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1. (ES2098344) SUSTRATO CROMOGENICO.
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DESCRIPCION
Ambito   de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo sustrato sintético cromogénico usado para la determinación cuantitativa de endotoxinas bacterianas en fluidos fisiológicos, alimentos, productos farmacéuticos, etc.
Fundamentos     de la invención
Las endotoxinas bacterianas se producen mediante bacterias Gram negativas y son consideradas por la mayoría de los investigadores como un factor muy importante en el desarrollo de la septicemia. Se han descrito diversos procedimientos para la determinación de endotoxina basados en la observación de Levin y Bang (1956) de que las endotoxinas activan específicamente el sistema de coagulación del Limulus Polyphemus. Al principio, se desarrolló un ensayo, en el cual, el lisato de amebocito de Limulus (LAL) en contacto con fuentes que contenían endotoxinas, producía una gelación específica. Más recientemente, se han desarrollado procedimientos cromogénicos y fluorogénicos basados en la observación anterior que pueden detectar rápidamente pequeñas proporciones de endotoxinas (H. C. Hemker: Handbook of Synthetic Sustrates, 1983, Martinus Nijhoff Publisher, Boston).
Técnica   anterior
A. E. Torano y otros han descrito que una enzima procedente de lisato de amebocito de Limulus muestra especificidad similar al factor de coagulación de sangre de mamífero X a (Thrombosis Research, vol. 34, págs. 407-417, (1984)), el cual reconoce la secuencia -Ile-Glu-Gly-Arg- en su protrombina sustrato natural.
Otras investigaciones han mostrado igualmente el importante papel que la secuencia COOH-terminal Gly-Arg juega cuando se analiza endotoxina. T. Harada y otros, en Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (Limulidal), E. Cohen (Ed.), Alan R. Liss Inc., New York, 1979, págs. 209-220, describe en una tabla de la página 213 diferentes sustratos usados, pero únicamente los que tenían la secuencia carboxiterminal Gly-Arg dieron resultados interesantes. En la página 212, líneas 7-10 contando a partir del final de la página, los autores señalan que: \Estos resultados indican claramente que la enzima de coagulación del Limulus muestra una alta especificidad frente al péptido pNA conteniendo la secuencia COOH-terminal Gly-Arg".
Igualmente, los Documentos US-4.188.264 y US 4.576.745 poseen Gly-Arg como secuencia carboxi-terminal en el sustrato usado para la determinación de endotoxina. Se han investigado otros sustratos, todos los cuales muestran Arg como carboxi-terminal.
De acuerdo con el Documento USA-4.406.832, el carboxi-terminal suele ser -Ala-Arg- o -Cys-Arg- y este sustrato ha mostrado una actividad relativa que es tan buena o un poco mejor que la del -Gly-Arg- estándar. Debido al complicado mecanismo en estas reacciones no es posible conocer la secuencia del péptido que pudiera dar un resulado aceptable.
De manera sorprendente, y en contra de la técnica anterior dentro de este campo, los autores de la presente invención han encontrado que un sustrato que tiene la secuencia carboxi-terminal -Gly-Lys- muestra una actividad relativa que es al menos un 20% mejor en comparación con la de los sustratos conocidos.
El uso delácido glicólico (Glyc) en un sustrato para la determinación de endotoxina no ha sido descrito nunca anteriormente, y es muy sorprendente el hecho de que sea tan bueno cuando se usa -Glyc-Arg- que cuando se usa Gly-Lys, mostrando ambos un efecto mejor que el normalmente usado Gly-Arg.
Descripción    de la invención
El péptido sintético cromogénico o el derivado isóstero del péptido en la presente invención muestra alta sensibilidad en el procedimiento usado para la determinación de endotoxinas.
Los nuevos sustratos se caracterizan por la fórmula siguiente:
R 1 - A 1 - A 2 - A 3 - A 4 - R 2 o su sal,
en  la que:
R 1 = H o un grupo protector,
A 1 = H, Ile, Leu o Val,
A 2 = Glu, Asp, Ser, Thr,
A 3 = Gly o Glyc,
A 4 = Arg o Lys,
R 2 = un grupo aromático que proporciona 4-nitroanilina mediante hidrólisis enzimática, con la condición de que A 3 es Gly cuando A 4 es Lys y de que A 3 es Glyc cuando A 4 es Arg.
