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1. JP2008532949 - ヒト化L243抗体

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Description

Title of Invention ヒト化L243抗体 US 60/657,695 20050303 20130619 C07K 16/00 C12N 15/00 JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) GenBank/EMBL/DDBJ/UniProt/GeneSeq CA/REGISTRY/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) 特表平08−511421(JP,A) Mol Immunol., 1993 Jan, Vol.30, No.1, p.105-108 Int J Cancer., 2001 Aug 15, Vol.93, No.4, p.556-565 Blood, 2002, Vol.100, No.11, p.358a Nat Med., 2002 Aug, Vol.8, No.8, p.801-807 US2006007598 20060303 WO2006094192 20060908 2008532949 20080821 20090227 三原 健治

Technical Field

0001   0002  

Background Art

0003   0004  

Disclosure of Invention

0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021  

Best Mode for Carrying out the Invention

0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199  

Mode for the Invention 1

0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213  

Mode for the Invention 2

0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220  

Mode for the Invention 3

0221   0222   0223  

Mode for the Invention 4

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Mode for the Invention 5

0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257  

Brief Description of Drawings

0258  

Claims

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Drawings

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24    

Description

ヒト化L243抗体

US 60/657,695 20050303 20130619 C07K 16/00 C12N 15/00 JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) GenBank/EMBL/DDBJ/UniProt/GeneSeq CA/REGISTRY/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) patcit 1 : 特表平08−511421(JP,A)
nplcit 1 : Mol Immunol., 1993 Jan, Vol.30, No.1, p.105-108
nplcit 2 : Int J Cancer., 2001 Aug 15, Vol.93, No.4, p.556-565
nplcit 3 : Blood, 2002, Vol.100, No.11, p.358a
nplcit 4 : Nat Med., 2002 Aug, Vol.8, No.8, p.801-807
US2006007598 20060303 WO2006094192 20060908 2008532949 20080821 20090227 三原 健治

Technical Field

[0001]
[関連出願の相互参照]
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下、2005年3月3日に提出された、米国特許仮出願明第60/657,695号の優先権を主張する。前記出願は、すべての目的のために、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。
[0002]
[発明の分野]
本発明は、マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対するヒト化抗体に関する。1つの実施形態において、本発明は、そのような抗体を調製するためおよび使用するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、主要組織適合性複合体(MHC)のHLA遺伝子クラスターのD領域中でコードされたヒト白血球抗原(HLA)またはHLA−DRとして知られているものに対して特異的な、ヒト化モノクローナル抗体hL243を提供する。抗体は、HLA−DR +細胞の増殖を阻害し、TNF分子の発現および放出を誘導する。

Background Art

[0003]
ヒトにおいて、主要組織適合性複合体(MHC)は、第6染色体上のヒト白血球抗原(HLA)遺伝子クラスターであり、D、B、CおよびAと呼ばれる領域に分けられる。D領域には、クラスIIタンパク質に対する遺伝子が含まれ、免疫系の細胞間の協調および相互作用に関与する。D領域は、ほとんどの自己免疫疾患を含む多くの疾患に関与している。
[0004]
1つの抗体、L243(以下mL243)は、マウスIgG2a抗HLA−DR抗体である。この抗体は、マウスHLA遺伝子のD領域を標的化することによって自己免疫疾患のような疾患の処置において使用される可能性があり得る。mL243は、インビトロ免疫機能の強力な抑制を示し、すべてのHLA−DRに対して単型(monomorphic)である。しかしながら、ヒト患者に対するマウス抗体の投与によって、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答の誘導のような問題が存在する。ヒト対象に投与し得る、mL243の抗原特異性を有する抗体に対する必要性が存在する。

Disclosure of Invention

[0005]
本発明の1つの実施形態は、マウスモノクローナル抗体mL243によって認識されるエピトープに対する特異性を有する組換えヒト化抗体分子を提供する。このエピトープは、DRα鎖に依存する抗原決定であり得る。本実施形態にしたがって、抗体は、ヒト化CDR移植抗体であり得る。
[0006]
たとえば、1つの実施形態において、マウスモノクローナル抗体mL243によって認識されるエピトープに対する特異性を有するヒト化抗体分子は、可変ドメインの少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)が、マウスモノクローナル抗体mL243(MAb L243)に由来し、このヒト化抗体分子の残りの免疫グロブリン由来部分が、ヒト免疫グロブリンまたはその類似体に由来する、抗原結合部位を有する。本発明の1つの特定の実施形態において、ヒト化抗体の3つの重鎖および軽鎖CDRのすべては、mAb mL243に由来する。本発明の他の実施形態において、ヒト化抗体分子を、エフェクターまたはレポーター分子にコンジュゲートし得る。
[0007]
1つの実施形態において、本発明は、可変ドメインのCDR1、CDR2およびCDR3領域、および1つ以上のフレームワーク残基27、38、46、68および91が、マウスモノクローナル抗体mL243重鎖からのものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りが、1つ以上のヒト重鎖からのものである、重鎖可変ドメインを有する、ヒト化L243抗体を提供する。本実施例にしたがって、抗体は、HLA−DR +細胞上のHLA−DRの少なくとも1つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。1つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
[0008]
本発明の他の実施形態において、ヒト化L243抗体は、可変ドメインのCDR1、CDR2およびCDR3領域、および1つ以上のフレームワーク残基37、39、48および49が、マウスモノクローナル抗体mL243軽鎖からのものであり、免疫グロブリンフレームワークドメインの残りが、1つ以上のヒト軽鎖からのものである、軽可変ドメインを含み得る。本実施形態にしたがって、抗体は、HLA−DR *細胞上のHLA−DRの少なくとも1つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。1つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
[0009]
本発明の他の実施形態において、ヒト化L243抗体は、重鎖可変ドメインのCDR1、CDR2およびCDR3領域、および1つ以上のフレームワーク残基27、38、46、68および91が、マウスモノクローナル抗体mL243重鎖からのものであり、免疫グロブリン重鎖フレームワークドメインの残りが、1つ以上のヒト重鎖からのものである、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み得る。1つの特定の実施形態において、ヒト化L243抗体は、軽鎖可変ドメインのCDR1、CDR2およびCDR3領域、および1つ以上のフレームワーク残基37、39、48および49が、マウスモノクローナル抗体mL243軽鎖からのものであり、免疫グロブリン軽鎖フレームワークドメインの残りが、1つ以上のヒト軽鎖からのものである、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み得る。さらに、抗体はHLA−DR +細胞上HLA−DRの少なくとも1つのエピトープに結合することができ、細胞の殺傷を増加させる。1つの特定の実施形態において、細胞殺傷は、細胞傷害性の追加物あるいは免疫学的エフェクター機構のいずれも殺傷のために必要としないで増加し得る。
[0010]
本発明の1つの実施形態において、上述したような抗体の任意の1つを、薬学的組成物中で使用し得る。本実施形態にしたがって、本明細書で記述した1つ以上の抗体を含む薬学的組成物は、さらに以下で記述されるような治療的薬剤を含み得る。
[0011]
さらに、本発明における1つの実施形態によって、以下で記述されるような、1つ以上の開示された抗体組成物、コンジュゲート体および融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。これらの核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞も含まれ得る。
[0012]
これらの実施形態にしたがって、抗体を産出するために好適な増殖培地中で培養した宿主細胞の使用などの、抗体を作成するための方法が含まれ得る。
[0013]
本発明の1つの実施形態にしたがって、本発明で開示された抗体の1つ以上を、治療および/または診断目的のために薬学的組成物中で使用してもよい。たとえば、1つ以上の抗体を、処置を必要としている対象(たとえば自己免疫疾患のような免疫疾患を有する対象)に、治療的または薬学的組成物中で投与してもよい。
[0014]
本発明のより特定の実施形態において、ヒト化L243抗体は、図4で示した配列を有する重鎖可変ドメイン、および/または図3で示した配列を有する軽鎖可変ドメインを有する。
[0015]
他の実施形態において、薬学的組成物はさらに、CD4、CDS、CDS、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a、b、c、d)、CD74、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、1a、HM1.24、テネイシン、VEGF、EGFR、CEA、CSAp、ILGF、胎盤増殖因子、Her2/neu、炭酸脱水酵素IX、IL−6、SI00、MART−1、TRP−1、TRP−2、gplOO、アミロイドおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上の抗原に特異的に結合する、1つ以上の追加結合分子を含み、前記追加結合分子は、ヒト化L243抗体組成物および/または抗体のための送達媒体を含む、本明細書で開示された任意の薬学的組成物の前、一緒または後に投与される。
[0016]
1つの実施形態において、そのような処置を必要とする対象に投与するために薬学的組成物は、ヒト化L243抗体および1つ以上のペプチド、脂質、重合化担体、ミセル、ナノ粒子、またはこれらの組み合わせ、および1つ以上のエフェクターを含んでよい。
[0017]
本発明の開示方法の1つ以上を、限定はしないが、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞急性および慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、急性および慢性骨髄性白血病T細胞リンパ腫および白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、カルシノーマ、メラノーマ、サルコーマ、グリオーマおよび皮膚がんを含む疾患を処置するために使用してもよい。カルシノーマは、口腔、胃腸管、肺気管、乳、卵巣、前立腺、子宮、膀胱、膵臓、肝臓、胆嚢、皮膚および精巣のカルシノーマからなる群より選択され得る。さらに、1つ以上の開示された方法を、たとえば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎血管内膜炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維化肺胞炎のような自己免疫疾患を処置するために使用してもよい。
[0018]
1つの実施形態において、本発明の薬学的組成物を、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病のような白血病を有する対象を処置するために使用してもよい。
[0019]
1つの実施形態において、本発明の薬学的組成物を、アミロイドーシスのような代謝性疾患、アルツハイマー病のような神経変性疾患を有する対象を処置するために使用してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物を、免疫調節不全疾病を有する対象を処置するために使用してもよい。
[0020]
本発明の他の目的、特徴および利点が、以下の詳細な記述より明らかになる。しかしながら、詳細な記述および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示唆する一方で、本発明の精神および範囲の中での種々の変化および変更が、この詳細な記述から当業者に明らかになるので、例示の目的のみによって提供されると理解されるべきである。
[0021]
以下の図面は、本発明の一部分を形成し、本発明の特定の実施形態をさらに例示することを意図している。実施形態は、本明細書で提示された特定の実施形態の詳細な記述との組み合わせで、1つ以上のこれらの図面を参照することによってより理解され得る。

