rice (1993) Nature 361:473-475. Ver también Henderson, et al., WO 96/09406. Los tioles de cisteína en cada uno de los dos indicadores de zinc se atacan rápidamente por los reactivos tales como los compuestos Cu+2, Fe+3, C-nitroso, disulfuros, maleimidas, cetonas alfa-halogenadas y derivados de óxido nítrico, con pérdida simultánea de la estructura de proteína nativa. Por ejemplo, el __tratamiento de HIV-1 completo con un agente oxidizante, tal como 3-notrosobenzamida, un compuesto C-nitroso, nduce la unión de disulfuro de la proteína de la nucleocapside e inactiva la infectividad viral a través de la oxidación de los indicadores de zinc (Rice (1993) Nature 361:473; Rice (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:9721-9724). Los compuestos C-nitrosos pueden también inactivar indicadores de zinc CCHC eucarióticos que contienen poli (ADP-ribosa) polimerasa (Buki (1991) FEBS Letters 290:181). Sin embargo, estos compuestos tienden a ser tóxicos, tener pobre solubilidad y biohabilidad y son reducidos e inactivados en soluciones biológicas.
Los tiolésteres novedosos de la invención interactúan con el indicador de zinc a través de su residuo de tioléster en lugar de un residuo S-S electrofílico. Los tiolésteres resultantes carecen de residuos electrofíleos S-S. Los grupos menos nucleofílicos se utilizan para motifs de indicadores de zinc objetivo. Como resultado, tienen propiedades grandemente mejoradas en comparación a muchos reactivos de disulfuro. Tienen toxicidad celular reducida. Tienen actividad antiviral mejorada y mejor reactividad con los residuos del indicador de zinc, particularmente el indicador de zinc en la proteína de nucleocapside NCp7 de HIV-1. Los tiolésteres de la invención tienen solubilidades acuosas mejoradas. Mantienen reactividad del indicador de zinc en la presencia de agentes reductores. La combinación de características mejoradas, especialmente la resistencia a la reducción en una solución biológica, en los tiolésteres de la invención mejora claramente su uso in vi tro, in vivo y aplicaciones terapéuticas.
Definiciones
Para facilitar él entendimiento de la invención se definen abajo varios de los términos.
Como se utiliza en la presente, el término "alquilo" se utiliza para referirse a un radical de hidrocarburo monovalente, saturado o insaturado, ramificado o no ramificado que tiene de 1-30 carbonos y preferentemente de 4-20 carbonos y más preferentemente de 6-18 carbonos. Cuando el grupo alquilo tiene de 1-6 átomos de carbono, este es referido como un "alquilo inferior" . Los radicales alquilo adecuados incluyen por ejemplo, estructuras que contienen uno o más grupos metileno, metino y/o metine. Las estructuras ramificadas tienen un motif de ramificación similar a i-propilo, t-butilo, i-butilo, 2-etilpropilo, etc. Según se utiliza en la presnete, el término abarca "alquilos substituidos" . "Alquilo substituido" se refiere a alquilo como se describió incluyendo uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, arilo, acrilo, halógeno (es decir, alquílhalos, por ejemplo, CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, tioamido, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo, mercapto, tia, asa, oxo, hidrocarburos cíclicos tanto saturados como insaturados, heterociclos y lo similar. Estos grupos pueden unirse a cualquier carbono del residuo alquilo. Adicionalmente, estos grupos pueden ser dependientes de o integrales a la cadena alquilo.
El término "alcoxi" se utiliza en la presente para referirse a el grupo COR, en donde R es un alquilo inferior, alquilo inferior substituido, arilo, arilo substituido, arilalquilo o arilalquilo substituido en donde los grupos alquilo, arilo, arilo substituido, arilalquilo y arilalquilo substituido son como se describe en la presente. Los radicales alcoxi adecuados incluyen por ejemplo, metoxi, etoxi, fenoxi, fenoxi substituido, benziloxi, fenetiloxi, t-butoxi, etc.
El término "alquilamino" denota aminas secundarias y terciarias en donde los grupos alquilo pueden ser ya sea el mismo o diferente y son como se describe en la presente para los "grupos alquilo" .
El término "arilo" se utiliza en la presente para referirse a un substituyente aromático que puede ser un anillo aromático simple o un anillo aromático múltiple que se fusiona junto, unido covalentemente o unido a un grupo común tal como un residuo de metileno o etileno. El grupo de unión" común puede también ser un carbonilo como una benzofenona. El anillo (s) aromático (s) puede incluir fenil, naftil, bifenil, difenilmetil y benzofenona entre otros. El término "arilo" que abarca "arilalquilo" "aril substituido" se refiere a arilo como ya se describió incluyendo uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halógeno, alquílalos (por ejemplo, CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, fenoxi, mercapto y hidrocarburos cíclicos tanto saturados como insaturados que se fusionan al anillo (s) aromático (s) , unido covalentemente o unido a un grupo común tal como un residuo de metileno o etileno. El grupo de unión puede también ser un carbonilo tal como en la ciciohexil fenil cetona. El término "arilo substituido" abarca "arilalquilo substituido" .
El término "arilalquilo" se utiliza en la presente para referirse a un subconjunto de "arilo" en el cual el grupo arilo se une además a un grupo alquilo, como se define en la presente.
"Contactar" se refiere al acto de poner los componentes de una reacción en proximidad adecuada de tal manera que pueda ocurrir la reacción. Más particularmente, como se utiliza en la presente, el término "contactar" puede utilizarse de manera intercambiable con lo siguiente: combinado con agregado a, mezclado con, pasado sobre, seguido por, etc.
Según se utiliza en la presente, el término "proteína Gag-Pol" se refiere al producto de traducción de la poliproteína de HIV-1 u otros retrovirus, como se describe por ejemplo por Fehrmann (1997) Virology 235:352-359; Jacks (1988) Nature 331:280-283. La "proteína Gag" se procesa por una, proteasa viral para producir proteínas virales maduras, ver por ejemplo, Humphrey (1997) Antimicrob. Agents . Chemother 41:1017-1023; Karacostas (1993) Virology 193 : 661-671.
El término "halógeno" se utiliza en la presente para referirse a átomos de fluoruro, bromuro, cloruro y yoduro .
Según se utiliza en la presente, "aislado" cuando se refiere a una molécula o composición tal como por ejemplo, el tioléster de la invención, un polipéptido o virus formado en complejo con el tioléster o un virus inactivado con el tioléster, significan que la molécula o la composición se separa de al menos otro compuesto, tal como una proteína, otros ácidos nucleicos (por ejemplo ARNs) u otros contaminantes con los cuales se asocia in vivo o en el estado que ocurre de manera natural. Así, un compuesto, un polipéptido o un virion se considera aislado cuando se ha aislado a partir de cualquier otro componente con el cual se asocia naturalmente, por ejemplo, membrana celular, como en un extracto celular, suero y lo similar. Una composición aislada puede, sin embargo, también ser substancialmente pura. Una composición aislada también puede estar en un _ estado homogéneo y puede estar en una solución seca o acuosa. La pureza y homogeneidad pueden determinarse, por ejemplo, utilizando técnicas químicas analíticas tales como electroforésis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) o cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) .
Según se utiliza en la presente, el término "proteína de núcleo capside" o "proteína NC" se refiere a la proteína de núcleo capside retroviral, la cual es una parte completa de la nucleocapside de virion en donde cubre el genoma de ARN dimérico, como se describió por, por ejemplo, Huang (1997) J. Virol . 71:4378-4384; Lapadat-Tapolsky (1997) J. Mol . Biol . . 268:250-260. La proteína de nucleocapside de HIV-1 se denomina "NCp7" , ver también Demene (1994) Biochemistry 33:11707-11716.
El término "retrovirus" como se utiliza en la presente se refiere a virus de la familia Retroviridae, la cual típicamente tiene ARNss transcritas por transcriptasa inversa, como se definió por, por ejemplo P. K. Vogt, "Historical introduction to the general properties of retroviruses" ("Introducción histórica de las propiedades generales de los retrovirus") en Retroviruses, eds. J.M. Coffin, S. H. Hughes y H. E. Varmus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, pp 1-26; Murphy et al. (eds.) Archives of Virology/Supplement 10, 586 pp (1995) Springer Verlag, Wien, NY y el sitio web para el Commite on International Taxonomy of Viruses, Virology División of the International Union of Microbiology Society en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/lCTV/para clasificación viral y taxonomía. Los miembros de la familia Retroviridae que contienen polipéptidos que contienen motif de indicador de zinc y cuya repliσación puede inhibirse por los tiolésteres de la invención incluyen sarcoma avian y retrovirus de leucosis (alfaretrovirus) , retrovirus tipo B de mamífero (betaretrovirus) (por ejemplo, virus de tumor mamario de ratón) leucemia de célula T humana y retrovirus de leucemia bovina (deltaretrovirus) (por ejemplo, virus linfotrópico-T 1 humano) grupo relacionado a la leucemia murina (gamaretrovirus) , retrovirus tipo D (epsilonretrovirus) (por ejemplo, virus de mono Mason-Pfizer) y Lentivirus. Los lentivirus incluyen grupos de lentivirus bovino, equino, felino, ovino/caprino y primate, tales como virus 1 de inmunodeficiencia humana (HIV-1) . Ejemplos de especies particulares de virus cuya capacidad replicativa se afecta por los tiolésteres de la invención incluyen retrovirus de HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, ELAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV y SSV.
Según se utiliza en la presente el término "tioléster" y "tioéster" puede utilizarse de manera intercambiable y se refieren a la estructura química G-S-(C=0) -G' , en donde G y G' representan cualquiera de dos agrupamientos de átomos; y cualquier estructura química consistente de un grupo carbonilo en base a oxígeno unido directamente a un átomo de azufre en el estado -2 de oxidación. Los átomos de carbono y azufre, a su vez se unen a cualquiera de los dos agrupamientos de átomos; así, G-S- (C=0) -G' .
Según se utiliza en la presente, el término "indicador de zinc" se refiere a un motif de polipéptido que consiste de cisteínas y/o histidinas que coordinan iones de metal dando lugar a estructuras involucradas en ácidos protein/nucléico y/o interacciones proteina/proteina. Los tiolésteres de la invención son capaces de disociar iones de metal provenientes de un indicador "de zinc in vi tro. Típicamente, el ion de metal es un catión divalente, tal como de zinc o cadmio. Una proteína que contiene motif de indicador de zinc es comúnmente una estructura esencial y altamente conservada en virus. Los motifs de indicador de zinc se encuentran en el virus de papiloma humano (HPV) , particularmente, proteínas HPV E6 y E7 (ver por ejemplo, Ullman (1996) Biochem J. 319:229-239, virus de influenza (ver por ejemplo, Nasser (1996) J. Virol . 70:8639-8644). En la mayoría de las subfamilias de Retroviridae, incluyendo retrovirus de sarcoma avian y leucosis, retrovirus tipo B de mamífero, retrovirus de leucemia de célula T humana y leucemia bovina, retrovirus tipo D y Lentiviruses, el motif de indicador de zinc invariable es la estructura más altamente conservada. La nucleocapside retroviral, las proteínas Gag y Gal-Pol tienen motifs de indicador de zinc.

En los retrovirus, el motif indicador de zinc típicamente consiste de 14 aminoácidos, con cuatro residuos siendo invariantes: Cys (X) 2Cys (X) 4His (X) .jCys y así se refiere como un "indicador de zinc CCHC" (Henderson (1981) J". Biol . Chem. 256:8400) . Esto quela el zinc a través de su imidazol de histidina y tiolatos de cisteina (Berg (1986) Science 232:485; Bess (1992) J. Virol . 66:840; Chance (1992) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:10041; South (1990)

Adv. Inorg. Biochem . 8:99; South (1990) Biochem . Pharmacol . 40:123-129). Los indicadores de zinc CCHC realizan funciones esenciales en la infectividad retroviral, tal como empacar el ARN genómico. Son también esenciales para eventos tempranos en la infección de virus .
Según se utiliza en la presente el término "capaz de disociar un ion de metal proveniente de un indicador de zinc in vi tro o tiene actividad antiviral" significa que un tioléster se encuentra dentro del alcance de la invención si, utilizando un análisis in vi tro, varios de los cuales se describen en la presente, este es capaz de disociar un ion de metal proveniente de un indicador de zinc hasta cualquier grado. La detección de la disociación de un ion de metal proveniente de un indicador de zinc puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo electroforesis capilar, inmuno-manchado, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , detección por liberación de zinc-65 radioactivo, detección de fluorescencia y detección del desplazamiento de movilidad de gel. El término también significa que un tioléster se encuentra dentro del alcance de la invención si este despliega una actividad antiviral en cualquier análisis, por ejemplo, el análisis de citoprotección XTT descrito en la presente. Por ejemplo, un tioléster con cualquier grado de actividad antiviral medible se encuentra dentro del alcance de la invención aún si no es detectable la disociación del ion de metal.
Según se utiliza en la presente el término "inhibe la transmisión del virus" y "actividad antiviral" significan la capacidad de un tioléster para afectar de manera negativa la capacidad replicativa viral en cualquier forma. Tal inhibición de transmisión, por ejemplo pérdida en la capacidad replicativa, puede medirse utilizando cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, un tioléster de la invención se encuentra inhibiendo la transmisión del virus

(que tiene actividad antiviral) si este disminuye la capacidad del virus para producir progenie, (cuando se encuentra en la forma de un virion, fusionarse con una célula, entrar a una célula, brotar de una célula, sobrevivir intracelular o extracelularmente, transcribir inversamente su genoma de ARN, traducir proteínas virales, procesar poliproteínas con proteasas, afectar ordenamientos intracelulares de componentes virales en una capside y lo similar. La capacidad de un tioléster de la invención para inhibir la transmisión de un virus no se limita por ningún mecanismo o trayectoria química o biológica. El tioléster puede inhibir la transmisión (disminuir la capacidad replicativa) de un virus mediante, por ejemplo, ligarse a una proteína de nucleocapside, tal como NCp7; evitar el enlace de NCp7 al ARN viral u otro ácido nucleico; siendo involucrada en un ataque químico específico que da como resultado la formación aducta estable, formando enlaces de disulfuro intracelular como resultado del colapso de los aductos de compuestos NCp7 inestables; interactuar con otros residuos conservados o no conservados dentro de la proteina NCp7 que da como resultado la pérdida de la función y lo similar.
Métodos Generales
La presente invención proporciona un nuevo género de compuestos de tioéster capaces de disociar un ion de metal de un indicador de zinc in vi tro. Los expertos reconocerán que los tioésteres de la invención pueden sintetizarse " utilizando una variedad de procedimientos y metodologías, que se encuentran bien descritos en la literatura científica y de patentes, por ejemplo, Volúmenes Colectivos de Síntesis Orgánicas, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc. NY; Venturi (1989) Pharm Res. 6:867-873. La invención se puede practicar en conjunto con cualquier método o protocolo conocido en la materia, que se encuentran bien descritos en la literatura científica y de patentes. Por lo tanto, solamente se describirán una pocas técnicas generales antes de tratar las metodologías específicas y ejemplos con relación a los novedosos tioésteres y métodos de la invención.
Todos los reactivos orgánicos e intermediarios se obtuvieron de Sigma/Aldrich (St. Louis, MO) y Lancaster Síntesis, Inc. (Windham, NH) . Los solventes y otros químicos fueron de grado de reactivo. La estructura y composición de todos los compuestos se verificó por 1H-NMR y El MS y se analizaron con TLC de capa de sílice, eluyéndose con metanol/ ácido acético (6:4) para tioésteres, incluyendo el quimiotipo de tioéster piridinoalcanoilo (PATE) y cloroformo/metanol (9:1) para los otros.
Los tioésteres de la invención se utilizan para inactivar el indicador de zinc que contiene retrovirus, tal como HIV-1, al atacar los indicadores de zinc y eyectar el zinc de los mismos. Será fácilmente aparente para aquellos^ expertos en la materia, que una vez inactivado, el retrovirus puede utilizarse, por ejemplo, como vacunas, como profilácticos o como compuestos en los análisis ELISA estándar para el diagnóstico de infecciones retrovirales . Elaborar y utilizar estas novedosas composiciones y métodos puede incluir incorporar una variedad de procedimientos y reactivos estándar. También se proporcionan los equipos para identificar los compuestos que pueden reaccionar con los indicadores de zinc HIV-1 CCHC. En adición a las novedosas composiciones de la invención, estos equipos incorporan una variedad de procedimientos y reactivos estándar.
La siguiente exposición de los métodos generales que pueden utilizarse en conjunto con la presente invención se proponen únicamente para propósitos ilustrativos. Serán aparentes para aquellos expertos en la materia, otros métodos y modalidades alternativas al revisar esta exposición.
Síntesis del Quimiotipo de Disulfuro Benzamida, Compuesto 2D