Igualmente, la presente invención describe el procedimiento para la preparacioón de los derivados de péptidos.
Así mismo, se describe el procedimiento para la determinación de endotoxinas bacterianas mediante el uso del derivado con la fórmula siguiente:
R 1 - A 1 - A 2 - A 3 - A 4 - R 2 o su sal,
en  la que:
R 1 = H o un grupo protector,
A 1 = H, Ile, Leu o Val,
A 2 = Glu, Asp, Ser, Thr,
A 3 = Gly o Glyc,
A 4 = Arg o Lys,
R 2 = un grupo aromático que mediante hidrólisis enzimática proporciona un compuesto R 2-NH 2, el cual puede determinarse cuantitativamente, con la condición de que A 3 es Gly cuando A 4 es Lys y de que A 3 es Glyc cuando A 4 es Arg.
R 2-NH 2 son compuestos conocidos anteriormente con propiedades cromogénicas que permiten la cuantificación de endotoxinas mediante la determinación del marcador separado directamente o después de modificación (H. C. Hemker, véase cita anterior).
Igualmente, se describe el uso de estos derivados para la determinación de endotoxinas bacterianas.
Los ejemplos de compuestos que pueden ser R 2-NH 2 son: p - nitroanilina, 3 - carboxi - 4 - hidroxianilina, 3 - sulfo - 4 - nitroanilina, 3 - alcoxi - 4 - nitroanilina, 3 - carboxi - 4 - nitroanilina, 4 - metiloxi - naftilamina, 4 - (N - etil - N - hidroxietil)aminoanilina, ester dimetílico del ácido 5 -amino - isoftálico, 5 - amino - 8 - nitroquinoleína, 7 - amino - 4 - trifluorometil cumarina, 7 - amino - 4 - metil cumarina, 4 - amino - difenilamina. Igualmente, la invención describe el uso de estos derivados para la determinación de endotoxinas bacterianas.
El nuevo péptido o derivados isósteros de péptidos contienen como carboxi-terminal Lys cuando se combinan con Gly y Arg cuando se combinan con Glyc. La combinación Gly-Lys se consideraba desfavorable hasta el presente en los sustratos usados para el lisato de amebocito de Limulus y la combinación Glyc-Arg no había sido nunca usada anteriormente en este tipo de sustratos en procedimientos para la determinación de endotoxinas bacterianas.
Descripción  de la síntesis
Se han usado técnicas convencionales para el acoplamiento y grupos de protección convencionales (Z, Boc, etc.) usados en la química de péptidos (M. Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984), p. ej., la adición paso a paso de los aminoácidos en el aminoácido C-terminal provisto con un marcador o la síntesis del fragmento péptido N-terminal per se, el cual, a continuación, se acopla al aminoácido C-terminal provisto con un marcador.
La síntesis de los diferentes sustratos de acuerdo con la invención se describe a continuación detalladamente en los siguientes ejemplos de realización no limitativos. La purificación de los productos intermedios y finales se realizó mediante precipitación, cristalización o cromatografía de filtración por gel. Los productos finales purificados se liofilizaron. Se usaron placas de vidrio prefabricadas de gel de sílice F 254 para los análisis de TLC. Una vez terminada la cromatografía, las placas se inspeccionaron con luz U.V. (254 nm) y, a continuación, se revelaron con reactivo de nihidrina y cloro/dicarboxidina. Los valores de Rf obtenidos son los resultados de cromatografías sencillas.
El sistema de disolvente usado para la TLC es el indicado de acuerdo con la tabla siguiente:
Los análisis mediante HPLC se realizaron sobre columna Merck R.P. (Hibar Lichracart) con MeOH al 40% en trietilaminofosfato al 5%, pH 2,35, como eluyente (1 ml/min). La actividad óptica de los productos finales se determinó a 589 mm en AcOH al 50% a una concentración de 0,4-1,0 g/100 ml a 25 °C. Las abreviaturas mencionadas a continuación tienen el significado siguiente (se ha usado la indicación de la I.U.P.A.C. en los casos en que existía):
Arg = arginina
Gly = glicina
Ile = isoleucina
Leu = leucina
Val = valina
Glu = ácido glutámico
Asp = ácido aspártico
Ser = serina
Thr = treonina
A menos que se indique lo contrario, todos los aminoácidos en los sustratos tienen configuración L.
