Some content of this application is unavailable at the moment.
If this situation persist, please contact us atFeedback&Contact
1. (FR3066503) PROCEDE D'ANALYSE DE MICROORGANISMES
Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters
Procédé d'analyse de microorganismes
Description
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est la caractérisation de microorganismes, notamment la caractérisation de levures ou de bactéries.
ART ANTERIEUR L'utilisation de microorganismes tels des levures ou des bactéries, ou leurs dérivés, trouve de nombreuses applications dans de nombreux domaines. Dans le domaine de l'agroalimentaire, par exemple, l'utilisation de levures est répandue dans différents secteurs, tels la boulangerie, la production de vin, la brasserie ou encore la fabrication de produits laitiers. L'application de levures ou de bactéries concerne de nombreux aliments par le biais de probiotiques, ces derniers étant par exemple ajoutés à des céréales ou à des aliments pour animaux. En dehors de l'agroalimentaire, de nombreux domaines industriels peuvent mettre en œuvre des microorganismes. Il s'agit par exemple de l'agriculture ou de l'horticulture, avec le développement de produits phytosanitaires ou de fertilisants plus respectueux de l'environnement, ou encore de la production de biocombustibles obtenus à partir de végétaux. D'autres applications concernent le domaine de la pharmacie et du diagnostic médical. A des fins de contrôle qualité, l'étape de caractérisation de tels microorganismes constitue un maillon essentiel de la chaîne de production. Des contrôles microbiologiques sont fréquemment utilisés, sur des échantillons prélevés dans des milieux de culture, de façon à détecter et dénombrer les microorganismes vivants. La mise en culture sur des boîtes de Pétri est toujours très utilisée, mais comporte certains inconvénients, en particulier la préparation, la durée de l'analyse et l'impossibilité de détecter des microorganismes vivants et non cultivables.
Des techniques par dénombrement direct ont été développées, en utilisant par exemple des marqueurs de viabilité aptes à faire varier les propriétés optiques de microorganismes de façon différente selon qu'ils sont morts ou vivants. De tels marqueurs peuvent agir sur la couleur ou une propriété de fluorescence des microorganismes examinés. Mais l'étape de détection, effectuée au microscope, est généralement longue, le champ d'observation étant faible.
La publication Feizi "Rapid, portable and cost effective yeast cell viability and concentration analysis using lensfree on-chip microscopy and machine learning", Lab Chip, 2016, 16, 4350-4358, décrit une méthode de caractérisation de levures Saccharomyces cerevisiae, basé sur la microscopie sans lentille. Le dispositif présenté est simple, et permet de discriminer les levures mortes des levures vivantes en offrant un champ d'observation élevé. Du bleu de méthylène est préalablement mélangé au milieu de culture dans lequel baignent les levures examinées. Le procédé comporte l'acquisition d'une image du milieu de culture par un capteur d'image, et l'application d'un opérateur de propagation holographique à l'image acquise en considérant de multiples distances de propagation, de façon à effectuer une focalisation numérique, ce qui permet d'établir une distance dite optimale. Lorsque la distance optimale est obtenue, chaque levure est classifiée selon une catégorie vivante ou morte en fonction d'un indicateur établi à partir d'une image reconstruite à ladite distance optimale.
Les inventeurs ont proposé une alternative à cette méthode, de façon à effectuer une classification entre des microorganismes morts et vivants selon un procédé simple et peu coûteux en temps de calcul. Par ailleurs, comme décrit dans la description, le procédé permet une analyse plus aboutie des microorganismes vivants.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un procédé d'analyse de microorganismes, les microorganismes étant disposés dans un échantillon, l'échantillon comportant un marqueur de viabilité, apte à modifier une propriété optique des microorganismes de façon différente selon qu'ils sont morts ou vivants, le procédé comportant les étapes suivantes :
a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation;
b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination ;
le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) détermination de positions radiales de différents microorganismes dans un plan parallèle au plan de détection, chaque position radiale étant associée à un microorganisme ;
d) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à calculer au moins une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse d'exposition, à chaque position radiale déterminée lors de l'étape c), et à une pluralité de distances du plan de détection;
e) formation d'un profil, représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape d) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par chaque position radiale déterminée lors de l'étape c), chaque profil étant associé à un microorganisme ;
f) en fonction de chaque profil formé lors de l'étape e), identification des microorganismes vivants.
Par grandeur caractéristique, on entend par exemple un module ou une phase de l'onde lumineuse d'exposition, ou leur combinaison.
Par application d'un opérateur de propagation à partir d'une image, on entend que l'opérateur de propagation est appliqué à ladite image ou à une image résultant d'une transformation de ladite image, par exemple une racine carrée de ladite image, ainsi qu'une éventuelle normalisation de l'image. L'étape f) peut comporter une identification des microorganismes morts.