Un medio ejemplificativo para sintetizar el compuesto 2D como se describe en la Tabla 1 "D" designa una forma de dímero o "forma D" como se anotó en la Tabla 1) o

N, N' - (2 , 2 ' -ditiodibenzoil) -bis-sulfactamida, siguiente. El material de inicio, 2 , 2 ' -ditiodibenzoil cloruro, se sintetizó como se describe por Katz (1953) J. Org. Chem. 18:1380-1402; Baggaley (1985) J. Med. Chem. 28:1661-1667. A una solución de sulfacetamida (13 g, 60 mmol) en piridina (300 ml) se agregó por goteo una solución de 2 , 2 ' -ditiodibenzoil cloruro (como 85%, 8.1 g, 20 mmol) en 1,4 -dioxano (100 ml) a temperatura ambiente (RT) . La solución clara, café rojizo se agitó a RT durante la noche, entonces se vaciaron en etil éter agitado vigorosamente (ÍL) . El precipitado de líquido viscoso se separó de la fase de éter, disuelta en N, N-dimetilformaldehído (DMF, aproximadamente 50 ml) y se agregó por goteo a 800 ml de HCl 3M acuoso, agitado vigorosamente. El precipitado blanco se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío. Produjo, 11 g (78%) . El producto crudo (1 g) se disolvió en etanol caliente (20 ml) . El filtrado caliente se agregó a agua (200 ml) agitándolo. El precipitado blanco se filtró y se secó. Produjo 0.85 gramos (85%) de 2D puro. XH NMR(DMS0-d6) , (12.08 (s, 1H,HNS02), 11.04 (s, 1H, HN-Ph) , 8.01 (AB q, 4H, H-Ph) , 7.87 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-Ph) , 7.81 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-Ph), 7.59 (t, 1H, J=7.7 Hz, H-Ph), 7.46 (t, 1H, J=7.4 Hz, H-Ph) ,1.97 (s, 3H, CH3) ; El MS m/z 699 (MH+) ; Anal. Caled (C30H2sN4O8S ) :C, 51.56; H, 3.75 ;N, 8.02. Se encontró: C, 51.34, H, 3.84, N, 8.05.
Síntesis de Quimiotipos de Bnezoisotiasolona, Compuestos 2B, 22, 31, 34
Los medios ejemplificativos para sintetizar los quimiotipos de benzoisotiazolona, incluyen compuestos 2B como se describe en la Tabla 1 (la "B" designa la forma BITA o benzoisotiasolona) o N- [4- (3-oxo-3H-benz [d] isotiazol-2-il) fenilsulfonil] acetamida, siguiente. Se utilizaron dos métodos. En un método, a una solución del compuesto 2D (0.2 g, 0.28 mmol) en piridina (2 ml) se agregó una solución de N-bromosuccinimida (0.18 g, 1 mmol) en 1,4 -dioxano (1 ml) . La solución se agitó a RT durante 3 horas y se agregó al agua

(30 ml) . El precipitado blanco se recolectó y se precipitó por precipitación a partir de etanol caliente y agua.

Produjo 0.17g (87%). XH NMR (DMSO-d6) , (12.24 (s,lH, NH) , 8.14 (d, 1H ,J=8.0 Hz, H-Ph), 8.10 (s, 4H, H-Ph), 8.02 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-Ph), 7.83 (t, 1H, J=7.0 Hz, H-Ph), 7.56 (t, 1H, J=7.6 Hz, H-Ph), 2.00 (s, 3H, CH3) ; El MS m/z 349 (MH+) ; Anal. Caled (Ci52 204S2) : C, 51.71; H, 3.47; N, 8.04. Se encontró: C, 51.42, H, 3.57, N, 8.04.
El segundo método se utilizó para sintetizar el compuesto 2B, el compuesto 22 BITA, el compuesto 31 BITA y el compuesto 34 BITA (ver Tabla 1). A una mezcla de 2,2'-ditiobenzoil cloruro (0.32 g, 0.93 mmol) en CC14 (10 ml) se añadió una solución de 2.5% p/v de Cl2 en CC14 (10 ml) . La mezcla se agitó hasta que se aclaró (1 h) . Después de la filtración, el filtrado se burbujeó con N2 por 1 hr y se añadió una solución de sulfacetamida (0.2 g, 0.93 mmol) en N, N-dimetilacetamida (DMA, 4 ml) . La mezcla se agitó durante 2 h, se agregó etil éter (20 ml) y el precipitado se recolectó y se purificó con etanol caliente y agua. Produjo para el compuesto 2B, 0.3 g (92%); el mismo ^Η ΝMR y El MS según el método de A. Anal. Caled (CιsHι2Ν204S2) :C, 51.71; H, 3.47; Ν, 8.04. Se encontró C, 51.34, H, 3.64, Ν, 7.96.
Síntesis Separada de los Quimiotipos Disulfuro Benzamida/

Benzoisotiasolona, Compuestos Ejemplificativos 23D, 24D y 25D

Los medios ejemplificativos para sintetizar los compuestos 23D (ver Tabla 1) o N, N' - (2 , 2 ' -ditiodibenzoil) -bis-4- (aminometil) benceno-sulfonamida, 24D o N, N' - (2 , 2 ' - ditiodibenzoil) -bis-4- (2 -aminoetil) benceno-sulfonamida y 25D o N, N' - (2 , 2 ' -ditiodibenzzoil) -bis-4- (glicinamida) bencenosulfonamida (ver Tabla 1) siguiente. Estos compuestos se prepararon, respectivamente, de 4- (aminometil) bencenosulfonamida (Aldrich) , 4- (2 -aminoetil) benzenosulfonamida (Aldrich) y N-glicil sulfonamida. El último compuesto se preparó mediante el primer tratamiento de sulfonamida con cantidades equimolares de bromoacetilbromuro y piridina en DMA y se recuperó el derivado bromoacetilado después de agregar la mezcla de reacción hasta exceder 0.5 M de HBr. El producto crudo, seco se recristalizó a partir del etanol y se convirtió a Ν-glicilsulfanilamida a través de una reacción Gabriel estándar (preparando el derivado de ftalimido y dividiéndolo con hidrato de hidracina. Se siguieron después los procedimientos para el compuesto 2D, de la configuración de arriba.
Compuesto 23D: 1H ΝMR (DMSO-d6) , (9.34 (t, 1H, J=6.1 Hz, ΝH) , 7.85 (d, 2H, J=8.3 Hz, H-Ph), 7.79 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-Ph), 7.70 (d, 1H, J=8.0 Hz, H-Ph), 7.59 (d, 2H, J=8.3 Hz, H-Ph), 7.51 (t, 1H, J=7.7 Hz , H-Ph), 7.37 (m, 3H, ΝH2 y H-Ph) , 4.61 (d 2H, J=5.9 Hz, CH2) ; El MS m/z 643 (MH+) ; Anal. Caled (C28H26Ν406S4) ; C, 52.32; H, 4.08; Ν, 8.72; Se encontró: C, 52.10, H, 4.25, Ν, 8.53.
Compuesto 24D. ^Η ΝMR (DMSO-d6) , (8.81 (t, 1H, J=5.2 Hz, ΝH) , 7.81 (d, 2H, J=8.0 Hz, H-Ph), 7.66 (d, 1H, J=8.0 Hz, H-Ph) , 7.61 (d, 1H, J=7.3 Hz, H-Ph) , 7.54-7.46 (m, 3H, H-Ph) ,

7.34 (m, 3H, NH2 y H-Ph), 3.58 (q, 2H J=6.3 Hz,CH2-N), 3.01

(t, 2H, J=7.1 Hz,CH2-Ph) ; El MS m/z 671 (MH+) ; Anal . Caled

(C30H3oN406S4) : C, 53.71; H, 4.51; N, 8.35. Se encontró: C,53.43, H, 4.68, N, 8.33.
Compuesto 25D XH NMR (DMS0-d6) , (10.53(s,lH, HN-Ph) , 9.09 (t, 1H, J=5.8 Hz, HN-CH2) , 7.87-7.83 (m, 5H, H-Ph), 7.72 (d, 1H, J=7.1, H-Ph), 7.55 (t, 1H, J=7.0 Hz, H-Ph), 7.39 (t, 1H, J=7.6 Hz, H-Ph), 7.31 (s, 2H, NH2) , 4.18 (d, 2H, J=3.7 Hz,CH2); El MS m/z 729 (MH+) ;Anal . Caled (C30H28N6O8S4 (H20) : C, 48.25; H, 4.05; N, 11.25. Se encontró: C, 48.54, H, 4.12, N, 11.20.
Síntesis del Quimiotipo A inofenil Sulfona Modificado en N-terminal, Compuesto Ejemplificativo 34D
Los medios ejemplificativos para sintetizar el compuesto 34D (ver Tabla l)o N,N' - (2 , 2 ' -ditio dibenzoil) -bis-4-sulfonil-N- [ (2-nitrobenzil) sulfonil) ] anilina, siguiente. El compuesto 26 se elaboró de manera similar al compuesto 2D, iniciando con 3-aminofenilsulfona y 2 , 2 ' -ditiodibenzoil cloruro. A una solución del compuesto 26 (1.5 g, 1.9 mmol) en DMA (30 ml) se le agregó (por goteo) una solución de 2- nitro-touenosulfonil cloruro (1.4 g, 5.9 mmol) en 1,4 -dioxano (10 ml) . La solución se agitó a RT durante la noche y después se transfirió a etil éter " (300 ml) agitando vigorosamente. Después de retirar la fase de éter, el líquido viscoso se diluyó con DMF (15 ml) . A la solución diluida se le agregó agua (200 ml) con agitación. El precipitado blanco se recolectó y se purificó mediante doble precipitación a partir de etanol caliente y etil éter. El compuesto 34D produjo: 1.92g (84%) XH NMR (DMSO-d6) , (11.01 (s, 1H,HN-S02) 10.74 (s, 1H, HN-CO) , 8.10-7.29 (m, 16H, H-Ph), 5.11 (s 2H,CH2); El MS m/z 1165 (MH+) ,-Anal . Caled (C25H4oN6θ14S6 : C, 53.60; H, 3.46; N, 7.21. Se encontró: C, 53.49, H, 3.84, N, 7.13.
Síntesis del Quimiotipo 2 , 3 -Haloalcanoamido Benzamido, Compuesto Ejemplificativo 37
El medio ejemplificativo para sintetizar el compuesto 37 (ver Tabla 1) o N- [2- (3 -cloro-propionamido) benzoil] sulfacetamida, siguiente. Se elaboró la N- (2-nitrobenzoil) sulfacetamida de manera similar como el 2D, pero agitando con 2 -nitrobenzoil cloruro. Se disolvió 1 gramo (2.7 mmol) de este producto en metanol (100 ml) a 45°C. La solución se enfrió a temperatura ambiente y después se burbujeó con N2 para retirar el aire. A la solución se le agregó paladio, 10% en peso en carbón activado, (0.22 g) bajo N2. La mezcla se burbujeó con H2 durante 1.5 h y después con N durante 0.5 h. Después de la filtración, el filtrado se evaporó hasta secarse. Produjo, 0.84 g (93%) del producto blanco-amarillo. Este derivado de 2-aminobenzamida se hizo reaccionar con 3-cloropropionil cloruro bajo condiciones similares a aquellas descritas para el compuesto 34D, que produjo el compuesto 37. 1H NMR (DMSO-d6) , (12.06 (s,lH, NH-S02) , 10.84 (s, 1H, NH-Ph) , 10.32 (s, 1H, NH-Ph) , 8.03-7.91 (m, 5H, H-Ph), 7.76 (d, 1H, J=7.7Hz, H-Ph) , 7.60 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-Ph), 7.32 (t, 1H, J=7.6 Hz,H-Ph), 3.87 (t, 2H, J=6.1 Hz,CH2 Cl); 2.86 (t,2H, J=6.2 Hz,CH2), 2.00(s,3H, CH3) ; El MS m/z 424 (MH+);Anal. Caled (Cι88N3Os SCI): C, 51._00; H, 4.28; N, 9.91. Se encontró: C, 50.85, H, 4.49, N, 9.96.
Síntesis del Quimiotipo Haloalcanil Tioester, Compuesto Ejemplificativo 44
El medio ejemplificativo para sintetizar el compuesto 44 (ver Tabla 1) o N- [2- (5-bromovaleroiltio) benzoil] sulfacetamida, siguiente. Se preparó primero Ν- (2-mercaptobenzoilsulfacetamida al agregar a una solución de 2D (2.2 g, 3.1 mmol) en 90% de DMF (20 ml) , hidrocloruro de tris (2-carboxietilfosfina) (1 g, 3.5 mmol) y trietileamina (0.5 ml) . La solución se agitó durante 1 h y después se agregó a 0.5 M HCl (200 ml) . El precipitado se recolectó y se secó, produciendo 2.3 g (95%) . A una solución de este producto se le agregó (0.5 g, 1.4 mmol) en DMA (5 ml) , (0.6 ml -4.5 mmol) bajo Ν2. La solución se agitó bajo Ν2 durante 1 h y se agregó al etil éter (50 ml) . Después de decantar la fase de éter, el líquido viscoso remanente se disolvió en DMF

(10 ml) . A la solución se agregó agua (100 ml) agitando^ vigorosamente. El precipitado blanco se filtró y se purificó a partir del etanol caliente y agua. El compuesto 44 produjo: 0.47g (65%) 1H NMR (DMSO-d6) , (12.05(s,lH, HNS02) , 10.91 (s, 1H, HN-Ph) , 7.94 (s, 4H, H-Ph), 7.74-7.61 (m, 4H, H-Ph) , 3.48 (t, 2H, J=6.3 Hz,CH2Br), 2.74 (t, 2H, J=7.1 Hz, CH2CO) , 1.96 (s, 3H,CH3), 1.90-1.64 (m, 4H, CH2 CH2) ; El MS n/z.515 (MH+) ; Anal. Caled (C20H2ιN2O2 S2 Br) : C, 46.79; H, 4.12; N, 5.46. Se encontró: C, 47.16, H, 4.31, N, 5.60.
Síntesis del Quimiotipo Piridinoalcanoil Tioester, Compuesto Ejemplificativo 45
El medio ejemplificativo para sintetizar el compuesto 45 (ver Tabla 1) o N- [2- (5piridinio-valoroiltio) benzoil) sulfacetamida bromuro, siguiente. Una solución del compuesto 44 (0.25 g, 0.49 mmol) en piridina (7 ml) se agitó bajo Ν2 durante la noche. Se agregó etil éter (80 ml) y el precipitado blanco se recolectó y se purificó a partir del etanol caliente y éter; el precipitado se secó al vacio inmediatamente . El compuesto 45 produjo: 0.21g (72%) Η

ΝMR(DMSO-d6) , (12.10 (br. s, 1H, HΝS02) , 10.94 (s, 1H, HΝ-Ph) , 9.12 (d, 2H, J=6.1 Hz , 2,6-H-Py) , 8.65 (t, 1H, J=7.2 Hz, 4-H-Py) , 8.21 (t, 2H, J=7.0 Hz,3, 5-H-Py) , 7.94 (s, 4H, H-Ph) , 7.74-7.58 (m, 4H,H-Ph) , 4.62 (t,2H, J=7.2 Hz, CH2-Py) , 2.79 (t, 2H, J=7.2 Hz, Ch2-CO) , 1.92 ( , 5H, CH3 y CH2) , 1.57 (pentet, 2H, J=7.6 Hz, CH2) ; El MS n/z.512 (MH+) ; Anal. Caled (C25H2305 S2 Br) : C, 50.68; H, 4.42; Ν, 7.09. Se encontró: C, 50.54, H, 4.68, Ν, 7.22.