Best Mode for Carrying out the Invention

[0022]
以下のセクションにて、いくつかの方法が、本発明の様々な実施形態を詳細に説明するために記述されている。様々な実施形態の実施には、本明細書で概略された特定の詳細のすべて、またはそれらのいくつかを利用する必要はなく、濃度、時間および他の特定の詳細を、日常的な実験を介して改変し得ることが当業者に対して明らかであり得る。いくつかの場合、周知の方法または組成物は、様々な実施形態の不必要な遮蔽を防ぐために、本記述には含まれていない。
[0023]
本発明の1つの実施形態において、HLA−DRに結合するヒト化マウス抗体が提供される。1つの特定の実施形態において、HLA−DRに結合するが、相当するマウス抗体と比較して免疫原性が減少した、ヒトmL243抗体が提供され得る。本実施形態にしたがって、抗体が、リンパ腫細胞のようなHLA−DR分子を発現する細胞の増殖を阻害(または細胞殺傷を誘導)し得る。あるいは、本明細書で開示されている抗体を、標的分子に結合し、細胞殺傷の可能性を増加させるために使用してもよい。抗体を含む薬学的組成物、およびHLA−DR +細胞の増殖に関連した疾患を処置する方法が提供される。
[0024]
mL243は、Lampson & Levy(J.Immunol.(1980)125 293)によってすでに記述されたモノクローナル抗体である。本抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を図1および2(それぞれまた配列番号1および2)にて示している。mL243は、アクセッション番号ATCC HB55で、American Type Culture Collection,Rockville,MDにて寄託されている。
[0025]
以下の記述において、多数の語句を使用し得、以下の定義が、本発明の理解を促進するために提供される。
[0026]
他に特定しない限り、「a」または「an」は「1つ以上」を意味する。
[0027]
本明細書において、記述「対象」は、限定はしないが、ヒト、またはたとえばイヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマまたはウシのような哺乳動物を含み得る。
[0028]
「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害」または「ADCC」は、Fcレセプターを発現する非特異的細胞傷害性細胞(ナチュラルキラー細胞、好中球およびマクロファージ)が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介反応である。ADCCを仲介するための初代細胞は、(FcDRIIIのみを発現する)ナチュラルキラー細胞および単球(FcDRI、FcDRIIおよびFcDRIIIを発現する)である。
[0029]
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系(Clq)の第一成分の、同起源抗原と複合体形成した分子(たとえば抗体)の結合によって開始される。
「Fcレセプター」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを記述するために使用される。CDCおよびADDC両方が、MAbのFc部分を必要とし、ADDCの効果が、エフェクター細胞上、FcyR(IgG Fcレセプター)に対する結合親和力の増加によって増大され得る(Shinkawa,et al.,J.Biol.Chem.278:3466−3473,2003;Shields et al.,J.Biol.Chem.211:26733−26740,2002;Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591−6604,2002;Davies et al.,Biotechnol.Bioeng.74:288−294,2001;およびUmana et al.,Nature Biotechnol.176−180,1999)。「エフェクター細胞」は、エフェクター細胞機能を実施することが可能な任意の型の細胞を指す。異なる特定化免疫機能を有するエフェクター細胞を、結合ドメインポリペプチドが特異的に結合可能である、本明細書で記述した多くの抗原のような広く種々の細胞表面抗原のそれらの異なる発現に基づいて、互いに区別可能であることが周知である。エフェクター細胞には、限定はしないが、天然に、または遺伝子工学的な改変の結果として、免疫系機能の一成分である活性を直接調節できる能力を有する細胞を含む、任意の細胞が含まれる。エフェクター細胞は、免疫グロブリン定常領域に対するレセプターとしてのような免疫グロブリンに対する細胞表面レセプターを含み、「Fcレセプター」(FcR)として一般的に参照されるレセプターのクラスを含む。ADCCを仲介可能な細胞が、エフェクター細胞の例である。他の例には、ナチュラルキラー(NK)細胞、腫瘍浸潤Tリンパ球(TIL)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびアレルギー応答機構を含む細胞のような顆粒球細胞が含まれる。エフェクター細胞はまた、骨髄性およびリンパ系系列内での種々の分化の段階にある細胞を含む造血由来の細胞に影響を与え、Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好塩基球、好酸球、マスト細胞、血小板、赤血球、およびそのような細胞の前駆体、子孫(たとえば造血幹細胞)、休眠、活性化および成熟形態のような、1つ以上の型の機能的細胞表面FcRを(必要はないが)発現し得る。他のエフェクター細胞には、免疫機能を仲介可能な非造血起源の細胞、たとえば、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、骨芽細胞、内皮細胞および他の細胞が含まれ得る。免疫エフェクター細胞にはまた、細胞傷害性または細胞増殖抑制事象、エンドサイトーシス、食細胞、または飲細胞事象を仲介する、またはアポトーシスの誘導に影響を与える、または細菌免疫または細菌感染の中和に影響を与える細胞、またはアレルギー、炎症、過敏症および/または自己免疫反応を仲介する細胞が含まれる。
[0030]
「増殖を阻害する」抗体は、インビトロおよび/またはインビボで疾患細胞の増殖を阻害するものである。疾患細胞の増殖を阻害することによって、S期の細胞の割合が減少する。本発明の抗体による増殖阻害の好ましい割合は、インビトロで約0.5μg/mL〜20μg/mLの抗体濃度で、そして約0.5mg/kg〜15mg/kgの成人患者における用量で、20%を超える、好ましくは50%を超えるものであり得る。
[0031]
本明細書において、「抗体」は、全長(すなわち天然に存在するか、正常免疫グロブリン遺伝子断片の組換えステップによって形成される)免疫グロブリン分子(たとえばIgG抗体)、または抗体断片のような、免疫学的に活性な(すなわち特異的に結合している)免疫グロブリン分子の部分を指す。語句「抗体」にはまた、「ヒト化」抗体、およびファージディスプレイ、遺伝子およびクロモソームトランスフェクション法によって、ならびに他の方法によって産出可能である完全ヒト抗体も含まれる。本語句にはまた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体)も含まれる。
[0032]
「免疫原性応答」または「抗原性応答」は、適切な細胞が化合物に接触した後に、結果としてその化合物に対する抗体を産出することである。免疫原性応答を誘発するために使用される化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。免疫原性応答にて産出された抗体は、応答を誘発するために使用した免疫原に特異的に結合する。
[0033]
免疫原性応答を誘発するために使用される化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。「エピトープ」または「抗原性決定基」は、エピトープを指向する特異的免疫応答を刺激する免疫原の表面上の領域である。タンパク質、特に変性タンパク質において、エピトープは典型的には連続アミノ酸配列によって定義され、表される。しかしながら、未変性(nondenamred)タンパク質の場合、エピトープにはまた、タンパク質のアミノ酸配列の離れた部分からのアミノ酸が互いに近い物理的接触となるような様式で、タンパク質の三次元折りたたみによって形成される活性部位のような構造も含まれる。
[0034]
天然に存在する(野生型)抗体分子は、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって互いに共有結合している2つの同一重鎖および2つの同一軽鎖からなるY型分子である。両方の型のポリペプチド鎖は、同一のクラスの抗体(すなわちIgA、IgMなど)内で変わらないか、または最小限変化した、定常領域および可変領域を有する。可変領域は、特定の抗体に対して固有であり、エピトープに対する認識要素を含む。重鎖および軽鎖両方のカルボキシ末端領域は、配列中で保存され、定常領域(またCドメインとして知られている)と呼ばれる。アミノ末端領域(またVドメインとして知られている)は配列中で変化し、抗体特異性に関連する。抗体は、そのVドメイン中に局在する6つの短い相補性決定領域(CDR)を主に介して特異的に抗原を認識し、結合する。
[0035]
抗体の各軽鎖が1つの重鎖に結合し、2つの鎖が抗原結合ドメインを構築する各鎖のアミノ末端領域から遠位である各鎖のカルボキシ末端領域中のシステイン残基間で形成されたジスルフィド架橋によって連結する。抗体分子はさらに、重鎖および軽鎖間のジスルフィド架橋が形成される局所よりも重鎖のカルボキシ末端により近い局所の、ヒンジ領域として知られている領域において、2つの重鎖間のジスルフィド架橋によってさらに安定化される。ヒンジ領域はまた、抗体の抗原結合部分に関して柔軟性を提供する。
[0036]
抗体の抗原結合特異性は、軽鎖および重鎖のアミノ末端領域に局在する可変領域によって決定可能である。軽鎖および関連した重鎖の可変領域が、特定のエピトープを認識する「抗原結合ドメイン」を形成し、したがって抗体は2つの抗原結合ドメインを有する。野生型抗体における抗原結合ドメインは、免疫原性タンパク質の同一のエピトープを指向し、したがって、単一野生型抗体は、免疫原性タンパク質の2つの分子に同時に結合可能である。したがって、野生型抗体は、単一特異性(すなわち固有の抗原を指向する)、および二価(すなわち抗原の2つの分子に結合可能である)である。
[0037]
「ポリクローナル抗体」は、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答にて産出される。したがってポリクローナル抗体の組成(たとえば血清)には、タンパク質内の同一および異なるエピトープを指向する種々の異なる抗体が含まれる。ポリクローナル抗体を産出するための方法は、当分野で公知である(たとえば、Cooper et al.,Section III of Chapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology,2nd Ed.,Ausubel et al.,eds,John Wiley and Sons,New York,1992,pages 11−37 to 11−41を参照のこと)。
[0038]
「抗ペプチド抗体」(また「単一特異性抗体」としても知られている)は、由来するタンパク質の2、3の(好ましくは1つの)単離エピトープに対応する短い(典型的には5〜20アミノ酸)免疫原性ポリペプチドに対する体液性応答中で産出される。複数の抗ペプチド抗体には、タンパク質の特定の部分に、すなわち、少なくとも1つの、好ましくはただ1つのエピトープを含むアミノ酸配列に指向する種々の異なる抗体が含まれる。抗ペプチド抗体を産出するための方法は、当分野で公知である(たとえば、Cooper et al.,Section III of Chapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology,2nd Ed.,Ausubel et al.,eds,John Wiley and Sons,New York,1992,pages 11−42 to 11−46を参照のこと)。
[0039]
「モノクローナル抗体」は、免疫原性タンパク質の単一の特異的エピトープを認識する特異的抗体である。複数のモノクローナル抗体において、各抗体分子は、他の複数の抗体と同質である。モノクローナル抗体を単離するために、特定のモノクローナル抗体を発現、提示および/または分泌するクローン細胞系がまず同定される。このクローン細胞系は、本発明の抗体を産出する1つの方法において使用可能である。クローン細胞系の作製と、それによって発現されたモノクローナル抗体の調製のための方法は、当分野で公知である(たとえば、Fuller et al.,Section II of Chapter 11 in Short Protocols in Molecular Biology,2nd Ed.,Ausubel et al.,eds,John Wiley and Sons,New York,1992,pages 11−22 to 11−36を参照のこと)。
[0040]
「裸抗体」は、毒素との、または放射性核種に結合するためのキレートとの複合体のような、さらなる改変を含まない本来の抗体分子である。裸抗体のFc部分によって、結果として細胞溶解となり得る活性の機構である補体固着およびADCC(抗体依存性細胞傷害)などのエフェクター機能が提供され得る。たとえば、Markrides,「Therapeutic inhibition of the complement system」,Pharmacol.Rev.50:59−87,1998を参照のこと。1つの実施形態において、抗体の治療活性は、Fc領域のエフェクター機能を必要とし得る(たとえば、Golay et al.,「Biologic response of B lymphoma cells to anti−CD20 monoclonal antibody rituximab インビトロ:CD55 and CD59 regulate complement−mediated cell lysis.」,Blood 95:3900−3908,2000を参照のこと)。
[0041]
他の実施形態において、Fc部分は、対象の治療的処置のために、必要ないか、もしくはいくつかの例で望まれない可能性がある。本実施形態にしたがって、アポトーシスのような他の機構が関与し得る。Vaswani and Hamilton,Humanized antibodies as potential therapeutic drugs.Ann.Allergy Asthma Immunol.81:105−119,1998。
[0042]
「抗体断片」は、F(ab’)a、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、sFvなどのような本来の抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同一の抗原に結合する。たとえば、抗CD20モノクローナル抗体断片は、CD20のエピトープに結合する。語句「抗体断片」はまた、特定の抗体に結合して複合体を形成することによって抗体のように働く、任意の合成または遺伝的に改変したタンパク質を含む。たとえば、抗体断片には、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される組換え体単一鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」、および高度可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニットのような、可変領域からなる単離断片が含まれる。
[0043]
野生型抗体の限定タンパク質分解によって産出された抗体断片は、タンパク質分解抗体断片と呼ばれる。これらには、限定はしないが、以下が含まれる。「F(ab’) 2断片(」は、抗体のタンパク質分解酵素、たとえばペプシンまたはフィシンに対する限定暴露によって抗体より放出される。F(ab’)2断片は、2つの「アーム」を含み、それぞれが、共通抗原を指向し、特異的に結合する可変領域を含む。2つのFab’分子は、重鎖のヒンジ領域中の鎖内ジスルフィド結合によって連結する。Fab’分子は、同一の(二価)または異なる(二特異性)エピトープに対して指向し得る。
[0044]
「Fab 1断片」は、Fabと、ヒンジ領域を介して、重鎖のさらなる部分を含む単一の抗結合ドメインを含む。
[0045]
「Fab’−SH断片」は典型的に、F(ab’)2断片中のH鎖間のジスルフィド結合によって互いに維持されるF(ab’)2断片から産出される。非限定例として、β−メルカプトエチルアミンのような穏やかな還元剤での処置によってジスルフィド結合が破壊され、2つのFab’断片が、1つのF(ab’) 2断片より放出される。Fab’−SH断片は一価および単一特異性である。
[0046]
「Fab断片」(すなわち、抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合によって架橋された軽鎖と重鎖の部分を含む抗体断片)が、本来の抗体のパパイン消化によって産出される。簡便な方法は、酵素が簡単に除去され、消化が終結するように樹脂上に固定したパパインを使用することである。Fab断片は、F(ab’)2断片中に存在するH鎖間にジスルフィド結合を有さない。
[0047]
「一本鎖抗体」は、抗体断片の1つの型である。語句「一本鎖抗体」はしばしば、「scFv」または「sFv」と略される。これらの抗体断片は、分子遺伝学および組換えDNA技術を用いて産出される。一本鎖抗体は、抗原結合部位を形成するために相互作用するVHおよびVLドメイン両方を含むポリペプチド鎖からなる。VHおよびVLドメインは通常、10〜25アミノ酸残基のペプチドによって連結される。
[0048]
語句「一本鎖抗体」にはさらに、限定はしないが、ジスルフィド結合によって互いに連結した(それぞれが異なるエピトープを指向し得る)2つの一本鎖抗体、異なる特異性の2つの別個のscFvがペプチドリンカーと連結した二特異的sFv、ジアボディ(第一sFvのVHドメインが、第二sFvのVLドメインとアセンブルされ、第一sFvのVLドメインが第二sFvのVHドメインとアセンブルされる時に形成される二量体化sFv。ジアボディの2つの抗原結合領域は、同一または異なるエピトープを指向し得る)、およびトリアボディー(三量体化sFv、ジアボディと同様の様式で形成される、ただし、3つの抗原結合ドメインが、一つの複合体中で作成される。3つの抗原結合ドメインは、同一または他のエピトープに指向し得る。)が含まれる。
[0049]
「相補性決定領域ペプチド」または「CDRペプチド」は、抗体断片の他の形態である。(また「最小認識ユニット」とも呼ばれる)CDRペプチドは、単一相補性決定領域(CDR)に相当するペプチドであり、対象となる抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって調製可能である。そのような遺伝子は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産出細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。たとえばLarrick et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991を参照のこと。
[0050]
「システイン改変抗体」において、システインアミノ酸が、遺伝的操作によって抗体の表面上に挿入または置換され、たとえばジスルフィド架橋を介して抗体を他の分子にコンジュゲートさせるために使用される。抗体に対するシステイン置換または挿入が記述されている(米国特許第5,219,996号を参照のこと)。抗体の部位特異的コンジュゲートにおいて使用するためにIgG抗体の定常領域内へCys残基を導入するための方法が、Stimmel et al.(J.Biol.Chem 275:330445−30450,2000)によって記述されている。
[0051]
「ヒト化抗体」は、1つの種からの抗体、たとえば齧歯類抗体からのCDR、齧歯類抗体の可変重鎖および可変軽鎖が、たとえばタンパク質工学的技術を用いてヒトの重鎖および軽鎖可変ドメインに対して変換されることにより、非ヒトタンパク質の量を減少するために使用される組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。Gussow and Seemann,「Humanization of monoclonal antibodies」,Method Enzymol.203:99−121,1991およびVaswani and Hamilton,Ann.Allergy Asthma Immunol.81:105−119,1998を参照のこと。
[0052]
<抗体断片の産出>
主張された方法および/または組成物のいくつかの実施形態が、抗体断片に関係する。そのような抗体断片は、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって入手し得る。たとえば、抗体断片を、F(ab’) 2と呼ばれる5S断片を得るためにペプシンで抗体を酵素的に開裂させることによって産出し得る。この断片をさらに、チオール還元剤および、任意にジスルフィド結合の開裂によるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して開裂して、3.5S Fab’一価断片を産出し得る。あるいは、ペプシンを用いる酵素的断片によって、2つの一価Fab断片およびFc断片が産出される。抗体断片を産出するための例示的方法は、米国特許第4,036,945号、米国特許第4,331,647号、Nisonoff et al.,1960,Arch.Biochem.Biophys.89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman et al.,1967,Methods in Enzymology,page 422(Academic Press)、およびColigan et al.,(eds.),1991,Current Protocols in Immunology,(John Wiley & Sons)にて開示されている。
[0053]
一価軽鎖重鎖断片を形成するための重鎖の分離、さらなる断片の開裂または他の酵素的、化学的または遺伝子技術のような、抗体を開裂する他の方法もまた、断片が、本来の抗体によって認識される抗原に結合する限り使用し得る。たとえば、Fv断片は、V HおよびV L鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al.,1972,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,69;2659にて記述されたような非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合、またはグルタルアルデヒドのような化学物質による架橋によって連結され得る。Sandhu,1992,Crit.Rev.Biotech,12:437を参照のこと。
[0054]
好ましくは、Fv断片は、ペプチドリンカーによって連結されるV HおよびV L鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結した、V HおよびV LドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子を、発現ベクター内に挿入し、大腸菌のような宿主細胞内に次いで導入する。組換え宿主細胞が、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。sFvsを産出するための方法が当分野で周知である。Whitlow et al.,1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:87;Bird et al.,1988,Science,242:423;米国特許第4,946,778号,Pack et al.,1993,Bio/Technology,11:1271,およびSandhu,1992,Crit.Rev.Biotech,12:437を参照のこと。
[0055]
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識ユニット」)は、対象となる抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産出細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。Larrick et al.,1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106;Ritter et al.(eds.),1995,「Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application.」pages 166−179(Cambridge University Press);Birch et al.,(eds.)1995、「Monoclonal Antibodies:Principles and Applications」,pages 137−185(Wiley−Liess,Inc.)を参照のこと。
[0056]
1つの実施形態において、ヒト化抗体を、エフェクターまたはレポーター分子に連結してもよい。たとえば、重金属原子、またはリシンのような毒素をキレートするための大員環を、共有架橋構造によってヒト化抗体に連結してもよい。あるいは、組換えDNA技術の手順を使用して完全抗体分子のFc断片、Cu3またはCn2ドメインが、酵素または毒素分子のような機能的非免疫グロブリンタンパク質によって置換、またはペプチド連結によって連結される、ヒト化抗体分子を産出してもよい。
[0057]
本発明の他の実施形態において、ヒト化抗体には、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子、Fab、Fab’、F(ab’)2またはFv断片のようなその断片、たとえば一本鎖Fv、軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマーのような一本鎖抗体断片、連結構造によって互いに結合した2,3、4以上の抗体またはその断片を含む多価一特異性抗原結合タンパク質、またはMAb mL243と同様の特異性を有する任意のこれらのまたは任意の他の分子の断片または類似体が含まれ得る。1つの特定の実施形態において、抗体には、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子が含まれ得る。
[0058]
<ヒト化L243抗体>
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域がたとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR)を含む、抗L243マウス抗体の可変領域によって置換された組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与したときに、免疫原性の減少および安定性の増加を示す。キメラ抗体を構築するための方法が当分野で周知である(たとえばLeung et al.,1994,Hybridoma 13:469)。
[0059]
キメラモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖からのマウスCDRを相当するヒト抗体の可変ドメインに移すことによってヒト化してもよい。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域(FR)はまたヒトFR配列によって置換される。ヒト化モノクローナルの安定性と抗体特異性を保存するために、1つ以上のヒトFR残基を、マウス対応物残基によって置換してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療的処置のために使用されてもよい。標的に対するヒト化抗体の親和性はまた、CDR配列の選択改変によって増加され得る(WO0029584A1)。ヒト化モノクローナル抗体の産出のための技術が、当分野において周知である(たとえばJones et al.,1986,Nature,321:522;Riechmann et al.,Nature,1988,332:323;Verhoeyen et al.,1988,Science,239:1534;Carter et al.,1992,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,89:4285、Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437;Tempest et al.,1991,Biotechnology 9:266、Singer et al.,J.Immun.,1993,150:2844を参照のこと)。
[0060]
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関係する。ヒヒにて治療的に有用な抗体を生じるための一般的技術が、たとえばGoldenberg et al.,WO91/11465(1991)およびLosman et al.,Int.J.Cancer 46:310(1990)にて見ることができる。
[0061]
他の実施形態において、抗体はヒトモノクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、抗原チャレンジに対する応答で特異的ヒト抗体を産出するために工学的に改変したトランスジェニックマウスから得る。本技術において、ヒト重および軽鎖座の要素は、内因性重鎖および軽鎖座の標的とした破壊を含む胚幹細胞株から派生したマウス株内に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成可能であり、マウスを使用して、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産出可能である。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al.,Nature Genet.7:13(1994),Lonberg et al.,Nature 368:856(1994),およびTaylor et al.,Int.Immun.6:579(1994)によって記述されている。
[0062]
1つの実施形態において、ヒト化抗体には、ヒト抗体フレームワーク配列内にmL243のCDR領域配列が含まれ、ヒト抗体定常領域配列を有し得る。より詳しくは、ヒト化抗体には、CDR1(31〜35)、CDR2(50〜65)およびCDR3(95〜102)のすべてでmL243−VH残基を含む重鎖可変ドメイン(VH)が含まれる。他の実施形態において、軽鎖可変ドメイン(VL)のCDRは、CDR1(24〜34)、CDR2(50〜56)およびCDR3(89〜97)のすべてにおいてmL243−VL残基に相当する。本発明の他の特定の実施形態において、ヒト化設計で維持される他のマウスL243−VH残基は、1つ以上の以下の位置においてである。F27、K38、K46、A68およびF91。同様に、ヒト化設計中で維持されるVL中のマウスL243残基は、1つ以上の以下の位置においてである。R37、K39、V48、F49およびG100。
[0063]
抗体配列のヒト化のためのさらなる詳細は、元の非ヒト抗体の抗原特異性を維持する一方で、たとえば、その全文章が参考により本明細書に組み込まれる、2001年11月16日に提出された、米国特許出願第09/988,013号にて開示されている。
[0064]
1つの実施形態において、本発明はさらに、サブグループIのヒト重鎖に由来するアクセプターフレームワークと、フレームワークが1つ以上の位置F27、K38、K46、A68およびF91にてmL243ドナー残基を含むmL243に由来する抗原結合領域を含む、可変領域ドメインを有するCDR移植ヒト抗体重鎖を提供する。それぞれ図3および4を参照のこと。
[0065]
本発明の1つの実施形態において、CDA移植ヒト化抗体軽鎖がサブグループIのヒトκ軽鎖に由来するアクセプターフレームワークと、フレームワークが1つ以上の位置R37、K39、V48、F49およびG100にてmL243ドナー残基を含む、mL243ドナー抗原結合領域を含む、可変領域ドメインを含むことを提供し得る。
[0066]
本発明の実施形態のCDR移植ヒト化抗体分子において、残りの非L243免疫グロブリン由来(アクセプター)部分は、ヒト化抗体がHLA−DRに特異的に結合する能力を維持するように折りたたまれ得るという条件で、任意の好適なヒト免疫グロブリンに由来し得る。好ましくは、使用されたヒトフレームワーク(FR)の型は、ドナー抗体と同様/類似のクラス/型である。
[0067]
本発明の1つの実施形態において、ヒトフレームワークは、特にCDRに空間的に近いか隣接する位置でドナー抗体配列との相同性を最大化するように選択し得る。本実施形態にしたがって、ヒト化L243−VHまたはVLのフレームワーク(すなわちFR1−4)は、ヒト抗体の組み合わせに由来し得る。CDR移植抗体を構築するために使用し得るヒトフレームワークの例は、LAY、POM、TUR、TEI、KOL、NEWM、REI、RFおよびEUであり、好ましくは、RF−TS3 FR1−3およびNEWM FR4を重鎖のために使用し、REI FR1−4を軽鎖のために使用する。本明細書で使用するVドメイン残基番号付けシステムが、Kabat et al.,(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,5th Edition,United States Department of Health and Human Servicesに記述されている。ヒトRF−TS3(FR1−3およびNEWM FR4)、mL243およびhL243 VH鎖の比較アミノ酸配列アライメントに関して、図5を参照のこと。ヒトREI、mL243およびhL243 VL鎖の比較アミノ酸配列アライメントに関して、図6を参照のこと。