Selon un mode de réalisation, le procédé comporte suite à l'étape f), une étape g) d'analyse de la faculté du microorganisme à se diviser, l'étape g) comportant les sous-étapes suivantes pour au moins un microorganisme considéré comme vivant lors de l'étape f):
gi) obtention d'une première image d'observation de l'échantillon, à un premier instant, l'image d'observation comportant des régions d'intérêt respectivement associées à des microorganismes, et détection d'une région d'intérêt associée audit microorganisme ;
gii) acquisition d'une image de l'échantillon à un deuxième instant, postérieur au premier instant, et obtention d'une deuxième image d'observation de l'échantillon à partir de l'image acquise au deuxième instant ;
giii) détection, sur la deuxième image d'observation, d'une région d'intérêt correspondant au microorganisme ;
giv) comparaison des régions d'intérêt détectées lors des sous-étapes gi) et giii) ;
gv) détermination de la faculté du microorganisme à se diviser en fonction de la comparaison effectuée lors de la sous-étape giv). L'étape g) permet alors d'identifier, parmi les microorganismes identifiés comme étant vivants, les microorganismes viables et non cultivables. Elle peut être appliquée à chaque microorganisme considéré comme vivant suite à l'étape f).
Lors des sous-étapes gi) et gii), la première image d'observation et la deuxième image d'observation peuvent être obtenues par application d'un opérateur de propagation respectivement à partir d'une image acquise au premier instant et à partir d'une image acquise au deuxième instant. La première image d'observation peut résulter de l'image acquise lors de l'étape b). L'intervalle temporel entre le premier instant et le deuxième instant peut être compris entre 5 heures et 70 heures.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape d) l'opérateur de propagation est appliqué à partir de l'image acquise, lors de l'étape b), selon une pluralité de distances de propagation, de façon à obtenir une pile d'images complexes.
Selon un autre mode de réalisation, l'étape d) comporte les sous-étapes suivantes :
di) application d'un opérateur de propagation, à partir de l'image acquise lors de l'étape b) de façon à calculer une image complexe, dite image de référence, représentative de l'échantillon, dans un plan de référence ;
dii) application d'un opérateur de propagation à l'image de référence, de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires, à différentes distances du plan de référence selon l'axe de propagation, les images complexes secondaires et l'image de référence formant une pile d'images complexes ;
diii) détermination d'une position radiale de microorganismes à partir des images de la pile d'images complexes obtenue lors de la sous-étape dii).
Selon ce mode de réalisation, la première image d'observation peut être issue de l'image de référence, en étant par exemple l'image du module ou l'image de la phase de l'image de référence. L'étape c) peut être mise en œuvre à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes résultant de l'étape d), ou à partir de l'image complexe de référence, en considérant le module ou la phase de ladite image complexe.
Selon un mode de réalisation, le marqueur de viabilité induit une coloration des microorganismes lorsqu'ils sont morts, selon une bande spectrale de coloration. Lors de l'étape a), l'illumination de l'échantillon est effectuée selon une bande spectrale d'illumination, la bande spectrale d'illumination ne comportant pas tout ou partie de la bande spectrale de coloration. Le procédé peut comporter une des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables : dans l'étape d), la grandeur caractéristique est déterminée à partir du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition, à chaque distance du plan de détection. L'étape f) comporte une classification de chaque profil selon une première classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes vivants et une deuxième classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes morts. La classification de chaque profil peut être effectuée en fonction de sa forme ou d'une valeur maximale ou d'une valeur minimale du profil.
Aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image.
Un système optique de formation d'image est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique présentant un plan focal objet, l'échantillon s'étendant dans un plan de l'échantillon, le plan de l'échantillon étant décalé par rapport au plan focal objet.
Un autre objet de l'invention est un dispositif pour l'analyse de microorganismes disposés dans un échantillon, le dispositif comportant :
- une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon;
- un capteur d'image;
- un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et le capteur d'image;
un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et à mettre en œuvre les étapes c) à f) d'un procédé selon le premier objet de l'invention.
Selon un mode de réalisation, aucune optique de grossissement ou de formation d'image ne s'étend entre le capteur d'image et l'échantillon, lorsque ce dernier est maintenu sur le support. Selon un autre mode de réalisation, un système optique de formation d'image est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique présentant un plan focal objet, l'échantillon s'étendant dans un plan de l'échantillon, le dispositif étant agencé de telle sorte que le plan de l'échantillon est décalé par rapport au plan focal objet. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous.
FIGURES
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention.
La figure 2 illustre les principales étapes d'un procédé permettant d'identifier des microorganismes vivants ainsi que, parmi ces derniers, des microorganismes viables non cultivables.
La figure 3A est une image du module d'une image complexe reconstruite à partir d'une image acquise, à un premier instant, d'un échantillon. Cette image a été obtenue au cours d'un essai expérimental réalisé en utilisant un échantillon comportant des levures. La figure 3B est détail de la figure 3A. Les figures 3C et 3D représentent respectivement des profils d'amplitude et de phase d'une onde lumineuse reconstruite à partir de l'image de la figure 3B, chaque profil passant par une position radiale, dans le plan du capteur d'image, à laquelle est associée une levure.