Síntesis de Tioésteres Representados por los Modelos I, II y III
Los medios ejemplificativos para sintetizar los compuestos de tioéster representados por los Modelos siguientes I, II y III. Como se trató arriba, los expertos pueden utilizar cualquier esquema sintético o cualquier variación a un protocolo ejemplificativo para generar un tioéster de la invención.
En los modelos I y Illb, donde X es -CH2-, -CH2CH2-y -CHC (=0) -NH- , el tioéster puede generarse utilizando los métodos para sintetizar los compuestos 23D, 24D y 25D, respectivamente, descritos arriba (ver Tabla 1) .
Donde el tioéster es N- [2- (α-Piridinio-4-toluoiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, una solución de N-2 (2 -mercaptobenzoil) sulfacetamida (ver síntesis del compuesto 44) (0.4 g) y 4- (clorometil) benzoil cloruro (0.6 ml) en dimetilacetamida (2 ml) se agitó bajo nitrógeno durante 1 h y después se agregó al etil éter (40 ml) con agitación. El precipitado de líquido viscoso se diluyó con dimetilformamida (1 ml) y después se agregó a una solución de éter (40 ml) y heptano (40 ml) . El precipitado de líquido viscoso se recolectó y se agregó a la piridina (3 ml) . La solución se agitó a RT bajo Ar durante 3 días y después se agregó al éter

(50 ml) . El precipitado se recolectó y se secó. El producto crudo se purificó en columna de gel de sílice utilizando elusión isocrática con 10% de AcOH en MeOH.
Cuando el tioéster es N- [2- (piridinioacetamida) benzoiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, un compuesto análogo 37 se preparó de la misma manera excepto que el cloroacetilcloruro se sustituyó por 3-cloropropionil cloruro. El producto se disolvió en piridina y se le dejó permanecer a RT y el producto se trabajó como se describió anteriormente para N- [2- (- (α-Piridinio-4-toluoiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro .
Donde el tioéster es N- [2- (piridinioacetamida acetiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, N- (2- Mercaptobenzoil) sulfacetamida se preparó como se describió para el compuesto 44. La cloroacetilglicina puede ligarse al grupo tilo de este producto siguiendo la activación del grupo glicincarbonil a través de (a) u derivado p-nitrofeniléster o (b) un ácido dórico preparado utilizando oxalil cloruro. Se trabajó y la reacción subsecuente con piridina se llevó a cabo como se describió para N- [2- (- ( -Piridinio-4-toluoiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, descrito anteriormente.
Donde el tioéster es N- [2- (2- (Piridinioacetamida) isobutiriltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, el compuesto puede prepararse de manera similar como N- [2- (Piridinio acetamida acetiltio) benzoil] sulfacetamida cloruro, descrito arriba, excepto que el ácido N-cloroacetil -2 -aminoisobutírico (preparado de acuerdo a Birnbaum (1952) J. Biol .. Chem. 194:455 y Rpnwin (1953) J. Org. Chem. 18:127), se substituyó por cloro-acetilglicina.
Donde el tioéster es N- [2- (2- (5-Dimetilsulfonio valeroiltio) benzoil] sulfacetamida yoduro, en donde Z=-S*(CH3)2 y Y= -(CH)4-: una mezcla del compuesto 44 (1.10) g) y Nal (5 g) en acetona (99.9%, 25 ml) se agitó bajo nitrógeno a RT durante la noche, y después se agregó agua (250 ml) con agitación. El precipitado blanco se recolectó y se secó.

Produjo, 1.2 g. Una solución clara de este producto (0.3 g) en acetonitrilo (3 ml) y metil sulfuro (4 ml) se agitó a RT durante la noche. La solución clara se agregó al etil éter

(250 ml) con agitación vigorosa. El precipitado blanco se recolectó, se lavó con éter y se secó. Produjo, 0.15g.
Donde el tioéster es N- [2- (2- (5-Trietil amonio valeroiltio) benzoil] sulfacetamida yoduro, en donde Z=-Ν+(C2H5)3 y Y= -(CH2)4-: una síntesis paralela a N- [2 - (2 - (5-Dimetilsulfoniovaleroiltio) benzoil] sulfacetamida yoduro, puede conducirse en donde la trietilamina se substituye por metil sulfuro. Puede requerir se refluir para la reacción final con trietilamina.
Donde el tioéster es N- [2- (2- (5-Tri-n-butilfosfonio valeroiltio) benzoil] sulfacetamida yoduro, en donde Z=- P+(C4H9)3 y Y= -(CH2)4-: una síntesis paralela a N- [2 - (2 - (5 - Dimetilsulfoniovaleroiltio) benzoil] sulfacetamida yoduro, puede conducirse en donde tri-n-butilfosfinaa se substituye por metil sulfuro.
Para sintetizar una especie de tioléster del Modelo III, donde G es t-butil, Y es -CH2-, X es -CH2-, el anillo piridino lleva un grupo carboxamida substituido en R8 y Rι0, R6 es H, R9 es =-S02-NH2, y R7, R8, Rxo, Rn es H: 4[l-(t-Butiltiocarbonilmetil) nicotinamidometil] -bencenosulfonamida cloruro trietilamida (36 mmol) y nicotinil clruro hidroclórico (30 mmol) se agregaron a la suspensión de hidrato de 4- (aminometil) bencenosulfonamida hidrocloruro (30 mmol) en 150 ml acetonitrilo. Un adicional 60 mmol de trietilamina se agregó gradualmente. El precipitado de 4-(nicotinamidometil) bencenosulfonamida se recristalizó de una solución de 12 ml de etanol en 180 ml de agua. El producto se secó al vacío/CaCl2. A continuación se preparó S-cloroacetil-t-butil mercaptano al hacer reaccionar cloroacetil cloruro y t-butil mercaptano de acuerdo a Dawson

(1947) J". Amer. Chem . Soc. 69:1211. El tioléster se generó al agitar 10 mmol del derivado de nicotinamida con 20 mmol del cloroacetil tioéster en 125 ml de acetonitrilo en reflujo durante la noche. Al permanecer a RT, el producto se cristalizó. Puede cristalizarse a partir de una mezcla de etanol-agua .
En los modelos II y Illb, donde Rx es alquilo, -CH3, -(CH2)n-CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3), -arilo, -arilalquilo, -Ph-CH3, arilalcoxi, -Ph-OCH3, nitrarilo, -Ph-N02, -(CH2)n-X donde X es un halógeno, -3 (CH2) n-Cl2- (CH2) n-Br, o -(CH2)n-I; el grupo de N- (2-aciltiobenzoil) sulfacetamidas, que tienen grupos acilo con la fórmula Rι-C(=0)- y las Ri tomadas de estas estructuras Ri alternativas, pueden prepararse como se describió para el compuesto 44 y substituyendo Rι-C(=0)-Cl para 5-bromovaleril cloruro .
Los tiolésteres basados en las Muestras I y II con R2 siendo -CH3 preferentemente H, pueden prepararse de la misma manera como los compuestos 44 y 45 al substituir 2.2'-ditiobis (3-metilbenzoil cloruro) para 2 , 2 ' -ditiodi -benzoil cloruro en la preparación del precursor, compuesto 2D. El derivado 3 -metil puede prepararse de acuerdo al método de Coliman y Groh (1982) J". Amer. Chem . Soc . 104:1391-1400.
Los tiolésteres basados en el Modelo I con R6 siendo -CH3 pueden prepararse como se describió para los compuestos 44 y 45, excepto que, en lugar de sulfacetamida, N-metil -4- (nitrobencenosulfonil) anilina se utilizó y preparó como se describe por Saxena (1989) Arzneim . Forsch . 39:1081-1084.
Los tiolésteres basados en el Modelo II con R6 siendo -CH3 pueden prepararse como se describió para los compuestos 44 y 45, excepto que 2 -metiamino-.AT- (4-sulfamoilfenil) acetamida se utilizó y el tioléster se preparó de acuerdo a Horstmann (1977) Eur. J. Med. Chem . Chim. Ther. 12:387-391.

Los tiolésteres basados en el Modelo II con R6 siendo arilo o fenilo pueden prepararse como se describió para los compuestos 44 y 45, excepto que en lugar de sulfacetamida, uno podría utilizar ácido N-fenilglicil -sulfanílico preparado como se describe por Gañid, Sehgal y Ray; J. (1941) Indian Chem. Soc. 18:209.
Diseño y Síntesis de Tiolésteres Capaces de Disociar los Iones Metal de los Indicadores de Zinc
Los indicadores virales de zinc, particularmente el indicador de zinc en la proteína nucleocapside de ΝCp7 de HIV-l, se utilizan como modelos para diseñar los nuevos tiolesteres de la invención. ΝCp7 posee regiones en sus superficies accesibles solventes donde pueden ocurrir las interacciones favorables con ligandos candidatos. Cada indicador de zinc tiene dos sitios potenciales de unión de alta afinidad. Uno comprende el ARΝm putativo que une el sitio cercano Phel7 en el indicador 1 y Trp37 en el indicador 2. El otro sitio se encuentra cerca del metal que coordina la histidina en cada indicador, el sitio opuesto del ARΝm putativo. Para el propósito de diseñar nuevos tiolésteres capaces de disociar los iones metal de los indicadores de zinc, el sitio de unión del ligando opuesto a las regiones de unión del ARΝm putativo se considera el más fuerte de los dos sitios de unión candidatos. Estas regiones de unión se probaron con un rango de tipos hidrofóbicoe e hidrofílicos probables .
Los estudios de modelado adicionales de las interacciones de los ligandos (agentes) con NCp7 sugieren que ambos derivados de disulfuro benzamidas (DIBAs) y benzoisotiazolona (BITAs) pueden interactuar con parches hidrofóbicos en las superficies de ambos indicadores de Zn retrovirales de tal forma para orientar los grupos reactivos de estos agentes en proximidad cercana con los átomos de cisteína azufre del factor transcripcional GATA-1 debido a la exclusión esférica (Huang (1998) J". Med. Chem. 41:1371-1381). Los difulfuros y sus respectivos derivados BITA se diseñaron, sintetizaron y purificaron, y se analizaron las actividades de eyección del zinc NCp7 antiviral in vi tro.

Tabla 1 : Síntesis de Nuevos Disulfuros y Formas de Benzoisotiazolona Derivado de los Quimiotipos DIBA 1 y DIBA 2


Dimero (Forma D) Benzoisotiazolona (Forma BITA)
Actividad3 Antiviral

Compuesto R Forma ECsoμM IC50μM TI

1. — NHZ¿> D 0.85 217 255.3
BITA - 16.2
2. Ϋ
— — C-CH3 D 1.5 >200 >133
H BITA 12.6 34 2.7
O ,
3. D 3.8 54.1 14.2

H ^-X BITA 9.3 49.5 5.3


5. D 2 46.4 23.2

H \ = BITA 6.5 50.8 7.8


Tabla l (continuación)

V D 2.1 55.5
N 26.2
\ OCH3
H -i y, BITA 17.8 57.6 3.3

18. — N- D 1 18 18
N, // BITA NT Tabla 1 (continuación)



20. -N— " ! D 2.5 44.2 17.7
H BITA 12.8 39.0 3.0
H,C CH,
HN^NHg
21. I D 111 >316 >2.8
^N
^H BITA NT

a Se midió la actividad antiviral en el análisis de citoprotección XTT
b Reportado Originalmente como DIBA-1
c Reportado Originalmente como DIBA-2
d NT designa compuestos que no puede elaborarse en suficiente cantidad y o puresa para análisis

Tabla 2: Modificación del Quimiotipo DIBA-2 mediante substituciones del enlace de Esqueleto.



Disulfuro (Forma D) Benzoisotϊazolona (Forma BITA)
Actividad3 Antiviral Reactividad de Indicador de

Compuesto R :orma EC50μM IC50μM TI Zinc RFU/Í
23. CH2 D 0.33 19.4 58.8 3.3
BITA 13.8 53.7 3.9 2.7
24. (CH2)2 D 0.41 52.8 139 2.7
BITA 2 45.5 22.7 2.7
25. 1.6 17.6 11 7.9
— C— C — N
H2 H

a La actividad Antiviral se midió por el análisis de citoprotección XTT
b La reactividad del indicador de Zinc se midió por el análisis de fluorescencia Trp37. Los resultados se expresaron como la disminución promedio relativa.

Tabla 3: Optimización de las Benzamidas de Disulfuro con base de Bis(Aminofenil)Sulfona


Disulfuro (Forma D) Benzoisotiazolona (Forma BITA)
Actividad3 Antiviral Reactividad de Indicadorde

Compuesto R Forma EC50μM IC50μM TI Zinc RFU/minb

26. NH2 D 4.3 <316 >73.5 3.3
27. CH3 D 1.5 160 106.7 5.9
— N - - C
H

Tabla 3 (continuación)

28. 1.0 12.7 12.7 5.9
-N- P\ D
BITA 9.6 188 19.6 7.9

o
29. II
— N— C- OCH, 3.8 79.6 20.9 6.9

30. D 12.2 190 15.6
-N-C- H
31. -N02 D 12.2 >316 >26 2.9
BITA >316 - 4.1
O

II
-N— C- NO. D 78 >316 >4 2.9

32

Tabla 3 (continuación)

33. D 240 >316 >1.3 1.6



Q °*NN--_
34. D 12.3 >316 >25.7 1.5
-N-S— X i ITA 3.2 59.5 15.1 2
O π2 J B
a La actividad antiviral se midió por el análisis de citoprotección XTT <- 5 b La reactividad del indicador de Zinc se midió por el análisis de fluorescencia Trp37. Los resultados se expresaron como disminución promedio relativa

Tabla 4: Isómeros de Sulfona de 3, 3' Bis (Aminofenil)


Tabla 5: Bensamidas de Ligado sencillo (Monomero) unidas a Grupos Haloalcanoilo vía Uniones Amida o tioester


Compuesto Actividad3 Antiviral Reactividad de Indicador de de
Reactividad R1 R2 EC50μM IC, 50 S TI Zinc RFU/minb

Amida:
37. O H >316 2.0
D

N C (CH2)2 Cl O
H D

N C (CH2)2 Cl
H
38. H 38 103 2.8 3.9
39. O H 202 0.3
D N C C C!
H H2
Tioésteres
40. O H 2.8 56.7 20.3 4.2
D S C CH3

Tabla 5: (Continuación)



44. I
— S-C— (CH2)4— Br H 3.8 184.5 49.2 1.8
O
45. -S-C-tCH2)-+N i,
Br— -&—- '> H 6.2 >316 >51 3.6

a La actividad Antiviral se midió por el análisis de citoprotección XTT
b La reactividad del indicador de Zinc se midió por el análisis de fluorescencia Trp37. Los resultados se expresaron como 5 la disminución promedio en unidades de fluorescencia relativa sobre 30 min.