[0068]
ヒト化抗体分子の軽鎖および重鎖可変ドメインを、適切にヒト軽鎖または重鎖定常ドメインに融合し得る(語句「重鎖定常ドメイン」は、他に特定しない限りヒンジ領域を含む)。ヒト化抗体分子のヒト定常ドメインは、存在するならば、抗体の予定された機能にしたがって選択されてもよい。1つの実施形態において、ヒト定常ドメインは、エフェクター機能の欠如に基づいて選択され得る。重鎖可変領域に融合した重鎖定常ドメインは、ヒトIgA(a1またはa2鎖)、IgG(71、72、j3>またはy4鎖)またはIgM(u鎖)のものであり得る。好ましくは、ヒトy鎖が使用される。軽鎖可変領域に融合され得る軽鎖定常ドメインには、ヒトλおよびκ鎖が含まれる。
[0069]
本発明の1つの特定の実施形態において、y1鎖を使用する。本発明のまた他の特定の実施形態において、γ4鎖が使用される。y4鎖の利用は、いくつかの場合で、hL243の対象中での耐性を増加し得る(副作用および注入反応の減少、より大きな耐性など)。
[0070]
1つの実施形態において、ヒト定常ドメインの類似体を使用し得る。これらには限定はしないが、相当するヒトドメイン以外の1つ以上の追加アミノ酸を含む定常ドメイン、または1つ以上のアミノ酸が欠損または変更された定常ドメインが含まれる。そのようなドメインは、たとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって得てもよい。
[0071]
本明細書において、抗体の補体を固定する能力に関連して使用される語句「変化した」は、元の非変化抗体と比較して補体を固定する抗体の能力が減少することを示唆する。適切なアミノ酸を変化させることにより、補体を固定する抗体の能力が変化する。本明細書において、語句、補体固定化を「本質的に(substantially)」減少させるは、ヒト補体固定化が好ましくは、野生型抗体で見られるレベルの30%以下、より好ましくは20%以下、最も好ましくは10%以下であることを示している。
[0072]
変化した補体固定化能力は、たとえば残基の削除、分子中の好適な部分での糖付加部位の挿入、または異なるイソタイプの抗体のより低いヒンジ領域の変換のような、当分野で周知の技術によって産出し得る。
[0073]
<HL243抗体をコードする遺伝子の調製>
当分野で公知の分子生物学の任意の標的技術を、本発明にしたがって抗体をコードするDNA配列を調製するために使用し得る。たとえば、DNA配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合成してもよい。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を適切に使用し得る。好適なステップには、たとえば「PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification」(1989),Ed.H.A.Erlich,Stockholm Pfress,N.Y.,Londonにて記述されたようなPCR鎖重複手順およびPCR変異誘発、およびオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発(Kramer et al.,Nucleic.Acid.Res.12 9441(1984))が含まれる。
[0074]
分子生物学の任意の標準技術をまた、CDR移植産物をコードするDNA配列を調製するために使用し得る。たとえば、DNA配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合成し得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を適切に使用してもよい。オリゴヌクレオチド特異的合成(Jones et al(1986)Nature 321 522−525)および先に存在している可変ドメイン領域のオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発(Verhoeyen et al(1988)Science 23 1534−1536)を使用してもよい。T4−DNAポリメラーゼを用いるギャップオリゴヌクレオチドの酵素的埋め(Queen et al(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 10029−10033)をまた使用してもよい。任意の好適な宿主細胞/発現ベクターシステムを、キメラまたはCDR移植重鎖および軽鎖をコードするDNA配列の発現のために使用してもよい。「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターいずれかを含む任意の真核または原核細胞であり得る。本語句にはまた、宿主細胞または細胞のクロモソームまたはゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝し工学的に改変した原核または真核細胞、ならびにトランスジェニック動物が含まれる。たとえば大腸菌のような細菌、および他の微生物システムを、特に抗原断片、たとえばFv、FabおよびFab’断片、および一本鎖抗体断片、たとえば一本鎖Fvsの発現のために有利に使用し得る。真核宿主、たとえば哺乳動物細胞発現システムはまた、本発明にしたがって、特に、より大きなキメラまたはCDR−移植抗体産物の産出のための抗体を得るために使用されてもよい。好適な哺乳動物宿主細胞には、Sp2/0およびNSO細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ハイブリドーマ細胞株、および抗体を発現するために有用な他の哺乳動物細胞が含まれる。
[0075]
本明細書において、「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現する対象となる遺伝子を含むDNA分子である。典型的には、遺伝子発現は、構造的または誘導可能プロモーター、組織特異的制御要素およびエンハンサーを含む特定の調節要素の制御下におかれる。そのような遺伝子は、調節要素「に動作可能に連結され」ていると言われる。さらなる態様にて、1つの実施形態には、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列、これらのDNA配列を含むクローニングおよび発現ベクター、これらのDNA配列で形質導入した宿主細胞、形質導入宿主細胞中でのこれらのDNA配列の発現を含む、重鎖または軽鎖および抗体分子を産出するためのステップも含まれる。
[0076]
ヒト免疫グロブリン配列をコードするDNAを、当分野で公知の任意の方法によって得てもよい。たとえば、−LAY、POM、KOL、REI、EU、TUR、TEI、RFおよびNEWMのような、好ましいヒトアクセプター・フレームワークのアミノ酸配列が広く利用可能である。同様に、ヒト軽鎖および重鎖サブグループのコンセンサス配列もまた利用可能である。当業者は、複数のコドン配列が同一のアミノ酸をコードできること、および種々の実施形態にて、開示核酸配列が、アミノ酸の同一配列をコードする異なる配列で置換し得ることを理解する。当業者はまた、核酸配列からタンパク質を発現するために使用した細胞株に対する由来の種に依存して、コドン使用頻度を選択した種での発現を増強するために最適化してもよいことを理解する。そのような種の好ましいコドン頻度が当分野で周知である。
[0077]
1つの実施形態において、本明細書で開示される抗体は、完全抗体、または以上で説明したように、その断片、モノマーまたはダイマーまたは多価単一特異性抗原結合タンパク質であってもよい。したがって、さらに本発明の1つの態様に対して、多価単一特異性抗原結合タンパク質が、連結構造によって互いに結合した、2、3、4以上の抗体断片を含み、タンパク質が天然の免疫グロブリンではなく、前記抗体または断片のそれぞれが、マウスMAbであるL243によって認識されたエピトープに対して特異性を有し、前記抗原結合タンパク質が任意にエフェクターまたはレポーター分子とコンジュゲートするように提供され得る。
[0078]
これらの実施形態にしたがって、それぞれの抗体または断片は、以上で定義したような、ヒト化抗体またはその断片であり得、多価単一特異性抗原結合タンパク質は、ヒト化多価単一特異性抗原結合タンパク質であり得る。しかしながら、非ヒト化、たとえばマウス、多価単一特異性抗原結合タンパク質が意図されてもよく、実施形態が適用可能なところでこれらに拡大され得る。
[0079]
1つの特定の実施形態において、多価抗原結合タンパク質が、連結構造によって互いに結合した、2、3または4つの抗体またはその断片を提供し得る。他の実施形態において、ヒト化抗体を産出するためのステップには、i)可変ドメインのCDRの少なくとも1つがmL243−MAbに由来することができ、抗体鎖の残りの非免疫グロブリン由来部分が、ヒト免疫グロブリンに由来する可変ドメインを含む抗体重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を、発現ベクター中に作製するステップと、ii)可変ドメインのCDRの少なくとも1つがmL243−MAbに由来し、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分がヒト免疫グロブリンに由来する可変ドメインを含む相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を、発現ベクター中に作製するステップと、iii)上記DNA配列を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、iv)トランスフェクト細胞株を培養して、ヒト化抗体分子を産出するステップとが含まれる。
[0080]
<宿主細胞内での組換えhL243の産出>
1つの実施形態において、組換えhL243を産出するために使用した宿主細胞株を2つのベクターでトランスフェクトしてもよく、第一ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするDNA配列を含み、第二ベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードするDNA配列を含む。好ましくは、ベクターは、コード配列および選別可能マーカーが連結している限りを除いて同一であり、それによって、各ポリペプチド鎖が等しく発現される可能性が確保される。トランスフェクションは、当業者に公知の任意の技術によって実施され得る。たとえばManiatis et al(1982)(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,New York)およびPrimrose and Old(1980)(Principles of Gene Manipulation,Blackwell,Oxford)を参照のこと。トランスフェクションのための1つの特定の技術は、エレクトロポレーションであり得る。他の例には、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、カチオン脂質仲介トランスフェクションなどが含まれる。1つの他の実施形態において、単一ベクターを使用してもよく、ベクターには、軽鎖および重鎖由来ポリペプチド両方をコードするDNA配列、および選別可能マーカーが含まれる。
[0081]
<抗体断片を含む組換え融合タンパク質の産出のための一般的方法>
特定のエピトープを認識する抗体断片をコードする核酸配列を、当分野で周知の技術によって得ることが可能である。たとえば、所望の特異性の抗体を分泌しているハイブリドーマを使用して、たとえばPCRによって、または伝統的なcDNAクローニング技術によって公知の技術を用いて調製可能である抗体をコードするDNAを得ることができる。あるいは、Fab’発現ライブラリーまたは抗体ファージディスプレイライブラリーを所望の特異性を有する抗体断片に対してスクリーニングするために構築可能である。
[0082]
次いで抗体断片をコードする核酸を、直接、またはペプチドスペーサーをコードする配列を介して、DDDまたはADいずれかをコードする核酸に連結可能である。これらの型の融合タンパク質をコードする核酸配列を産出する方法が、当分野で周知であり、以下の実施例でさらに議論されている。
[0083]
他の実施形態において、追加アミノ酸残基を、A/DDDまたはE/ADからなるモジュラーサブユニットのNまたはC末端いずれかに加えてもよく、実際の融合部位は、DDDまたはADがNまたはC末端へ(または内部部位にて)連結するかどうかに依存し得る。追加アミノ酸残基には、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素(たとえばプロドラッグ活性化酵素)、ホルモン、毒素、ペプチド薬物、膜相互作用ペプチド、または他の機能的タンパク質が含まれ得る。
[0084]
タンパク質またはペプチドを、従来の技術にしたがって、全体でまたは部分的に溶液内または固体支持体上で合成してもよい。種々の自動合成器が市販されており、公知のプロトコールにしたがって使用可能である。たとえば、Stewart and Young,(1984,Solid Phase Peptide Synthesis,2d.ed.,Pierce Chemical Co.);Tam et al.,(1983,J.Am.Chem.Soc.,105:6442);Merrifield,(1986,Science,232:341−347);およびBarany and Merrifield(1979,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds.,Academic Press,New York,pp.1−284)を参照のこと。通常約6から約35〜50アミノ酸の短いペプチド配列がそのような方法によって簡単に合成可能である。あるいは、対象となるペプチドをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質導入またはトランスフェクトし、発現に好適な条件下で培養する組換えDNA技術を利用してもよい。
[0085]
所望の宿主細胞中で、組換えタンパク質を産出するための方法が、当分野で周知である。精製を促進するために、安定連結構造がFLAG配列またはポリHIS配列のような好適なペプチドタグを含んでよく、関連するアフィニティカラムでのそれらの精製を促進する。
[0086]
1つの実施形態において、Fv断片には、ペプチドリンカーによって連結したV HおよびV L鎖が含まれ得る。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結した、V HおよびV LドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製する。構造遺伝子を発現ベクター内に挿入し、次いで大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞が、2つのVドメインを架橋しているリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。sFvsを産出するために方法が当分野で周知である。Whitlow et al.,1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:97;Bird et al.,1988,Science,242:423;米国特許第4,046,778号;Pack et al.,1993,Bio/Technology,11:1271,およびSandhu,1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437を参照のこと。
[0087]
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識ユニット」)は、対象となる抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産出細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製する。Larrick et al.,1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106,Ritter et al.(eds.),1995,Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,pages 166−179(Cambridge University Press);Birch et al.,(eds.),1995,Monoclonal Antibodies Principles and Applications,pages 137−185(Wiley−Liss,Inc.)を参照のこと。
[0088]
安定連結構造の構成サブユニットの発現のために好適な宿主細胞または細胞株が、当業者に公知である。ヒト宿主細胞の使用によって、任意の発現した分子をヒト糖鎖修飾パターンで改変可能である。しかしながら、ヒト宿主細胞が開示方法のために必須または好ましいという示唆は存在しない。
[0089]
<二重特異性抗体およびコンジュゲート体>
特定の実施形態において、本明細書で開示したL243リガンドをリガンドに連結した他の分子との組み合わせで使用してもよい。連結は、共有または非共有いずれかであってもよい。いくつかの実施形態において、L243リガンドを、二重特異性抗体、すなわち2つの異なる結合部位、1つはL243リガンドに対して、他は疾患関連標的抗原に対して、を有する抗体に連結してもよい。限定はしないが、原発がん、転移がん、新生物、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、腫瘍組織の形成および発達、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、心筋血管新生、プラーク新血管形成、再狭窄、血管外傷後の内膜新生、毛細血管拡張症、血友病関節、血管線維腫、慢性炎症に関連した線維症、肺線維症、深部静脈血栓症および創部肉芽形成を含む、血管新生、がん、転移または細胞運動性に関連する任意の疾患または状態を標的とし得る。二特異性および多重特異性抗体の構築および使用のための方法が、たとえば、すべての文章が参考により本明細書に組み込まれる、2004年11月2日に出願された米国特許出願第20050002945号で開示されている。
[0090]
二重特異性抗体が、部分的に腫瘍関連抗原を標的化する場合、任意の型の腫瘍および任意の型の腫瘍抗原を標的化し得ることが見込まれる。標的化し得る腫瘍の例示的型には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、胆管がん、乳がん、子宮がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、甲状腺髄様、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、グリオーマ、メラノーマ、肝がん、前立腺がんおよび膀胱がんが含まれる。好ましくは、L243の構造的発現を有する、またはL243を産出するために刺激可能な腫瘍である。
[0091]
種々の組換え法を使用して、二重特異性抗体および抗体断片を産出可能である。たとえば、二重特異性抗体および抗体断片を、トランスジェニック家畜の乳中で産出可能である(たとえば、参考により本明細書に組み込まれる、Colman,A.,Biochem.Soc.Symp.,63:141−147,1998;米国特許第5,827,690号を参照のこと)。2つのDNA構造物を、それぞれ、対になる免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするDNA区画を含むように調製する。断片を、哺乳動物上皮細胞中で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクター内にクローン化する。例としては、制限はしないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子からのプロモーターが含まれる。好ましくは、挿入断片が、哺乳動物特異的遺伝子からの同種ゲノム配列によってその3’側上で隣接する。これによって、ポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。発現カセットを、受精した哺乳動物卵の前核内に共注入し、次いでこれをレシピエントメスの子宮内に移植し、妊娠させる。誕生後、子孫をサザン解析によって両方のトランスジーンの存在に関して選別する。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖遺伝子両方が、同一の細胞内で同時に発現すべきである。トランスジェニックメスからの乳を、当分野で公知の標準の免疫学的方法を用いて抗体または抗体断片の存在および機能性に関して解析する。抗体を、当分野で公知の標準の方法を用いて乳より精製可能である。
[0092]
<プレ標的化>
二重特異性抗体の使用のための1つの戦略にはプレ標的化法が含まれ、そこでは、抗血管新生または抗腫瘍リガンドのようなエフェクター分子を、二重特異性抗体を投与した後に対象に投与する。L243リガンドに対する結合部位、および疾患組織に対する結合部位を含み得る二重特異性抗体が疾患組織に局在化し、エフェクターL243リガンドの疾患組織への局在化の特異性を増加させる(米国特許出願第20050002945号)。エフェクター分子が、二重特異性抗体よりも非常に迅速に循環より消えるので、正常組織は、エフェクター分子が直接疾患標的化抗体に連結する時よりもプレ標的化戦術を使用したときに、エフェクター分子への暴露が減少し得る。
プレ標的化方法は、検出または治療薬剤の標的:バックグラウンド比を増加させるように発展してきた。プレ標的化およびビオチン/アビジンアプローチの例が、たとえば、すべてが参考により本明細書に組み込まれる、Goodwin et al.,米国特許第4,863,713号、Goodwin et al.,J.Nucl.Med.29:226,1998;Hnatowich et al.,J.Nucl.Med.28:1294,1987;Oehr et al.,J.Nucl.Med.29:728,1988;Klibanov et al.,J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn et al.,J.Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos et al.,J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter et al.,Int.J.Cancer 48:167,1991;Paganelli et al.,Cancer Res.51:5960,1991;Paganelli et al.,Nucl.Med.Commun.12:211,1991;米国特許第5,256,395号、Stickney et al.,Cancer Res.51:6650,1991,Yuan et al.,Cancer Res.51:3119,1991;米国特許第6,077,499号、米国特許第09/597,580号、米国特許第10/361,026号、米国特許第09/337,756号、米国特許第09/823,746号、米国特許第10/116,116号、米国特許第09/382,186号、米国特許第10/150,654号、米国特許第6,090,381号、米国特許第6,472,511号、米国特許第10/114,315号、米国仮出願第60/386,411号、米国仮出願第60/345,641号、米国仮出願第60/3328,835号、米国仮出願第60/426,379号、米国特許第09/823,746号、米国特許第09/337,756号および米国仮出願第60/342,103号にて記述されている。
[0093]
特定の実施形態において、二重特異性抗体および標的化可能構造物は、たとえば、それぞれ参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,126,916号、第6,077,499号、第6,010,680号、第5,776,095号、第5,776,094号、第5,776,093号、第5,772,981号、第5,753,206号、第5,746,996号、第5,697,902号、第5,328,679号、第5,128,119号、第5,101,827号および第4,735,210号にて記述された方法を用いて、正常または疾患組織および器官の処置および/またはイメージングで使用され得る。さらなる方法が、1999年6月22日に出願された米国特許第09/337,756号および2001年4月3日に出願された米国特許第09/823,746号にて記述されている。
[0094]
<hL243の治療的および診断的使用>
他の実施形態において、本発明はまた、本発明の実施形態の抗体を含む治療的および診断的組成物を提供する。そのような組成物には、たとえばインビボ使用のために、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液または担体と一緒に、本発明にしたがった抗体を含んでよい。
[0095]
「治療薬剤」は、抗体部分と別々に、同時にまたは連続して投与される、または抗体部分、すなわち抗体または抗体断片またはサブ断片にコンジュゲートした、疾患の処置において有用である分子または原子である。治療薬剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、キレート、ボロン化合物、光学活性薬剤または色素および放射性同位体が含まれる。
[0096]
「診断/検出薬剤」は、抗体部分、すなわち、抗体または抗体断片、またはサブ断片に連結またはコンジュゲートして投与され、抗原を含む細胞を局在化することによって疾患を診断または検出することにおいて有用である分子または原子である。有用な診断/検出薬剤には、限定はしないが、放射性同位体、(ビオチン−ストレプトアビジン複合体とのような)色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴映像法(MRI)のための増強薬剤(たとえば常磁体イオン)、および超音波イメージングのために使用する薬剤の例として粒子またはリポソームが含まれる。超音波増強薬剤は、米国特許第US20040219203 A1号およびUS20050014207A1号にて開示されており、したがって、参考により、そのすべてが組み込まれている。好ましくは、気体封入リポソームである。Maresca,G.et al.,Eur.J.Radiol.Suppl 2 S171−178(1998);Demos,Sm.Et al.J.Drug Target 5 507−518(1998);およびUnger,E.et al.,Am J.Cardiol.81 58G−61G(1998)を参照のこと。あるいは、二重特異性抗体を使用して、リポソームを標的化し得る。そのような1つの実施形態において、リポソームは、リポソーム脂質膜の外側表面に共有結合した二価DTPAペプチドとの気体充填リポソームである。米国特許第US20040018557A1号がそのようなリポソームを開示しており、そのすべてが参考により組み込まれる。
[0097]
米国特許第6,331,175号は、MRI技術、およびMRI増強薬剤にコンジュゲートした抗体の調製を記述しており、参考によりその全体が組み込まれている。1つの特定の方法において、診断/検出薬剤は、放射性同位体、磁気共鳴映像法における使用のための増強薬剤、超音波薬剤および蛍光化合物からなる群より選択してもよい。抗体成分を、放射活性金属または常磁体イオンとロードするために、イオンに結合するために多数のキレート基に連結する長い尾部を有する試薬と反応させる必要があり得る。そのような尾部は、ポリリシン、ポリサッカライドのようなポリマー、またはたとえばエチレンジアミンエテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、および本目的のために有用であると知られている類似の基のようなキレート基に結合可能であるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導可能な鎖であり得る。キレートは、標準の化学反応を用いて抗体に結合可能である。キレートを、免疫反応性の最小欠損、および最小凝集および/または内部架橋により分子に対する結合を形成可能にする基によって抗体に連結し得る。他の、より通常ではないが、キレートを抗体にコンジュゲートさせるための方法および試薬については、以下の開示が、参考によりそのすべてが本明細書に組み込まれる、Hawthorneに付与された、1989年4月25日に刊行された、「Antibody Conjugates」という名称の米国特許第4,824,659号にて開示されている。他の特定の実施形態において、有用な金属−キレート組み合わせには、放射イメージングのための、 125I、 131I、 123I、 124I、 62Cu、 MCu、 18F、 inIn、 67Ga、 68Ga、 nnnTc、 94mTc、 HC、 13N、 15O、 76Br、 97Zrのような、一般的に、60〜4,000KeVのエネルギー範囲である診断アイソトープとともに使用する、2−ベンジル−DTPAおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ得る。マグネシウム、鉄およびガドリニウムのような非放射活性金属と複合体形成した場合、同様のキレートが、本明細書で開示した任意の抗体と一緒に使用した場合に、MRIのために有用であり得る。NOTA、DOTAおよびTETAのような巨大環状キレートが、種々の金属および放射金属と、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに使用される。そのような金属キレート複合体は、環のサイズを対象となる金属にあわせて調整することによって安定化可能である。RAITのための 223Raのような、核種を安定に結合させることを関心対象とした巨大環状ポリエーテルのような他の環の型のキレートが、本明細書における実施形態によって意図される。
[0098]
治療薬剤の例には、限定はしないが、抗体、抗体断片、化学療法薬、毒素、酵素、酵素阻害剤、ヌクレアーゼ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節物、サイトカイン、キレーター、ボロン化合物、ウラニウム原子、光学活性薬剤および放射性核種を含む薬物が含まれる。
[0099]
有用な診断/検出薬剤には、限定はしないが、放射性同位体、(ビオチン−ストレプトアビジン複合体と一緒のような)色素、放射線不透過性物質(たとえばヨウ素、バリウム、ガリウムおよびタリウム化合物など)、造影剤、磁気共鳴映像法(MRI)のための蛍光化合物または分子および増強剤(たとえば常磁体イオン)が含まれる。米国特許第6,331,175号は、MRI技術、およびMRI増強剤にコンジュゲートした抗体の調製を記述しており、参考によりその全体に組み込まれている。好ましくは、診断/検出薬剤は、核イメージング、手術中および内視鏡的検出のための放射性同位体、磁気共鳴映像法、または超音波検査での使用のための増強薬剤、X線およびコンピュータ断層撮影法のための放射線不透過性および造影剤、および内視鏡蛍光板透視を含む蛍光版透視のための蛍光化合物からなる群より選択される。
[0100]
本開示の目的のための化学療法薬には、すべての公知の化学療法薬が含まれる。公知の化学療法薬には、限定はしないが、タキサン類、窒素マスタード類、エチレンイミン誘導体類、スルホン酸アルキル類、ニトロソウレア類、トリアゼン類、葉酸類似体類、ピリミジン類似体類、プリン類似体類、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、転写因子のアンタゴニストまたは阻害剤、干渉RNA、アルカロイド類、抗生物質類、酵素類、白金配位錯体類、COX−2阻害剤類、アポトーシス薬剤類、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体類、アドレノコルチコ抑制剤類、またはアンタゴニスト類が含まれる。より特定の実施形態において、化学療法薬には、ステロイド類、プロゲスチン類、エストロゲン類、アンチエストロゲン類またはアンドロゲン類が含まれ得る。他の特定の実施形態において、化学療法薬には、アクチノマイシン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−1、ブスルファン、カルムスチン、セレブレックス(Celebrex)、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン(CPT−11)、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、L−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミタラマイシン、マイトマイシン、マイトタン、オキサリプラチン、フェニルブチラート、プレドニゾン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、セムスチンストレプトゾシン、SN−38、タモキシフェン、タキサン類、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、ビノレルビンまたはビンクリスチンが含まれ得る。
[0101]
いくつかの好適な化学療法薬が、Remington’s Pharmaceutical Sciences 19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)にて記述されている。実験的薬物のような、他の好適な化学療法薬が当業者に公知である。
[0102]
本発明の1つの実施形態において、毒素には、限定はしないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシンA、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、または緑膿菌内毒素が含まれ得る。