La figure 4A représente une observation au microscope de levures. La figure 4B montre, sur une partie de l'image représentée sur la figure 3B, les levures considérées comme mortes et celles considérées comme vivantes, en mettant en œuvre l'invention. Cette image correspond à l'état des levures à un premier instant. La figure 4C montre une image obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image acquise, à un deuxième instant. Elle représente l'état des levures au deuxième instant. La comparaison entre les figures 4B et 4C permet l'identification, parmi les levures vivantes, de levures viables et non cultivables.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination Δλ. L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment un milieu 10m dans lequel baignent des micro-organismes 1 Oj. Le milieu 10m est généralement un milieu de culture, comportant des nutriments permettant le développement des microorganismes. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon ou une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule eucaryote ou procaryote, ou une microalgue. L'échantillon comporte également un marqueur de viabilité 10v, ce dernier étant apte à modifier une propriété optique d'un microorganisme 10j de façon différente selon que le microorganisme est vivant ou mort. Comme évoqué en lien avec l'art antérieur, par modification de l'aspect visuel, on entend par exemple une modification de la couleur du microorganisme. L'utilisation de tels marqueurs de viabilité est bien connue. Il peut s'agir du bleu de méthylène, ou du bleu trypan. La modification de la propriété optique peut également être une modification de l'intensité d'une lumière de fluorescence émise par un microorganisme analysé en utilisant par exemple un indicateur de viabilité, parfois désigné par le terme marqueur fluorogène, des exemples de tels marqueurs étant décrits dans WO9855861A1, ou encore dans la publication Kwolek-Mirek M "comparison of methods used for assessing the viability and vitality of yeast cells", FEMS Yeast Res 14 (2014) 1068-1079.
Dans l'exemple décrit ci-après, l'indicateur de viabilité 10v est du bleu de méthylène. Sous son effet, les microorganismes morts se colorent selon une bande spectrale de coloration Δλ', en l'occurrence le bleu, tandis que les microorganismes vivants restent translucides. L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Gene Frame® d'épaisseur e=250 pm. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation, varie typiquement entre 10 pm et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 pm et 500 pm. L'échantillon s'étend selon un plan Pw> dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La concentration de microorganismes peut varier entre 500 par microlitre et 5000 par microlitre.
La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 pm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur.
De préférence, la bande spectrale d'émission Δλ de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale.
Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière élémentaires 11k, chacune étant apte à émettre une onde lumineuse incidente 12k dans une bande spectrale AÀk. De préférence, les bandes spectrales AÀk des différentes sources de lumière llksont différentes les unes des autres. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan Pio selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z.
Le capteur d'image 16 est apte à former une image Io de l'échantillon 10 selon un plan de détection Po. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 mm.
On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection.
Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les microorganismeslOj présents dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre :
une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque microorganisme de l'échantillon ;
une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon.
Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférence pouvant être associée à un microorganisme 10j de l'échantillon.
Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image Io acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20.
Une image Io acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x,y,z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance \z\ du capteur d'image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant de préférence le plan selon lequel s'étend l'échantillon Pio> avec :
A(x,y,z) = I0(x,y,z) * h* désignant l'opérateur produit de convolution, ou, et de préférence, A(x,y,z) = gl0(x,y, z) * h, ou encore : /1 (x y z) _ A(x,y,z) = v 0 * h, Io étant une moyenne de l'image acquise, to L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x,y,z), situé à une distance |z| du capteur d'image. Il est alors possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase φ (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à cette distance |z|, dite distance de reconstruction, avec : M(x,y,z)= abs [A(x,y,z)] ;
- <p(x, y, z) = arg [A (x, y, z)] ;
Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument. L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que :
Autrement dit, l'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x,y,z) de l'espace, est telle que : A(x,y,z) = M(x,y,z)eiCx’y’z>.
Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 d'exposition détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image Io par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe Az représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance | z | du plan de détection Po. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = 0. L'image complexe Az correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction Pz. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle des propriétés optiques de l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction
Il est possible de former des images Aiz et φζ représentant respectivement le module ou la phase d'une image complexe complexe Az dans un plan Pz situé à une distance |z| du plan de détection Po, avec Aiz = mod (Az) et φζ = arg(4z).
Les inventeurs ont mis au point un procédé de caractérisation de microorganismes, par exemple des levures, ce procédé étant décrit en lien avec la figure 2, et dont certains résultats sont illustrés sur les figures 3A à 3D et 4A à 4C. Ces résultats ont été obtenus selon les conditions expérimentales suivantes :
Echantillon 10 : il comporte des levures sèches actives ADY (Active Dry Yeast) dispersées dans un milieu de culture Sabouraud, auquel une solution de bleu de méthylène (0.1 mg.ml"1) a été ajoutée. La concentration est d'environ 1500 levures par μΙ.