Tabla 6: Evaluación de Piridinioalcanoilo tioesteres (PATEs) y 4-bromovaleroilo Tiesteres



R1 R2

Compuesto Grupo R Actividad3 Antiviral Indicador de Zinc de
Reactividad EC50%μM IC50μM RFU/minb



Esqueleto del Compuesto 2:
44. R1 38 184.5 49.2 1.8

45. R2 6.2 >316 >51 3.6

Tabla 6 (Continuación)
Esqueleto del Compuesto 31 :

46. R1 1.6 21.7 13.6 1 47. R2 5.5 >316 >57 4.1


Esqueleto del Compuesto 23:
48. R2 1.1 55 50 1.4

Tabla 6 (Continuación)
Esqueleto del Compuesto 34:

49. R1 >316 1.9 50. R2 2.9 >316 >109 0.86



Esqueleto del Compuesto 27:
51. R2 4.6 288 63 1.7



Esqueleto del Compuesto 36:
52. R2 4.9 205 43 1.1

Tabla 6 (Continuación)

Estructura Parcial (R2):


53. >316

a La Actividad Antiviral se midió por el análisis citoprotección XTT
10 b La reactividad del indicador de Zinc se midió por el análisis de fluorescencia Trp37. Los resultados se expresaron como la disminución promedio en unidades de fluorescencia relativa durante 30 min.

Tabla 7: Mecanismo de Acción Antiviral

Compuesto (l 0:Ma)
Actividad- 44 45 47

Integrasa NI5 NI NI

Transcriptasa Inversa
rAdT NI NI NI rCdG NI NI NI

Proteasa NI NI NI

Reactividad del indicador de Zinc 1.8(1 133..33%%)) 3.6(34.7%) 4.1(17.9%)

Unión NI NI NI

Fusión 100 77 99

a. Concentración 150 de inhibición del compuesto al 50% de la actividad indicada b. Todos los controles positivos para análisis individuales son como se anota en la Sección Experimental
c. Sin Inhibición (NI) a una prueba de dosis alta de 100μM
d. Expresado como disminución en unidades de fluorescencia relativa por 30 min. (RFU/30MIN), con porcentaje total de disminución en fluorescencia dada entre paréntesis.

Tabla 8: Efecto de la glutationa sobre la Actividad Antiviral de los PATEs Seleccionados y
5-BromovaIeroilo Tioésteres

Reactividad3 del indicador de Zinc
Compuesto GSH RFU/min % de Dismi

44. 6.5 60.1
2.4 28 45. 2.6 28.2
3.8 36.9 47. 1.6 24.3
1.6 21.1 Control PBS 0 0
1.3 7.9

a. La reactividad del indicador de Zn se midió por el análisis de fluorescencia Trp37. La reactividad se expreso tanto como el cambio promedio en unidades de
fluorecencia por 30 min. (RFU/min) o como el porcentaje total de disminución durante 30 min de incubación (% de disminución)
b. Los compuestos (2mM) se trataron por 2 h a 37°C con 4mM de glutationa reducida. Después las reacciones de incubación se diluyeron a una concentración final de μM y la actividad en la eyección de Zn por Trp37 se determinó, como se describió previamente.

Tabla 9 Resumen de Reactividad del indicador de Zinc para los Compuestos 44, 45 y 47

Ul
NCp7 Cruzamiento del Unión de Acido Actividad Inhibición de Cruzamiento del

Compuesto (Trp37) Virión Nucleico (IsoμM) Virucida (l50μM) p24 (EC50μM) Precursor Gag

44 + -/+ 100 12.3 94 +/- 45 + +/+ 1 13.2 42.2 +/- 47 + -/+ 100 2.1 10.7 +++

Tabla 10: Evaluación de las Características Estructucturales que comprende la cadena lateral de Piridinioalcanoilo de las PATEs.



Actividad3 Antiviral Reactividad del indicador

Compuesto X n R EC50%μM IC50% TI de Zinc RFU/minb

54 s 3 H 10.1 175 17.3 2.2
45 (PATE original) s 4 H 6.2 >316 >51 3.6
55 s 5 H 10.5 69.7 6.5 1.9
56 NH 4 H - >316 - 2.60
57 S 4 Cl 54 264 4.8 0.2

a. Actividad Antiviral se midió por el análisis de citoprotección XTT
b. La reactividad del indicador de Zinc se medió por el análisis de fluorescencia Trp37. Los resultados se expresaron como la disminución promedio en unidades de fluorescencia relativa durante 30 min.

El disulfuro, y donde es sintéticamente imposible, la forma BITA de los compuestos 1 a 36 se sintetizaron

(Tablas 1 a 4) y su actividad antiviral se analizó en el análisis de citoprotección XTT (descrito abajo) .
Esencialmente todos los compuestos generados por estos estudios poseyeron algún grado de actividad antiviral

(análisis de citoprotección XTT) y la reactividad del indicador de zinc. La reactividad del indicador del zinc se midió utilizando un fluoroclomo de Zn específico, TSQ, N- [2- (2- ( (6-metoxi-8-quinolil) -p-toluenosulfonamida, análisis o un análisis de fluorescencia del indicador del zinc Trp37. Las mediciones de fluorescencia del residuo Trp37 en el indicador C-terminal de la proteína recombinante HIV-1 NCp7 se realizó como se describe por Rice (1995) Science 270:1194-1197; Rice (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 419-426. Las mediciones de eyecciones de Zn a partir de ambos indicadores se midió utilizando la prueba de fluorocromo selectiva de Zn,

TSQ (Molecular Probé Eugene OR) como se describe por Rice

(1996) J". Med. Chem. 39:3606-3616. La medición de la capacidad de NCp7 para unirse a un oligómero de ADN, un 44 mer: GGC GAC TGG TGA GTA CGC CA AAA TTT TGA CTA GCG GAG GCT AG (SEQ ID NO. 1) , análogo al sitio de empaque del ARN del HIV-1 como se describe por Huang (1998) J. Med. Chem. 41:1371-1381, ver también Rossio (1998) Patogénesis y Tratamiento de HIV; Symposio de Keystone en Biología Molecular y Celular, Resumen # 4082. En resumen, 50 nM de NDp7 se trataron con los compuestos de prueba durante 1 hora a RT en 10 ml de regulador que contenía 10% de glicerol y 50 mM Tris- HCl (pH 7.5). El oligómero etiquetado (0.1 picomoles, extremo etiquetado [32P] ) se agregaron en un volumen igual del regulador que contiene 10% de glicerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 400 M KCl y 40 mM MgCl2. La reacción se continuó durante 15 min. a temperatura ambiente, y un total de 5 ml (o 1/4 del volumen total de reacción) en geles de poliacrilamida al 4.5% no desnaturalizado en regulador de electroforesis 0.5X Tris-Borato. Se visualizaron NCp/-complejos de oligómero por autoradiogafía.
Entre los nuevos compuestos análogos a base de disulfuro 26, 31 y 34 no exhibió toxicidad en la dosis de prueba alta de 316 pM (micromolar) y exhibió un EC50 (50% de inhibición de concentración de la replicación del virus) de 4.3, 12.2 y 12.3 μM, respectivamente. La substitución de aminofenil se utilizó para generar el compuesto 26 convirtió la porción del ligando del DIBA hacia una bis (4-aminofenil) sulfona. La N- [2- (2- (acetilación del compuesto 26 produjo el compuesto 27 con un bajo EC50 (1.5 μM) pero con mayor tocicidad (160 μM) . La conversión del puente de bis (amofenil) sulfona del compuesto 26 a un grupo sulfonamida y que cambia la terminal amina a una sulfonamida primaria (compuesto 26, Tabla 1) dio como resultado una toxicidad mucho mayor (43 μM) . En general, donde el par disulfuro/BITA pudo sintetizarse, existió un promedio de una jgota por 4 veces de (n=15, rango 1.5- a 8 veces) en el índice terapéutico (IC50/EC30) , principalmente debido a una pérdida en la potencia antiviral, es decir, se incrementaron los valores EC50. No existió toxicidad celular mejorada. Ninguno de los nuevos disulfuros o BITAs fueron superiores al compuesto 1.
El modelado molecular sugiere que las mejores adaptaciones de agentes en los dominios de unión de la superficie atómica del indicador puede lograrse por la adición de separadores de metileno (compuesto 23) o etileno

(compuesto 24) en los fundamentos entre el grupo de ncabezado benzamido y el grupo del ligando bencenosulfonamida del compuesto 1 (Tabla 2) . La actividad antiviral y la reactividad del indicador de Zn se mantuvieron, pero estas modificaciones se asociaron con un disminución de 4 a 10 veces en IC50 (más citotóxico) cuando se comparó al compuesto 1 original . Como se observa en la Tabla 2 , las BITAs correspondientes demostraron una pérdida significativa de actividad antiviral (compuesto 23 :disminuido 42 veces, y compuesto 24: disminuido 5 veces), aún cuando se mantuvo la reactividad contra NCp7 purificado. Además la modificación del espaciador del grupo de encabezado mediante la adición de un grupo carbamilo al compuesto 23 (ver compuesto 25) mejoró la reactividad del indicador de zinc (RFU/min 7.9 versus 3.3), pero disminuyó la potencia antiviral.
Optimización de Bis (aminofenil) Sulfona a base de Disulfuro Benzamidas
La incorporación de 4 , 4 ' -bis (aminofenil) sulfona en el grupo encabezado por disulfuro produjo el compuesto 26 con una amina terminal como un locus sintético para modificaciones adicionales. Varias modificaciones acilo generaron los compuestos 27, 28 y 29, los cuales dieron como resultado el incremento de la reactividad del indicador de zinc y mejoró el EC50. Estas ganancias fueron parcialmente

(compuestos 27 y 29) y completamente (compuesto 28) neutralizadas mediante la disminución en el IC50. Hasta aquí, la extensión terminal de la porción del ligando de 26 no produjo un agente antiviral significativamente mejorado.
El derivado de BITA del compuesto 26 no puede producirse en suficiente pureza o calidad para estudiar sus propiedades. Sin embargo, intercambiando un grupo terminal NH2 de 26 a un N02, que produce el compuesto 31, supera esta restricción y permite la producción de ambos el disulfuro y su correspondiente BITA (Tabla 3) . La forma disulfuro del compuesto 31, igual que el 26, no fue tóxico y tuvo equivalente reactividad del indicador de zinc NCp7 aún cuando el EC50 se incrementó 2.6 veces (menos efectivo) . La forma BITA del compuesto 31 estuvo sin actividad antiviral. La exploración de las extensiones del ligando con grupos nitro aromáticos condujo a los compuestos 32 y 34 que generalmente despliegan menos reactividad del indicador de zinc que el grupo nitro solo, como en el compuesto 31. Únicamente el disulfuro y las formas BITA del compuesto 43 mostraron significativa actividad antiviral.
La recolocación del grupo sulfonil en 3,3'-bis (aminofenil) sulfonas creó isómeros, los compuestos 35 y 36, Tabla 4. Estos compuestos tienen actividades antivirales mejoradas (compuesto 26 vs . compuesto 35: EC50 4.3 a l mM; 27 vs . 36: EC50 1.5 a 0.62 mM respectivamente. Sin embargo la reactividad del indicador de zinc se redujo significativamente (26 vs . 35: 3.3 a 0.92 RFU/min., 27 vs . 36: 5.9 a 2 RFU/min., respectivamente. Además, este cambio disminuyó el IC50 por al menos 3 veces (mayor toxicidad) . Así, los isómeros de 3,3' -difenil sulfona no proporcionaron mayores ventajas.
Conversión del Disulfuro en un Nuevo Tiolester
La acción de los disulfuros en los indicadores de zinc NCp7 incluye intercambio de un tiol-disulfuro entre el agente y los átomos de azufre de cisteína CCHC. El enlace de disulfuro covalente resultante entre NCp7 y una mitad del fármaco (porción "monomérica") causa la disrupción del quelato de zinc con pérdida pasiva de iones de Zn2+ a partir de la estructura NCp7 (ver por ejemplo, Rise (1995) supra;

Huang (1998) supra .
Para modificar covalentemente las cisteínas de indicador de zinc a través de las uniones que son más estables de lo que sería posible utilizando cualquiera de los compuestos anteriormente descritos, se diseñaron y sintetizaron nuevos tiolésteres. Para crear un enlace de tioléster se diseñó una función de alquilación SH-selectiva, moderadamente activa en las posiciones orto o meta del grupo principal de benzamida. Se enlazaron benzamidas de un solo ligando (monómero) para reactivar potencialmente grupos haloalcanoilo a través de enlaces de amida o tioéster (ver Tabla 5) . Los compuestos 37 a 39 representan enlaces amida para ya sea las posiciones de benzamida orto o meta. La substitución de Cl- (CH2) 2-C0-NH en ya sea las posiciones orto (compuesto 37) o meta (compuesto 38) en la forma de ligando del compuesto 2 generaron los compuestos con modesta actividad de indicador de zinc. Sin embargo, ninguno tuvo actividad antiviral apreciable. El compuesto 39 que tiene un orto Cl-CH2-CO-NH- , fue completamente inactivo. Las pruebas orto amida substituida se sintetizaron utilizando varios otros esqueletos como la estructura de ligando y dieron resultados equivalentes .
Se diseñaron y sintetizaron alcanoilo, aroilo y haloalcanoi ltioéstrescolocados orto (compuestos 40 al 52, Tablas 5 y 6) . La síntesis de los tioésteres de acetil (compuesto 40) , benzoil (compuesto 41) , 4-metoxibenzoil (compuesto 42) y el butiruil (compuesto 43) dieron como resultado cuatro compuestos con bajos valores μM ECΞ0 y se moderaron para la reactividad substancial del indicador de zinc. Sin embargo, debido a los valores IC50 en el rango de 50 μM, su actividad antiviral se aproximó a la de los derivados BITA (Tabla 1) .
Se sintetizó un nuevo tioester utilizando grupos ω-haloalcanoilos . El derivado orto 5-bromovaleroilo tioéster del compuesto 2, compuesto 44, dio como resultado citotoxicidad significativamente reducida y moderada actividad del indicador de zinc. El índice terapéutico se mejoró adicionalmente al convertir el compuesto 44 al derivado priridinioalcanoilo tioéster (PATE), compuesto 45. El agente resultante demostró eficiente reactividad del indicador de zinc (3.6 RFU/min), ninguna toxicidad a la dosis de prueba elevada de 316 μM y un EC50 de menos de 10 μM.
La Tabla 6 muestra que los PATEs exhibieron como perfiles antiviral y de toxicidad de quimiotipo más favorables que sus compuestos originales. La falta de toxicidad desplegada por los tioésteres de piridimiovaleroilo se ilustran por su adición a los esqueletos de monobenzamida de los compuestos 2, 31, 31, 27 y 36, produciendo los nuevos compuestos 45, 47, 50, 51 y 52 respectivamente, en donde la toxicidad celular de la monobenzamida original se disminuye en todos los casos. Aunque la conversión del compuesto 23 del- esqueleto para el quimiotipo PATE, da como resultado el compuesto 48, no generó índices de selectividad (TI) del orden encontrado en los otros tioésteres de piridiniovaleroilo y falla para reducir la toxicidad de monobenzamida (compuesto 23 SlTA 53.7 μM vs . compuesto 48 μM) , la conversión de tioéster de piridimiovaleroilo parcialmente aligera la toxicidad asociada con la forma disulfuro (IC50 del compuesto 23D:19.4 μM vs . el compuesto 48:55 μM. Así, el tioléster y los PATEs en particular, representan un nuevo quimiotipo que puede utilizarse como nuevos agentes quimioterapéuticos para dirigir los indicadores de zinc virales .
Actividad Antiviral de Piridinioalcanoil Tioésteres (PATEs)
El 5-bromovaleroilo tioéster, compuesto 44 y dos 5-piridiniovaleroilo tioésteres, compuestos 45 y 47 se analizaron en análisis mecánicos y en base a objetivos, estos compuestos no exhibieron HIB-1 integrasa, transcriptasa inversa o actividades enzimáticas de proteasa (ver Tabla 7) . Los análisis para la actividad contra la transcriptasa inversa HIV-1 rAdT (modelo/iniciador) y rCdG (modelo/ iniciador) utilizando transcriptasa inversa de HIV-1 recombinante (S. Hughes, Investigación Básica ABL de NCI-FCRDC, Frederick MD) se realizaron como se describió por Rice (1997) supra . La división del substrato de la proteasa HIV-1 recombinante en la presencia de los cpomuestos de prueba utilizando una metodología basada en HPLC con el substrato artificial Ala-Ser-Glu-Asn-Try-Pro-Ile-Val -amida (Sistemas de Péptido Múltiple, San Diego CA.) se realizó como se describió por Rice (1997) supra . La capacidad de la integrasa HIV-1 recombinante (S. Hughes, Investigación Básica ABL de NCI-FCRDC, Frederick MD) para llevar a cabo actividades de trasnsferencia de procesamiento y trenzado 3' en la presencia de los compuestos de prueba se realizó como se describió por Buckheit (1994) AIDS Res . Hum. Retroviruses 10 : 1497-1506 y Turpin (1998) Antimicrob. Agents Chemother 42 : 487-494.
El compuesto 44 5-bromovaleroilo tioéster y los dos compuestos 45 y 47 de 5-piridimiovaleroilo tioéster tampoco7 exhibieron uniones de virus (análisis de unión p24 en base a célula) y fusión a las células huésped. El análisis de unión p24 en base a célula se realizó como se describió en Rice