[0103]
本発明の1つの実施形態において、酵素がまた有用な治療薬剤であり、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ストレプトコッカスヌクレアーゼ、デルタ−V−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、a−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、p−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む群より選択してもよい。
[0104]
本明細書において、語句「免疫調節物(immunomodulator)」には、サイトカイン類、幹細胞増殖因子類、腫瘍壊死因子(TNF)のようなリンホトキシン類、およびインターロイキン類(たとえばインターロイキン−1(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18およびIL−21)のような造血性因子類、コロニー刺激因子類(たとえば顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF))、インターフェロン類(たとえばインターフェロン−α、−βおよび−γ)、「S1因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、およびエリスロポエチンおよびトロンボポエチンが含まれる。好適な免疫調節物部分の例には、IL−2、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18、IL−21、インターフェロン−γ、TNF−αなどが含まれる。あるいは、対象に本発明の組成物、および本明細書で開示された組成物の投与前、一緒または後に投与可能な別に投与したサイトカインを与えることが可能である。本発明の実施形態には、免疫調節物にコンジュゲートした組成物が含まれ得る。
[0105]
本開示物の目的のために、サイトカインには、限定はしないが、IL−1、IL−2、IL−3、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18、IL−21、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γを含む任意のサイトカインが含まれる。GM−CSF、G−CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチンなどのようなコロニー刺激因子でもあってもよい。
[0106]
さらに、キレーターには限定はしないが、DTPA、DOTA、TETAまたはNOTA、または蛍光分子のような検出可能標識、または重金属または放射性核種のような細胞傷害性薬剤をコンジュゲートさせることが可能な好適なペプチドが含まれ得る。たとえば、治療的に有用な免疫コンジュゲート体を、光学活性薬剤または色素を抗体組成物にコンジュゲートさせることによって得ることができる。フルオロクロムのような蛍光組成物、および他の色素原、可視光に感受性のポルフィリンのような色素を使用して、好適な光を損傷に指向させることによって、損傷を検出し、処置されることが、本明細書で意図されている。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている(Jori et al.(eds.),「Photodynamic Therapy of Tumors and Other Disease」(Libreria Progetto,1985)、van den Bergh,Chem.Britain 22:430,1986)。さらに、光学治療を達成するために、光学活性化色素とコンジュゲートしたモノクローナル抗体を、本明細書の診断または治療目的で使用し得ることが意図される。Mew et al.,J.Immunol.130:1473,1983,idem.,Cancer Res.45:4380,1985,Oseroff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8744,1986,idem.,Photochem.Photobiol.46:83,1987,Hasan et al.,Prog.Clin.Biol.Res.288:471,1989,Tatsuta et al.,Lasers Surg.Med.9:422,1989,Pelegrin et al.,Cancer 67:2529,1991。しかしながら、これらの早期の研究には、特に、抗体断片またはサブ断片の使用と一緒の、内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。したがって、1つの実施形態で本明細書で意図されるのは、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用である。したがって、本治療的方法には、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が含まれ得る。検出および治療の内視鏡的方法は、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,932,412号、第5,525,338号、第5,716,595号、第5,736,119号、第5,922,302号、第6,096,289号および第6,387,350号にて記述されている。
[0107]
本発明の1つの実施形態において、核種を使用してもよい。1つの特定の実施形態において、それぞれインジウム−111またはイットリウム−90のような有用な診断または治療特性を有する放射性核種が本明細書で意図される。他の有用な核種には、限定はしないが、F−18、P−32、Sc−47、Cu−62、Cu−64、Ca−67、Ga−67、Ga−68、Y−86、Y−90、Zr−89、Tc−99m、Pd−109、Ag−111、In−111、I−123、I−125、I−131、Sm−153、Gd−155、Gd−157、Tb−161、Lu−177、Re−186、Re−188、Pt−197、Pb−212、Bi−212、Bi−213、Ra−223、Ac−225、As−72、As−77、At−211、Au−198、Au−199、Bi−212、Br−75、Br−76B、C−11、Co−55Co、Dy−166、Er−169、F−18、Fe−52、Fe−59、Ga−67、Ga−68、Gd−154−158、Ho−166、1−120、1−121、1−124、In−110、In−111、M194、Lu−177、Mn−51、Mn−52、Mo−99、N−13、O−15P−32、P−33、Pb−211、Pb−212、Pd−109、Pm−149、Pr−142、Pr−143、Rb−82、Re−189、Rh−105、Sc−47、Se−75、Sr−83、Sr−89、Tb−161、Tc−94、Tc−99、Y−86、Y−90またはZr−89が含まれる。たとえば、好適な診断放射性核種には、限定はしないが、In−110、In−111、Lu−177、F−18、Fe−52、Cu−62、Cu−64、Cu−67、Ga−67、Ga−68、Y−86、Zr−89、Tc−94m、Tc−94、Tc−99m、I−120、I−123、I−124、I−125、I−131、Gd−154−158、P−32、C−11、N−13、O−15、Re−186、Re−188、Mn−51、Mn−52m、Co−55、As−72、Br−75、Br−76、Rb−82m、Zr−89およびSr−83が含まれる。典型的な診断放射性核種は、25〜10,000keVの間を有する粒子および/またはポジトロンを放射する。
[0108]
さらに、好適な治療放射性核種には、限定はしないが、In−111、Lu−177、Bi−212、Bi−213、At−211、Cu−62、Cu−64、Cu−67、Y−90、1−125、1−131、P−32、P−33、Sc−47、Ag−111、Ga−67、Pr−142、Sm−153、Tb−161、Dy−166、Ho−166、Re−186、Re−188、Re−189、Pb−212、Ra−223、Ac−225、Fe−59、Se−75、As−77、Sr−89、Mo−99、Rh−105、Pd−109、Pr−143、Pm−149、Er−169、Ir−194、Au−198、Au−199、Ac−225およびPb−211が含まれる。典型的な治療カチオンは、20〜10,000keVの間を有する粒子および/またはポジトロンを放射する。
[0109]
有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは好ましくは20〜5,000keV、より好ましくは100〜4,000keV、最も好ましくは500〜2,500keVである。また、Auger−放射粒子をともなって本質的に崩壊する放射性核種が好ましい。たとえば、Co−58、Ga−67、Br−80m、Tc−99m、Rh−103m、Pt−109、In−111、Sb−119、1−125、Ho−161、Os−189mおよびIr−192。有用なAuger粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは1,000keV未満、より好ましくは100keV未満、最も好ましくは70keV未満である。α粒子の発生をともなって本質的に崩壊する放射性核種が好ましい。そのような放射性核種には、限定はしないが、Dy−152、At−211、Bi−212、Ra−223、Rn−219、Po−215、Bi−211、Ac−225、Fr−221、At−217、Bi−213およびFm−255が含まれる。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは2,000〜10,000keV、より好ましくは3,000〜8,000keV、および最も好ましくは4,000〜7,000keVである。
[0110]
他の有用な治療薬剤には、光線力学療法の一部である金属、中性子捕獲手順に基づく治療で価値のある核種が含まれる。特に、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、ルテチウムおよびパラジウムが光線力学療法のために有用であり、B−10、Gd−157およびU−235がニュートロン捕獲治療のために有用である。
[0111]
1つの実施形態において、金属は磁気共鳴映像法技術のためのものを含む診断薬剤として利用してもよい。これらの金属には、限定はないが、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが含まれる。放射活性金属または常磁体イオンで抗体成分をロードするために、イオンを結合させるための多数のキレート基を接着させる長い尾部を有する試薬と反応させる必要があり得る。たとえば、そのような尾部は、ポリリシン、ポリサッカライドのようなポリマー、またはたとえば、エチレンジアミンエテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、および本目的のために有用であると知られている類似の基のようなキレート基に結合可能であるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導可能な鎖であり得る。さらに、キレートを、標準化学反応を用いてペプチド抗原にコンジュゲートし得る。キレートは、免疫活性の欠損が最小であり、凝集が最小であり、および/または内部架橋が最小である分子に対する結合の形成を発生させる基によって抗体に連結可能である。他の、抗体にキレートをコンジュゲートさせる方法および試薬については、以下の開示が、参考により、そのすべてが本明細書に組み込まれる、Hawthorneに付与された、1989年4月25日に刊行された、「Antibody Conjugates」という名称の米国特許第4,824,659号にて開示されている。1つの特定の実施形態において、有用な金属−キレートの組み合わせには、限定はしないが、20〜2,000keVの一般的エネルギー範囲での診断アイソトープと一緒に使用される2−ベンジル−DTPAおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ得る。マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化した場合の同様のキレートが、本明細書で開示された実施形態の抗体と一緒に使用した場合に、MRIにとって有用である。NOTA、DOTAおよびTETAのような巨大環状キレートが、種々の金属および放射性金属、最も詳しくはそれぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と一緒に利用され得る。そのような金属−キレート錯体は、環のサイズを対象となる金属にあわせて調整することによって強く安定化できる。RAITのための 223Raのような、核種を安定に結合させるために関心対象である巨大環状ポリエーテルのような他の環の型のキレートが、本明細書における実施形態によって意図される。
[0112]
本発明の1つの実施形態において、治療的に有用な免疫コンジュゲート体が、光学活性薬剤または色素を抗体組成にコンジュゲートさせることによって得られ得る。蛍光および他の色素原、可視光に感受性なポルフィリン類のような色素を使用して、好適な光を損傷に指向させることによって損傷を検出および処置してきた。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている(Jori et al.,eds.,「Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases」(Libreria Progetto,1985),van den Bergh,Chem.Britain 22:430,1986)。さらに、モノクローナル抗体は、光学治療を達成するために光学活性化色素と結合された。Mew et al.,J.Immunol.130:1473,1983,idem.,Cancer Res.45:4380,1985,Oseroff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8744,1986、idem.,Photochem.Photobiol.46:83,1987,Hasan et al.,Prog.Clin.Biol.Res.288:471,1989,Tatsuta et al.,Lasers Surg.Med.9:422,1989,Pelegrin et al.,Cancer 67:2529,1991。しかしながら、これらの早期の研究には、特に、抗体断片またはサブ断片の使用を伴った、内視鏡治療適用の使用は含まれていなかった。したがって、本発明の1つの実施形態において、光学活性薬剤または色素を含む免疫コンジュゲート体の治療的使用が意図される。
[0113]
本発明の実施形態での使用のために好適である常磁体イオンには、限定はしないが、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(HI)、サマリウム(III)、イットリビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)およびエルビウム(III)が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。
[0114]
X線イメージングのような他の文脈中の有用なイオンには、限定はしないが、トランサヌム(III)、金(III)、鉛(II)および特にビスマス(III)が含まれる。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンが含まれる。ローダミンおよびフルオレセインはしばしば、イソチオシアネート中間体を介して連結する。放射線不透過および造影剤が、X線およびコンピュータ断層撮影法を増強するために使用され、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、サリウム化合物などが含まれる。特定の化合物には、バリウム、ジアトリゾエート、エチオダイズド油、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタミン酸、ヨードアミド、ヨージパルムド、ヨードキサミン酸、イオグルタミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノン酸、イオプロセミン酸、イオセファミン酸、イオセリン酸、イオスルアミドメグルミン、イソセメチン酸、イオタスル、イオテトリン酸、イオサラミン酸、イオトロキシ酸、イオキサグリ酸、イオキソトリゾン酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリドンおよび塩化タリウムが含まれる。したがって、他の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体との組み合わせでの、本明細書で開示した抗体を含む治療的、薬学的または診断的組成物が提供され得る。
[0115]
本発明の他の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と一緒に、本明細書にて開示された抗体を混合することを含む、治療的、薬学的または診断的組成物の調製のためのステップが提供され得る。
[0116]
抗体および組成物は、使用される治療にしたがった、任意の適切な形態および量で投与されるためのものであり得る。
[0117]
1つの実施形態において、治療的、薬学的または診断的組成物は、投与のために任意の好適な形態を取ることができ、好ましくは、非経口投与のために好適な形態、たとえば注射または注入によってであり、たとえばボーラス注射または連続注入によってである。製品が注射または注入のためのものである場合、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることができ、懸濁、防腐、滅菌および/または分散剤のような処方薬剤を含み得る。あるいは、抗体または組成物は、適切な滅菌液体との使用の前の再構築のために乾燥形態であり得る。
[0118]
治療的および診断的使用は、本明細書で開示された実施形態にしたがった有効量の抗体をヒト対象に投与することが含まれ得ることが本明細書で意図される。投与される実際の用量は、抗体の使用にしたがって、そして患者の年齢、性別および状態にしたがって変化するが、一般的に、約0.1mg〜1000mg、たとえば約1mg〜500mg変化し得る。抗体は、単一用量として、または時間にわたり連続様式で投与してもよい。投与は必要に応じて繰り返してもよい。
[0119]
1つの実施例において、本明細書で開示された抗体および組成物は、使用される治療にしたがった任意の適切な形態および量での投与のために使用し得る。抗体を投与する用量は、処置すべき状態の性質に依存し、抗体が予防的に使用されるかどうかまたは存在する状態を処置するかどうかに依存して投与される。用量はまた、患者の年齢および状態にしたがって選別される。したがって、抗体の治療用量は、たとえば好ましくは0.1〜25mg/kg体重/単一治療用量、最も好ましくは、単一治療用量に対して、0.1〜10mg/kg体重であり得る。
[0120]
1つの実施形態において、本明細書で開示された任意の抗体は、任意の好適な経路による投与のために従来の実施にしたがって処方してもよく、一般的に、たとえば静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内経路による投与のために、液体形態(たとえば無菌生理学的に許容可能な緩衝液中の抗体の溶液)であり得る。
[0121]
本明細書で意図される「免疫強薬物」は、少なくとも1つの治療的および/または診断的/検出薬剤にコンジュゲートした、抗体、融合タンパク質、またはその断片である。診断的/検出薬剤には、放射性核種または非放射性核種、(磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または超音波のためのような)造影剤を含んでよく、放射性核種は、γ−、β−、α−、Augerエレクトロン−、またはポジトロン−放射性同位体であり得る。
[0122]
本明細書において、語句「抗体融合タンパク質」は、2つ以上の同一または異なる天然の抗体、同一または異なる特異性を有する一本鎖抗体または抗体断片区画が連結した、組換え的に産出された抗原結合分子である。融合タンパク質の価数は、融合タンパク質が有する、抗原またはエピトープに対する結合アームまたは部位の総数を示唆し、すなわち、一価、二価、三価または四価である。多価の抗体融合タンパク質は、抗原への結合における多数の相互作用を利用することができることを指し、したがって、抗原に対する結合の親和力の増加を利用することができることを意味する。特異性は、どれくらい多くの異なる抗原またはエピトープに、抗体融合タンパク質が結合可能であるか、を示唆しており、すなわち一特異性、二特異性、三特性、多特異性である。これらの定義を用いて、天然の抗体、たとえばIgGは、2つの結合アームを有するので二価であるが、1つの抗原に結合するので、一特異性である。一特異性、多価融合タンパク質は、エピトープに対して1つより多い結合部位を有するが、同一の抗原上の同一のエピトープにのみ結合し、たとえば、同一の抗原と反応する2つの結合部位を有するジアボディである。融合タンパク質には、異なる抗体成分の多価または多特異性組み合わせ、または同一の抗体成分の多重コピーの組み合わせが含まれ得る。融合タンパク質は、さらに、治療薬剤を含んでよい。そのような融合タンパク質のために好適な治療薬剤の例には、免疫調節物(「抗体免疫調節物融合タンパク質」)および毒素(「抗体毒素融合タンパク質」)が含まれる。1つの好ましい毒素には、リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)、好ましくは組換えRNアーゼが含まれる。
[0123]
他の実施形態において、選択的結合を、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなヘテロ二機能リンカーを用いることによって達成し得る。エステルの抗体または断片との反応により、抗体または断片上のアミン基を誘導可能であり、次いで、誘導体がたとえば遊離スルフヒドリル基をもつ抗体Fab断片(または、たとえばトラウト試薬によって、付加するスルフヒドリル基を有するより大きな断片または本来の抗体)と反応可能である。そのようなリンカーは、同一の抗体中の架橋基に連結する可能性は少なく、結合の選択性を改善する。
[0124]
1つの特定の実施形態において、本明細書で開示される抗体または断片を、抗体結合部位から離れた部位で結合してもよい。これは、たとえば以上で述べたように、開裂した鎖間のスルフヒドリル基への結合によって達成可能である。他の方法には、酸化炭水化物部分を有する抗体を、少なくとも1つの遊離アミン官能基を有する他の抗体に反応させることが含まれる。これによって、初期シフ塩基(イミン)結合となり、好ましくは、たとえばボロヒドリド反応によって、第二アミンへの還元によって安定化され、最終産物が形成される。そのような部位特異的結合が、小分子に関して米国特許第4,671,958号、およびより大きな追加物に関して米国特許第4,699,784号にて開示されている。
[0125]
標的特異性を有するF(ab’)2断片の鎖間ジスルフィド架橋をシステインで還元させ、軽鎖−重鎖結合を避けて、Fab’−SH断片を形成可能である。SH基を、過剰のビス−マレイミドリンカー(1,1’−15(メチレンジ−4,1−フェニレン)ビス−マレイミド)で活性化可能である。
[0126]
1つの実施形態において、本明細書で開示されたhL243抗体、ならびに異なる特異性を有する他の結合分子を組み合わせ治療で使用してもよい。たとえば、多特異性抗体には、マウスモノクローナル抗体mL243によって認識されるエピトープまたは抗原への少なくとも1つの結合部位、およびマウスモノクローナル抗体mL243によって認識された他のエピトープまたは他の抗原に対する少なくとも1つの結合部位が含まれ得る。さらに、(同一のエピトープまたは抗原に対する多結合部位を含む)多価抗体、または抗体が、多価および多特異性両方であり得る。
[0127]
1つの特定の実施形態において、結合分子は、融合タンパク質であり得る。1つのより特定の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書で記述されたような、ヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスL243抗体または断片の、4以上のFvまたはFab’を含み得る。他の実施形態において、抗体融合タンパク質は、本明細書で記述したような、ヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスL243−MAbまたは断片のmAbまたは断片の1つ以上のFvまたはFab’を含み得る。これらの実施形態にしたがって、HLA抗原以外の細胞マーカーに対して特異的である他の抗原に対して特異的な抗体からの1つ以上のFvまたはFab’が含まれ得る。たとえば、非HLA抗原には、B細胞系列抗原(たとえば、B細胞悪性腫瘍の処置のためのCD19、CD20またはCD22)から選択される腫瘍マーカーが含まれ得る。他の実施例において、非HLA抗原はまた、メラノーマ中のSI00のような他の型の悪性腫瘍を引き起こす他の細胞上に発現し得る。さらに、細胞マーカーは、HLA−DR、CD30、CDS3、CD52、CD66、MUC1およびTACからなる群より選択されるような非B細胞系列抗原であり得る。
[0128]
1つの実施形態において、本明細書で開示されたL243抗体を他の抗体と組み合わせ、疾患を有するか、または進行が疑われる対象を処置するために使用し得る。本実施形態にしたがって、L243抗体またはその組成物を、ヒト化モノクローナル抗体(たとえばhA20(CD20−Mab))のような抗がんモノクローナル抗体と組み合わせてもよく、がんを処置するために使用してもよい。より特定の実施形態において、L243のHLA−DR抗体を、抗がんモノクローナル抗体(たとえばhA20)と組み合わせて、疾患の進行の疑いを有する患者を処置するために使用してもよい。hL243抗体を、1つ以上の他の別の抗体組成物と組み合わせて別の抗体組成物として使用してもよく、またhL243の1つ、およびhA20の他の1つに対する二機能性抗体として使用してもよいことが、本明細書で意図されている。この実施形態にしたがって、hL243抗体は、hL243のHLA−DRであってもよい。他の特定の実施形態において、疾患には、そのような疾患を有する対象における、B細胞悪性腫瘍疾患を標的化することが含まれ得る。B細胞悪性腫瘍は、B細胞リンパ腫の無痛性形態、B細胞リンパ腫の悪性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症および多発性骨髄腫からなり得る。また、免疫調節不全疾患における敗血症および敗血性ショックを含む多くの自己免疫および免疫調節不全疾患のような非悪性腫瘍B細胞疾病および関連疾患が存在する(またGoldenberg and Hansenによって2004年12月8日に出願され、そのすべてが本明細書に組み込まれている、米国特許仮出願明第60/634,076号を参照のこと)。特に、本明細書で記述した組成物は、種々の自己免疫疾患、ならびにB細胞リンパ腫の無痛性形態、B細胞リンパ腫の亜性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに急性および慢性骨髄性白血病およびT細胞白血病およびリンパ腫のような他の造血系悪性腫瘍の処置のために特に有用である。たとえば、hL243抗体成分および免疫コンジュゲート体を、非ホジキンリンパ腫およびリンパ性白血病の無痛性および悪性形態両方を好ましく処置するために使用可能である。
[0129]
標的化し得る腫瘍関連抗原には、限定はしないが、A33抗体に対して特異的なA3抗原、BrE3抗原、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA−DR、NCA95、NCA90、HCGおよびそのサブユニット、CEA(CEACAM−5)、CEACAM−6、CSAp、EGFR、EGP−1、EGP−2、Ep−CAM、Ba733、HER2/neu、低酸素症誘導因子(HIF)、KC4抗原、KS−1抗原、KS1−4、Le−Y、マクロファージ阻害因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM−4抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG−72、p53、タナスシン、IL−6、IL−8、インスリン増殖因子−1(IGF−1)、Tn抗原、トムソン−フリーデンライチ抗原、腫瘍壊死抗原、VEGF、17−1A−抗原、血管新生マーカー(たとえばED−Bフィブロネクチン)、オンコジーンマーカー、オンコジーン産物、および他の腫瘍関連抗原が含まれる。腫瘍関連抗原における最近の報告には、それぞれ参考により本明細書に組み込まれる、Mizukami et al.,(2005,Nature Med.11:992−97),Hatfield et al.,(2005,Curr.Cancer Drug Targets 5:229−48),Vallbohmer et al.,(2005,J.Clin.Oncol.23:3536−44)およびRen et al.(2005,Ann.Surg.242:55−63)が含まれる。
[0130]
さらに、本発明の他の実施形態には、免疫強薬物および組成物を調製するための二特異性または多特異性抗体が含まれ得る。これらの実施形態にしたがって、L243抗体または断片またはその抗体融合タンパク質を、がんマーカー基質、感染性疾患器官の表面上のエピトープ、または血液または他の体液中の有害な基質に対して特異的な抗体または抗体断片に連結してもよい。二特異性および多特異性抗体は、種々の有害な基質のクリアランスを誘導するために有用であり得る。たとえば、二重特異性抗体は、病原体微生物のような有害な基質に対する1つ以上の特異性、およびHLA−DR、HLAクラスII不変鎖(li)に対する1つ以上の特異性を有し得る。HLAクラス−II不変鎖(li)は、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、表題「二重特異性抗体の治療的使用(Therapeutic Using a Bispecific Antibody)」、1999年5月19日に出願された米国特許第09/314,135号にて詳細に記述されている。
[0131]
他の実施形態において、本明細書で開示されている免疫コンジュゲート体および組成物はまた、L243多価抗体を含み得る。本実施形態にしたがって、多価標的結合タンパク質を、第一および第二ポリペプチドの結合によって構築してもよい。第一ポリペプチドには、好ましくは免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインである、第一免疫グロブリン様ドメインに共有結合した、第一一本鎖Fv分子が含まれ得る。第二ポリペプチドには、好ましくは免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインである第二免疫グロブリン様ドメインに共有結合した第二一本鎖Fv分子が含まれ得る。第一および第二一本鎖Fv分子それぞれが、標的結合部位を形成し、第一および第二免疫グロブリン様ドメインが結合して、第三の標的結合部位を形成する。
[0132]
他の実施形態において、ヒト化、キメラまたはヒトL243モノクローナル抗体を用いて、抗原特異的ジアボディ、トリアボディーおよびテトラボディーを産出してもよい。たとえば、単一特異性ジアボディ、トリアボディーおよびテトラボディーは、選択的に標的化抗原に結合し、その結果分子上の結合部位の数が増加するので、標的細胞に対する親和性が増加し、より長い居留時間が所望の局所で観察される。ジアボディに関して、5アミノ酸残基リンカーによってヒト化L243 mAbのVKポリペプチドに連結したヒト化L243 mAbのVHポリペプチドを含む2つの鎖を利用可能である。それぞれの鎖が、ヒト化L243ジアボディの二分の一を形成する。トリアボディーの場合、リンカーなしで、ヒト化L243 MAbのVKポリペプチドに連結したヒト化L243 MAbのVHポリペプチドを含む三つの鎖が利用される。それぞれの鎖は、hL243トリアボディーの三分の一を形成する。
[0133]
他の実施形態において、本明細書で開示される免疫コンジュゲート体および組成物にはまた、機能的二特異性一本鎖抗体(bscAb)も含まれ得る(たとえば、参考により本明細書に組み込まれる、Mack et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7021−7025,1995を参照のこと)。たとえば、bscAbを、組換え法を用いてグリシン−セリンリンカーを介して2つの一本鎖Fv断片を連結することによって産出可能である。対象となる2つの抗体のV軽鎖(VL)およびV重鎖(VH)ドメインを、標準のPCR法を用いて単離可能である。各ハイブリドーマから得たVLおよびVHのcDNAを、二段階融合PCRにて連結させて一本鎖断片を形成してもよい。1つの実施例において、第一PCR段階によって、(Gly4−SerI)3リンカーが導入され、第二段階でVLおよびVH増幅物が連結される。各一本鎖分子を、細菌発現ベクター内にクローン化可能である。増幅に続いて、1つの一本鎖分子を活性化させ、他のベクター内にサブクローン化し、対象となる第二一本鎖分子を含む。次いで、bscAb断片を、真核発現ベクター内にサブクローン化可能である。機能性タンパク質発現を、チャイニーズハムスター卵巣細胞内にこのベクターをトランスフェクトすることによって得ることが可能である。他の二特異性融合タンパク質を同様の様式で調製する。二特異性一本鎖抗体および二特異性融合タンパク質は薬物担体を調製するために使用されてもよい。
[0134]
さらに、1つの実施形態には、二重特異性を有する四価タンデムジアボディー(タンダブと呼ばれる)が含まれ得る(Cochlovius et al.,Cancer Research (2000)60:4336−4341)。二特異性タンダブは、自己結合に際して、2つの異なる特異性のそれぞれに対して2つの可能性ある結合部位の形成を促進する方向で連結した2つの異なる抗体の4つの可変ドメイン(VH1、VL1、VH2、VL2)をそれぞれ含む、2つの同一ポリペプチドのダイマーである。