Source de lumière 11 : diode électroluminescente Créé MC-E Color, comportant trois diodes électroluminescentes pouvant être simultanément ou successivement activées, chaque diode émettant respectivement dans les bandes spectrales Δλ suivantes :
450nm - 465 nm ; 520nm - 535 nm ; 620nm - 630 nm. Dans les essais qui suivent, seule la bande spectrale 620nm - 630 nm a été mise en œuvre.
Capteur d'image 16 : Capteur 8 bits CMOS monochrome 3884 x 2764 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 pm de côté, la surface de détection s'étendant sur environ 30 mm2. Compte tenu de l'épaisseur de la chambre fluidique, le volume d'échantillon adressé par chaque image s'élève à 7.5 pl.
Distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 : 5 cm.
Distance d entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 16 :1000 pm.
Epaisseur e de la chambre fluidique 15 : 250 pm.
Diamètre de l'ouverture du filtre spatial 18 : 150 pm.
Les principales étapes du procédé de numération selon l'invention sont :
L'acquisition, par le capteur d'image, d'une image Io de l'échantillon dans une ou plusieurs bandes spectrales d'illumination, l'image étant acquise à un premier instant ti. A partir de l'image acquise, l'obtention d'une première image d'observation /(ίχ), correspondant au premier instant, puis, à partir de cette image d'observation, la détection de régions d'intérêt RO/j correspondant aux microorganismes 10/ et la détermination de leurs coordonnées radiales respectives (%j,yj), le terme "radial" signifiant dans un plan parallèle au plan de détection. A partir de l'image acquise, le calcul d'une grandeur caractéristique, par exemple le module ou la phase, de l'onde lumineuse d'exposition 14, à différentes distances de l'échantillon, dites distances de reconstruction ;
cela passe notamment par l'obtention d'une pile d'images complexes représentant l'onde lumineuse d'exposition, les images complexes s'étendant selon des plans parallèles disposés entre le plan de détection Po et le plan de l'échantillon Pio-
La formation d'un profil représentant une évolution de la grandeur caractéristique en fonction de la distance de reconstruction, chaque profil étant associé à un microorganisme. A partir d'un ou plusieurs profil associé à chaque microorganisme, l'identification de microorganismes vivants ou morts.
Le procédé peut comporter l'acquisition d'une image de l'échantillon à un deuxième instant t2, le deuxième instant étant postérieur au premier instant ίχ, et l'obtention d'une deuxième image d'observation /(f2) associée au deuxième instant. La comparaison des images d'observation respectivement associées au premier et au deuxième instant permet d'identifier, parmi les microorganismes considérés comme vivants, les microorganismes viables non cultivables.
La notion de microorganisme viable et non cultivable (VNC) est connue de l'homme du métier. Il s'agit d'un microorganisme vivant, car présentant une activité métabolique, mais ne pouvant pas se diviser dans le milieu dans lequel il est plongé. Il ne peut donc pas se développer dans son milieu. L'état VNC peut être influencé par différents facteurs, par exemple la température, la teneur de l'environnement ou du milieu de culture en certains nutriments ou éléments chimiques, l'exposition à la lumière, autant de facteurs pouvant induire un stress au microorganisme. L'identification de microorganismes VNC permet une caractérisation rigoureuse de la qualité de l'échantillon considéré.
Etape 100 : Acquisition d'une image Io de l'échantillon 10 par le capteur d'image 16, cette image formant un hologramme. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Cela permet d'observer simultanément plusieurs microorganismes, et ainsi d'obtenir une caractérisation rapide de l'échantillon. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope. Dans cet exemple, cette image est acquise à un premier instant t1 et peut être notée /oCU)·
Etape 110 : Formation d'une image de référence. Du fait de l'absence d'optique de formation d'image, l'image acquise Io peut comporter un grand nombre de figures d'interférence, et peut ne pas être aisément exploitable pour localiser les microorganismes présents dans le champ observé. Ces derniers sont plus facilement identifiables à partir d'une image complexe reconstruite par application d'un opérateur de propagation holographique à l'image acquise. Dans cet exemple, cette image complexe est une image de référence Aref, obtenue en effectuant une reconstruction holographique dans un plan de référence Pref à une image obtenue à partir de l'image acquise l0.
Une première solution est d'appliquer l'opérateur de propagation à l'image acquise l0, ou de préférence à la racine carrée de l'image acquise yfï^, éventuellement normalisée par la valeur moyenne Io de l'image acquise. L'image de référence Aref est une image complexe comportant des informations de phase et d'amplitude de l'onde lumineuse 14 à laquelle est exposé le capteur d'image 16. Le plan de référence est un plan avantageusement perpendiculaire à l'axe de propagation Z, et/ou parallèle au plan de détection Po. Il s'agit de préférence du plan de l'échantillon Pio- En effet, c'est généralement dans ce plan que la résolution spatiale d'une image complexe reconstruite est la meilleure, un tel principe étant à la base des algorithmes dits de focalisation numérique.