(1995) Science 270:1194-1197. Los análisis de inactivavión viral se llevaron a cabo como se describió en Rise (1995)

Science 270:1194-1197 y Turpin (1997) supra, con modificaciones menores. En resumen, las células MAGI-CCR-5 se colocaron sobre placas (4 x 104 células por cavidad) en placas de pozos de 2 cm de parte inferior plana durante 24 h, después de lo cual el medio de cultivo se retiró y se agregaron los virus tratados con el compuesto. Los virus utilizados se obtuvieron por transfección transitoria de pNL4-3 en células HeLa que produjeron el virus NL4-3 competente de repetición. Los virus que contienen supernadantes se trataron durante 2h a 37°C después de lo cual el compuesto residual se retiró por centrifugación (18,000 x g, Ih, 4°C) . Las pellets de virus se resuspendieron y se colocaron en monocapas MAGI CCR-5 y se cultivaron durante 48h. Las monocapas se fijaron y tiñeron con solución X-gal y las células azules se contaron.
La determinación del efecto de los compuestos de prueba en la fusión viral se llevaron a cabo como sigue. En resumen, las células HL2/3 que expresaron establemente Tat HIV-1 y superficie celular gp 120 y las células MAGI-CCR-5 que expresaron establemente CD4 y CCR5 en su superficie celular conteniendo un gen informador β-galactosidasa bajo el control del HIV-1 LTR se pre-trataron con el compuesto de prueba durante 1 h a 37°C. Después de la incubación, las células se mezclaron en una proporción 4 a 1 (células de 2 x 105 MAGI-CCR-5 a 8 x 105 HL2/3) y se co-cultivó por 18 h a 37°C; los cultivos se fijaron y tiñeron con solución X-gal para la actividad β-galactosidasa . Las células azules representaron la transactivación Tat del HIV-1 LTR en la fusión de las células HL2/3 y MAGI-CCR-5 a través de la interacción gp 120 del correceptor CD4/CCR5.
Todos los tres compuestos de tiolester 44, 45 y 47 promueven la eyección del ion metal (zinc) de la proteína NCp7, como se valoró por el análisis de Trp37 anteriormente descrito. Estos compuestos interfieren, y así no podrían probarse en análisis de fluorocromo TSC (ver Tabla 9) .
La interacción de los inhibidores del indicador de zinc con NCp7 pueden dar como resultado la pérdida de la estructura de la proteína y sus capacidad para unir específicamente los oligonucleótidos que representan el sitio de empaquetamiento HIV-lψ (Huáhg (1998) supra; Tummino (1997) Anti-Ωicrojb. Agents Chemother. 41:394-400; South (1993) Protein Sci . 2:3-19; Dannull (1994) EMBO J. 13:1525-1333). Se probó la capacidad de la NCp7 para asociarse específicamente con estos oligonucleótidos después de 1 tratmiento de la proteína con un tiolester de la invención. Por ejemplo, los compuestos 44, 45 o 47 fueron muy efectivos al inhibir la capacidad de NCp7 para asociarse con el oligonucleótido objetivo, según se determinó utilizando análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) en geles de poliacrilamida no desnaturalizados. En 1 μM, el compuesto 45 de inhibió la formación del complejo. Los compuestos 44 y 47 inhibieron la formación del complejo en_ 100 μM (ver Tabla 9) .
Para determinar si la actividad de unión de los compuestos 44, 45 o 47 fue específica para los indicadores de zinc CCHC, se realizó un EMSA super de cambio del gel, después del tratamiento de extractos nucleares celulares K562 con los compuestos . Esto fue seguido por el super desplazamiento con el anticuerpo específico Spl-. El Spl se eligió debido a su factor de transcripción celular que contiene tres copias de un motif de indicador de zinc CCHH tipo clásico que se requiere para la unión de Spl a su objetivo de ADN. Los tres compuestos 44, 45 o 47 fallaron en alterar el patrón de super desplazamiento de la unión de Spl a su objetivo de ADN, indicando que estos tiolésteres mostraron especificidad para el indicador de Zn retroviral CCHC. El super desplazamiento de gel para determinar la especificidad de los compuestos reactivos del indicador de zinc, se llevó a cabo utilizando un oligómero de concenso Spl (Stratagene, La Jolla, CA) , extractos nucleares celulares K562 y anticuerpos para Spl (Spl [PHP2] G) (extractos y Spl Abs de Santa Cruz Biotecnology, Inc. Santa Cruz, CA) . Las reacciones de unión de los oligómeros con el extracto nuclear K562, así como las condiciones de electrofoéticas se llevaro a cabo como se describió en el Equipo de Regulador de Desplazamiento de Gel, Statagene, La Jolla, CA.
La interacción de los inhibidores del indicador de zinc, tal como los tiolésteres de la invención, con virus libres de células, pueden dar como resultado la modificación de la proteína NCp7 intravirión y la pérdida de infectividad. Las proteínas NCp7 asociadas al virión provenientes de HIV-IMN libre de células se trataron con los compuestos de tioester 44 y 45. También se evaluaron por manchado Western sin reducción utilizando anticuerpos específicos NCp7 de HIV-1. El compuesto 45 de PATE dio como resultado el cruzamiento extensivo de NCp7, en donde su precursor haloalcanoil tioester (compuesto 44) fue un agente muy pobre de cruzamiento. El cruzamiento de NCp7 intravirión mediante el compuesto 45 fue comparable al compuesto 1, DIBA-1. El cruzamiento mediante el compuesto 45 se debió a la formación de uniones disulfuro intermolecular debido a la reducción con 2 -mercaptoetanol (β-MF) invirtió completamente reservado de la retardación del gel. El compuesto 47 no inició de manera efectiva el cruzamiento de NCp7. AZT, un inhibidor de la transcriptasa inversa de nucleosido, también falló para el cruzamiento de NCp7 (ver Tabla 9) .
El cruzamiento de NCp7 se encuentra asociado con la inactivación viral. Cualquiera que sea la capacidad para el cruzamiento de la proteína de la nucleocápside como se determinó por el manchado Western, correlacionada con la capacidad para inactivar los virus, se probó en un análisis virucida. Las existencias de virus de HIV-1NIJ4-3 se incubaron con varios compuestos de tiolester. El virus se obtuvo por transfección transitoria de un pásmido pNL4-3 componente de replicación en células HeLa. El tiolester residual se retiró por centrifugación. Los pellets de virus se resuspendieron en un medio de cultivo y se utilizaron para infectar células CCR-5 de MAG1. A las 48 horas después de la infección, las células se lavaron y tiñeron con X-Gal . Los compuestos 44 y 45 fueron virucidas con valores I50 (la concentración dio como resultado 50% de inactivación de virus) de 12.3 μM y 13.2 μM respectivamente. Aunque el compuesto 47 no fue un cruzamiento potente de NCp7 intravirión, fue aproximadamente 6 veces (I50 = 2.1 μM) más potente que los compuestos 44 y 45 en virus de inactivación. Estos datos sugieren que los tiolésteres y el compuesto 47 en particular, forman aductos estables con los átomos de azufre del indicador de zinc que no participan en la generación de cruzamientos de disulfuro intermolecular o intramolecular.
El análisis de 5-piridiniobalérico (compuesto 53) , sin conjugación a un esqueleto de monobenzamida mostró reactividad significativa en el análisis de eyección de zinc Trp37 (4 RFU/min) , aunque fue sin actividad antiviral (ver Tabla 6) . El compuesto 53 se valoró adicíonalmente para el cruzamiento de intravirión de NCp7 y actividad virucida. Ni el cruzamiento de intravirión de NCp7 ni la actividad virucida se detectaron. Así, los esquetetos de monobenzamida de los compuestos 44, 45 y 47 son esenciales para la actividad contra los virions libres de células.
Los compuestos de tiolester también se probaron para su capacidad de inhibir la replicación de HIV-1 en las células Ul y ACH-2 inducidas por TNFα. Las células Ul se indujeron con 5 ng/ml de TNFα en la presencia de varias concentraciones del tiolester 44, 45 o 47. Cuarenta y ocho horas después los cultivos se caracterizaron por la producción de antígeno de virus p24 y la viabilidad celular._ Los tres compuestos inhibieron la liberación de de los viriones HIV-1 (p24) de las células Ul (EC50:94, 42.2 y 10.7 μM para los compuestos 44, 45 y 47 respectivamente) (ver Tabla 9) . Ninguna toxicidad celular fue evidente en las ocho dosis de prueba de 100 μM. Pruebas de dosis más elevadas (300 μM) de los tres tiolésteres no mostraron toxicidad para los compuestos 45 y 47. El compuesto 44 inactivo 60% de las células a 200 μM. La visualización de las proteínas virales proveniente de las células Ul inducidas por TNFα mediante separación electroforética e inmunomanchado (manchado Western) revelaron que los compuestos 45 y 47 indujeron el cruzamiento de las poliproteínas precursoras virales y evitaron el procesamiento de los precursores . La reducción de las preparaciones de proteína Ul con β-ME mostraron que ambos, el compuesto 45 (100 μM) y el compuesto 47 inhibieron el procesamiento del precursor Pr55gaa. El compuesto 44 también indujo alteraciones reversibles de β-ME en la movilidad del indicador de zinc que contenía proteínas precursoras de HIV-1 a un nivel intermedio entre los compuestos 45 y 47. La evaluación del procesamiento del precursor realizada como se describió por Turpin (1997) Antiviral Chem. Chemother. 8:60-69. Así, los PATEs de tiolester iniciaron el cruzamiento de disulfuro intracelular de las poliproteínas precursoras durante el ordenamiento de virus de fase tardía y mediaron un efecto virucida directo a través de una ataque en el indicador de zinc retroviral NCp7 maduro en el virus libre de células.
El cruzamiento de virión se realizó como se describió por Rice (1995) Science 270:1194-1197 y Torpin (1997) Aπtiviral Chem. Chemother. 8:60-67. Brevemente, el HIV-IMN altamente purificado (11.8 μg de proteína total) se incubó por dos horas con concentraciones del compuesto. Los viriones se concentraron y el compuesto residual se retiró por centrifugación (18,000 x g, lh, 4°C) . El pellet viral se solubilizó en 0.5 M de Tris-HCl2(pH 6.8), 50% de glicerol, 8% de SDS y 0.4% de azul bromofenol y proteínas determinadas por manchado Western. El manchado Western detecta la expresión de las proteínas de HIV-1 en células Ul o pellets de virus para los experimentos de cruzamiento de virión que se llevaro a cabo como se describió por Turpin (1996), J. Virol . 70:6180-6189. Brevemente 50 μg del total de la proteína celular para los experimentos de Ul o el total de pellets de virión (11.8 μg total de proteína viral), para los estudios de cruzamiento de NCp7 se determinaron en geles de polacrilamida de 4 a 20% en SDS con Tris-Glicina (Novex, San Diego, CA) . Las muestras para reducir los geles se hirvieron durante 5 minutos en la presencia de 5% de β-ME antes de cargarse . Las proteínas detectadas se electromancharon para las membranas de disulfuro de polivinilideno (PVDF) y las proteínas específicas de HIV-1 se detectaron utilizando una mezcla de NCP7 de anti-HIV-1 de cabra y p24 o anti-NCp7 para proteínas de virión solas (una clase de donación de L. E. Henderson, AIDS Vaccine Program NCI-FCRDC, Frederick, MD) . Las manchas Western se desarrollaron utilizando metodologías de quimioluminiscencia estándar, según se produjeron y describieron por Dupont-NEN, Wilmington, DE.
Una característica significativa de los tiolésteres es su capacidad para mantener la reactividad del indicador de zinc en la presencia del ambiente de reducción de un fluido biológico in vivo. Esta propiedad puede evaluarse, por ejemplo, al probar la resistencia del compuesto a la reducción por glutationa bajo condiciones fisiológicas. Esta ressistencia a la reducción es una mejora significativa sobre todos los compuestos que contienen disulfuro. Por ejemplo, la Naturaleza del disulfuro de DIBAs los hace inherentemente inestable en ambientes de reducción. Esto da como resultado la disociación del dímero a formas monoméricas y disulfuros mezclados .
Los compuestos 44, 45 y 47 de PATE de tiolester mantienen la capacidad para atacar los tioles de cisteína en la presencia de un exceso 2 molar de glutationa. Así, la conversión del disulfuro a los tioésteres de 5-bromovaleroilo menos nucleofílieos, como en el compuesto 44 o el tioester de 5-piridiniovaleroilo, como con los compuestos 45 y 47, confiere resistencia significativa a los agentes reductores, evitando así la pérdida subsecuente de la reactividad del indicador de zinc (ver Tabla 8) .
Con respecto a la Tabla 10 el perfil de actividad del quimiotipo de PATE fue dependiente de la longitud del espaciador alquilo entre los residuos de carbonilo y piridinio (comparando los Compuestos 54, 45 y 55) . El espaciamiento n = 4 parece ser óptimo con respecto a la potencia y toxicidad. La presencia esencial del azufre de tioléster se demostró por el Compuesto inactivo 56 en donde el azufre se reemplaza por NH- . Substituyendo un cloro por el hidrógeno meta para el nitrógeno en el anillo de piridinio, disminuye significativamente la potencia antiviral, posiblemente debido a una interacción electrostática (repulsiva) entre el grupo cloro y los residuos 39 y 49 de NCp7.
Detección de la Disociación de un Ion de Metal Provenienbte de un Motif de Indicador de Zinc
La invención proporciona un método y equipo para seleccionar compuestos capaces de disociar un ion divalente quelado con un motif de indicador de zinc. El motif puede ser aislado o una subestructura de una proteína viral o un virión. El método incluye poner en contacto el indicador de zinc con un tiolester y subsecuentemete detectar la disociación del ion de metal proveniente de la proteína del indicador de zinc. El catión comúnmente es zinc. Cualquier metodología conocida en la tpecnica puede utilizarse para detectar la disociación del ion de metal. Medios ejemplificativos incluyen por ejemplo, electroforésis capilar, inmunomanchado, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , detección de la liberación de zinc-65 radioactivo, detección de fluorescencia o detección del desplazamiento de movilidad del gel y otras técnicas que serían aparentes para alguien de experiencia a la vista de esta exposición. Estos procedimientos pueden practicarse con algún protocolo conocido en la técnica, los cuales se encuentran bien descritos en la literatura científica y de patentes. Unas cuantas técnicas ejemplificativas se establecen más adelante.
Como la invención también proporciona un género de nuevos tiolésteres capaces de disociar un ion de metal proveniente de un indicador de zinc in vi tro, la detección de la disociación del ion de metal identifica una especie de tiolester dentro del alcance de la invención. El análisis de eyección de zinc se utilizó como una primer clasificación de línea para identificar tiolésteres dentro del alcance de la invención. Debido a la estrategia utilizada para tal clasificación, el análisis de citoprotección XTT monitorea la actividad antiviral y el análisis de eyección de zinc Trp37 identifica los tioléteres capaces de actuar en el nivel celular en la proteína NCp7 o sus precirsores Gag o Gag-Pol.
Un tiolester se encuentra dentro del alcance de la invención sí es capaz de cualquier nivel de eyección de catión proveniente de un indicador de zinc. De hecho, un tiolester capaz de la eyección de zinc a una tasa baja, es decir con cinéticas lentas, se prefiere para algunos usos, especialmente para ciertas aplicaciones in vivo. Un tiolester ejemplificativo de "eyector de catión débil" de la_ invención es el compuesto 50, con una tasa de eyección de zinc de 0.86 RFU/min. según se midió por el análisis de florescecia del indicador de zinc Trp37. Sin embargo los tiolésteres con más bajas tasas de eyección (<0.86 RFU/min) también se encuentran dentro del alcance de la invención. Una "alta" tasa de eyección estaría en el rango de aproximadamente 8 RFU/min. los tiolésteres con una actividad antiviral ECS0 de <15 μM se seleccionaron como τnodalidades preferidas
Electroforesis de Zona Capilar (CZE)
Las proteínas de indicador de zinc retrovirales forman complejos con dos iones de zinc, cada uno con una carga formal de +2. Los reactivos que reaccionan con la proteína y retiran los iones de zinc, causan una carga en la conformación y carga de la proteína. Así, la movilidad electroforética de la proteína reaccionada diferirá de la movilidad de la proteína no reaccionada. Los cambios en la movilidad electroforética de la proteína pueden detectarse fácilmente por la técnica estándar de electroforesis de zona capilar (CZE) . Para una descripción general de CZE, ver por ejemplo Capillary Electrophoresis, Theory and Practice (Academic Press, Inc. Grossman and Colburn (eds.) (1992) .
En general la movilidad electroforética de la proteína (a un pH determinado por el regulador en el tubo de electroforesis capilar) , se utiliza para mover la proteína retroviral de una posición inicial fija hacia un electrodo. La tas de migración puede monitorearse por absorción UV, por ejemplo a 215 nm. Los tubos de muestra conteniendo una cantidad apropiada de una solución que comprende la proteína NC retroviral de elección, con y sin el compuesto de tiolester a ser probado para la inactivación del indicador de zinc CCHC, se colocaron en un inyector de muestras automático. A intervalos programados, las muestras se llevaron hacia el tubo capilar y se monitoreo la absorción UV. La proteína NC retroviral no modificada dio un pico agudo de proteína de migración que pasó el detector. Las modificaciones de la proteína, causadas por la reacción de los compuestos de prueba de elección, se revelaron por un cambio en la movilidad electroforética de la proteína reaccionada.
La electroforesis de zona capilar tiene la ventaja de automatización simple, ya que pueden cargarse y analizarse muchas muestras diferentes en pruebas sucesivas. Cada prueba requiere aproximadamente 10 minutos y cada tubo de muestra puede analizarse múltiples veces. Un ejemplo de un equipo que utiliza CZE para el análisis de los compuestos seleccionados para probarse para la reactividad del indicador de zinc de CCHC contendría aproximadamente 100 microgramos (μg) de proteína NC retroviral purificada formando complejos con zinc en por ejemplo 1.0 ml de agua y podría utilizarse para la prueba de aproximadamente 1000 compuestos de prueba. Liberación de Zinc Radioactivo a Partir de NCp7 Etiquetado con Zinc - 65
La NCp7 de HIV-1 purificada puede reconstituirse con zinc-65 radioactivo con una actividad específica determinada. Al monitorear la liberación del zinc-65 radioactivo causado por la reacción de un compuesto de prueba con una cproteína retroviral, es posible determina la reactividad del compuesto de prueba.
Puede agregarse un compuesto de prueba de tiolester a una solución que contiene la proteína NC formada en complejo con el zinc-65 radioactivo. después de la reacción, la proteína (reaccionada y no reaccionada) n puede precipitarse, por ejemplo por métodos de inmunoprecipitación o inmunoadsorción utilizando anticuerpos conocidos o por la adición de una cantidad calibrada de ácido nucleico de tal manera que la proteína NC sature los sitios de unión en la matriz de ácido nucleico. Bajo condiciones de baja resistencia iónica, el complejo de ácido nucleico-proteína saturada forma un precipitado que puede retirarse por centrifugación. Alternativamente, la proteína de la nucleocápside etiquetada puede unirse a un soporte sólido, y los reactivos de prueba agregarse directamente a la proteína unida. Cualquier reacción que libera el zinc de la proteína, puede detectarse por la liberación del zinc-65 radioactivo en el sobrenadante soluble. Este procedimiento general puede automatizarse dependiendo del equipo disponible.
Un equipo que suministra proteína de la nucleocápside retroviral y agentes de precipitación apropiados puede utilizarse para detectar la capacidad de los compuestos de prueba para retirar el zinc de la proteína.
iiJbejraclózi del Zinc Radioactivo a Partir del virus Completo Etiquetado con Zinc- 65
El zinc se encuentra presente en eí virus en cantidades cercanamente estequiométricas con los análisis de indicador de zinc CCHC (Bess (1992) J". Virol . 66:840). Casi todo el zinc se encuentra coordinado en los análisis de CCHC (Summer (1992) Protein Science 1:563) . Por lo tanto, el zinc-liberado desde un virus se deriva del zin previamente coordinado en los análisis de CCHC, preferentemente de proteínas no relacionada u otras asociaciones no específicas con el virión.
El virus purificado puede producirse a partir de células cultivadas en la presencia de zinc- 65 agregado. El virus etiquetado puede aislarse y purificarse por centrifugación de gradiente de densidad en la presencia de EDTA agregado para retirar cualquier zinc no unido. El virus purificado puede ser cualquier retrovirus de interés incluyendo, pero no limitándose a HIV-1, HIV-2 o SIV.
Los compuestos a probarse (tiolésteres de la invención) pueden agregarse al virus radioactivo purificado bajo condiciones apropiadas para el compuesto de prueba de elección (Rice (1993) Nature 361:473-475). Después de la reacción, retiro y/o inactivación del reactivo el virus se rompe por la adición de un detergente no iónico (por ejemplo Tritón X-100) y el núcleo viral que contiene la proteína NC que forma complejo con el ácido nucleico se retira por centrifugación .
El zinc-65 radioactivo liberado en el sobrenadante indica que el compuesto de prueba penetra en el virus inactivo y rompe el complejo zinc-proteína NC. El equipo para determinar si los compuestos de prueba pueden retirar el zin quelado por NC retroviral, podría contener, por ejemplo, partículas retrovirales intactas con el zinc-65 radioactivo incorporado en sus proteínas NC, los reguladores de reacción apropiados y un detergente no iónico.
Fluorescencia Basada en la Detección de la Disociación de Zinc a partir de la Proteína
Los cambios en la fluorescencia intrínseca de los residuos de proteína aromática se utilizan comúnmente para monitorear una reacción que incluye un cambio en la conformación de la proteína. En la presente invención, la fluorescencia puede utilizarse para monitorear la pérdida del ion de metal proveniente de un indicador de zinc, por ejemplo, la pérdida de zinc desde una proteína de indicador de zinc retroviral CCHC, después de estar en contacto con un tiolester de la invención. La fluorescencia intrínseca de Trp37 en el segundo indicador de zinc de la proteína NC de HIV-1 se ha utilizado para monitorear la unión de ácido nucleico y la conformación del complejo del indicador de zinc (ver, Summers (1992) supra) .
La eyección del zinc se mide por la capacidad de los compuestos para atacar químicamente las cisteínas en la proteína en ECp7 purificada, dando como resultado una pérdida de fluorescencia debido al movimiento del residuo 37 del triptofano desde un expuesto a una posición interna en la proteína. La eyección del zinc se mide y expresa ya sea como unidades de disminución del porcentaje de la fluorescencia total o disminución en la fluorescencia relativa por minuto durante un análisis de 30 minutos (RFU/min) . Un tiolester se considera dentro del alcance de la invención si se detecta cualquier cantidad de eyección de zinc. Por ejemplo el compuesto 50 tiene una tasa de eyección de zinc de 0.86 RFU/min.
Las pruebas fluorescentes artificiales también pueden incorporarse en una proteína para proporcionar la detección de cambios en la configuración. La poli etino-adenina, por ejemplo, puede utilizarse como un nucleótido fluorescente para medir el grado de interacción del indicador de zinc del tiolester (ver Karpel (19987) J". Biol . . Chem. 262:4961) .
Finalmente puede utilizarse una variedad de queladores de zinc fluorescentes conocidos capaces de formar complejos con el zinc liberado para monitorear la pérdida de zinc. Al monitorear la liberación del zinc de los análisis del indicador de zinc CCHC, puede determinarse el efecto de un reactivo dado (Rice (1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616; Rice (1996) Science 270 : 1194-1197) .
Detección de la Proteína NC Disulfuro Degradada por Análisis de Desplazamiento por Movilidad del Gel
El retrovirus concentrado purificado y el antisuero contra la proteína NC del virus, pueden utilizarse para probar la capacidad de un compuesto específico para penetrara el virus y reaccionr con la proteína NC al formar complejos de disulfuro en el núcleo del virus. El compuesto se mezcló con el retovirus completo bajo condiciones de reacción apropiadas para el compuesto. El virus se retiró entonces del reactivo mediante centrifugación y se separó en, por ejemplo, regulador de muestra SDS-PAGE estándar con (reducido) y sin (no reducido) 2 -mercaptoetanol . Las proteínas virales se separaron entonces por SDS-PAGE estándar y la muestra se examinó para la presencia o ausencia de la proteína del indicador de zinc monomérico en la muestra no reducida. Dependiendo del virus utilizadoen el experimento y las condiciones de electroforesisi, la proteína del indicador de zinc puede visualizarse por métodos de tinción de proteína, o por métodos de inmuno-mancha. Los compuestos que reaccionen con la proteína del indicador de zinc al atacar los complejos del indicador de zinc y formar productos de disulfuro degradado inactivan al virus. Así, los compuestos de interés (es decir, aquellos que causan degradación) , incluyendo los tiolésteres de la invención, reducen la cantidad de proteína del indicador de zinc monomérico detectada. Por ejemplo, el compuesto 45 de tioléster es un fuerte degradante del NCp7 intravirón que resulta en pérdida completa de NCp7 monomérica como se detecta por el examen de mancha Western.
Los viriones tratados con tiolester también pueden probarse para la infectividad. Los viriones se suspenden en el medio (preferentemente solubilizado) y se agregan a las células objetivo. Los cultivos se examinan entonces para determinar si las partículas de virus tratadas se encuentran activas, las células se monitorean para la presencia de ATN viral intracelularmente sintetizado utilizanco, por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasas (PCR) (Rice (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:9721; Tupin (1996) J. Virol . 70:6180); Alternativamente, pueden utilizarse ensayos de citoprotección (Weislow (1993) J". Nati . Cáncer Inst . 81:577).
Un ejemplo de un compuesto que puede utilizarse como un control en el ensayo de desplazamiento de movilidad de gel es izodicarbonamida (ADA) , un compuesto que se encuentra comercialmente disponible de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl) . ADA también inactiva el virus HIV-1, según se determinó utilizando el ensayo de PCR anteriormente descrito.
Puede utilizarse un equipo que incorpora el concepto de desplazamiento de movilidad de gel para identificar y estudiar los tiolésteres que se encuentran disponibles para penetrar el virus intacto y para inducir la degradación del disulfuro en las proteínas virales del indicador de zinc. Tal equipo puede contener, por ejemplo, retrovirus concentrado purificado y apropiado tamaño estándar para deterctar el cambio en la movilidad a través del gel debido a la degradación del disulfuro.