[0135]
他の実施形態において、コンジュゲート多価L243抗体を使用して、免疫コンジュゲート体または組成物を調製してもよい。追加アミノ酸残基を、第一または第二ポリペプチドのNまたはC末端いずれかに加えてもよい。追加アミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素(たとえばプロドラッグ活性化酵素)、ホルモン、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、シュードモナスエキソトキシンのようなペプチド毒素、ペプチド薬物、細胞傷害性タンパク質または他の機能的タンパク質を含み得る。本明細書において、機能的タンパク質は、生物学的な機能を有するタンパク質である。
[0136]
また他の実施形態において、hL243抗体またはその断片を、多価タンパク質複合体、3または4つの抗原結合部位を含む新規抗体融合タンパク質を調製するために使用してもよい。これらの実施形態にしたがって、1つ以上の抗原結合部位は、hL243可変ドメインからなってもよく、1つ以上の残りの抗原結合部位には、所望のような他の抗原特異的抗体の可変ドメインが含まれ得る。そのような多価タンパク質複合体は、PCT刊行物WO04094613A2(Rossi et al.,2004)にて記述されている。適切な抗原特異的抗体可変鎖と組み合わせる場合、hL243可変ドメインを含む多価タンパク質複合体を種々の新生物、感染、代謝性、神経変性、自己免疫、または免疫調節不全疾患を処置するために使用してもよい。
[0137]
本発明の1つの実施形態において、薬物、毒素、放射活性化合物、酵素、ホルモン、細胞傷害性タンパク質、オリゴヌクレオチド、干渉RNA(たとえばRNAi分子)、キレート、サイトカインおよび他の機能的薬剤が多価標的結合タンパク質にコンジュゲートし得る。これらの実施形態にしたがって、たとえばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基など、多価標的結合タンパク質のアミノ酸残基の側鎖への共有結合を使用してもよい。種々の従来のリンカーを本目的のために使用してもよく、たとえば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス(ヒドロキシスクシンイミド)エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどを使用してもよい。多価タンパク質に対する薬剤のコンジュゲートは、好ましくは、その標的に対するタンパク質の結合特異性または親和性に有意な影響を与えない。本明細書において、機能的薬剤は、生物学的機能を有する薬剤である。好ましい機能的薬剤は、細胞傷害性薬剤である。
[0138]
また他の実施形態において、インビボ標的に対する治療またはプロドラッグポリマーの二重特異性抗体由来伝達を、放射性核種の二重特異性抗体伝達と組み合わせることが可能であり、組み合わせ化学治療および放射免疫治療が達成される。各治療薬剤を、標的化可能コンジュゲート体にコンジュゲートさせ、同時に投与可能であり、または核種を第一標的化可能コンジュゲート体の一部として与え、薬物を、第二標的化可能コンジュゲート体の一部として後の段階で与えることが可能である。好適な標的化可能コンジュゲート体および薬物が当分野で公知である。
[0139]
他の実施形態において、細胞傷害性薬剤を重合化担体にコンジュゲートしてもよく、重合化担体を続いて、多価標的結合タンパク質にコンジュゲートしてもよい。本方法に関して、参考により本明細書に組み込まれる、Ryser et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3867−3870,1978、米国特許第4,699,784号、および米国特許第4,046,722号を参照のこと。コンジュゲートは、好ましくは、多価結合タンパク質の結合特異性または親和性に有意な影響を与えない。
[0140]
<処置および診断のための、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体使用>
本明細書で記述しているヒト化抗体、キメラ抗体およびヒトモノクローナル抗体が、本明細書で記述しているような免疫強薬物および組成物を利用する治療法および診断法での使用のために好適である。したがって、免疫コンジュゲート体または組成物には、裸のヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体または抗体が含まれ得、これらは、担体、治療薬剤、または診断薬剤にコンジュゲートしてもよい。免疫コンジュゲート体を、多重モデル治療として投与してもよい。たとえば、追加治療または診断薬剤を、免疫コンジュゲート体または組成物の投与前、同時または後に投与してもよい。免疫コンジュゲート体または組成物の効果を、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒトL243免疫コンジュゲート体をまたは組成物に、1つ以上の他の結合分子(すなわち、CD4、CDS、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CCD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、壊死抗原、PAM−4、KS−1、Le(y)、MAGE、1a、IL−2、IL−6、テナスシン、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP−1、EGP−2、葉酸レセプター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、大腸特異的抗原p(CSAp)、インスリン様増殖因子(ILGF)、胎盤成長因子(PIGF)、前立腺酸ホスファターゼ、PSA、PSMA、T101、TAG、TAG−72、Her2/neu、カルボニックアンヒドラーゼIX、IL−6、SI00、αフェトプロテイン、A3、GA125、がん胎児性抗原(CEA)、hL243抗体とのCD66(a、b、c、d)、MART−1、TRP−1、TRP−2、gplOO、アミロイドのような非特異性交差反応抗原、またはその免疫コンジュゲート体、またはこれらの引用した抗原に対する抗体)を補充することによって増強し得る。好ましいB細胞関連抗原には、ヒトCD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD46、CD52、CD74、CD80およびCDS抗原と等価のものが含まれる。好ましいT細胞抗原には、ヒトCD4、CDSおよびCD25(IL−2レセプター)抗原に等価のものが含まれる。
[0141]
あるいは、HLA−DR抗原に対する置換分子を、B細胞およびT細胞疾病両方の処置で使用してもよい。1つの特定の実施形態において、B細胞抗原は、ヒトCD19、CD22、CD21、CD23、CD74、CD80およびHLA−DR抗原に等価であり得る。他の特定の実施形態において、ヒトCD4、CDSおよびCD25抗原と等価のT細胞抗原を使用可能である。あるいは、補体依存性溶解(CDC)を防止するがん細胞の表面上のCD46およびCD59抗原を使用してもよい。1つの実施形態において、MART−1、TRP−1、TRP−2およびgplOOとの等価物のような、悪性メラノーマ関連抗原を使用してもよい。さらに、1つの実施形態において、多重メラノーマ関連抗原は、MUC1、CD38およびCD74に等価なものである。
[0142]
1つの実施例において、補足結合分子は裸であるか、脂質、ポリマー、薬物、毒素、免疫調節物、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉RNAおよび治療放射性核種などを含む、担体、治療薬剤または診断薬剤とコンジュゲートされていてもよい。本実施形態にしたがって、補足結合分子を、ヒト化、キメラおよびヒトL243免疫コンジュゲート体または組成物と、同時に、連続して、または処方された投与計画にしたがって、投与してもよい。
[0143]
さらに、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、および他の疾患または疾病での診断および治療的使用のための免疫コンジュゲート体または組成物の投与が本明細書で意図される。本明細書で記述したような、免疫コンジュゲート体は、担体にコンジュゲートした結合分子を含む分子であり得る。本実施形態にしたがって、免疫コンジュゲート体を、治療的または診断薬剤をさらに含む組成物を形成するために使用してもよく、これには、診断または治療薬剤を有し得るペプチドが含まれ得る。免疫コンジュゲート体は、結合分子の免疫応答性を残す(すなわち、抗体部分は、コンジュゲート後、コンジュゲート前とほとんど同一か、またはわずかに減少した同種抗原に結合する能力を有する)。免疫コンジュゲート体には、任意の好適な第二分子(たとえば、より高次の構造を形成し得る脂質、タンパク質、炭水化物、またはリポソーム、ミセルおよび/またはナノ粒子のような高次構造それ自体)にコンジュゲートした結合分子が含まれ得る。特定のエフェクターの伝達を促進するために、高次構造(たとえば両親媒性脂質)を形成可能である1つ以上の分子に対してhL243抗体をコンジュゲートさせることが望ましい。両親媒性分子がまた、水溶液中の溶解性の制限を示すエフェクターの伝達を促進するために望ましい。
[0144]
他の実施形態において、広く種々の診断および治療薬剤を使用して、本明細書で記述したような免疫コンジュゲート体および組成物を形成可能である。治療薬剤には、たとえば、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン類、エピドフィロ毒素類(epidophyllotoxin)、タキサン類、代謝拮抗物質類、アルキル化剤類、抗生物質類、Cox−2阻害剤類、抗有糸分裂剤類、抗血管新生およびアポトーシス剤類、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、CPT−11、カンプトテカン類、およびこれらのそして他のクラスの抗がん剤からの他のものなどの化学療法薬が含まれる。免疫コンジュゲート体および抗体融合タンパク質の調製のための他の有用ながん化学療法薬には、ニトロゲンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、COX−2阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモンなどが含まれる。好適な化学療法薬が、Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)にて、およびGoodman and Oilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,7th Ed.(MacMillan Publishing Co.1985)にて、ならびにこれらの刊行物の改訂版にて記述されている。実験薬物のような他の好適な化学療法薬を使用してもよく、当分野で公知である。
[0145]
さらに、他の実施形態において、DTPA、DOTA、TETAまたはNOTAのようなキレーターを、本明細書で記述したような組成物の1つ以上の成分とコンジュゲートさせてもよい。あるいは、検出可能標識(たとえば蛍光分子)、または細胞傷害性薬剤(たとえば重金属または放射性核種)を含む好適なペプチドを、本明細書で記述したような組成物のより多くの成分と共有的、非共有的または結合させ得る。たとえば、1つの治療的に有用な免疫コンジュゲート体を、本明細書に記述したように、組成物中、光学活性薬剤または色素を組み込むことによって得てもよい。蛍光発色団、および他の発色団、または可視光に感受性のポルフィリンのような色素などの蛍光組成物を使用して、損傷に好適な光を指向させることによって損傷を検出し、処理してきた。治療において、これは、光学放射、光学治療、または光線力学療法と呼ばれてきている(Jori et al.(eds.),「腫瘍および他の疾患の光線力学療法(PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES)」(Libreria Progetto,1985)、van den Bergh,Chem.Britain 22:430,(1986))。さらに、モノクローナル抗体は、光学治療を達成するために光学活性化色素とコンジュゲートした。Mew et.al.,J.Immunol.130:1473(1983);idem.,Cancer Res.45:4380(1985);Oseroff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8744(1986);idem.,Photochem.Photobiol.46:83(1987);Hasan et al.,Prog.Clin.Biol.Res.288:471(1989);Tatsuta et al.,Lasers Surg.Med.9:422(1989);Pelegrin et al.,Cancer 67:2529(1991)。内視鏡適用もまた意図される。検出および治療の内視鏡法が、その全体が参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,932,412号、第5,525,338号、第5,716,595号、第5,736,119号、第5,922,302号、第6,096,289号および第6,387,350号にて記述されている。
[0146]
1つの実施形態において、光活性薬剤または色素を含むhL423免疫コンジュゲート体組成物の治療的使用が本明細書で意図されており、および本診断/治療法には、光活性薬剤または色素を含むhL423免疫コンジュゲート体組成物の診断または治療利用が含まれ得る。免疫コンジュゲート体はまた、以上で議論した型の超音波薬剤も含まれ得る。また、本明細書で記述したようなヒト化、キメラおよびヒトL423免疫コンジュゲート体組成物中での診断薬剤としての放射活性および非放射活性薬剤の使用も意図される。好適な非放射活性診断薬剤は、磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または超音波のために好適な造影剤である。磁気イメージング薬剤には、たとえば、本明細書で記述した抗体と一緒に使用した場合、2−ベンジル−DTPAおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属−キレート組み合わせと錯体化したマグネシウム、鉄およびガドリニウムのような非放射活性金属が含まれる。(参考によりその全体が組み込まれる、2001年10月10日に出願された、米国特許第09/921,290号を参照のこと)。
[0147]
他の実施形態において、ヒト化、キメラおよびヒトL423免疫コンジュゲート体組成物には、診断イメージングのために有用な放射性同位体またはポジトロンエミッターが含まれ得る。好適な放射性同位体には、60〜4,000keVのエネルギー範囲でのものが含まれ得る。好適な放射性同位体には、18−F、52−Fe、62−Cu、64−Cu、67−Cu、67−Ga、68−Ga、86−Y、89−Zr、94−Tc、94m−Tc、99m−Tc、111−In、123−1、124−1、125−1、131−1などが含まれる(たとえば、イメージング目的のための18−F、68−Ga、94m−Tcなどのようなポジトロンエミッターを開示しており、参考によりそのすべてが組み込まれている、本発明者G.L.Griffiths and W.J.McBrideの表題「Labeling Targeting Agents with Gallium−68」の米国特許出願(米国仮出願第60/342,104号)を参照のこと)。
[0148]
本発明の他の実施形態において、緑膿菌外毒素のような毒素が、本明細書で記述したようなヒト化、キメラおよびヒトL243抗体またはその免疫コンジュゲート体または組成物中に存在し得る。たとえば、毒素は、本明細書で記述したhL243抗体の抗体融合タンパク質に複合体化するか、またはその治療薬剤部分を形成することができる。他の毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシンA、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素が含まれる(たとえば、Pastan et al.,Cell 47:641(1986)、およびGoldenberg,CA−A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)を参照のこと。本明細書での使用に好適なさらなる毒素が当業者に公知であり、参考によりそのすべてが組み込まれている米国特許第6,077,499号にて開示されている。
[0149]
あるいは、サイトカインのような免疫調製物がまた、本明細書で記述したような投与されるhL423免疫コンジュゲート体組成物中に存在してもよい。たとえば、免疫調節物は、抗体融合タンパク質の治療薬剤部分に複合体化するか、またはその治療薬剤部分を形成するか、または本明細書で記述したヒト化、キメラおよびヒトL423免疫コンジュゲート体組成物の一部として投与してもよい。好適なサイトカインには、限定はしないが、以下で記述するような、インターフェロン類およびインターロイキン類が含まれる。
[0150]
1つの実施形態において、ヒト化L243抗体を、先に標的化した、非免疫原性、診断および治療適用のための非常に選択的な変法の一部として使用可能であり、そこで二重特異性抗体を担体分子上の腫瘍抗原および1つ以上のハプテンを共認識するために使用し、担体分子にはエフェクター分子が含まれる。二重特異性抗体(bsAb)は、比較的非免疫学的ヒト化タンパク質として改変可能であるという利点を有する。bsAbの結合親和性は、初期標的化薬剤の結合親和性に依存し得る。二価ペプチドを用いることによって、親和性増強が達成され得、一価ペプチドと比較して、標的部位に対するペプチドの結合を大きく改善させる。たとえば、そのすべてが参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,256,395号を参照のこと。
[0151]
1つの実施形態において、hL243−bsAbで先に標的化することには、本明細書で記述したように、hL243抗体の可変領域に由来するbsAbの1つのアーム、および診断または治療薬剤(たとえば、「標的化可能構造」として診断または治療薬剤と一緒の担体)を含む部分を認識する抗体の第二アームが含まれる。好適な標的化可能構造物および使用の方法が、米国特許出願第20050002945号にて記述されており、その内容は、そのすべてが本明細書にて参考により組み込まれる。標的化可能構造物は、当業者が他の標的化可能構造物を使用し得ることを理解するけれども、たとえば、(i)DOTA−Phe−Lys(HSG)−D−Tyr−Lys(HSG)−NH 2、(ii)DOTA−Phe−Lys(HSG)−Tyr−Lys−(HSG)−NH 2、または(iii)Ac−Lys(HSG)D−Tyr−Lys(HSG)−Lys(Tsc 8−Cys)−NH 2であり得る。他の系において、標的化可能構造物には、抗体の第二アームによって認識されるハプテン部分、および治療または診断薬剤が含まれ得る。たとえば、治療薬剤は、以上で記述したもののような化学療法薬または毒素であり得る。
[0152]
1つの特定の実施形態には、種々のエフェクター基質が調製可能である認識系のようなヒスタミン誘導体、ヒスタミン−スクシニル−グリシル(HSG)に対して指向する抗体を使用するJanevik−Ivanovska et al.によって記述された前標的化系が含まれる。本発明のヒト化L243抗体をそのような系にて使用し得る。この前標的化系は、種々の異なるイメージングまたは治療薬剤と一緒に使用可能である他の前標的化系に対して有意な利点を表している。1つの実施例において、この系は、DTP AまたはHSGに対して指向する抗体の使用、およびDTPAまたはHSG残基を含むペプチドの開発に基づき得る。DTPA含有および/またはHSG含有ペプチドが合成可能であり、そこでペプチドはDTPAを含み、ペプチドをIn、YまたはLuのようなキレート化核種で標識化してもよく、治療または診断にて有用であり得る。抗体はDTPA−In部分に対して産出されてきた。他の実施形態において、系には、ハプテンのペプチドおよび/またはDTPAのようなキレーターが含まれ、 90Y、’’’inおよび 177Luならびに 99mTcでの放射標識のために好適であり得る。
[0153]
<免疫コンジュゲート体の調製>
本明細書で記述した免疫コンジュゲート体を、抗体を脂質、炭化水素、タンパク質、または他の原子および分子に連結する公知の方法によって調製してもよい。たとえば、本明細書で記述した結合分子を本明細書で記述した1つ以上の担体(たとえば脂質、ポリマー、リポソーム、ミセルまたはナノ粒子)にコンジュゲートさせて免疫コンジュゲート体を形成可能であり、免疫コンジュゲート体は共有、非共有、またはその他いずれかで、治療または診断薬剤を組み込み得る。さらに、本明細書で記述した結合分子を、本明細書で記述した1つ以上の治療または診断薬剤、またはさらなる担体とコンジュゲート可能である。一般的に、1つの治療または診断薬剤を、各結合分子に連結してもよいが、1つより多い治療薬剤または診断薬剤を同一の結合分子に連結可能である。1つの実施形態において、本明細書で意図する抗体融合タンパク質には、2つ以上の抗体またはその断片が含まれてもよく、この融合タンパク質を含む、各抗体を、本明細書で記述した1つ以上の融合担体とコンジュゲートしてもよい。さらに、1つ以上の抗体融合タンパク質の抗体が、1つ以上の連結した治療または診断薬剤を有し得る。さらに、治療薬剤は、同一のものである必要はなく、異なる治療薬剤であり得る。たとえば、本明細書で記述した組成物には、薬物および放射性同位体が含まれ得る。
[0154]
1つの実施例において、IgGを、131−1で放射標識化してもよく、IgG−脂質コンジュゲート体がリポソームを形成可能であるように脂質にコンジュゲートしてもよい。この実施例にしたがって、リポソームは、1つ以上の治療または診断薬剤(たとえばFUdR−dOのような薬物)を組み込み得る。あるいは、担体に加えて、IgGを、131−1(たとえばチロシン残基)および薬物(たとえばリシン残基のεアミノ基)にコンジュゲートしてもよく、担体はさらなる治療または診断薬剤を組み込み得る。治療および診断薬剤を、結合分子と共有結合してもよい(たとえば、結合分子上の還元ジスルフィド基、炭化水素側鎖、または任意の他の反応基にコンジュゲートしてもよい)。
[0155]
他の実施形態において、担体、治療薬剤または診断薬剤を、ジスルフィド結合形成を介して、還元抗体成分のヒンジ領域で結合してもよい。あるいは、ペプチドを、N−スクシニル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)のようなヘテロ二機能架橋剤を用いて抗体成分に結合可能である。Yu et al.,Int.J.Cancer 56:244(1994)。そのようなコンジュゲート体のための一般技術が当分野で周知である(たとえば、Wong,「Chemistry of Protein Conjugation and Cross−linking」(CRC Press 1991);Upeslacis et al.,「Modification of Antibodies by Chemical Methods」,Monoclonal Antibodies Principles and Applications,Birch et al.(eds.),pages 187D230(Wiley−Liss,Inc.1995)、Price,「Production and Characterization of Synthetic Peptide−Derived Antibodies」,Moniclonal Antibodies:Production,Engineerting and Clinical Application,Ritter et al.(eds.),pages 60D84(Cambridge University Press 1995)を参照のこと)。あるいは、担体、治療薬剤または診断薬剤を、抗体のFc領域中の炭化水素部分を介してコンジュゲート可能である。炭化水素基を使用して、チオール基に結合する同一のペプチドの積み込み量を増加可能であり、または炭化水素部分を使用して異なるペプチドを結合可能である。
[0156]
抗体炭化水素部分を介したペプチドを抗体成分にコンジュゲートするための方法が、当業者に周知である(たとえば、すべてが参考によりそのすべてが組み込まれているShih et al.,Int.J.Cancer 41:832(1988);Shih et al.,Int.J.Cancer 46:1101(1990);およびShih etal.,米国特許第5,057,313号を参照のこと)。同様の化学反応を使用して、1つ以上のhL243抗体またはその成分を、1つ以上の担体、治療薬剤または診断薬剤にコンジュゲートするために使用してもよい。1つの実施形態において、1つの一般法には、酸化炭化水素部分を有する抗体成分を、少なくとも1つの遊離アミン官能基を有し、複数のペプチドをロードした担体ポリマーと反応させることが含まれる。本反応によって、初期シフ塩基(イミン)結合となり、これは第二アミンへの還元によって安定化し、最終コンジュゲート体を形成可能である。
[0157]
1つの実施形態において、たとえばhL423結合分子が抗体断片である場合、Fc領域は存在しなくてもよい。あるいは、炭化水素部分を、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域内に導入してもよい(たとえば、すべてが参考によりそのすべてが組み込まれている、Leung et al.,J.Immunol.154:5919(1995);Hansen etal.,米国特許第5,443,953号(1995);Leung etal.,米国特許第6,254,868号を参照のこと)。これらの実施形態にしたがって、工学的に改変した炭化水素部分を、担体、治療または診断薬剤に結合させるために使用してもよい。
[0158]
<担体(脂質、リポソーム、ミセル、ポリマーおよびナノ粒子)>
リポソームおよびミセルの形成のための任意の方法を使用してもよく、当分野で公知である(たとえば、Wrobel et al.,Biochimica et Biophysica Acta,1235:296(1995);Lundberg et al.,J.Pharm.Pharmacol.,51:1099−1105(1999);Lundberg et al.,Int.J.Pharm.,205:101−108(2000);Lundberg,J.Pharm.Sci.,83:72−75(1994);Xu et al.,Molec.Cancer Then,1:337−346(2002);Torchilin et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,100:6039−6044(2003)、米国特許第5,565,215号、米国特許第6,379,698号、および米国特許第2003/0082154号を参照のこと)。薬物輸送またはイメージングのために本明細書で意図されている、ポリマー、シリカまたは金属から形成されるナノ粒子またはナノカプセルが記述されてきている(たとえば、West et al.,Applications of Nanotechnology to Biotechnology,11:215−217(2000);米国特許第5,620,708号、米国特許第5,702,727号および米国特許第6,530,944号を参照のこと)。
[0159]
<免疫リポソーム>
抗体または結合分子をリポソームに結合し、治療または診断薬剤のための標的化担体を形成するための方法が記述されてきている(たとえば、Bendas,Biodrugs,15:215−224(2001);Xu et al.,Molec.Cancer Ther.,1:337−346(2002);Torchilin et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,100:6039−6044(2003);Bally,et al.,J.Liposome Res.,8:299−335(1998);Lundberg,Int.J.Pharm.,109:73−81(1994);Lundberg,J.Pharm.Pharmacol.,49:16−21(1997);Lundberg,Anti−cancer Drug Design,13:453−461(1998)を参照のこと)。また米国特許第6,306,393号、米国特許第10/350,096号、米国特許第09/590,284号、および1999年6月9日に出願された米国特許第60/138,284号も参照のこと。すべてのこれらの参考は、参考により本明細書に組み込まれる。
[0160]
<薬学的に許容可能な賦形剤>
1つの実施形態において、免疫コンジュゲート体または組成物には、1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、1つ以上の追加成分またはこれらの組み合わせが含まれてもよい。
[0161]
他の実施形態において、本明細書で開示された免疫コンジュゲート体または組成物を、公知の方法にしたがって処方して薬学的に有用な組成物を調製してもよく、それによって、免疫コンジュゲート体または組成物を薬学的に好適な賦形剤との混合液中で組み合わせる。無菌リン酸緩衝食塩水が、薬学的に好適な賦形剤の1つの例である。他の好適な賦形剤が、当業者に周知である(たとえば、Ansel et al.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,5th (Lea & Febiger 1990)、and Gennaro(ed),Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Mack Publishing Company 1990),およびそれらの改訂版を参照のこと)。
[0162]
他の実施形態において、本明細書で開示した免疫コンジュゲート体または組成物を、たとえばボーラス注射または連続注入を介して静脈内投与のために処方可能である。
[0163]
注射のための処方は、添加保存剤とともにたとえばユニット投与形態、たとえばアンプル中または多数回投与型の容器中で存在してもよい。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態であってもよく、懸濁、安定および/または分散薬剤のような処方薬剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用の前に、たとえば発熱物質を含まない無菌水のような好適な媒体との組成のための粉末形態で存在してもよい。さらなる薬学的方法を使用して、治療、診断コンジュゲート体または裸の抗体の活性の期間を制御してもよい。たとえば、制御放出調製物を、免疫コンジュゲート体または裸の抗体を複合体化または吸着するためにポリマーの使用を介して調製してもよい。1つの実施例において、生物適合性ポリマーには、ポリ(エチレン−コ−ビニル酢酸)のマトリックスおよびステアリン酸ダイマーとセバシン酸のポリアンヒドリドコポリマーのマトリックスが含まれる。Sherwood et al.,Bio/Technology 10:1446(1992)。そのようなマトリックスからの免疫コンジュゲート体または抗体の放出のいくつかの速度は、免疫コンジュゲート体または抗体の分子量、免疫コンジュゲート体、抗体のマトリックス中の量、および分散粒子のサイズに依存する。Saltzman et al.,Biophys.J.55:163(1989);Sherwood et al.,上記。他の固体用量形態が、Ansel et al.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems;5th Edition(Lea & Febiger 1990);およびGennaro(ed.),Ramington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Mack Publishing Company 1990)、およびその改訂版にて記述されている。
[0164]
1つの実施形態において、免疫コンジュゲート体または組成物はまた、哺乳動物皮下にまたは他の非経口経路にて投与してもよい。さらに、投与は、連続注入または単一もしくは複数ボーラスでよい。1つの実施例において、ヒトに対する投与された免疫コンジュゲート体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、年齢、一般病状および過去の治療歴などのような因子に依存して変化する。特定の実施形態において、より低いまたはより高い用量も環境規定として投与し得るけれども、レシピエントに単一静脈内注入として、約1mg/kg〜mg/kgの範囲で免疫コンジュゲート体、または免疫コンジュゲート体を含む組成物の用量を投与し得る。この用量は、必要に応じて、たとえば4〜10週間、1週間あたり1回、好ましくは8週間、1週間あたり1回、より好ましくは、4週間、1週間あたり1回繰り返し得る。数ヶ月にわたり隔週でのようなより低い頻度で投与してもよい。用量およびスケジュールの適切な調節をともなって種々の非経口経路を介して投与してもよい。
[0165]
1つの実施形態において、治療の目的のために、免疫コンジュゲート体、または免疫コンジュゲート体を含む組成物を治療的に有効量で哺乳動物に投与する。本明細書で開示された治療および診断方法のために好適な対象は、非ヒト動物対象も意図されるけれども、ヒトであり得る。
[0166]
1つの実施例において、抗体調製物を、投与された量が生理学的に有意である場合に、「治療的に有効量」にて投与されると言われる。その存在によって、レシピエント哺乳動物の生理学において検出可能な変化となる場合に、薬剤が治療的に有意である。特に、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍反応を誘引するか、または自己免疫疾患状態の兆候および症状を軽減する場合に、その抗体調製物が生理学的に有意である。生理学的に有意な効果はまた、レシピエント哺乳動物における体液性および/または細胞性免疫応答の誘引でもあり得る。