Cependant, l'image acquise ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde d'exposition 14. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique incomplète, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique a fait l'objet de nombreux développements, en mettant en œuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse à laquelle le capteur d'image est exposé. Ce type d'algorithme permet de limiter le bruit de reconstruction affectant l'image complexe reconstruite Aref. Un exemple d'algorithme utilisable est par exemple décrit dans US2012/0218379.
Selon une possibilité, l'échantillon est illuminé successivement ou simultanément dans différentes bandes spectrales AAfc, et on acquiert, dans le plan de détection Po, une image /0(AAfc) représentative de chaque bande spectrale. L'algorithme permet d'obtenir une image complexe Aref(AAk) de l'échantillon 10, dans le plan de référence, dans chaque bande spectrale AAk. Les images complexes ainsi obtenues peuvent être combinées, par exemple en effectuant une moyenne, en chaque pixel, de leur module et de leur phase, ce qui permet de former l'image de référence Aref. Alternativement, l'image complexe de référence est une image complexe Are^(AAfc) dans une bande spectrale AAfc. Un tel algorithme a été décrit dans la publication S. N. A. Morel, A. Delon, P. Blandin, T. Bordy, O. Cioni, L. Hervé, C. Fromentin, J. Dinten, and C. Allier, "Wide-Field Lensfree Imaging of Tissue Slides," in Advanced Microscopy Techniques IV; and Neurophotonics II, E. Beaurepaire, P. So, F. Pavone, and E. Hillman, eds., Vol. 9536 of SPIE Proceedings (Optical Society of America, 2015) ainsi que dans la demande de brevet FR1554811 déposée le 28 mai 2015, et plus précisément dans les étapes itératives 100 à 500 décrites dans cette demande. On a montré que l'utilisation de deux ou trois bandes spectrales différentes permet d'obtenir une bonne qualité de reconstruction.
Une autre possibilité, qui correspond au mode de réalisation préféré, est de reconstruire une image complexe de référence en se basant sur une image acquise de l'échantillon lorsque ce dernier est illuminé dans une seule bande spectrale Δλ. L'image complexe de référence peut être obtenue en utilisant un algorithme itératif tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ladite demande de brevet.
La coordonnée zre^ du plan de référence Pref est déterminée soit a priori, notamment lorsque la position de l'échantillon est maîtrisée par rapport au capteur d'image 16, soit par le biais d'une focalisation numérique. La focalisation numérique permet de définir un plan de focalisation Pfocus reconstruisant plusieurs images et définissant un critère de netteté de chaque image reconstruite. Le plan de focalisation Pf0CUs correspond à celui dans lequel l'image reconstruite présente un critère de netteté optimal. Il correspond au plan dans lequel s'étend une majorité des microorganismes. L'image de référence Aref est alors formée dans un plan de référence Pref correspondant au plan de focalisation Pf0CUS· l-θ plan de focalisation correspond à un plan selon lequel s'étend l'échantillon. L'image complexe Aref est désignée comme étant une image de référence, car elle sert de base à la formation de profils sur la base duquel les microorganismes de l'échantillon sont caractérisés. La figure 3A montre une image du module Mref de l'image complexe de référence obtenue en mettant en œuvre l'algorithme décrit dans le paragraphe précédent.
Etape 120 : construction d'une pile d'images.
Cette étape comporte une application d'un l'opérateur de propagation h à l'image complexe de référence Aref de façon à calculer des images complexes Are^z, dites secondaires, le long de l'axe de propagation Z. Au cours de cette étape, l'image complexe de référence Aref est propagée selon une pluralité de distances de reconstruction z, en utilisant un opérateur de propagation h tel que précédemment défini, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes, dites secondaires, Are^z reconstruites aux différentes distances z du plan de référence Pref- Ainsi, cette étape comprend la détermination d'une pluralité d'images complexes Are^ z telles que :
Aref,z Are^ * hz avec zmin — z — zmax-
On obtient ainsi une pile d'images complexes Aref Zmin Aref Zmax.
Les valeurs zminet zmax sont les coordonnées minimales et maximales, selon l'axe Z, entre lesquelles l'image complexe de référence est propagée. De préférence, les images complexes sont reconstruites selon une pluralité de coordonnées z entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 16. Les inventeurs ont estimé qu'il était préférable d'obtenir des images complexes secondaires de part et d'autre du plan de référence Pref, de telle sorte que zmin < zref < zmax- Contrairement à l'image acquise Io par le capteur d'image 16, l'image complexe de référence décrit correctement l'onde lumineuse d'exposition 14, en particulier au niveau de sa phase. Par conséquent, on estime que les images secondaires Are^z , obtenues par propagation de l'image de référence, forment un bon descripteur de la propagation de l'onde lumineuse d'exposition 14 selon l'axe de propagation Z. Ainsi, les images complexes secondaires sont calculées rapidement, sans nécessiter la mise en œuvre d'un procédé itératif tel que celui mis en œuvre pour calculer l'image complexe de référence Aref. Le procédé consistant à appliquer un algorithme itératif pour établir une image complexe de référence Aref (étape 110) puis, d'obtenir des images complexes secondaires par application d'un opérateur de propagation h à l'image complexe de référence, permet d'obtenir une pile d'images complexes Are^z en optimisant les moyens de calcul.