Proteínas NC Purificads por Cromatografía de Líquido de Alta Presión (HPLC) para la Caracterización Estructural de los Productos de Reacción
Las proteínas retrivirales del indicador de zinc altamente purificadas pueden producirse mediante la expresión de vectores generados a través de tecnología de ADN recombinante. Estas proteínas cuando se reconstituyen con zinc, según se describió por Stemmers (1992) Protein Science 1:563-567, proporcionó la fuente de las proteínas NC que contienen los indicadores de zinc que son los abjetivos a atacar mediante los compuestos de tioléster de esta invención. Cuando las proteínas de los indicadores de zinc reaccionan con compuestos identificados, la reacción produce un cambio co-valente en la proteína del indicador de zinc, y la proteína modificada puede separarse de la proteína sin reacción mediante, por ejemplo, fase HPLC inversa.
Las proteínas purificadas y estos métodos de separación se utilizan para obtener suficiente proteína modificada (es decir, productos de la reacción) para análisis químico y estructural . Los productos de reacción purificados se aislan y su estructura se detarmina mediante degradación Edman N-terminal estándar. Sin embargo, para cualquier reactivo específico, los gradientes y las condiciones de HPLC dependerán de la proteína NC y los productos de reacción.
Este procedimiento se utiliza para identificar los compuestos de tiolester que reaccionan con los indicadores de zinc. Las condiciones dereacción y las condiciones de HPLC para los datos presentados, fueron similares a aquellos dexcritos anteriormente.
Los equipos que estandarizan estas técnicas pueden construirse de tal manera que contengan, por ejemplo, proteínas retrovirales de indicadores de zinc purificadas. Resonancia Magnética Nuclea -Basada en la Detercción de Pérdida de Zinc
Puede utilizarse NMR para monitorear la pérdida de zinc de las proteínas retrovirales de indicador de zinc (ver, por ejemplo, Rice (1993) Nature 361:473-475 ; McDonnell (1997) J". Med. Chem. 40:1969; Rice (1997) Nature Medicine 3:341-345) . Se espera que una de las técnicas sea familiar con la técnica general de NMR y sus muchas aplicaciones, para monitorear las interacciones proteína-ligando. En resumen, los átomos en las proteínas retovirales del indicador de zinc unidas al zinc, comparten un ambiente local diferente al de las proteínas del indicador de zinc que carecen de zinc. La diferencia en el ambiente local conduce a distintos espectos de NMR para las moléculas de proteína que se unen al zinc, contra aquellas que no lo hacen. Al monitorear, por ejemplo, el espectro del protón (1H) de una muestra que contiene la proteína del indicador de zin con el ion metal quelado y un compuesto de la presente invención durante un tiempo extra, es posible, medir si el compuesto hace que la proteína pierda su ion zinc .
Ya que puede utilizarse la NMR para proporcionar elporcentaje de las moléculas de proteína que se unen al zinc durante un tiempo extra, es posible utilizar esta técnica para definir la cinética de la reacción de una reacción dada. De manera similar, puede utiklizarse la NMR para monitorear el efecto de los compuestos de prueba en la unión de las proteínas del indicador de zinc a los complejos de ácido nucleico. Los equipos que contienen, por ejemplo, proteína retroviral del indicador de zinc purificada y oligonucleótidos, pueden utilizarse para estandarizar la práctica de este método.
Determinación de la Actividad Anti -Viral del Tioléster
Un tioléster se encuentra dentro del alcance de la invención sí despliega cualquier actividad antiviral (es decir, cualquier capacidad para disminuir o reducir la transmisión o la capacidad replicativa del virus) . La actividad antiviral puede determinarse empíricamente mediante observación clínica o utilizando objetivamente cualquier prueba o análisis in vivo o in vitro, por ejemplo, el análisis de citoprotección XTT (descrito en la presente) , midiendo el análisis de la actividad Tat-inducida (como en HeLa-CD4-LTR-beta-gal (células MAGI) y detectando la actividad Tat inducida beta galactosidasa, ver, por ejemplo, Tokunaga (1998) J. Virol 72:6257-6259), y lo similar. Un tiolester con cualquier grado de actividad antiviral medible se encuentra dentro del alcance de la invención, aún si no es detectable la disociación del ion metal.
Un medio ejemplificativo para determinar la actividad antiviral es con las células CEM-SS y el virus (por ejemplo, HIV-1RF) (MOI=0.01) utilizando el análisis de citoprotección XTT (2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5- [ (fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio hidróxido, como se describió por Rice (1993) PNAS 90:9721-9724, y Rice (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:419-426. En resumen, las células se infectan con HIV-1RF (u otro virus a ser probado) en la presencia de varias diluciones de los compuestos de prueba (tiolésteres y controles) . Los cultivos se incuban duarnte siete días. durante este tiempo, los cultivos control sin los compuestos protectores (es decir, compuestos con actividad antiviral) los virus de replicación, inducen syneytia, y da como resultado aproximadamente 90% de muerte celular. La muerte celular se midepor reducción de colorante XTT. XTT es un colorante de tetrazolio soluble que mide la salida de energía mitocondrial, similar a MTT. Los controles positivos que utilizan dextrán sulfato (un inhibidor de unión) o 3 ' -Azido-2 ' -3 ' -didioxitimidina, AZT (un inhibidor de transcriptasa inversa) se agrega a cada análisis. Los análisis individuales se hacen en duplicado utilizando un método de placa hermana.
Se calcula que las concentraciones antivirales efectivas proporcionan 50% de citoprotección (EC50) , y las concentraciones inhibidoras del crecimiento celular causan el 50% de citotoxicidad (IC50) .
De manera alternativa, cualquier virus puede crecer en el cultivo, o en un modelo in vivo (animal) , en la presencia o ausencia de un tiolester o formulaciones farmacéuticas que contiene tioleste para probar la actividad y eficacia anti-viral, transmisión-inhibición viral. Puede utilizarse cualquier virus, análisis o model animal que pueda ser aparente a un experto después de la revisión de esta exposición, ver por ejemplo, Lu (1997) Cri t . Rev. Oncog. 8:273-291; Neiidez (1998) Virology 243:12-20; Geretti (1998) J. Gen Virol . 79:415-421; Mohri (1998) Science 279:1223-1227; Lee (198) Proc. natl . Acad. Sci USA 95:939-944; Schwiebert (1998) AIDS Ras . Hum. Retroviruses 14:269-274.
Para los análisis in vi tro, cualquier disminución medible en la carga viral de un crecimiento de cultivo en la presencia de un compuesto de prueba de tiolester según se compara a un control positivo o negativo, es indicativo de un efecto anti-viral, transmisión-inhibición. Típicamente, se observa al menos una reducción del 30% en la carga viral, en general, entre 10% y 99%. Como se trató en la sección de definiciones, anterior, puede utilizarse cualquier criterio relevante para evaluar la eficiencia antiviral de una composición de tiolester o formulación que contiene tiolester.
Clonación y Expresión de las Proteínas de la Nucleocápside Retroviral
Los nuevos tiolésteres de la invención, son capaces de disociar un ion metal de un indicador de zinc in vi tro. Las proteínas que contienen indicador de zinc se utilizan para detectar la disociación de un ion metal de un motif indicador de zinc y en los métodos y equipos de la invención. Los procedimientos generales de laboratorio para la clonación y expresión de los motifs del indicador de zinc y proteínas que contienen esos motifs, pueden encontrarse, por ejemplo, en ediciones actules de Sambrook, et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring harbor Laboratory, Cold spring harbor, new York, 1989; PROTOCOLOS ACTUALES EN BIOLOGÍA MOLECULAR, Ausubel, ed. Greene Publishing y Willey-Interscience, New York (1987) . Las secuencias y fuentes de indicadores de zinc, que incluyen ácidos nucleicos, proteínas y fuentes virales, se encuentran pública, ente disponibles, por ejemplo, a través de las bases de datos electrónicas, tal como, por ejemplo, The National Center for Biotechnology Information en http: //www.ncbi .nlm.nih.gov/Entrez/ o, The National Library of Medicine en http : //ww . ncbi . nlm. nih . gov/PubMed/_.