[0167]
<ヒト化、キメラおよびヒトL243抗体を含む組成物を用いる処置の方法>
1つの実施形態において、本発明の抗体で処置し得る免疫学的疾患には、たとえば強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節リウマチのような関節疾病、多発性硬化症および重症筋無力症のような神経学的疾患、糖尿病、特に若年性発症糖尿病のような膵臓疾患、慢性活動性肝炎、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血のような胃腸管疾患、乾癬または強皮症のような皮膚疾患、喘息のような、また移植片対宿主疾患および同種移植片拒絶のような移植関連状態でのアレルギー疾患が含まれる。
[0168]
本発明の他の実施形態において、組成物および方法は、自己免疫疾患または疾病を処置するために、本明細書で開示された抗体またはその免疫コンジュゲート体を含むことができ提供される。B細胞を標的とする抗体を用いる自己免疫疾病の免疫治療が、それぞれの内容が、そのすべてが本明細書にて組み込まれている、米国特許仮出願明第60/138,284号の優先権を主張している、PCT公開特許公報第WO00/74718号にて記述されている。例示的自己免疫疾患には、限定はしないが、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎動脈硬化、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬および線維化肺胞炎が含まれる。
[0169]
本発明の他の実施形態において、癌、肉腫、グリオーマ、リンパ腫、白血病または皮膚がんからなる群より選択される疾病を処置するために組成物および方法が提供される。がんは、皮膚、食道、胃、大腸、直腸、膵臓、肺、乳、卵巣、膀胱、子宮内膜、頸部、膀胱、腎臓、副腎または肝臓がんからなる群より選択され得る。B細胞関連疾患は、無痛性B細胞リンパ腫、悪性B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、または多発性骨髄腫であり得る。さらに、B細胞関連疾患は、ヒトまたは家畜型の疾患であり得る。他方T細胞関連疾患には、ヒトまたは他の哺乳動物T細胞白血病またはリンパ腫、皮膚乾癬、乾癬性関節炎または菌状息肉腫が含まれ得る。1つの実施例において、代謝性疾患は、アミロイドーシスであり得る。1つの実施例において、神経変性疾患は、アルツハイマー病であり得る。
[0170]
また、本発明の1つの実施形態にて本明細書で意図されるものは、任意の以下の疾患または疾病の処置のための組成物として免疫コンジュゲート体を含む抗体の使用であり、前期疾患または疾病は、免疫調節不全疾患、自己免疫疾患、器官移植片拒絶、移植片対宿主疾患、代謝性疾患(たとえばアミロイドーシス)、および神経変性疾患(たとえばアルツハイマー病)からなる群より選択される。悪性疾患または疾病は、固形腫瘍、造血系腫瘍(リンパ腫、白血病、ミエローマなど)からなる群より選択される。固形腫瘍は、メラノーマ、カルシノーマおよびサルコーマからなる群より選択され、カルシノーマは、腎臓がん、乳がん、肺がん、胃腸がんおよび尿生殖器がんからなる群より選択される。B細胞悪性腫瘍は、無痛性B細胞リンパ腫、悪性B細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症および多発性骨髄腫からなる群より選択される。免疫調節不全疾患における敗血症および敗血性ショックを含む多くの自己免疫および免疫調節不全疾患のような非悪性B細胞疾病および関連疾患も存在する(免疫調節不全疾患のリストは、Goldenberg and Hansenによって、2004年12月8日に提出された米国特許仮出願明第60/634,076号にてより包括的に見ることができ、そのすべてが本明細書に組み込まれている)。特に、本明細書で記述された組成物が、種々の自己免疫疾患、ならびに無痛性B細胞リンパ腫、悪性B細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫およびワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに急性および慢性骨髄性白血病およびT細胞白血病およびリンパ腫のような他の造血性悪性腫瘍の処置のために特に有用である。たとえば、hL243抗体成分および免疫コンジュゲート体を、好ましくは、無痛型および悪性型の非ホジキンリンパ腫およびリンパ性白血病両方を処置するために使用可能である。
[0171]
他の実施形態において、本発明のヒト化、キメラおよびヒトL243抗体を、必要に応じて、ヒト、および限定はしないがイヌ、ネコ、ウマおよびウシを含む家畜哺乳動物を含む全ての哺乳動物における、上記疾患および疾病を処置するために使用してもよい。
[0172]
1つの特定の実施形態において、B細胞悪性腫瘍を処置するための方法には、薬学的に許容可能な担体、治療薬剤、およびL243抗体またはその成分(たとえば、ヒト化、キメラ、またはヒトL243抗体またはその断片またはその抗体融合タンパク質)を含む免疫コンジュゲート体を含む治療組成物を、B細胞関連悪性腫瘍を患っている対象に投与することが含まれてもよく、そこで、B細胞悪性腫瘍はリンパ腫または白血病である。より詳しくは、B細胞悪性腫瘍は、無痛型のB細胞リンパ腫、悪性のB細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または急性リンパ性白血病である。より特定の実施形態において、免疫コンジュゲート体または免疫コンジュゲート体を含む組成物を、B細胞悪性腫瘍を検出または処置するために使用される少なくとも1つの追加治療薬剤または診断薬剤の投与の前、同時または後に、免疫コンジュゲート体または組成物を投与することをさらに含んで、約20〜2000mgの用量で、静脈内または筋肉内に投与してもよい。たとえば、追加薬剤には、治療または診断薬剤を含む、本明細書に記述されたような追加免疫コンジュゲート体が含まれ得る。これらの実施形態にしたがって、治療薬剤には、裸の抗体、免疫調節物、ホルモン、細胞傷害性薬剤、酵素、および/または少なくとも1つの免疫調節物にコンジュゲートした抗体、放射活性標識、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、または細胞傷害性薬剤、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。1つの特定の実施例において、免疫調節物はサイトカインであってもよく、細胞傷害性薬剤は、薬物または毒素であってもよい。より特定の実施形態において、裸の抗体としてまたは補助免疫コンジュゲート体としての組み合わせで投与し得る抗体は、好ましくは、CD4、CDS、CDS、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、壊死抗原、PAM−4、KS−1、90Le(γ)、MAGE、1a、IL−2、IL−6、テナスシン、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP−1、EGP−2、葉酸レセプター、ヒトコリン性ゴナドトロピン、CEA、大腸特異的抗原p(CSAp)、インスリン様増殖因子(ILGF)、胎盤成長因子(PIGF)、前立腺酸性ホスファターゼ、PSA、PSMA、T101、TAG、TAG−72、Her2/neu、カルボニックアンヒドラーゼIX、IL−6、SI00、αフェトプロテイン、A3、CA125、がん胎児性抗原(CEA)、CD66(a、b、c、d)、MART−1、TRP−1、TRP−2、アミロイドまたはgp100のような非特異的交差反応抗原と反応する。
[0173]
悪性腫瘍の処置に、リンパ腫または白血病以外の悪性腫瘍を患う対象に、(1)hL243抗体、またはその免疫コンジュゲート体、および担体と、(2)エフェクターと、(3)薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る治療組成物とを投与することが含まれ得ることがまた、本明細書で意図される。組成物は、20〜2000mgの用量で静脈内または筋肉内に投与してもよい。さらに、組成物を、少なくとも1つの追加治療薬剤または診断薬剤の投与前、同時または後に投与してもよい。以上および本明細書にわたって記述しているように、治療薬剤には、免疫調節物、ホルモン、細胞傷害性薬剤または結合分子(裸であるか、または少なくとも1つの免疫調節物、放射活性標識、酵素、ホルモン、細胞傷害性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNAまたはそれらの組み合わせにコンジュゲートしているかいずれかであり、前記免疫調節物が好ましくはサイトカインであり、細胞傷害性薬剤が好ましくは薬物または毒素である)を含み得る。治療薬剤または診断薬剤には、本明細書で開示したような組成物または免疫コンジュゲート体が含まれ得る。特定の実施形態において、B細胞悪性腫瘍ではないが、処置される悪性腫瘍を含む細胞が発現するマーカー(hL243抗体によって認識されるもの以外)と反応し得る悪性腫瘍を処置するために、抗体を治療および/診断組成物との組み合わせで投与してもよく、抗体は薬学的に許容可能な媒体中で処方されるべきである。悪性メラノーマ関連抗原に対して投与し得る抗体の例は、MART−1、TRP−1、TRP−2およびgplOOと反応性の抗体である。さらに、多重メラノーマ関連抗原に対する好ましい抗体は、MUC1、CD74およびCD38と反応性のものが含まれる。処置のための組成物は、単独で、または他のヒト化、キメラまたはヒト抗体のような他の抗体との組み合わせでWL243抗体またはその免疫コンジュゲート体を含み得る。
[0174]
1つの実施例において、組成物には、エフェクターとして免疫調節物が含まれ得る。本明細書において、語句「免疫調節物」には、サイトカイン類、幹細胞増殖因子類、腫瘍壊死因子(TNF)のようなリンホトキシン類、およびインターロイキン類(たとえばインターロイキン−1(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18、およびIL−21)、コロニー刺激因子類(たとえば顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GMDCSF))、インターフェロン類(たとえば、インターフェロン−α、βおよびγ)のような造血性因子類、「SI因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチンまたはこれらの組み合わせが含まれる。好適な免疫調節物部分の例には、IL−1、IL−2、IL−3、IL−6、IL−10、IL−12、IL−18、IL−21およびその組み合わせ、およびインターフェロン−α、βおよびγ、TNF−αおよびβなどが含まれる。1つの実施形態において、免疫調節物は、組成物中で存在してもよいか、または免疫コンジュゲート体を、治療および/診断組成物の投与の前、同時または後に投与可能である。1つの特定の実施形態において、hL243抗体はまた、免疫調節物にコンジュゲートしてもよい。免疫調節物はまた、異なる抗原に結合している1つ以上の抗体からなるハイブリッド抗体にコンジュゲートしてもよい。
[0175]
1つの実施例において、本明細書にて意図されている多重モデル治療には、追加結合分子(たとえば抗CD22、抗CD19、抗CD21、抗CD20、抗CD80、抗CD23、抗CD46またはHLA−DR、好ましくは、裸抗体、融合タンパク質の形態での、または免疫コンジュゲート体としての、成熟HLA−DRダイマー抗体)の投与を加えたhL243抗体のような免疫コンジュゲート体での免疫治療が含まれる。さらに、本明細書で記述したような、ミセル、リポソーム、またはナノ粒子には、hL243抗体に加えて、結合分子が含まれ得る。たとえば、抗体は、上記抗原決定基上の少なくとも1つのエピトープを認識する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。さらに、抗CD19および抗CD22抗体が当分野で公知である(たとえば、そのすべてが参考により組み込まれる、Ghetie et al.,Cancer Res.48:2610(1988);Hekman et al.,Cancer Immunol.Immunother.32:364(1991);Longo,Curr.Opin.Oncol.8:353(1996)および米国特許第5,798,554号および第6,187,287号を参照のこと)。
[0176]
1つの特定の実施例において、他の形態の多重モデル治療は、標準のがん化学治療との組み合わせで対象にhL243免疫コンジュゲート体を与えるものであってもよい。たとえば、「CVB」(1.5g/m 2シクロホスファミド、200〜400mg/m 2エトポシド、および150〜200mg/m 2カルムスチン)が、非ホジキンリンパ腫を処置するために使用される投与計画である。Patti et al.,Eur.J.Haematol.51:18(1993)。他の好適な組み合わせ化学治療投与計画が、当業者に周知である(たとえば、Freedman et al.,「非ホジキンリンパ腫(Non−Hodgkin’s Lymphomas)」 Cancer Medicine,Volume 2,3rd Edition,Holland et al.(eds.),pages 2028−2068(Lea & Febiger 1993))。例示のように、中間グレード非ホジキンリンパ腫(NHL)の処置のための第一世代化学治療投与計画両方には、C−MOPP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン)およびCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)が含まれる。本発明の1つの特定の実施形態において、第二世代化学治療投与計画は、m−BACOD(メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロウコボリン)であってもよく、好適な第三世代投与計画は、MACOP−B(メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロウコボリン)である。さらなる治療には、フェニルブチラートおよびブリオスタチン−1が含まれ得る。好ましい多重モデル治療において、化学治療薬物およびサイトカイン両方を、抗体、免疫コンジュゲート体または融合タンパク質と同時投与してもよい。サイトカイン、化学治療薬物および抗体または免疫コンジュゲート体は、任意の順番で、または同時に投与してもよい。
[0177]
特定の実施形態において、NHLは4連続週または2週間ごと25〜700mg/m 2の用量で(2〜8時間にわたりiv)、必要に応じて次の月/年にわたり繰り返し、より好ましくは、4連続週または2週間ごと100〜400mg/m 2(2〜8時間にわたりiv)、必要に応じて次の月/年にわたり繰り返し、hL243免疫コンジュゲート体(たとえば治療組成物)の4週間注入によって処置し得る。さらに、NHLは、上記のように4半月注入で処理し得るが、同日に、1時間にわたるiv注入として、hL243抗体免疫コンジュゲート体注入の前、間または後いずれかで、360mg/m 2の用量で、エプラツズマブ(抗CD22ヒト化抗体)と組み合わせ得る。あるいは、HLは、上記のようにhL243抗体免疫コンジュゲート体の4週間注入で処理し、イットリウム90のような治療用のアイソトープにて放射標識したCD22−mAbの1回以上の注射と組み合わせてもよい(数週間または数ヶ月の期間にわたる1以上の注入として、5〜35mCi/メートル平方の間の90−Y用量)。1つの実施例において、CD20抗体に対してより低い応答をもつ患者で使用する場合、WL243を、リツキシマブまたはhA20のようなCD20抗体と組み合わせてもよい。本実施例にしたがって、後者の組み合わせは、同一の日または週の間いずれかで、各種用量にて連続的にまたは同時に、そしてリツキシマブまたはhA20に対してi.v.注入によって1週間に1回375mg/m 2にて投与され、またi.v.注入によって、250mg/m 2のhL243もまた一週間に一回投与し得る。すべての上記の場合において、用量は分画し、連続注入として、または当分野で公知の非経口経路によって投与してもよい。これらはまた、皮下のような他の経路によって投与してもよい。
[0178]
さらに、1つの実施形態において、本明細書で開示したような治療組成物には、hL243抗体によって認識される、異なる非ブロッキングエピトープに指向するhL243免疫コンジュゲート体の混合物またはハイブリッド分子が含まれ得る。本実施形態にしたがって、治療組成物には、hL243抗体に認識される少なくとも2つのエピトープにて結合するhL243免疫コンジュゲート体の混合物が含まれ得る。また、本明細書で記述された免疫コンジュゲート体は、種々のCDR配列を有するhL243抗体の混合物を含み得る。
[0179]
本発明の1つの実施形態において、hL423抗体、またはその免疫コンジュゲート体を、B細胞リンパ腫および白血病、および他のB細胞疾患または疾病、ならびに影響を受けるか関連した悪性腫瘍細胞がhL243抗体によって認識されるエピトープと反応性である、他の悪性疾患を処置するために使用してもよい。たとえば、hL243抗体またはその免疫コンジュゲート体は、限定はしないが、たとえば、免疫仲介血小板減少症、たとえば急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シューグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎のような、クラスIII自己免疫疾患を含む、免疫調節不全疾患および関連自己免疫疾患を処置するために使用してもよい。
[0180]
より特定の実施形態において、hL243抗体またはその免疫コンジュゲート体または断片、またはその抗体融合タンパク質を、1つ以上の上記の自己免疫疾患を患う対象に投与してもよい。本明細書で開示されたhL243抗体は、そのすべてが参考により本明細書に組み込まれる、2000年6月9日に出願された、表題「Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodies that Tagets B−Cells」の、係願中米国特許第09/590,284号にて開示された、自己免疫疾患を処置する方法において特に有用である。1つの特定の実施形態において、hL243抗体を、20〜2000mgの用量で静脈内または筋肉内に投与してもよい。さらに、hL243抗体は、少なくとも1つの治療薬剤または診断薬剤の投与前、間または後に投与してもよい。より特定の実施形態において、本明細書で記述したような治療薬剤には、抗体、免疫調節物、ホルモン、酵素、細胞傷害性薬剤、少なくとも1つの免疫調節物にコンジュゲートした抗体、放射活性標識、ホルモン、酵素または細胞傷害性薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNAまたはその混合物を含むことができ、そこで免疫調節物はサイトカインであり、前記細胞傷害性薬剤は薬物または毒素である。たとえば、治療薬剤には、本明細書で記述したような免疫コンジュゲート体が含まれ得る。1つの特定の実施形態において、裸抗体として、または補足免疫コンジュゲート体としての組み合わせで投与し得る抗体には、薬学的に許容可能な媒体中に処方されたCD4、CDS、CDS、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CCD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、壊死抗原、PAM−4、KS−1、Le(γ)、MAGE、1a、IL−2、IL−6、テナスシン、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP−1、EGP−2、葉酸レセプター、ヒトコリン性ゴナドトロピン、大腸特異的抗原−p(CSAp)、インスリン様増殖因子(ILGF)、胎盤成長因子(PIGF)、前立腺酸性ホスファターゼ、PSA、PSMA、T101、TAG、TAG−72、Her2/neu、カルボニックアンヒドラーゼIX、IL−6、SI00、αフェトプロテイン、A3、CA125、がん胎児性抗原(CEA)、CD66(a、b、c、d)、MART−1、TRP−1、TRP−2、アミロイドおよびgplOOのような非特異的交差反応抗原などの特定の抗原、すなわちmAbに反応する抗体が含まれる。
[0181]
本明細書において、「薬学的組成物」は、担体が薬学的に許容可能な担体である薬物を含む組成物を指し、一方で、「獣医学組成物」は、担体が獣医学的に許容可能な担体であるものである。語句「薬学的に許容可能な担体」または「獣医学的に許容可能な担体」は、生物学的でない、または望まない任意の培地または物質を含むことができ、すなわち担体を、複合体または任意のその組成物または有機体と有害な様式で任意の望まない生物学的効果または相互作用を引き起こすことなく、本発明の組成物または化合物と一緒に、有機体に投与し得る。薬学的に許容可能な試薬の例が、Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems,7th Edition,Ansel et al.,editors,Lippincott Williams & Wilkins,1999であるように、本出願内の本明細書に参考としてそのすべてが組み込まれている、The United States Pharmacopeia,The National Formulary,United States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville,MD 1990にて提供されている。
[0182]
薬物(すなわち標的化可能構造または複合体)を、患者における所望の効果を産出するために十分な量で薬学的組成物内に含めることができる。本発明の薬学的組成物にはさらに、希釈剤および賦形剤のような他の化学成分を含み得る。「希釈剤(diluent)」は、溶媒中の薬物の溶解を促進する溶媒、好ましくは水溶液中に希釈された化学化合物であり、薬物または1つ以上のその成分の生物学的活性を安定化するためにも利用可能であり得る。緩衝溶液中に溶解した塩は、当分野で希釈剤として利用される。たとえば、好ましい希釈剤は、1つ以上の異なる塩を含む緩衝溶液である。好ましい緩衝溶液は、ヒト血液の塩状態を模倣するので、(特に、薬学的投与のために意図された組成物との組み合わせでの)リン酸緩衝食塩水である。緩衝塩が、低濃度で溶液のpHを制御可能であるので、緩衝希釈剤は生物学的に活性なペプチドの生物学的活性をほとんど改変しない。
[0183]
本発明の1つの実施形態において、薬学的組成物は、有機体、好ましくは動物、好ましくは哺乳動物へのヒト化抗体の投与を促進する。特定の哺乳動物には、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジおよびブタ動物、および非ヒト霊長類が含まれる。ヒトが特に好ましい。化合物を投与するまたは伝達する多数の技術が当分野で存在し、限定はしないが、経口、直腸(たとえば浣腸または坐薬)、エアロゾル(たとえば、経鼻または肺伝達のため)、非経口(たとえば、i.v.、i.m.、s.c.)および局所投与が含まれる。好ましくは、十分な量の組成物または化合物を、意図する効果を達成するために伝達し得る。伝達すべき特定の量の組成物または化合物は、達成すべき効果、組成物を伝達する有機体の型、伝達経路、投与計画、および有機体の年齢、健康および性別を含む多くの因子に依存する。そのような所与の処方中の、本明細書で開示された実施形態の組成物または化合物の特定の用量は、当業者の判断に任される(たとえば医療機関の判断)。
[0184]
当業者は、本発明の薬学的組成物を、(ワクチン化を含む)治療または保護効果を含み得る特定の所望の生物学的結果を達成するために薬剤として投与する場合、本明細書で開示された組成物または化合物を好適な薬学的担体と混合する必要があり得る。薬学的担体の選択、および治療または保護薬剤としての組成物または化合物の調製は、意図する使用および投与の様式に依存する。治療薬剤の投与の好適な処方および方法には、限定はしないが、経口、経肺、経鼻、口腔、眼内、皮膚、直腸または膣伝達のためのものが含まれる。
[0185]
使用する伝達の様式に依存して、状況依存機能存在物を、種々の薬学的に許容可能な形態中で伝達可能である。たとえば、状況依存機能存在物を、ピル、カプセル、タブレット、坐薬、エアロゾル、液滴またはスプレー内に組み込んだ、固体、溶液、エマルジョン、分散、ミセル、リポソームなどの形態で伝達可能である。ピル、タブレット、坐薬、エアロゾル、粉末、液滴およびスプレーは、複合、多重層構造を有してもよく、大きな範囲のサイズを有する。エアロゾル、粉末、液滴およびスプレーは、サイズにおいて、小(およそ1ミクロン)〜大(およそ200ミクロン)の範囲であり得る。
[0186]
本明細書で開示された薬学的組成物は、固体、凍結乾燥粉末、溶液、エマルジョン、分散、ミセル、リポソームなどの形態で使用してもよく、得られた組成物は、腸内または非経口適用のために好適な有機または無機担体または賦形剤との混合で、活性成分として、本発明の実施形態の1つ以上の標的化可能構造または複合体を含む。活性成分は、たとえば、タブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用のために好適な任意の他の形態のために、通常の非毒性、薬学的に許容可能な担体と混合し得る。使用可能な担体には、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マグネシウムトリシリケート、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および固体、半固体または液体形態で、調製物を製造することにおいて使用するために好適な他の担体が含まれる。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤および着色剤および香料を使用してもよい。安定化乾燥薬剤の例には、好ましくは0.1%以上の濃度でトリウロースが含まれる(たとえば、米国特許第5,314,695号を参照のこと)。
[0187]
個々の要求は変化し得るが、有効量の薬学的組成物の最適範囲の決定は、当業者の範囲内である。ヒト用量は、動物研究から推定し得る(Katocs et al.,Chapter 27 In:Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)。一般的に、当業者によって適合され得る、薬学的組成物の効果的量を提供するために必要とする用量は、レシピエントの年齢、健康、健康状態、体重、疾患または疾病の型および程度、処置の頻度、(存在するなら)同時治療の性質、および所望の効果の性質および範囲に依存して変化する。たとえば、Nies et al.,Chapter 3 In:Goodman & Oilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.,eds.,McGraw−Hill,New York,N.Y.,1996を参照のこと)。
[0188]
治療組成物の投与は、数日から数ヶ月維持される処置の過程で、または治癒が効果を有するか、または疾患状態の減少が達成されるまで、処置されるべき疾患状態の重症度および反応性に依存する。最適投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定より計算可能である。語句「患者(patient)」は、動物(たとえばネコ、イヌおよびウマ)ならびにヒトを含むことが意図される。当業者は、最適用量、用量法および繰り返し速度を簡単に決めることが可能である。最適用量は、個々の治療薬剤の相対的強度に依存して変化してもよく、一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であると発見されるEC 50に基づいて推定可能である。
[0189]
用量(投与した標的化可能構造または複合体の量)の範囲は、典型的には、異なる哺乳動物のための治療的影響の効果が、ラットでよりもヒトで20、30または40倍小さい(ユニット体重あたり)用量で広く変化するので、広範である。一般に、投与量は、0.01μg〜100mg/体重kg、好ましくは0.01μg〜10mg/体重kg、0.01μg〜50μg/体重kg、0.01μg〜100mg/体重kg、0.01μg〜10mg/体重kg、0.01μg〜1mg/体重kg、0.01μg〜100μg/体重kg、0.01μg〜10μg/体重kg、0.01μg〜1μg/体重kg、0.01μg〜10μg/体重kg、0.01μg〜1μg/体重kg、0.01μg〜0.1μg/体重kgであり、先行する濃度範囲の境界に基づいて及ぶ。したがって、たとえば先行する用量の記述は、10mg〜100mg/体重kg、1.0mg〜100mg/体重kg、0.1mg〜100mg/体重kgなどの範囲内での投与量を包含する。
[0190]
1つの実施形態において、投与は、1以上、毎日、毎週、毎月または毎年、または2〜5以上の年ごとに1回与えられ得る。当業者は、標的化可能構造物または複合体の、体液または組織中の測定残余時間および濃度に基づいた投与の繰り返し頻度を推定し得る。成功した処置に続いて、疾患状態の再発を防止するために患者に対して治療を維持することが望ましく、そこで、治療薬剤は、0.01ug〜100mg/体重kgの範囲で、1日1回以上から毎5年に1回まで、維持用量で投与される。
[0191]
1つの実施形態において、特定の用量は、患者のおよその体重または表面積にしたがって計算してもよい。適切な用量を決定することにおける他の因子には、処理または予防されるべき疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、患者の年齢、性別および病状が含まれ得る。処置のための適切な用量を決定するために必要な計算のさらなる改良が、特に本明細書で開示された用量情報およびアッセイの観点から、当業者によって日常的に実施される。用量はまた、適切な用量反応データと組み合わせて使用する用量を決定するための公知のアッセイの使用を介して決定可能である。
[0192]
1つの実施形態において、個々の患者の投与量は、疾患の進行をモニターすることで適合してもよい。標的化可能構造または複合体の患者内での血液レベルを、所望の結果を得るために投与量を適合する必要があるかどうか見るために測定してもよい。
[0193]
1つの実施例において、薬理ゲノミクスを使用して、標的化可能構造および/または複合体、およびその用量が、該個体に対して最も効果的であり得るかを決定してもよい(Schmitz et al.,Clinica ChimicaActa 308:43−53,2001;Steimer et al.,Clinica ChimicaActa 308:33−41,2001)。
[0194]
本明細書で開示されたヒト化抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下、腔内、カテーテルを介したかん流によって、または直接病巣内注入によってを含む非経口であり得る。この投与にしたがって、抗体を、1日1回以上、毎週1回以上、毎月1回以上、および毎年1回以上投与してもよい。
[0195]
本明細書で言及したか、または引用した文献、特許、および特許出願、およびすべての他の文書および電子的に入手可能な情報は、それぞれの個々の刊行物が、特別にそして個々に、参考により組み込まれるべきと示唆される場合と同様の程度まで、それらのすべてが参考により本明細書に組み込まれる。本出願者らは、任意のそして任意のそのような文献、特許、特許出願または他の分子からのすべての要素および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を有する。
[0196]
本明細書で例示的に記述した実施形態は、本明細書で特に開示されたものでない、任意の要素または要素類、制限または制限類の非存在下で好適に実施することができる。したがって、たとえば語句「含む(comprising)」、「含む(including)」「含む(containing)」などは、発展的に、そして制限なしに読まれるべきである。さらに、本明細書で使用する語句および表現は、制限の語としてでなく、記述の語として使用されており、そのような語句および表現の使用において、示され記述された特徴の任意の等価物、またはその部分を除く意図はないが、しかし、種々の改変が請求した本発明の範囲内である可能性があることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および最適な特徴によって特に開示されてはいるけれども、本明細書で開示された改変および変化様態が当業者によって再分類され得ること、およびそのような改変および変化が、本発明の範囲内であることが考えられることが理解されるべきである。
[0197]
本発明の実施形態は本明細書で広く、そして一般的に記述されている。一般的開示の範囲内に含まれる、それぞれのより狭い種および亜属グループ化がまた、本発明の一部を形成し得る。これには、切除物質が特に本明細書で引用されているかどうかにかかわらず、属から任意の対象事象を除去する条件またはネガティブな制限をともなう、本明細書の一般的な記述が含まれる。
[0198]
さらに、特徴または態様が、Markushのグループの語句によって記述されている場合、当業者は、実施形態が、Markushのグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関して記述されていることを認識する。
[0199]
実施形態はさらに、以下の実施例および詳細なプロトコールによって例示されている。しかしながら、実施例は単に、実施形態を例示する目的のみであり、本明細書の範囲を制限するために構築されるわけではない。本出願にわたり引用されているすべての参考文献、および刊行された特許および特許出願の内容が、参考により本明細書に組み込まれる。