De préférence, deux plans de reconstructions adjacents sont espacés les uns des autres selon un maillage fin, compris par exemple entre 5 pm et 50 pm, et par exemple 25 pm. Il s'agit d'une propagation locale, car réalisée selon une distance comprise entre 500 pm et 2 pm de part et d'autre du plan de référence Pref, par exemple à ± 500 pm. En se basant sur une reconstruction selon une distance de 500 pm de part et d'autre du plan de référence Pref/ et une distance entre deux plans adjacents de 20 pm, on propage l'image complexe de référence Aref selon quarante plans de reconstruction Pref.zi de façon à former autant d'images complexes secondaires, Aref.z-
De façon alternative, les étapes 110 et 120 peuvent être remplacées par une propagation à partir de l'image Io acquise lors de l'étape 100, selon l'étape 110' représentée sur la figure 2. La propagation peut être effectuée par exemple en appliquant un opérateur de propagation à la racine carrée de cette image, éventuellement normalisée par la valeur moyenne Io, selon différentes distances de propagation Ζχ ,...zn. Il peut s'agir d'une simple application d'un opérateur de propagation h, auquel cas les images reconstruites AZi AZn, formant la pile d'images complexes, peuvent être affectées d'un bruit de reconstruction important. Il peut également s'agir d'une mise en œuvre d'un algorithme de reconstruction holographique itératif, par exemple un des algorithmes précédemment évoqués, selon différentes distances de propagation Ζχ ,...zn. Cela permet d'obtenir des images complexes reconstruites de bonne qualité, mais le procédé est plus coûteux en tant de calcul. C'est pourquoi il est préférable de mettre en œuvre un algorithme de reconstruction itératif pour former l'image complexe de référence, selon l'étape 110, et de propager l'image complexe de référence par une simple application d'un opérateur de propagation, selon l'étape 120. Cela permet d'obtenir un bon compromis entre la qualité des images formant la pile d'images complexes et le temps de calcul.
Etape 130 : détection de microorganismes dans l'échantillon.
Cette étape vise à détecter chaque microorganisme présent dans l'échantillon. Elle est effectuée à partir d'une image d'observation /(tx), dite première image d'observation, formée à partir d'une l'image /ο(Ε) acquise par le capteur d'image à un premier instant d'acquisition t±, ou à partir d'une image complexe formée à partir de cette dernière. De préférence, sans pour autant que cela soit nécessaire, l'image /0(D correspond à l'image Io acquise lors de l'étape 100 et la première image d'observation /(tx) résulte de cette image acquise Io, ou d'une image complexe de la pile d'images formée lors de l'étape 120. Il est préférable que l'image d'observation /(tx) soit établie à partir du module et/ou de la phase d'une image complexe reconstruite dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon. Il peut par exemple s'agir de l'image complexe de référence Aref obtenue lors de l'étape 110 ou d'une image complexe secondaire Are^ z résultant de l'étape 120. La première image d'observation l(tf) peut être l'image du module Mref de l'image complexe de référence Arep ou l'image MrefZ du module d'une autre image complexe de la pile d'images formée lors de l'étape 120. Il peut également s'agir de l'image <pref de la phase de l'image complexe de référence Aref, ou de l'image <prefiZ de la phase d'une autre image complexe de la pile d'images formée lors de l'étape 120. D'une façon générale, l'image d'observation est obtenue à partir du module et/ou de la phase d'une image complexe résultant d'une propagation d'une image /0 acquise par le capteur d'image 16.
La détection de chaque microorganisme est effectuée soit manuellement par un opérateur, soit automatiquement, par une analyse morphologique sur la première image d'observation en prenant en compte le fait que chaque micro-organisme 10j peut être associé, dans l'image d'observation, à une région d'intérêt RO/j de forme prédéterminée, pouvant être aisément détectée. Il peut par exemple s'agir d'une forme circulaire ou ellipsoïdale, ou autre. Pour cela, le procédé peut détecter automatiquement chaque région d'intérêt RO/j en prenant compte un ou plusieurs critères morphologiques correspondant à un microorganisme 10j, par exemple son aire et son excentricité. A chaque région d'intérêt ROli détectée correspond au moins un microorganisme 10j. Des algorithmes basés sur une corrélation spatiale avec des formes de régions d'intérêt prédéterminées peuvent également être mis en œuvre. Le volume de l'échantillon 10 dans le champ d'observation du capteur d'image 16 étant connu, cette étape permet une estimation d'une quantité Ni ou d'une concentration de microorganismes 10j dans l'échantillon.