Las composiciones de ácido nucleico que pueden utilizarse para expresar las proteínas que contienen el indicador de zinc, ya sea ARN, ADNc, ADN genómico, o un híbrido de las diferentes combinaciones, pueden aislarse de fuentes naturales, o pueden sintetizarse in vitro. Las técnicas de ADN recombinante pueden utilizarse para producir péptidos. En general, el ASDN que codifica el polipéptido o péptido de interés se clona o se aisla primero en una forma adecuada para ligación en un vector de expresión. Después de la ligación, el vector que contiene los fragmentos o insertos de ADN se introduce en una célula huésped adecuada para la expresión del polipéptido recombinante. El polipéptido se aisla entonces de las células huésped. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas transformadas o transfectadas en una célula lisada transformada o trasfectada; o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos de genes que codifican las proteínas que contienen el indicador de zinc, tales como subclonación de secuencias de ácido nucleico en vectores de expresión, pruebas de etiquetado, hibridización de ADN, y lo similar, se describe, por ejemplo en, Sambook y Ausubel, supra .
Una vez que se aislan y se clonan los ADNs, se pueden expresar los polipéptidos deseados en una célula recombinantemente diseñada tal como bacteria, levadura, insecto, o células de mamífero. Se espera que aquellos de experiencia en la materia reconozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de las proteínas recombinantemente producidas. No se hará ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de las proteínas procariótidos o eucariótidos . En un breve resumen, la expresión de los ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los polipéptidos se logrará típicamente al enlazar de manera operable el ADN o ADNc a un promotor (que es ya sea constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación hacia un vector de expresión. Estos vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en cualquier procariótido o eucariótido. Los vectores de expresión típica contienen terminadores de transcripción y traslación, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica los polipéptidos recombinantes. Para obtener elevados niveles de expresión de un gen clonado, es deseable construir plásmidos de expresión, que contienen, al menos, un promotor para dirigir la transcripción, un sitio de unión de ribosoma para la iniciación translacional y un terminador de transcripción/translación .
Tiolésteres como Viricidas
La invención proporciona una composición que comprende un material bio-orgánico u otro y una material, y una cantidad de un tiolester de la invención efectiva para inactivar cualquier virus (susceptible a la inactivación por un tiolester) el cual es o puede contaminar el material . El material puede ser bio-orgánico tal como por ejemplo, plasma sanguino, medio nutriente, proteína, un fármaco, un cosmético, una preparación de esperma o de oocito, células, cultivos celulares, bacteria, virus, alimentos, bebidas. Pueden ser materiales quirúrgicos u otros materiales médicos, tal como por ejemplo materiales de implante o dispositivos implantables (por ejemplo, plásticos, válvulas de corazón artificiales o articulaciones, colágenos) , materiales médicos

(por ejemplo tubería para caterización, entubación IVs) y recipientes (por ejemplo bolsas sanguíneas, recipientes de almacenamiento) , y lo similar. Alternativamente, un tiolester de la invención puede encontrarse en la forma de una composición que se aplica a cualquiera de los materiales anteriores como un reactivo viricida y se retira antes del uso del material . La composición viricida puede contener una mezcla de diferentes tiolesteres de la invención en cantidades variables. Por ejemplo, los tiolésteres pueden agregarse a cultivos celulares para reducir la probabilidad de contaminación viral, proporcionando seguridad agregada para los trabajadores de laboratorio.
Tiolésteres cono Formulaciones Farmacéuticas
La invención también proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden los tiolésteres de la invención, estos tiolésteres se utilizan en composiciones farmacéuticas que son útiles para la administración a mamíferos, particularmente humanos, para el tratamiento de infecciones virales, especialmente retrovirales.
Los tiolésteres de la invención pueden formularse como fármacos para la administración en una variedad de formas. Las rutas típicas de administración incluyen tanto entérales como parenterales. Estas incluyen, por ejemplo, sin limitación, subcutáneas, intramusculares, intravenosas intraperitoneal, intramedular, intrapericardiaca, intrabursal, oral, sublingual, ocular, nasal, tópica, transdermal, transmucosal o rectal. El modo de administración puede ser por ejemplo, a través de deglución, inhalación, inyección o aplicación tópica a una superficie,

(por ejemplo, ojos, mucosa, membrana, piel) . Las formulaciones particulares típicamente son apropiadas para modos específicos de administración. Las diversas formulaciones contempladas incluyen por ejemplo, solución acuosa, sólido, aerosol, formulaciones liposomales y transdermales . Los detalles sobre las técnicas para la formulación y administración se encuentran bien descritos en la literatura científica y de patente, ver por ejemplo, la más reciente edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co. Easton PA) .