Mode for the Invention 1

[0200]
ヒト化L243抗体の構築
<L243VkおよびVH遺伝子の分子クローニング>
1つの例示的方法において、mAb−mL243を産出しているハイブリドーマ細胞クローンを、10%FBS(ハイクロン(Hyclone))で補充されるHSFM培地(Life Technologies,Inc.)中で培養した。mL243のVK(VK1BACK/CK3’)およびVH(VH1BACK/VH1FOR)をコードする遺伝子を、RT−PCRによってクローン化し、配列をDNAシークエンシングによって決定した。多重独立クローンを配列決定して、PCR反応からの結果である可能性があるエラーを排除した。
[0201]
<hL243のV遺伝子の配列デザイン>
1つの実施例において、Kabatデータベース中のヒトVKおよびVH配列を検索することによって、mL243のVKおよびVHのFRが、それぞれヒトREIのVKおよびRF−TS3のVHに対する高程度の配列相同性を示すことがわかった。1つの例外は、mL243VHのFR4であって、これは、NEWMのVHと最も高い配列相同性を示した。したがって、1つの実施例において、ヒトREIフレームワーク配列を、mL243VKのCDRを接ぐための足場として使用し(図5)、RF−TS3およびNEWMフレームワーク配列の組み合わせをhL243Vnのために使用した(図6)。実際、hL243 のVHは、他のヒト化Ab、hRS7(Govindan et al.,Breast Cancer Res.Treat.84,173−182,2004)のものと同一のヒトVHフレームワークを有する。開始ヒト抗体フレームワークと比較した場合、CDR領域の外の各鎖中に多数のアミノ酸変化が存在する。推定CDRに隣接したマウスFR中の種々のアミノ酸残基が、すでに確立されたガイドライン(Qu et al.,Clin.Cancer Res.(1999)5 3095s−3100s)に基づいて、再形成されたhL243 Fv中で維持された。これらの残基は、mL243のVkのR37、K39、V48、F49およびG100、およびmL243 VHのF27、K38、K46、A68およびF91である(それぞれ図3および4)。また、それぞれhL243のVLおよびhL243VHの配列に関して、それぞれ配列番号3および4を参照のこと。
[0202]
<hL243のV配列の構築>
Leung et al.(Mol.Immunol.(1995)32 1413−1427)によって記述されたような改変戦略を使用して、図4で例示したような長オリゴヌクレオチドシンターゼとPCRの組み合わせを用いて、hL243に対する設計されたVKおよびVH遺伝子を構築した。hL243のVHドメインの構築のために、2つの長オリゴヌクレオチド、hL243VHA(175塩基)およびhL243VHB(168塩基)を、自動化DNA合成器(Applied Biosystem)上で合成した。
hL243VHAは、HL243VHドメインのnt23〜197を表している。
5’−GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGCCTCAG TGAAGGTTTC CTGCAAGGCT TCTGGATTTA CCTTCACAAA CTATGGAATG AACTGGGTGA AGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTAAGTGGA TGGGCTGGAT AAACACCTAC ACTAGAGAGC CAA CATATGC TGATGACTTC AAGGG−3’(配列番号16)hL243 VHBは、nt176〜343に相補的なhL243VHドメインのマイナス鎖を表している。
5’−ACCCTTGGCC CCAGTAGTCA AAACCCGTAG GTACAACCGC AGTAATATCT CTTGCACAGA AATACACGGC AGTGTCGTCA GCCTTTAGGC TGCTGATCTG GAGATATGCC GTGCTGACAG AGGTGTCCAA GGAGAAGGCA AACCGT CCCT TGAAGTCATC AGCATATG−3’(配列番号17)。
[0203]
hL243VHAおよびBの3’末端配列(22nt残基)は、上記配列中で下線を引いたように、互いに相補的である。1つの実施例において、定義されたPCR条件下、hL243VHAおよびBの3’末端がアニールし、残りの長オリゴヌクレオチドによって隣接された短い二本鎖DNAを形成する。それぞれのアニールした末端が、PCR反応中の一本鎖DNAの複製に対するプライマーとして働き、結果として、hL243VHのnt23〜343からなる二本鎖DNAとなる。このDNAをさらに、短いオリゴヌクレオチドプライマー対、hRS7VHBACKおよびhL243VHFORの存在下で増幅させ、全長hL243VHを形成した。この領域でのhRS7VHとhL243VH間の配列同一性のために、hRS7Abのために先に設計され、使用されたhRS7VHBACKをここで使用した。
hRS7VHBACK 5’−GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG AAGAAGCC−3’(配列番号18)
hL243VHFOR 5’−TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC CCAGTAGT−3’(配列番号19)。
[0204]
本実施例において、(実験的に決定された)最小量のhL243VHAおよびBを、10μlの10×PCR−Buffer(500mM KCl、100mM Tris.HCL緩衝液、pH8.3、15mM MgCl 2)、2μmolのhRS7VHBACKおよびhL243VHFOR、および2.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus、Norwalk,CT)の存在下で増幅した。この反応混合液を94℃にて1分間の変性、45℃にて1分間のアニーリング、および72℃にて1.5分間の重合化からなる3サイクルのPCR反応と、続く、94℃にて1分間の変性、55℃にて1分間のアニーリング、および72℃にて1分間の重合化からなる27サイクルのPCR反応にかけた。hL243VHに対する二本鎖PCR増幅産物をゲル精製し、PstIおよびBstEIIにて制限消化し、重鎖ステージングベクター、VHpBS4の相補的PstI/BstEII部位でクローン化した。
[0205]
1つの実施例において、ヒト化VK配列の全長DNAを構築するために、hL243VKA(155塩基)およびhL243VKB(155塩基)を以上で記述したように合成した。hL243VKAおよびBを、上述のように、2つの短いオリゴヌクレオチドhlmmu31VKBACKおよびhlmmu31VKFORによって増幅した。hlmmuS1VKBACKおよびhlmmuS1VKFORを設計し、前もってヒト化抗AFP−Abに対して使用した(Qu et al.,Clin.Cancer Res.(1999)5 3095−3100)。
hL243VKAは、hL243VDドメインのnt21〜175を表している。
5’−TCCATCATCT CTGAGCGCAT CTGTTGGAGA TAGGGTCACT ATCACTTGTC GAGCAAGTGA GAATATTTAC AGTAATTTAG CATGGTATCG TCAGAAACCA GGGAAAGCAC CTAAACTGCT GGTCTTTGCT GCATCAAACT TAGCAGATGG TGTGC−3’(配列番号20)
hL243 VKBは、nt154〜312に相補的なhL243VKドメインのマイナス鎖を表している。
5’−CAGCTTGGTC CCTCCACCGA ACGCCCACGG AGTAGTCCAA AAATGTTGAC AATAATATGT TGCAATGTCT TCTGGTTGAA GAGAGCTGAT GGTGAAAGTA TAATCTGTCC CAGATCCGCT GCCAGAGAAT CGCGAAGGCA CACCATCTGC TAAGTTTGA−3’(配列番号21)
hImmu31 VKBACK
5’−GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCATCT CTGAGCGC−3’(配列番号22)
hImmu31 VKFOR
5’−CCGGCAGATC TGCAGCTTGG TCCCTCCACC G−3’(配列番号23)。
[0206]
本実施例におけるhL243VKに関するゲル精製PCR産物を、PvuIIおよびBglHIで制限消化し、軽鎖ステージングベクター、VKpBR2の相補的PvuI/BclI部位内にクローン化した。最終発現ベクターhL243pdHL2は、上記のようにpdHL2へhL243VicおよびVHのXbal−BamHIおよびXhoI/NotI断片それぞれを連続サブクローニングによって構築した。
[0207]
<hL243抗体に対する発現ベクターの構築>
1つの実施例において、最終発現ベクターhL243pdHL2を、先に記述されたように(Losman et al.Cancer,80:2660(1997))、それぞれhL243VxおよびVHのXbal−BamHIおよびXhoI/NotI断片を、pdHL2内に連続サブクローニングすることによって構築した。Gilles et al.(J.Immunol.Methods 125:191(1989))によって記述されたような、発現ベクターpdHL2は、ヒトyl鎖のゲノム配列を含み、したがって、hL243はIgG1/Kイソタイプである。
[0208]
1つの例示的方法において、IgG4/Kのような、他のイソタイプのhL243に対する発現ベクターを構築するために、ヒトγ1鎖のゲノム配列を、PCR増幅によって得たγ4鎖のものと置換した。使用した鋳型は、ATCC CRL−11397細胞から抽出したゲノムDNAであり、プライマー対はP−SacII(5’−CCGCGGTCACATGGCACCA CCTCTCTTGCAGCTTCCACCA AGGGCCC−3’)(配列番号24)およびP−EagI(5’−CCGGCCGTCG CACTCAT TTA CCCAGAGACA GGG−3’)(配列番号25)であった。増幅PCR産物は、TOPO−TAシークエンシングベクター(Invitrogen)へクローン化し、配列はDNAシークエンシングによって確認した。
[0209]
(Kabat番号付けに基づく)点変異、Ser241Proを、γ4配列のヒンジ領域に導入して、IgG4−Abが哺乳動物培養液中に発現した場合に半分子の形成を避けた(Schuurman et al.,Mol.Immunol.38:1(2001))。PstIおよびStuI制限部位間のヒトγ4ヒンジ領域配列(56bp)を、Ser241のためのTCAコドンの、ProのためのCCGへの置換を有する合成DNA断片で置換した。hL243pdHL2中のヒトγ1ゲノム配列を、突然変異誘発y4配列で置換し、結果として、IgG4アイソタイプhL243に対する、hL243γ4PpdHL2と呼ばれる最終発現ベクターを得た。
[0210]
<hL243抗体のトランスフェクションおよび発現>
1つの例示的方法において、およそ30μgのhL243またはhL243γ4Pに対する発現ベクターを、Sailと共に消化することによって直線化し、エレクトロポレーション(450Vおよび25uF)によってSp2/0−Agl4細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を2日間、96ウェルプレート中にまき、次いで、最終濃度0.025pMにて培地中にMTXを加えることによって薬物耐性に関して選別した。2〜3週間、MTX−耐性コロニーがウェル中で出現した。選別を耐えたコロニーの上清を、ELISAアッセイによってヒトAb分泌のためにスクリーンした。簡単に記すと、100ul上清を、GAH−IgG、F(ab’)2断片特異的Abにて先にコートしたマイクロタイタープレートのウェル内に加え、1時間室温にてインキュベートした。未結合のタンパク質を、洗浄緩衝液(0.05%ポリソルベート20を含むPBS)で3回洗浄することによって除去した。HRP−コンジュゲートGAH−IgG、Fc断片特異的Abをウェルに加えた。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。結合したHRP−コンジュゲートAbを、4mMのOPDおよび0.04%のH 22を含む基質溶液の添加後、A 490nmを読むことによって明らかにした。陽性細胞クローンを増殖させ、hL243およびhL243γ4Pを、Protein−Aカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清より精製した。
[0211]
<hL243のAg結合特異性>
1つの実施例において、HL243のAg結合活性および特異性を、細胞表面結合アッセイによって示した。Raji細胞を、飽和濃度の精製hL243(20μg/ml)を含むPBS/BSA(1%)中で、1時間、4℃にてインキュベートした。洗浄後、細胞表面結合hL243を、PE−コンジュゲート2 nd抗体(ヤギ抗ヒトIgG、Fc断片特異的)を含む緩衝液中でRaji細胞をインキュベートし、Guave−PCA系(Guava Technologies,Inc.、Hayword、CA)にて計数することによって検出した。図7で示すように、結合がmL243での細胞のプレインキュベーションによって特異的にブロックされるので、hL243は、mL243によって認識されるRaji細胞上の抗原に結合し、これはmL243のAg結合特異性がヒト化バージョンにて保存されていることを示している。
[0212]
hL243γ4PのAg結合活性
1つの例示的方法において、競合細胞結合アッセイを実施して、親mL243と比較したhL243γ4Pの免疫活性を査定した。一定量の 125I−標識化マウスL243またはhL243γ4P(100,000cpm、−10uCi/ug)を、種々の濃度(0.2〜700nM)の精製hL243γ4PまたはマウスL243の存在下で、4℃にて1〜2時間、ヒトリンパ腫細胞(Raji、DaudiまたはRamos)とインキュベートした。未結合Abを、PBS中で細胞を洗浄することによって除去した。細胞に結合した放射活性を洗浄後決定した。図8で示すように、マウスL243およびhL243γ4P mAbが、細胞表面抗原への結合に関して互いに競合し、これは、これらが同一の抗原性決定基を認識することを示唆している。hL243γ4Pは、mL243よりもよく競合するために、mL243よりも見かけ上約2倍強い結合活性を示した(EC 50 約7nM対約16.5nM)。
[0213]
hL243γ4Pの抗原結合親和定数を、放射標識抗体の直接細胞表面結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析によって決定した。特異的細胞表面抗原結合を測定するために、2つの組の細胞を調製し、それぞれ放射活性の非特異的および総結合を推定するために結合アッセイにて使用した。非特異的結合のための細胞を、放射標識抗体を加える前にすべての表面抗原部位をブロックするために過剰な量の非標識化Abでプレインキュベートし、一方、総結合のためのものは、PBS中でプレインキュベートした。プレインキュベーション後、種々の量の、 125I−hL243γ4Pまたは 125I−mL243いずれかを加え、2×10 5のヒトリンパ腫細胞(Raji、DaudiまたはRamos)とともに、4℃にて2時間インキュベートし、未結合抗体を洗浄により除去した。細胞に結合した放射活性を計数した。所与の濃度の放射標識抗体における放射標識抗体の特異的細胞表面結合を、総結合基質の数より非特異的結合の数から差し引いて計算した。次いでスキャッチャードプロット解析を実施して、細胞あたりのhL243γ4PおよびmL243結合部位の最大数、および平衡結合の見かけ解離定数を決定した。図9にて示すように、hL243γ4PおよびmL243のDaudi細胞への最大結合は実質的に同一であり、約6×10 5分子/細胞であり、これは、これらが同一のAgに結合したことを示している。hL243γ4PおよびmL243に対する見かけ解離定数値は、それぞれ2.6および14nMと計算された。同様の結果が、RajiおよびRamos細胞にて得られた(データは示していない)。

Mode for the Invention 2

[0214]
<hL243γ4P機能性研究>
1つの例示的方法において、インビトロの細胞に基づく研究を実施して、hL243γ4Pがその抗増殖性効果を維持したかどうか、およびエフェクター細胞および補体結合機能が無効にされたかどうかを決定した。この実施例において、以下で記述した研究によって、抗増殖性効果が維持されたが、エフェクター細胞および補体結合機能は無効にされたことが示唆されている。
[0215]
<エフェクター細胞アッセイ>
hL243のFc領域を、IgG4イソタイプFc領域で置換する目的は、Fey−レセプターおよび補体結合を通した、エフェクター細胞機能を無効にすることであった。CDCおよびADCCアッセイを実施して、hL243y4Pによるこれらの機能を査定した。
[0216]
<CDC>
Daudi細胞を、ヒト補体の存在下で2時間、抗体hL243、hL243γ4P、hA20(他の陽性対照として)およびhMN14(陰性対照)の連続希釈とともにインキュベートした。次いで細胞生存を査定するためにレサズリンを添加した。未処理および最大溶解対照両方を含めた。蛍光読み取りをレサズリン添加後5時間得た。得られた蛍光レベルは生細胞の量と直接相関する。%生細胞を式(試験−最大溶解)/(未処理対照−最大溶解)×100によって計算した。結果によって、hL243γ4Pは、hL243(EC 50=2.6nM)およびhA20(EC 50=0.66nM)と比較して、細胞上で任意の補体仲介細胞傷害性効果を産出しないことが示されている。図10を参照のこと。
[0217]
<ADCC>
Daudi細胞を、5μg/mlにてhA20、hL243、hL243γ4PおよびhMN−14とともにインキュベートした。エフェクター細胞を50:1の比で加えた。4時間後、細胞溶解を、LDH放出(図11A)および細胞溶解によってアッセイした(図1IB)。
[0218]
抗体のみの効果がエフェクター細胞上で見られたこれらの結果において、KL243が有意なエフェクター細胞の溶解を誘導し、一方でhL243γ4Pは示さなかったことを見ることができる。特異的溶解数が、エフェクター細胞における効果に補正される場合、hL243γ4Pは、hL243と比較して標的細胞の溶解を非常に減少させたことが示されている(12%対48%)。
[0219]
<インビトロ増殖アッセイ>
MTS生体内還元性(生細胞の数の決定のため)、およびBrdU(DNA合成の間のBrdU組み込みの測定に基づく細胞増殖の定量化のため)両方を用いる多重比色アッセイを実施した。DaudiおよびRaji細胞を、2および3日間、hL243γ4Pの連続希釈とともにインキュベートした。mL243およびhMN−14をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。インキュベーション後、BrdUおよびMTSアッセイを実施した。MTSアッセイの結果を以下に示している。BrdUアッセイが同様の結果を示した。
[0220]
1つの例示的方法において、MTS生体内還元性(生細胞の数の決定のため)、およびBrdU(DNA合成の間のBrdU組み込みの測定に基づく細胞増殖の定量化のため)両方を用いる多重比色アッセイを実施した。DaudiおよびRaji細胞を、2および3日間、hL243γ4Pの連続希釈とともにインキュベートした。マウスL243およびhMN14をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。インキュベーション後、BrdUおよびMTSアッセイを実施した。MTSアッセイの結果を図12および13で示している。BRDUアッセイが同様の結果を示した(示してはいない)。これらの結果によって、hL243γ4PがRajiおよびDaudi細胞株の増殖を阻害することが示される。しかしながら、EBV陰性細胞株Ramosでの同様の実験において、増殖の阻害は、架橋抗Fc(Fab) 2の存在下でのみ観察された。

Mode for the Invention 3

[0221]
<ヒト非ホジキンリンパ腫の異種移植モデルにおけるhL243γ4PおよびmL243(IgG2a)のインビボ効果の比較>
1つの例示的方法において、治療的研究を実施して、ヒト非ホジキンリンパ腫(Raji)の異種移植モデルにおけるヒト化L243−IgG4およびマウスL243−IgG2aモノクローナル抗体イソタイプのインビボ効果を比較した。先のインビトロ研究によって、IgG4イソタイプでのL243−IgG1のFc領域の置換が、抗体のエフェクター細胞機能(ADCCおよびCDC)を無効にし、一方で抗増殖効果を維持することが示された。IgG4イソタイプとして改変された完全なヒト抗HLA−DR抗体を用いた先の研究がまた、Fc部分を介したエフェクター機能のために副作用を最小化し、一方で、長期血液学的影響なしに、非ホジキンリンパ腫の異種移植モデル、および動物モデル(cynomologusサル)におけるインビトロおよびインビボでの素晴らしい殺腫瘍活性が提供されることを示した。Nagy et al.,Nature Medicine,8:801(2002)を参照のこと。したがって、本研究は、hL243−IgG4が、異種移植モデルにおける有意な抗腫瘍効果を維持し得るかどうかを決定することを目的とした。十分な量のhL243−IgG1の非存在下で、mL243−IgG2aを使用した(マウスIgG2aは、補体固定化においてヒトIgG1の等価物であり、ADCCに影響を与える)。
[0222]
SCIDマウスに、250万のRaji細胞を注射した。hL243−IgG4またはmL243−IgG2aでの治療を、腫瘍細胞投与後1日で開始した。生理食塩水または非特異的対照抗体、hMN−14を注射したマウスの両方の群が、17日の中間値生存時間(MST)を有した。ヒト化またはマウスL243いずれかで処理したマウスのすべての群が、生理食塩水またはhMN−14を注射したマウスと比較して、有意に生存期間が改善された(PO.0001)。種々の用量のhL243−IgG4が、用量反応相関となり、より高い用量を得たマウスが、よりよい生存時間であった。種々の用量のmL243 IgG2aで処理した動物の群で、治癒率は、80〜100%の範囲であった。図14を参照のこと。
[0223]
本研究によって、L243の抗腫瘍効果、およびIgG4構造の補体結合活性の除去の同時保持が示された。本研究をマウスで実施したけれども、上記の構築物を用いる有意な治療利点が、自己免疫疾患、リンパ腫または白血病を患っているすべての哺乳動物で達成され得る。特に、上記構築物を、(i)自己免疫疾患およびリンパ腫/白血病を処置するため、家畜動物、特にネコ、イヌおよびウマ、および(ii)自己免疫疾患、リンパ腫および白血病、ならびにHLA−DR発現を伴う免疫調節不全、代謝性疾患および神経変性疾患のためのヒトにて効果的に使用可能である。

Mode for the Invention 4

[0224]
<ヒトおよびイヌリンパ腫の処置にのL243および抗−B細胞MAbとのhL243のインビトロ比較>
0.5mgのhL243(IgG4イソタイプ)試料を、マウスL243との比較、ならびに他の抗B細胞MAbとの比較でリンパ腫細胞株およびイヌB細胞リンパ腫吸引物との反応性に関して試験した。2つの機能的研究もまた実施した。hL243の、イヌリンパ腫吸引物においてアポトーシスを誘導する能力を決定し、hL243の抗増殖活性をNamalwa、リツキシマブに対して耐性であると報告されたヒトリンパ腫細胞株に対して試験した。
[0225]
ヒト化またはキメラMAbの、ヒトB細胞リンパ腫上の結合を、以下のMAb−hMN−14、hLL1、hLL2、hA20 RituxanおよびhL243をFITCヤギ抗−ヒト(GAH)IgG Fcで染色したFluoroscence−Activated Cell Sorter(FACS)を用いるフローサイトメトリーによって測定した。選択した細胞株は、Namalwa(リツキシマブ耐性ヒトB細胞リンパ腫細胞株)、SU−DHL−6(ヒトB細胞非ホジキンリンパ腫)、WSU−FSCCL(EBV−陰性低悪性度ヒトB細胞リンパ腫細胞株)、Raji、DaudiおよびRamos細胞であった。表2で示すように、hL243がすべての上記細胞株に結合した。特に、hL243は、CD20無反応性であるNamalwa細胞に結合し、これは、他のヒト化MAbよりもより結合することを示している。表1を参照のこと。さらに、3H−チミジン取り込みアッセイによって測定したように、hL243は、リツキシマブ耐性ヒトB細胞リンパ腫細胞株、Namalwaにて抗増殖性活性を示した。Immunomedics,Inc.によって開発された、他のCD20抗体、ヒト化A20(hA20)は、リツキシマブ、Rituxan(登録商標)として知られているキメラ抗−CD20に対して同様の結果を示した。Stein et al.(2004)Clin.Cancer Res.10:2868−2878を参照のこと。
[0226]
図16A〜Bで示すように、hL243が、単独で与えられるときに、28%の増殖抑制を産出し、これは、hL243を抗ヒトIgG第二抗体との組み合わせで与えた時に、51%まで増加した。リツキシマブとの組み合わせで使用した場合、活性は、いずれかMAb単独のものよりも大きなレベルまで増加した。図16−Bを参照のこと。
[0227]
研究によって、hL243が、他のヒト化MAbよりもイヌリンパ腫細胞に対して、より大きな結合親和性を有することも示された。表3を参照のこと。さらに、KL243は、サブGO/G1期DNA含量にて%細胞として測定した、抗−ヒトIgG第二抗体と架橋したときに、イヌリンパ腫細胞中でアポトーシスを誘導可能であった。図15を参照のこと。