La figure 3A correspond à une image du module Mref d'une image complexe de référence d'un échantillon décrit ci-après, en lien avec les exemples. La figure 3B correspond à un détail de la figure 3A.
Etape 140 : détection des coordonnées radiales (%(,>%) de chaque microorganisme.
Les microrganismes 10j étant détectés, par l'intermédiaire des régions d'intérêt ROIi qui leur sont respectivement associées sur la première image d'observation /(tx), leur position dans le plan radial XY, c'est-à-dire dans un plan parallèle au plan de détection, peut être déterminée aisément, en considérant par exemple le centroïde de la région d'intérêt RO/j correspondant à chacun d'entre eux.
Etape 150 : formation d'un profil associé à chaque microorganisme. A partir de chaque image complexe formant la pile d'images, on estime une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse d'exposition 14, à chaque position radiale (%j,yj) sélectionnée lors de l'étape 140, et à une pluralité de distances z de reconstruction du plan de référence Pref, ou du plan de détection Po, puis on forme un profil représentant une évolution de la grandeur caractéristique en fonction de z, selon l'axe de propagation Z. La grandeur caractéristique peut notamment être établie à partir du module et de la phase de l'expression complexe A décrivant l'onde lumineuse d'exposition 14, en utilisant les images de la pile d'images complexes préalablement résultant des étapes 120 ou 110'.
Les figures 3C et 3D représentent respectivement un profil Aij(z) du module et un profil <Pi(z) de la phase, passant par les positions radiales (xpyi) sélectionnées sur l'image 3B. Chaque profil est obtenu à partir des images de la pile d'images complexes préalablement établie, en effectuant une interpolation entre les coordonnées de deux images reconstruites adjacentes. Chaque profil est associé à un micro-organisme 10j.
Etapel60 : classification de chaque microorganisme à partir des profils formés au cours de l'étape 150.
Des essais ont montré que lorsqu'un marqueur de viabilité est préalablement introduit dans l'échantillon, les profils Aij(z) décrivant l'évolution du module de l'onde lumineuse d'exposition 14 peuvent permettre une classification entre les microorganismes morts 10id ou les microorganismes vivants 10j a. Ces profils sont représentés sur la figure 3C. Sur cette figure, la coordonnée z = 20 correspond au plan de focalisation, c'est-à-dire au plan selon lequel s'étendent les microorganismes. Un critère de classification est par exemple la valeur maximale prise par chaque profil Aij(z) entre le plan de détection et le plan de focalisation. Sur la figure 3C, il s'agit de la valeur maximale sur une partie de chaque profil Aij(z) s'étendant entre les coordonnées z = Oetz = 20. Lorsque la valeur maximale d'un profil est inférieure à un seuil prédéterminé, le microorganisme est classé comme étant mort. Dans le cas contraire, le microorganisme est classé comme étant vivant. Sur les figures 3C et 3D, les profils correspondant aux microorganismes considérés comme morts et vivants sont représentés respectivement en pointillés (légende "d") et en tirets (légende "a").
Le procédé comporte de préférence les étapes 170 et 180 visant à identifier, parmi les microorganismes considérés comme vivants à l'issue de l'étape 160, les microorganismes viables non cultivables (VNC) précédemment évoqués.
Etape 170 : acquisition d'une image différée I0Çt2).
Au cours de l'étape 130, une première image d'observation /(ίχ) a été formée, représentant l'échantillon à un premier instant, ce premier instant étant noté ίχ. L'étape 170 comporte une acquisition, à un deuxième instant d'acquisition f2, postérieur au premier instant d'acquisition ίχ, d'une deuxième image I0Çt2), dite image différée, de l'échantillon 10 à l'aide du capteur d'image 16. Les inventeurs ont observé qu'il était préférable que l'intervalle temporel Δί entre le premier instant ίχ et le deuxième instant f2 soit supérieur à 4h, et de préférence supérieur à 15h ou 20h. Par exemple l'intervalle temporel Δί est compris entre 4 et 72 heures, cet intervalle étant ajusté en fonction de la durée nécessaire à une division du microorganisme considéré.
Etape 180 : formation d'une image d'observation différée et classification des microorganismes vivants.
Sur la base de l'image acquise au deuxième temps d'acquisition, une deuxième image d'observation /(f2) est formée. La deuxième image d'observation /(f2) est de préférence formée de la même façon que la première image d'observation /(ίχ), de façon que les microorganismes soient comparables sur ces deux images. A partir de la deuxième image d'observation, on observe les microorganismes 10/ α considérés comme vivants suite à l'étape 160. Parmi ces derniers, on identifie les microorganismes dont la morphologie a varié par rapport à celle observée sur la première image d'observation /(ίχ). La variation de la morphologie, obtenue par comparaison entre la première et la deuxième image d'observation, doit traduire au moins une division du microorganisme durant l'intervalle temporel Δί. Elle peut être déterminée manuellement ou automatiquement, par exemple sur la base d'une comparaison, entre les deux images d'observation /(tx) et IÇtf), de l'aire ou d'un paramètre de forme de la région d'intérêt RO/j associée, sur chacune de ces images, à chaque microorganisme vivant. Par exemple, lorsque l'aire d'une région d'intérêt RO/j a augmenté de plus de 20% entre les deux images, on considère que le microorganisme 10ί α s'est divisé ou qu'une division est en cours. Dans ce cas, il est considéré comme vivant et apte à ce diviser, donc cultivable. Dans le cas contraire, il est considéré comme viable non cultivable.