Soluciones Acuosas para Administración Enteral, parenteral o Transmucosal
Ejemplos de soluciones acuosas que pueden utilizarse en formulaciones para suministrar fármacos entérales parenterales o transmucosales incluyen, por ejemplo agua, salina, salina regulada por fosfato, solución de Hank, solución Ringer, dextrosa/salina, soluciones de glucosa y lo similar. Las formulaciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para mejorar la estabilidad, suministrabilidad o solubilidad, tal como agentes de regulación, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y lo similar. Los aditivos también pueden incluir ingredientes activos adicionales tales como agentes bactericidas o estabilizadores. Por ejemplo la solución puede contener acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan u oleato de trietanolamina. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales, o pueden filtrarse para esterilización. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para utilizarse como se encuentran o liofilizarse, siendo la preparación liofilizada combinada con una solución acuosa estéril antes de su administración.
Las soluciones acuosas son apropiadas para su inyección, y en particular para su inyección intravenosa. Las solución intravenosa puede incluir detergentes y emulsificantes tales como lípidos. Las soluciones acuosas también son útiles para su administración enteral como tónicos y la administración a mucosas u otras membranas como por ejemplo, gotas para nariz u ojos. La composición puede contener un tiolester en una cantidad de aproximadamente 1 mg/ml a 100 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml.
Formulaciones para Suministro Enteral o Transdermal
Las formulaciones sólidas también pueden utilizarse para la administración enteral . Pueden formularse como por ejemplo, pildoras, tabletas, polvos o cápsulas. Para las composiciones sólidas, pueden utilizarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almodón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y lo similar. Para la administración oral se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable al incorporar cualquiera délos excipientes normalmente empleados, tales como aquellos vehículos previamente listados y generalmente de 10% - 95% de ingrediente activo.
Puede también utilizarse una formulación no sólida para la administración enteral (oral) . El vehículo puede seleccionarse de varios aceites que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de frijol de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí, y lo similar. Ver Sánchez et al, Patente de E.U. No. 5,494,936. Los excipientes farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desgrasada seca, glicerol, propilen glicol, agua, etanol, y lo similar. Los copolímeros de bloque no iónicos sintetizados de óxido de etileno, y óxido de propileno también pueden ser excipientes farmacéuticos, los copolímeros de este tipo pueden actuar como emulsificantes, humectantes, espesantes, estabilizantes, y agentes de dispersión, ver por ejemplo, Newman (1998) Cri t . Rev. Ther. Drug Carrier Sist . 15:89-142.
Una forma de dosis unitaria tal como una tableta puede estar entre aproximadamente de 50 mg/unidad hasta aproximadamente 2 gramos/unidad, preferentemente entre aproximadamente 100 mg/unidad hasta aproximadamente 1 gramo/unidad.
Administración Tópica : Suministro Transdermal /Transmucosal
La administración sistémica también puede ser por medio transmucosal o transdermal . Para la administración transmucosal o transdermal pueden utilizarse en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrarse . Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo para la administración transmucosal derivados de sales de bilis y ácido fusídico. Además pueden utilizarse detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede ser a través de rocíos nasales, por ejemplo, o utilizando supositorios .
Para la administración tópica, los agentes se formulan en pomadas, cremas, ungüentos, polvos y geles. En una modalidad, el agente de suministro transdermal puede ser DMSO. Los sistemas de suministro transdermal tanbién pueden incluir por ejemplo, parches.
Los tiolésteres también pueden administrarse en suministro sostenido o mecanismos de liberación sostenida, los cuales puedan suministrar la formulación de manera interna. Por ejemplo microesferas o cápsulas bio-degradables u otras configuraciones de polímero bio-degradable capaces del suministro sostenido de una composición que puede incluirse en las formulaciones de la invención (ver por ejemplo, Putney (1998) Nat . Biotechnol . 16:153-157).
Suministro de Is Formulación por Inhalación
Para la inhalación, la formulación de tiolester puede suministrarse utilizando cualquier sistema conocido en_ la materia, incluyendo aerosoles de polvo seco, sistemas de suministro de líquidos, nebulizadores de chorro aire, sistemas propulsores, y lo similar. Ver por ejemplo, Patton (1998) Biotechniques 16:141-143; sistemas de suministro por inhalación, por ejemplo, Dura Pharmacéuticals (San Diego, CA) , Aradigm (Hayward, CA) , Aerogen (Santa Clara, CA) , Inhals Therapeutic Systems (San Carlos, CA) , y lo similar.
Por ejemplo, la formulación farmacéutica puede administrarse en la forma de un aerosol o niebla. Para la administración de aerosol, la formulación puede suministrarse en forma finamente dividida junto con un surfactante y un propulsor. El surfactante preferentemente es soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los esteres o los esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono tal como ácidos caproico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoléico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polhídrico alifático o su anhídrido cíclico tal como por ejemplo, etilen glicol, glicerol, eritritol, arabitol, manitol, sorbitol, los anhídridos de hexitol derivados del sorbitol y lderivados del polioxietileno y polioxipropileno de estos esteres. Pueden emplearse los esteres mezclados, tales como los glicéridos mezclados o naturales. El surfactante puede constituir 0.1% - 20% por peso de la composición, preferentemente 0.25% - 5%. El balance de la formulación es el propulsor ordinario. Los impulsores licuados son típicamente gases en condiciones ambientales y se condensan bajo presión. Entre los propulsores licuados adecuados se encuentran los alcanos inferiores que contienen hasta 5 carbonos tales como butano y propano; y preferentemente alcanos fluorinados o fluoroclorinados . También pueden emplearse mezclas de lo anterior. Alproducir el aerosol, se llena un recipiente equipado con una válvula adecuada con el propulsor apropiado conteniendo los compuestos y el surfactante finamente divididos. Los ingredientes se mantienen así a una presión elevada hasta la liberación por la acción de la válvula. ver por ejemplo, Edwards (1997) Science 296:1868-1871.
Un dispositivo nebulizador o rociador para la administración de los tiolésteres de esta invención, típicamente suministran una dosis inhalada de aproximadamente de 1 mg/m3 hasta aproximadamente 50 mg/m3.
El suministro por inhalación es particularmente efectivo para el suministro a tejidos respiratorios para el tratamiento de condiciones respiratorias que incluyen un componente inflamatorio.
Otras formulaciones
Al preparar los fármacos de la presente invención, pueden utilizarse una variedad de modificaciones de formulación y manipularse para modificar la fármaco-cinética y la bio-distribución. Para alguien de experiencia ordinaria en la técnica, son conocidos varios métodos para modificar la fármaco-cinética y la bio-distribución. Para una exposición general de la fármaco-cinética Ver Remington Pharmaceutical Science, supra, Capítulos 37-39.
Administración
El tiolester de la invención se utiliza en el tratamiento y prevención de infección viral, particularmente infecciones retrovirales. La cantidad de tiolester adecuada para efectuar esto, se define como una i "dosis terapéuticamente efectiva" . La programación de dosis y cantidades efectivas para este uso, por ejemplo el "régimen de dosis", dependerá de una variedad de factores, incluyendo frecuencia de dosis, la etapa de la enfermedad o condición, la severidad de la enfermedad o condición, el estado general de la salud del paciente, el estado físico del paciente, la edad y losimilar. Al calcular el régimen de dosis para un paciente, el modo de administración también se toma en consideración.
El régimen de dosis también debe tomar en consideración la fármaco-cinética, es decir, la tasa de tioléster de absorción, la biodisponibilidad, el metabolismo, el despeje y lo similar (ver, por ejemplo, la edición más reciente de Remington, supra) .
Las administraciones unitarias o múltiples de las . composiciones pueden llevarse a cabo con niveles de dosis y modelos que se seleccionan por el médico tratante. En cualquier caso las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de tiolester suficiente para tratar al paciente de manera efectiva. Lacantidad total efectivaa de un tiolester de la presente invención puede administrarse a un sujeto como una dosis única, ya sea como una pildora o por infusión durante un periodo de tiempo relativamente corto, o puede administrarse utilizando un pri¿ocedimiento de tratamiento fraccionado, en el cual las dosis múltiples se administran a través de un periodo de tiempo más prolongado. Un experto en la técnica sabrá que la concentración de un tiolester de la presente invención requerido para obtener una dosis efectiva en un sujeto depende de muchos factores incluyendo, por ejemplo, la fármaco-cinética del pro-fármaco y su producto de hidrólisis, la edad y salud general del sujeto, la ruta de administración, el número de tratamientoas a administrarse y el criterio del médico que prescribe. En vista de estos factores el técnico experto ajustará la dosis a fin de proporcionar una dosis efectiva para un uso particular.
Formulaciones de Vacunas que Comprenden los Tiolésteres de la Invención
La invención también proporciona un virus aislado e inactivado, en donde el virus se encuentra inactivado por un método que comrende poner en contacto el virus con un compuesto de tiolester de la invención, en donde el poner en contacto el virus con el compuesto inactiva al virus. En una modalidad, el virus aislado e inactivado comprende admás una formulación de vacuna. La formulación de vacuna de la invención también puede comprender un tiolester aislado formado en complejo con la proteína viral.
Los virus inactivados formados en complejo con el tiolester de la invención se utilizan en formulaciones de vacuna que son útiles para la administración a mamíferos, particularmente humanos, para tratar y generar inmunidad para una variedad de enfermedades virales, particularmente infecciones retrovirales tales como HIV-1. las formulaciones de vacuna pueden darse en administraciones simples o una serie de administraciones. Cuando se da como una serie, las inoculaciones subsecuentes a la administración inicial se dan para promover la respuesta inmune y son referidas típicamente como inoculaciones reforzadpras .
Las vacunas de la invención contienen como un ingrediente activo una cantidad inmunológicamente efectiva de un virus inactivado del complejo de tiolester. LOs vehículos útiles se conocen bien la técnica e incluyen por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide de tétanos, ácidos poliaminos tales como ácido poli (D-lisina: D-glutámico) , influenza, proteína del núcleo del virus de hepatitis B, vacuna recombinante del virus de hepatitis B y lo similar. Las vacunas también pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, salina regulada por fosfato o salina e incluye típicamente admás un adyuvante. Los adyuvantes tales como el adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre se utilizan también ventajosamente para promover una respusta inmune.
Usos de Virus Inactivados con Tiolester y Proteínas Formadas en Complejo con Tiolester
En adición a los usos como vacunas, los virus inactivados con tiolester y las proteínas virales formadas en complejo con el tiolester tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las proteínas virales formadas en complejo con el tiolester o los virus inactivados con tiolester pueden utilizarse como reactivos para la detección de anticuerpos antivirales correspondientes. Una prueba muy comúnmente utilizada para determinar si un individuo se encuentra infectado con un virus tal como HIV, es examinar para la presenia de anticuerpos antivirales. El virión inactivado con tiolester o la proteína viral formada en complejo con el tiolester pueden utilizarse en estas pruebas de dtección como antígenos de captura o antígenos de control. Ver por ejemplo, Hashida (1997) J. Clin . Lab. Anal . 11:267-286; Fio (1995) Eur. J. Clin . Microbiol . Inf ct Dis. 14: 504-511.
El virión inactivado con tiolester o la proteína viral que forma complejo con el tiolester pueden utilizarse como reactivos de cristalización para análisis de cristalización de rayos X u otros estudios ultra estructurales, ver por ejemplo Yamashita (1988) J". Mol . Biol . 278:609-615; Wu (1998) Biochemistry 37:4518-4526. También pueden utilizarse como peso molecular, pl u otros controles en varios experimentos y metodologías fisioquímicos .
Equipos y Aparatos
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un equipo que incorpora los métodos y aparatos de la presente. Los equipos de la invención comprenden opcíonalmente uno o más de lo siguiente: (1) un tiolester o componente de tiolester como se decribe en la presente; (2) instrucciones para practicar los nmétodos descritos en la presente y/o para utilizar el tiolester o componente de tiolester, (3) uno o más componentes de análisis; (4) un recipiente para contener los tiolésteres, los componentes de los análisis o los componentes de los aparatos para implementar los tiolesteres o practicar los métodos de la presente y (5) materiales de empaque.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de cualquier compuesto, aparato, componente de aparato o equipo de la presente, para la práctica de cualquier método o análisis en la presente y/o para el uso de cualquier aparato o equipo para practicar cualquier análisis o método de la presente.
Usos de los Tiolésteres
En un aspecto adicional, 1 presente invención proporciona para el uso de cualquier composición de tiolester, virus, inactivados o componente viral, célula, cultivo celular, mamíferos, aparatos, componentes de aparatos o equipos para los mismos, para la práctica de cualquier método o análisis de la presente y/o para el uso de cualquier aparato o equipo para practicar cualquier análisis o método en la presente y/o para el uso de virus, células, cultivos celulares, composiciones u otras características de la presente como un medicamento. La fabricación de todos los componentes de la presente como medicamenbtos para los tratamientos descritos en la misma también se proporcionan y son aparentes de la revisión de lo anterior.
La invención se describirá en mayor detalle por medio de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos y no están propuestos para limitar o definir la invención en ninguna manera.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Elecrtoforesis Capilar
Un medio ejemplificativo para determinar la capacidad de desplazamiento del ion de metal de un tiolester de la invención es a través de electroforesis capilar. La proteína NCp7 forma complejos con dos iones de zinc, cada uno con una carga formal de +2. Los reactivos que reaccionan con la proteína y retiran los iones de zinc, causan un cambio en la confirmación y carga de la proteína. Así, la movilidad de electroforesis de la proteína reaccionada diferirá de la movilidad de la proteína sin reaccionar. Pueden detectarse fácilmente cambios en la movilidad electroforética de la proteína mediante la electroforesis de zona capilar (CZE) .
El regulador de la columna capuilar es .001 M de fosfato de sodio a pH 3.0 y la proteína se detecta por la absorción UV a 215 nm. Los tubos de muestra pueden contener aproximadamente 10 o más microlitros de una solución que consiste de 0.25 microgramos de NCp7 por ml en agua a pH 7.0, con o sin agregar la composición reactiva del indicador de zinc, por ejemplo un tiolester de la invención. los tubos de muestra se colocaron en un inyector de muestra automático. A intervalos programados 10 μl de muestra se llevaro hacia la columna capilar y los datos se recolectaron como absorción UV por minuto. La NCp7 no modificada dio un pico agudo de proteína migrante que pasó el detector en aproximadamente 7.95 minutos. Las modificaciones de la proteína causadas por la reacción con el compuesto de prueba de selección se revelaron por un cambio en este patrón.
La electroforesis capilar tiene la ventaja de la automatización simple, ya que pueden cargarse muchas muestras diferentes en el estante que sostiene las muestras y analizarlas en pruebas sucesivas. cada prueba requiere de aproximadamente 10 minutos y cada tubo de muestra puede analizarse muchas veces.

Ejemplo 2 : Preparación de N- [2- (5-Piridiniovaleroiltio) benzoil] -3 -amino propianamida Bromuro (YS1332D) - Modelos VI γ_ VII, γ_ N- [2- (5- Piridiniovaleroiltio) glicinamida Bromuro
(XS1333D- Modelos V y VII)

Síntesis de YS1332A, un intermediario de Disulfuro Benzamida
Se agregaron 2 , 2 ' -Ditiodibenzoil cloruro (3.43 g, 10 mmol) a una solución clara de hidrocloruro de β-alanina amida (NOVA Biochem.) (3.1 g, 25 mmol) y 4- metilmorfolina (NMM; 5 ml, 45 mmol) en N/ N-dimetilacetamida (DMA; 30 ml) y agua (5 ml) a temperatura ambiente (RT) . La mexcla se cargó a una solución café rojiza clara en 30 min. La solución se agitó a RT durante 3 días, durante lo cual se formó un precipitado. La mezcla se agregó a 1M HCl (500 ml) . El precipitado amarillo-anaranjado resultante se recolectó, lavó con agua y se secó bajo vacío. La producción fue 2.93g (65%) .
Se sintetizó YS1333A de manera similar a YS1332A, pero el tiempo de reacción fue 1 día, no 3 días. La producción fue 4 g. (95%) .
Síntesis de YS1332B, Reducción de YS1332A a un intermediario
de tiol A la mezcla de YS1332A (2g, 4.5 mmol) en DMF (18 ml) y agua (2 ml) se le agregaron tris (2-carboxietilfosfina hidrocloruro (1.5 g. 5.2 mmol) y trietilamina (0.5 ml) a RT) . La mezcla se cargó a 5 ml de una solución anarajada clara. Se agitó por una hora, y después se agregó a 200 ml de etil éter. El precipitado se recolectó, se lavó con agua (3x20 ml) y se secó al vacío. Produjo 1.56 g (77%) de producto blanco.
YS1333B se elaboró de la misma manera como YS1332B. Produjo 1.5 g (76%).
Síntesis de YS1332C, un Intermediario de Haloalcanil tioester A una solución de YS1332B (0.8 g 3.6 mmol) en DMA (5 ml) se le agregó 5-bromovaleril cloruro (1.4 ml, 10.8 mmol) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por una hora, después se agregó a etil éter (80 ml) . El precipitado se recolectó, y se disolvió en DMF (5 ml) . La solución se agregó a 10% de bicarbonato de sodio (40 ml; pH-8) con agitación. El precipitado blanco se recolectó, se lavó con agua y se secó. Produjo 0.83 g (70%) .
YS1333C se elaboró de la misma manera como YS1333C.

Produjo 1.27 g (74%) .
Síntesis de YS1332D, un piridinioalcanil tiolester (PATE) :
Una solución de YS1332C (0.2 g 0.52 mmol) en piridina (4 ml) se agitó a RT bajo nitrógeno durante la noche. La mezcla se agregó a etil éter (40_ ml) . El precipitado blanco se recolectó, se lavó con éter y se secó. Produjo 0.23 g (95%).
YS1333D se elaboró de manera similar a YS1332D, pero la mezcla de reacción se agitó durante 2 días, no 1 día. Produjo 0.22 g (90%).

Ejemplo 3 : Preparación de ácido N- [2 - (5-Piridiniovaleroil tio) benzoil ] -3 -amino propiónico Bromuro (YS1334D) - Modelos VI v_ VII, _ N- [2 - (5- Piridiniovaleroil tio)benzonil -L- isoleucina Bromuro

(YS1324D- Modelos V y VII)
Síntesis de YS1334A, un intermediario de Disulfuro Benzamida

Se agregaron 2 , 2 ' -Ditiodibenzoil cloruro (3.43 g, 10 mmol) a una solución clara de hidrocloruro de β-alanina t— butil ester (NOVA Biochem.) (4.8 g, 25 mmol) y 4-metilmorfolina (NMM; 5 ml, 45 mmol) en N, N-dimetilacetamida

(DMA; 10 ml) a temperatura ambiente (RT) . La mexcla se agitó a RT durante la noche. A. la mezcla se agregó a heptato (200 ml) . El precipitado resultante se disolvió en una cantidad pequeña de DMF, después se agregó a 1M HCl (500 ml) . El precipitado sólido viscoso se recolectó, se lavó con agua y se secó bajo vacío. Produjo 5. Ig (91%) .
Se sintetizó YS1322A de la misma manera a partir de 5.0 mmol del dicloruro _de inicio y un exceso de hidrocloruro de L-isoleucina t-butil ester. La producción fue 3.10 g. (65%) del disulfuro.

Síntesis de YS1334B, Reducción de YS1334A a un intermediario
de tiol :
A una solución de YS1334A (1.8 g, 3.2 mmol) en DMF

(9 ml) y agua (1 ml) se le agregaron hidrocloruro de tris (2-carboxietilfosfina (1.3 g. 4.5 mmol) y trietilamina (0.45 ml) a RT) . La mezcla se agitó por una hora, y después se agregó a 0.5 M HCl (200 ml) . El residuo viscoso se recolectó, se lavó con agua y se secó al vacío. Produjo 1.24 g (69%) .
YS1324A se elaboró de la misma manera como YS1334B. 2.0 g de disulfuro produjo 1.5 g de tiol (75%).
Síntesis de YS1334C, un Intermediario de Haloalcanil
tioester:
A una solución de YS1334B (1.24 g, 4.4 mmol) en DMA (5 ml) se le agregó 5-bromovaleril cloruro (1.5 ml, 11 mmol) a RT bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por una hora, después se agregó a etil éter (100 ml) . El solvente se evaporó hasta 5 ml, y el residuo viscoso resultante se separó, se lavó con 10% de bicarbonato de sodio (20 ml ; pH; pH=8) y agua (40 ml) , y se secó. Produjo 1.6 g (82%) .
YS1324B se preparó a partir de 1.0 g de triol para producir 0.95 g de producto (65% de rendimiento) .
Síntesis de YS1334D, un piridinioalcanil tiolester (PATE)
Una solución de YS1334C (1.6 g, 3.6 mmol) en piridina (10 ml) se agitó a RT bajo nitrógeno durante la noche. Se agregó entonces a una solución de etil éter (200 ml) y heptano (100 ml) . La fase precipitada se disolvió en metanol (5 ml) y se agregó a una solución de éter (80 ml) y heptano (200 ml) . El precipitado se disolvió en una solución de ácido trifluoroacético (10 ml) y ácido fórmico (3 g) . La solución se agitó a RT durante la noche y se redujo a 5 ml con un vapor de nitrógeno. Al residuo se le agregó etil éter (40 ml) . El precipitado se recolectó y se secó. Produjo 0.9 g (53%) .
YS1324D se preparó a partir de 0.60 g del correspondiente bromovaleroil tioester para producir 0.58 g (58%) de la isoleucina portada por PATE..
Lo anterior se ofrece para propósitos de ilustración. Será fácilmente aparente para aquellos expertos en la materia que los materiales, procedimientos y etapas y otros parámetros de los métodos y equipos descritos en la presente pueden modificarse adicionalmente y substituirse en formas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.