Mode for the Invention 5

[0228]
hL243抗体組み合わせおよびそれらの効果
方法
<抗体>
1つの例示的方法において、抗HLA−DRモノクローナル抗体、L243を産出しているハイブリドーマ細胞クローンを、ATCC(ATCC番号HB−55)から得た。細胞を、10%FBS(Hyclone)で補充されるHSFM培地(Life Technologies,Inc.)中で培養した。L243のVκおよびVH遺伝子をコードする遺伝子をRT−PCRによってクローン化した。ヒト化L243(IgG1/κイソタイプ)、hL243γ1を、先に記述されたように(Leung et al.,Hybridoma 13:469(1994)、Leung et al.,Mol.Immunol.32:1413(1995),Stein et al.,Blood 104:3705(2004);Govindan et al.,Breast Cancer Res.Treat.84:173(2004))、同様に産出した。
[0229]
hL243のIgG4/κイソタイプ、hL243γ4pを、ヒトγ1鎖に対する配列をコードする重鎖定常領域をγ4鎖のものと置換することによって構築可能である。点変異、Ser241Pro(Kabat番号付けに基づく)を、抗体が発現され哺乳動物細胞培養液中で産出される場合に、半分子の形成を避けるために、γ4配列のヒンジ領域内に組みこんだ(Schuurman et al.,Mol.Immunol.38:1(2001))。本研究で使用した他のMAbは、たとえばIDEC Pharmaceuticals Corp.(San Diego,CA)から購入したリツキシマブ、イムノメディックス社(Immunomedics,Inc,)によって提供されるhMN−14またはラベツズマブ(ヒト化抗がん胎児性抗原IgG1)であった。陰性イソタイプ対照としてここで使用したhMN−14の構築および特性化はすでに記述されている。
[0230]
<細胞>
例示的細胞株をいくつかの研究で使用した。たとえば、Burkittリンパ腫株、Daudi、RajiおよびRamosを、American Type Culture Collection(Manassas,VA)より購入した。非バーキットリンパ腫細胞株を以下のように得た。染色体転座t(14:18)を含むRLおよびSU−DHL−6はそれぞれ、John Gribben博士(Dana−Farber Cancer Institute,Boston,MA)およびAlan Epstein博士(University of Southern California,Los Angeles,CA)より得た。細胞株SU−DHL−4、SU−DHL−10およびKarpas422は、Myron Czuczman博士(Roswell Park Cancer Institute,Buffalo,NY)より提供され、WSU−FCCLおよびDoHH2細胞株は、Mitchell Smith博士(Fox Chase Cancer Center,Philadelphia,PA)より得た。細胞は、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびL−グルタミン(2mM)で補充されるDMEM(Life Technologies,Gaithersburg,MD)(完全培地)中の上清培養液として増殖させた。
[0231]
<hL243−MAbの抗原結合特異性>
hL243γ1の抗原結合活性および特異性を、細胞表面結合アッセイによって示した。Raji細胞を、飽和濃度の精製hL243(20μg/ml)を含むPBS/BSA(1%)中で、4℃にて1時間インキュベートした。洗浄後、細胞表面結合hL243γ1を、Raji細胞をPE−コンジュゲート第二抗体(ヤギ抗ヒトIgG、Fc断片特異的)を含む緩衝液中でインキュベートし、たとえばGuave PCAシステム(Guava Technologies,Inc.,Hayword,CA)で計数することによって検出した。
[0232]
競合細胞結合アッセイを実施して、親mL243と比較してhL243γ4Pの活性を査定した。定量の 125I−標識化マウスL243またはhL243γ4P(100,000cpm、約10μCi/μg)を、種々の濃度(0.2〜700nM)の精製hL243γ4PまたはマウスL243の存在下で、4℃にて1〜2時間、ヒトリンパ腫細胞(Raji、DaudiまたはRamos)とともにインキュベートした。未結合MAbは、細胞をPBS中で洗浄することによって除去された。細胞に関連した放射活性を洗浄後に決定した。
[0233]
1つの実施例において、hL243γ4Pの抗原結合親和性定数を、放射標識化抗体の直接細胞表面結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析によって決定した。細胞表面抗体結合を測定するために、2つの組の細胞を調製し、結合アッセイで使用して、それぞれ放射活性の非特異的および総結合を推定した。非特異的結合のための細胞は、放射標識化抗体を添加する前にすべての表面抗原部位をブロックするために過剰量の未標識MAbとプレインキュベートし、一方で、総結合のための細胞は、PBS中でプレインキュベートした。プレインキュベーションの後、種々の、 125I−hL243γ4Pまたは 125I−mL243いずれかを加え、2×10 5ヒトリンパ腫細胞(Raji、DaudiまたはRamos)とともに、4℃にて2時間インキュベートし、未結合抗体を洗浄によって除去した。細胞関連放射活性を計数した。所与の濃度の放射標識抗体での放射標識抗体の特異的細胞表面結合を、総結合の数から非特異的結合の数を引いて計算した。
[0234]
<フローサイトメトリーアッセイ>
免疫フェノタイピング:間接免疫蛍光アッセイを、特にすでに記述したように、FITC−ヤギ抗−ヒトIgG(Tago,Inc.,Burlingame,CA)を用いて、上述の細胞株のパネルで実施し、FACSCaliber(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いてフローサイトメトリーによって解析した。
[0235]
アポトーシスの試料解析:細胞DNAのフローサイトメトリー解析を、ヨウ化プロピジウム染色に続いて実施した。細胞を24ウェルプレート(5×10 5細胞/ウェル)に置き、続いてMAb(5μg/ml)で処理した。3つのウェルをそれぞれのMAbで調製し、抗−マウスまたはヤギ抗−ヒト二次抗体での架橋の効果を研究した。一次MAbとの20分間インキュベーション(37℃、5% CO 2)に続いて、F(ab’) 2ヤギ抗−マウスIgG Fcγ特異的二次抗体(Jackson Laboratories,West Grove,PA)を、それぞれの一次MAbからの1つのウェルに加えて、二次抗体濃度を20μg/mlに調節した。F(ab’) 2ヤギ抗ヒトIgG−Fcγ特異的(Jackson Laboratories)を同様に、各一次MAbからの第二ウェルに加え、第三の組の容量を培地の添加によって平衡化した。48時間のインキュベーション(37℃、5% CO 2)に続いて、細胞を試験チューブに移し、PBSで洗浄し、次いで低張ヨウ化プロピジウム溶液(0.1% クエン酸ナトリウム、0.1% Triton X−100中の50mg/mlヨウ化プロピジウム)中に再懸濁した。試料を、FACSCaliberを用いるフローサイトメトリーによって解析した。アポトーシス細胞の割合を、G1/G0ピーク前のDNA染色での細胞の割合(低二倍体)として定義した。
[0236]
<hL243の構築および特性化>
1つの例示的方法において、2つのヒト化抗DR−MAbを産出した。hL243γ1を、ヒトIgG1/κ定常状態を有するように設計し、hL243γ4Pを、ヒトγ1鎖に関する配列をコードする重鎖定常領域をヒトγ4鎖のものと置換することによって構築した。点変異Ser241Proを、抗体が哺乳動物細胞培養液中で発現し産出されるときに、半−分子の形成を減少させるために、γ4配列のヒンジ領域内に導入した(Schuurman et al.,Mol Immunol.38:1(2001))。2つのヒト化L243抗体、γ1およびγ4Pの、Raji細胞に結合する能力を図7、8および17で示している。図7において、Raji細胞に結合しているhL243γ1は、親マウスL243(mL243)での細胞のプレインキュベーションによって特異的にブロックされており、これは、mL243の抗原結合特異性が、ヒト化バージョンで保存されていることを示唆している。
[0237]
1つの実施例において、親mL243と比較したhL243γ4Pの反応性を査定し、競合細胞結合アッセイを実施した。一定量の 125I−標識化mL243またはhL243γ4Pを、種々の濃度の精製hL243γ4PまたはmL243の存在下で、ヒトリンパ腫細胞(Raji、DaudiまたはRamos)とともにインキュベートした。図8で示すように、mL243およびhL243γ4P−MAbは、細胞表面抗原に対する結合に関して互いに競合し、これは、共通の抗原性決定基の認識を示唆している。hL243γ4Pは、mL243と比べて明らかにおよそ2倍強い結合活性を有した(EC 50約7nM対約16.5nM)。細胞あたりのhL243γ4PおよびmL243の結合部位の最大数、および平衡結合の明白な解離定数をスキャッチャードプロット解析によって決定した。図17で示すように、hL243γ4PおよびmL243のDaudi細胞への最大結合は、実質的に同一であり、およそ6×10 5分子/細胞であり、共通抗原への結合と一致する。hL243γ4PおよびmL243に対する明白な解離定数値が、それぞれ2.6nMおよび14nMであると計算された。同様の結果が、RajiおよびRamos細胞で得られた(データは示していない)。
[0238]
<培養リンパ腫細胞の抗原発現>
1つの例示的方法において、フローサイトメトリー解析を、hL243γ4Pが、培養ヒトB細胞リンパ腫のパネルに結合することを示すために、間接免疫蛍光染色を用いて実施した。他の表面抗原に対する比較を示している。表4で見られるように、hL243γ4P MAbは、すべての試験した細胞株に結合する。より強い発現が、DaudiおよびRajiで観察されたが、蛍光染色のレベルは、すべての細胞株で強力である。結合を、他のB細胞抗原(CD74、CD22、CD20)に対するヒト化MAb、マウス−ヒトキメラ抗−CD20 MAbリツキシマブ、およびヒト化抗−CEA MAb(陰性対照)のものと比較した。hL243γ4Pでの染色は、すべての7つの細胞株においてCD22およびCD74のものより顕著に大きい。CD20染色は、ヒト化(hA20)およびキメラ(リツキシマブ)MAbとの反応性によって示されたようにより変化した。バーキット株、Daudi、RajiおよびRamosは、中間レベルのCD20を発現しており、一方瀘胞性およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫株は変化に富んで査定された。hL243γ4P結合によって測定されたHLA−DR発現と比較して、SU−DHL−6はより大きなCD20発現をし、NamalwaおよびWSU−FSCCLはより低いCD20発現をし、RLは両方の抗原をほぼ等しく発現する。
[0239]
<エフェクター細胞アッセイ>
1つの実施例において、hL43のFc領域を、Fcレセプターおよび補体結合を介したエフェクター細胞機能を抑制するために、IgG4イソタイプFc領域と置換した。CDCおよびADCCアッセイを実施してこれらの機能を査定した。
[0240]
他の例示的方法において、CDC Daudi細胞を、ヒト補体の存在下で2時間、抗体hL243γ1、hL243γ4P、hA20(他の陽性対照として)、およびhMN14(抗CEA、陰性対照)の連続希釈とともにインキュベートした。これに続いて、細胞生存を査定するために、レサズリンを添加した。未処理および最大溶解対照両方を含めた。蛍光読み取りをレサズリン添加の5時間後に得た。得られた蛍光レベルは、生存細胞の数に直接相関する。この結果、hL243γ4Pは、CMCが観察されたhL243γ1(EC 50=2.6nM)およびhA20(EC 50=0.66nM)と比較して細胞において、補体−仲介細胞傷害性効果を産出しないことが示唆される。
[0241]
ADCCの誘導をまた、カルセインAM放出によってRaji、DaudiおよびSU−DHL−6中で測定した。hL243γ4Pの活性を、陽性対照として、マウスL243とリツキシマブのものと比較した。予想されたように、リツキシマブおよびマウスL243は、陰性対照(MAbなし、およびマウスおよびヒト化MN−14)よりも、有意により細胞融解を誘導したが、hL243γ4Pはしなかった(図19)。
[0242]
<インビトロ抗増殖効果>
1つの実施例において、細胞増殖におけるhL243の効果を、Raji、FSCCLおよびNamalwa上での 3H−チミジン取り込みアッセイを用いて査定した(図20Bおよび表5)。hL243γ4Pの効果を、架橋抗Fc抗体の存在下または非存在下で、リツキシマブおよびhL243γ4Pと組み合わせたリツキシマブのものと比較した。リツキシマブに対して比較的不感受性であることがすでに示されたFSCCLにおいて、hL243γ4pが、リツキシマブと比較してより大きな増殖の阻害を有意に産出した。Ramosにおいて、hL243およびリツキシマブ活性は同様であり、組み合わせは、いずれかのみよりも効果的であった。組み合わせは、相乗効果を有し得る。抗ヒトFc抗体との架橋が、Ramosにて見られる有意な抗増殖活性のために必要である。Namalwaにおいて、FSCCLでと同様に、hL243γ4Pがリツキシマブよりも有意に大きな増殖の阻害を産出し、リツキシマブおよびhL243γ4Pの組み合わせが、いずれかのMAbのみよりも有意により増殖の阻害を産出した。
[0243]
<アポトーシス誘導の査定>
1つの例示的方法において、hL243γ4p誘導細胞死アッセイの機構を、種々のアポトーシスマーカーを測定することによって評価して実施した。これらには、DNA断片化の誘導、Annexin V/7−AAD染色、活性化カスパーゼ−3の測定、ミトコンドリア膜電位の欠損およびAKT生存経路の活性化が含まれた。
[0244]
他の実施例において、DNA断片化を、SU−DHL−6およびNamalwaにおけるフローサイトメトリーによって評価した。細胞を、架橋のために第二MAbあり、またはなしで48時間MAbとともに培養し、続いてヨウ化プロピジウムでDNA染色した。細胞をフローサイトメトリーによって解析し、G1領域以下の陽性蛍光がDNA断片化を表し、アポトーシスの測定である。hL243γ4Pの活性を、抗CD74(hLL1)、抗CD22(hLL2、エプラツズマブ)、抗CD20(hA20)ならびにマススヒトキメラMAb リツキシマブを含む他のB細胞抗原に対するヒト化MAbのものと比較した。対照には、第一MAbを含まず、陰性対照はヒト化抗CEA MAb、hMN−14が含まれた。hL243γ4Pは、他の抗B細胞MAbと同様か、以上のレベルで両方の細胞株でアポトーシスを誘導した(図21Aおよび21B)。
[0245]
1つの特定の実施形態において、Daudi細胞内でのアポトーシスおよび非アポトーシス死細胞を見分けるために、キットを使用した(たとえばGuava Nexin(商標)キット)。本実施例において、キットは、アポトーシス細胞の外膜上のホスファチジルセリン(PS)を検出するためにAnnexin−V−PEを、そして膜構造の完全性の指標として、細胞不透過色素7−AADを使用する。7−AADは、生、健康細胞および早期アポトーシス細胞からは除外されるが、後期ステージアポトーシスおよび死細胞では透過される。図21Bで示すように、本研究の結果は、hL243γ4Pが、4時間および24時間処理両方にて、mL243と同様にアポトーシスを誘導したことを示唆した。反対に、抗CD20−MAbはDaudiにて測定可能なアポトーシスを誘導しなかった。したがって、抗−ヒトIgGまたはプロテインAのような二次薬剤によるハイパー架橋が、Daudiを含む多くの細胞株にて抗CD20−MAbによるアポトーシスの誘導のために使用され得る。
[0246]
他の実施例において、ミトコンドリア電位におけるヒト化およびマウスL243の効果を、SU−DHL−6、Daudi、Raji、WSU−FSCCL、RLおよびNamalwaと呼ばれる異なる細胞にて研究した。結果は図22で示しており、ミトコンドリア膜電位のアポトーシス変化が、マウスおよびヒト化L243−MAb両方で観察されたことを示唆している。二次抗体との架橋は必要ではないが、評価した6細胞株のうち2つ、FSCCLおよびNamalwaにて効果を増加させることができた。hL243γ4Pによって誘導されたミトコンドリア膜電位の欠損は、架橋剤なしで抗−CD20 MAb(hA20)のものよりも大きかった。hA20との架橋により、レベルが6細胞株のうち3つ(RL、SU−DHL−6およびDaudi)にてhL243γ4Pのものまで増加する。
[0247]
1つの実施例において、ヒト化およびマウスL243による活性化カスパーゼ−3の誘導をリンパ腫細胞株のパネルにおいてフローサイトメトリーによってアッセイした。表6にて要約した結果は、マウスおよびヒト化L243両方が二次抗体との架橋の非存在下で、同様のレベルにて、カスパーゼ−3の活性化を誘導することを表している。活性化カスパーゼ−3のL243−MAbでの誘導は、すべての細胞株で、hA20のものよりも大きい。二次抗体にて、これらのレベルは増加し、hA20の効果はNamalwaおよびFSCCLを除いて、hL243γ4Pのものと同様であり、この2つの細胞株では、抗CD20−MAbに対して比較的不感受性であることがすでに観察されている。開裂カスパーゼ−3をまた、2日間の時間経過にわたりDaudiにてアッセイした(図23A)。活性は、L243γ4Pインキュベーションのおよそ2日間、増加を続ける。1時間未満の時間点は実施しなかった。
[0248]
1つの実施例において、L243の活性機構におけるAKTの関与を、フローサイトメトリーによって6つの細胞株でアッセイした。細胞を種々のMAbとともに2日間インキュベートし、次いでリン酸化AKTに関してアッセイした。表7にて列挙した結果は、L243が、すべての細胞株でAKTを活性化することを示している。抗−CD20、hA20、処理細胞ならびに抗−CD74および抗−CD20処理細胞(示していない)におけるリン酸化AKTレベルが、すべての細胞株において未処理細胞と同様である。P−AKT活性化の時間経過を決定するために、Daudi細胞を種々の時間、MAbとともにインキュベートし、MAbを0分〜2日の時間点で(遠心によって)除去した(図23B)。これらの結果は、0時間点においてさえ、P−AKTレベルが2日時間点と等しいので、L243によるAKTの活性化が本アッセイによって測定可能であるよりも早くに発生可能であることを示している。
[0249]
<非ホジキンリンパ腫(Raji)の異種移植モデルにおけるhL243のインビボ治療効果>
1つの例示的方法において、治療研究を実施して、ヒト非ホジキンリンパ腫(Raji)の異種移植モデルにおけるhL243γ4PおよびmL243(IgG2aイソタイプ)モノクローナル抗体のインビボ効果を比較した。本研究の目的は、異種移植モデルにおいてhL243γ4Pが有意な抗腫瘍効果を維持可能であるかどうかを決定することであった。SCIDマウスに、2.5×10 6のRaji細胞を注射した。hL243γ4PまたはmL243での治療を腫瘍細胞投与後1日で開始した。結果を図24に示している。生理食塩水または非特異的対照抗体、hMN14を注射した両方の群のマウスが、17日の中間生存時間(MST)であった。ヒト化またはマウスL243いずれかで処理したすべての群のマウスが、生理食塩水またはhMN14を注射したマウスと比べて有意に生存時間が改善された(P<0.0001)。種々の用量のhL243γ4Pでの処理が、結果として、用量反応性の関係となり、より高用量を与えられたマウスがより生存時間が長かった。種々の用量のmL243−IgG2aで処理した動物の群において、治癒率は、80〜100%の範囲であった。
[0250]
[Table 1]


[0251]
[Table 2]


[0252]
[Table 3]


[0253]
[Table 4]


[0254]
[Table 5]


[0255]
[Table 6]


[0256]
[Table 7]


[0257]
本明細書で開示され、請求されたすべての組成物および/または方法および/または装置は、本開示物に関して必要以上の実験なしで、作成し、実施することが可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記述されている一方で、当業者にとって、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で記述した方法の段階、または連続段階において、変更を組成物および/または方法および/または装置に適用してもよいことが明らかである。より詳しくは、化学的および生理学的両方に関連した特定の薬剤を、本明細書で記述された薬剤で置換してもよく、同一または同様の結果が達成されることが明らかである。すべてのそのような同様の置換および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義されたような本発明の精神、範囲および概念内であると考えられることが明らかである。

Brief Description of Drawings

[0258]
[fig. 1] (また配列番号1および配列番号2)は、マウス抗HLA−DR抗体L243のVKをコードするDNAおよびアミノ酸配列を例示している。推定CDR領域に下線を引き、示唆している。ヌクレオチド残基を連続的に番号付けする。KabatのIg分子番号付けをアミノ酸残基のために使用する。文字(上部)を有する残基に対する番号付けは、先行する残基の数+文字であり、たとえばN52に続くTに対する数字は52Aであり、82に続くN、NおよびLの数字はそれぞれ82A、82Bおよび82Cである。
[fig. 2] (また配列番号3および配列番号4)は、マウス抗HLA−DR抗体L243のVHをコードするDNAおよびアミノ酸配列を例示している。推定CDR領域に下線を引き、示唆している。ヌクレオチド残基を連続的に番号付けする。KabatのIg分子番号付けを、上述のようにアミノ酸残基のために使用する。
[fig. 3] (また配列番号5および配列番号6)は、ヒト化L243VRのDNAおよびアミノ酸配列を例示している。アミノ酸配列の太字および下線区画が、Kabat番号付けスキームによって定義されたように、CDRを示唆している。
[fig. 4] (また配列番号7および配列番号8)は、ヒト化L243VHのDNAおよびアミノ酸配列を例示している。アミノ酸配列の太字および下線区画が、Kabat番号付けスキームによって定義されたように、CDRを示唆している。
[fig. 5] (また配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12)は、ヒトRF−TS3およびNEWM(フレームワーク4)、マウスL243およびhL243 VH鎖のアミノ酸配列アライメントを例示している。点線は、L243における残基を示し、そのヒト化バージョンはRF−TS3またはNEWMにおける対応する残基に同一である。破線は、アライメントを補助するために導入されたギャップを示している。四角は、CDR領域を示している。hL243のNおよびC末端残基両方が、使用したステージングベクターによって固定されている。したがって、L243の相当する末端残基を、ヒトVH配列のものとは比較していない。
[fig. 6] (また配列番号13、配列番号14および配列番号15)は、ヒトREI、マウスL243およびhL243のVK鎖の例示アミノ酸配列アライメントを例示している。点線は、REI中の相当する残基と同一であるL243中の残基を示唆している。破線は、アライメントを補助するために導入されたギャップを示している。四角は、CDR領域を表している。hL243のNおよびC末端残基両方が、使用したステージングベクターによって固定されている。したがって、L243の相当する末端残基を、ヒト配列のものとは比較していない。Kabat番号付けスキームを使用する。
[fig. 7] hL243の例示抗原結合特異性を例示している。(細胞表面抗原(「Ag」)部位をブロックするために)飽和濃度mL243とともに、またはなしでプレインキュベートしたRaji細胞を、1%BSAおよび10μg/mlの精製hL243を含むPBS中に再懸濁させ、4℃にて1時間インキュベートした。洗浄後、細胞を1%BSAおよびPE−標識化ヤギ抗ヒトIgG、Fc断片特異的抗体を含むPBS中に再懸濁した。さらに4℃にて30分間のインキュベーション後、細胞を、Guava−PCA中で計数した。(A)は、L243での細胞のプレインキュベーションによってブロックされた(青色トレース)、Rajiヒトリンパ細胞に対するhL243の特異的結合(赤トレース)を示している。(B)は陰性結合対照であり、同一の条件下、hL243の代わりに抗CEA抗体(hMN−14)で実施する。
[fig. 8] 競合的細胞表面結合アッセイ中でhL243γ4PおよびmL243を比較している例示Ag結合親和力を例示している。一定量(100,000cpm、−10uCi/ug)の 125I−標識化mL243(A)またはhL243γ4P(B)を、種々の濃度(0.2〜700nM)の非標識化hL243γ4P(A)またはmL2343(*)と混合した。この混合液をRaji細胞に加え、室温にて2時間インキュベートした。細胞を洗浄して、非結合抗体を除去し、細胞に関連した放射活性を計数した。hL243γ4PおよびmL234が、細胞表現Agの結合に対して互いに競合することが示された。両方の場合で、hL243γ4Pが、mL243よりも強くRaji細胞に結合することが明らかになった。
[fig. 9] 直接細胞表面飽和結合およびスキャッチャードプロット解析によって決定されたhL243γ4PおよびmL243の例示Ag結合親和力を例示している。種々の濃度の 125I−標識化mL243(>>)またはhL243γ4P(A)を、4℃にて2時間、2×10 5Daudiヒトリンパ腫細胞とともにインキュベートし、未結合放射活性を洗浄によって細胞上清より除去した。細胞関連放射活性を計数し、放射標識化抗体の細胞表面抗原への特異的な結合を計算し、次いでスキャッチャードプロット解析を適用して、細胞あたりの結合部位の最大数、および明確な抗原結合親和定数を決定した。mL234またはhL243γ4Pの、Daudi細胞表面への最大結合は、6×10 6分子/細胞であった。mL234またはhL243γ4Pに関して決定した解離定数は、それぞれ14および2.6nMであった。
[fig. 10] ヒト血清補体の存在下で、例示h243が標的細胞を殺傷することにおいて効果的であることを例示している。Daudi細胞を、ヒト血清補体の存在下で、hL243、hL243γ4P、hA20(陽性対照)、およびhMN−14(陰性対照)とともにインキュベートした。hL243γ4Pは、任意の補体誘導細胞毒性を産出しないことが示された。
[fig. 11] hL243、hL243γ4P、hA20(陽性対照)および1 hMN−14(陰性対照)に関して観察したように、ADCCによる例示LDH放出(A)および%細胞溶解(B)を例示している。
[fig. 12] 図12A〜Bは、2日の終了時点で、DaudiおよびRaji細胞株上での例示インビトロ増殖アッセイを例示している。
[fig. 13] 図13A〜Bは、3日の終了時点で、DaudiおよびRaji細胞株上での例示インビトロ増殖アッセイを例示している。
[fig. 14] hL243γ4Pを注射したがんを有するSCIDマウスに関する例示中間生存時間を例示している。
[fig. 15] L243、hL243(IgG4イソタイプ)、hMN−14(ヒト化MN−14 IgG)、およびAg8(マウスミエローマ由来mAb)によって引き起こされた(サブGO/G1相DNA含量での%細胞として測定)イヌリンパ腫細胞におけるアポトーシスの例示比較誘導を例示している。それぞれヤギ抗マウス(GAM)およびヤギ抗ヒト(GAH)抗体と架橋した時に、L243およびhL243がアポトーシスを引き起こした。
[fig. 16] 図16A〜Bは、 3H−チミジン取り込みアッセイによって決定したような、NamalwaヒトB細胞リンパ腫細胞株上での、ヤギ抗ヒトIgG(GAH)の有無での、ヒト化抗体(hLL1、hLL2、Rituximab、hA20、hMN−14およびhL243(IgG4イソタイプ)の例示抗増殖効果を例示している。
[fig. 17] 親マウスL243に関連したhL243γ4Pの結合特性を例示している。
[fig. 18] 図18Aおよび18Bは、本明細書で開示された様々な抗体に暴露した時のRaji、RamosおよびNamalwa細胞株中でのCDCアッセイを例示している。
[fig. 19] SU_DHL−6細胞を、本明細書で開示された様々な抗体に暴露したときのADCCアッセイおよびカルセインAM放出を例示している。
[fig. 20] 図20Aおよび20Bは、本明細書で開示されたいくつかの細胞株におけるhL243γ4Pの抗−増殖効果を例示している。A.MTT試験およびB. 3H−チミジン取り込みアッセイ。B.の軸ラベルにおいて、hL243はγ4Pを形成することを指す。
[fig. 21] 図21Aおよび21Bは、アポトーシスの誘導を例示しており、死細胞は白の棒グラフで示しており、アポトーシス細胞は黒の棒グラフで例示されている。A.SU−DHL−6およびNamalwa細胞中でのサブG0 DNAの測定、およびB.4および24時間の時点でのアネキシンV/7−ADD。使用した細胞は、処理の前で、97%生存率であった。
[fig. 22] いくつかの細胞株におけるJC−1アッセイを用いるミトコンドリア膜電位を例示している。
[fig. 23] 図23Aおよび23Bは、Daudi細胞における開裂カスパーゼ−3(A)およびP−AKT(B)時間経過研究を例示している。
[fig. 24] マウスL243およびL243γ4PでのRaji−SCIDマウスの治療を例示している。

Claims

[1]
配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインおよび 配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含むヒト化L243抗体またはその抗原結合断片であって 、前記ヒト化L243抗体が、マウスL243抗体よりも強い結合活性によりHLA−DR 細胞上のHLA−DRのうちの少なくとも1つのエピトープに結合できる能力を有する、ヒト化L243抗体またはその抗原結合断片。
[2]
請求項1に記載の抗体を含む薬学的組成物。
[3]
1つ以上のペプチド、脂質、重合化担体、ミセル、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ、および1つ以上のエフェクターにコンジュゲートした、請求項2に記載のヒト化L243抗体を含む薬学的組成物。
[4]
前記組成物が免疫コンジュゲート体である、請求項3に記載の薬学的組成物。
[5]
前記抗体が、1つ以上の脂質にコンジュゲートしている、請求項3に記載の薬学的組成物。
[6]
1つ以上の腫瘍関連抗原に特異的に結合する、1つ以上の追加的結合分子をさらに含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[7]
前記ヒト化L243抗体が、HLA−DRに対する特異性を少なくとも1つ有し、残りの特異性は、1つ以上の腫瘍関連抗原に結合する追加的結合分子に特異的に結合するペプチドに対するものである、請求項3に記載の薬学的組成物。
[8]
前記エフェクターが、治療薬剤または診断薬剤を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[9]
前記エフェクターが、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、放射性同位体、免疫調節物、サイトカイン、ホルモン、結合分子、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、光力学薬剤またはこれらの混合物を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[10]
前記エフェクターが、FUdR、FUdR−dOまたはこれらの混合物を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[11]
グループII、グループIII、グループIV、グループV、遷移、ランタニドまたはアクチニド金属カチオンまたはこれらの混合物から選択されるカチオンをさらに含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[12]
Tc、Re、Bi、Cu、As、Ag、Au、At、Pbまたはこれらの混合物から選択されるカチオンをさらに含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[13]
NOTA、DOTA、DTPA、TETA、Tscg−Cys、Taca−Cys、またはこれらの混合物をさらに含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[14]
前記エフェクターが、放射性核種を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[15]
前記エフェクターが、酵素を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[16]
前記エフェクターが、免疫調節物を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[17]
前記エフェクターが、抗血管新生薬剤を含む、請求項3に記載の薬学的組成物。
[18]
前記抗体が、前記抗体が、1つ以上の治療薬剤、診断薬剤またはこれらの混合物にコンジュゲートしている、請求項3に記載の薬学的組成物。
[19]
請求項18の組成物を含むキット。
[20]
前記ヒト化L243抗体またはその抗原結合断片がヒトIgG4またはその断片であって、前記IgG4のヒンジ領域はSer241Pro点突然変異を有する、請求項1に記載のヒト化L243抗体またはその抗原結合断片。

Drawings

[ Fig. 1]

[ Fig. 2]

[ Fig. 3]

[ Fig. 4]

[ Fig. 5]

[ Fig. 6]

[ Fig. 7]

[ Fig. 8]

[ Fig. 9]

[ Fig. 10]

[ Fig. 11]

[ Fig. 12]

[ Fig. 13]

[ Fig. 14]

[ Fig. 15]

[ Fig. 16]

[ Fig. 17]

[ Fig. 18]

[ Fig. 19]

[ Fig. 20]

[ Fig. 21]

[ Fig. 22]

[ Fig. 23]

[ Fig. 24]

配列表