Les figures 4B et 4C représentent respectivement :
la première image d'observation /(tx), décrite en lien avec l'étape 110, qui correspond au module Mref de l'image complexe de référence Aref ;
une deuxième image d'observation obtenue à partir d'une image acquise à un deuxième instant t2 postérieur de 10 heures au premier instant tr. La deuxième image d'observation est le module d'une image complexe obtenue, à partir de l'image /0(t2), de la même façon que l'image complexe de référence Aref.
Sur la figure 4B, les microorganismes 10ί α considérés comme vivants sont contournés d'un cadre blanc, tandis que les microorganismes 10j d considérés comme morts sont contournés par un cercle blanc. A la position radiale (xi; yQ correspondant à un microorganisme 10j a considéré comme vivant, une comparaison est effectuée entre la région d'intérêt RO/j s'étendant autour de la position radiale aux premier et deuxième instants. Sur la base de cette comparaison, les microorganismes 10ial considérés comme vivants et cultivables sont entourés par un cadre plein sur la figure 4C tandis que les microorganismes 10ί α2 considérés comme viables non cultivables sont entourés par un cadre en pointillés. L'invention permet alors un dénombrement de trois catégories de microorganismes : morts, vivants et cultivables, viables non cultivables.
Les inventeurs ont constaté que la performance du procédé était accrue lorsque la bande spectrale d'illumination Δλ est différente de la bande spectrale de coloration Δλ' induite par le marqueur de viabilité. Ainsi, lorsque le marqueur de viabilité est du bleu de méthylène, la bande spectrale d'illumination est de préférence située dans le rouge ou dans l'infrarouge. Ainsi, il est préférable que la bande spectrale d'illumination et la bande spectrale de coloration ne se recoupent pas, ou se recoupent de façon marginale. Par se recouper de façon marginale, on entend que l'intersection entre les deux bandes spectrales est inférieur à 10% ou 20% d'une des deux bandes spectrales.
Le procédé décrit ci-avant a été comparé avec une caractérisation visuelle des microorganismes, ces derniers étant observés au microscope par un opérateur. La figure 4A représente une vue au microscope au deuxième instant t2. La caractérisation visuelle a été utilisée en tant que méthode de référence, pour qualifier le procédé selon l'invention.
Le tableau suivant montre les pourcentages de microorganismes considérés comme morts, vivants et cultivables, viables non cultivables, obtenus respectivement selon la méthode décrite ci-dessus (première ligne) et au microscope (2ieme ligne).
La proportion élevée de levures viables non cultivables s'explique par une température élevée à laquelle a été porté l'échantillon, engendrant un stress favorisant l'état viable non cultivable.
La fiabilité du procédé est donc comparable à une caractérisation visuelle classique réalisée au microscope. Mais du fait de la configuration en imagerie sans lentille, le champ observé est nettement plus important que le champ observé résultant de l'utilisation d'un microscope. L'invention a par exemple permis une caractérisation simultanée de 11574 levures réparties dans le champ d'observation. La performance de l'invention est donc supérieure au procédé visuel en termes de quantité de microorganismes caractérisés par unité de temps. De plus, l'algorithme peut être automatisé, la fiabilité étant démontrée par les valeurs du tableau précédent.
Selon une variante, une optique de formation d'image est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image, le capteur d'image étant localisé selon une configuration dite défocalisée, le plan focal objet de l'optique étant décalé du plan selon lequel s'étend l'échantillon selon une distance dite de défocalisation. La distance de défocalisation peut être comprise entre 5 pm et 5 mm, et de préférence entre 10 pm et 2 mm. De la même manière qu'en configuration sans lentille, une telle configuration permet l'obtention d'une image dans laquelle chaque microorganisme apparaît sous la forme d'une figure de diffraction, des interférences se produisant entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et se propageant jusqu'au capteur d'image et une onde de diffraction générée par chaque microorganisme. Le procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 180 est applicable à des images acquises selon une telle
configuration. Toutefois, une configuration en imagerie sans lentille est préférée, par le plus grand champ d'observation qu'elle procure.
Bien que décrite relativement à une caractérisation de levures, à des fins de contrôle de qualité, l'invention s'applique à d'autres organismes tels que ceux précédemment listés, dès lors que l'on souhaite obtenir une analyse rapide et fiable dans un champ d'observation important.