El aminoácido libre o péptido se indica mediante H- en el grupo amino N-terminal y mediante -OH en el grupo carboxi-terminal. El grupo amino terminal se representa siempre a la izquierda y el carboxi a la derecha.
Abreviaturas
Ac = Acetilo
AcOH = ácido acetílico
AMC = 7-amino-4-metilcumarina
Boc = t-butiloxicarbonilo
Bz = benzoílo
Bzl = bencilo
DCCl = diclohexilcarbodiimida
DCU = diciclohexilurea
DMAP = dimetilaminopiridina
DMF = dimetilformamida
EtOAc = acetato de etilo
EtOH = etanol
Et 3N = trietilamina
Glyc = ácido glicólico
HOBT = 1-hidroxibenzotriazol
HPBT = cromatografía líquida de alta eficacia MeOH = metanol
ONp = éster nitrofenílico
OSu = éster hidroxisuccinimídico
pNA = p-nitroanilina
TFA = ácido trifluoroacético
Z = benciloxicarbonilo
Ejemplo  1
ff  - Ac - Ile - Glu - Gly - Lys - pNA - HCl (peso molecular = 644,15)
1a) " - Z - Lys - pNA - TFA (peso molecular = 514,5)
Se agregaron 9 ml de TFA a 10 mmoles de ff - Boc - " - Z - Lys - pNa disueltos en 25 ml de cloruro de metileno. La solución se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con una mezcla 2:1 de éter de t - butilmetilo:éter de petróleo.
Rendimiento : 95%.
TLC: Rf = 0,60 (A).
1b) ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - Gly - OH (peso molecular = 394,4)
A 0,1 moles de H - Gly - OH disueltos en 200 ml de NaHCO 3 1 molar se agregó una solución de 0,1 moles de ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - O - Su en 200 ml de dioxano. La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la solución se evaporó al vacío hasta un residuo aceitoso, el cual, se disolvió en 100 ml de agua y se lavó con éter dietílico. La fase acuosa se llevó a pH 2 con solución de KHSO 4 y se extrajo con EtOAc. Después de secado con Na 2SO 4, la solución de EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con una mezcla (1:1) deéter dietílico:éter de petróleo.
Rendimiento: 85%.
TLC : Rf = 0,5 (Pa).
1c) H - γ - O - Bzl - Glu - Gly - OHTFA (peso molecular = 408,4)
Se agregaron 9 ml de TFA a 10 mmoles de ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - Gly - OH (1b) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se evaporó en vacío hasta obtener un aceite y se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento : 90%.
TLC : Rf = 0,44 (A).
1d) ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly -OH (peso molecular = 507,6)
A 0,1 moles de H - γ - O - Bzl - Glu - Gly - OHTFA (1c) disueltos en 250 ml de NaHCO 3 1 molar se agregó una solución de 0,1 moles de ff - Boc - Ile - O - Su en 250 ml de dioxano. La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la solución se evaporó en vacío, el residuo se disolvió en 100 ml de agua y se lavó con EtOAc. La fase acuosa se llevó a pH 3 con solución de KHSO 4 y se extrajo con EtOAc. Después de secado con Na 2SO 4 la solución de EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter de petróleo.
Rendimiento : 92%.
TL : Rf = 0,6 (Pa).
1e) ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 890,0)
3 mmoles de " - Z - Lys - pNATFA (1a) disueltos en 25 ml de DMF se neutralizaron en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 3 mmoles de ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly - OH (1d), 3 mmoles de HOBT y 3,2 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento: 61%
TLC: Rf = 0,67 (P 1).
1f) ff - Ac - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly - " -Z - Lys - pNA (peso molecular= 831,9)
Se agregaron 3,5 ml de TFA a 1,2 mmoles de ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly - " - Z -Lys - pNA (1e) en 6 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 10 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con 160 μl de Et 3N. Se agregaron 140 μl de anhídrido acético y la mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 2 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite y la sustancia se precipitó con agua.
Rendimiento: 86%.
TLC: Rf = 0,45 (P 1).
1) ff - Ac - Ile - Glu - Gly - Lys - pNA - HCl (peso molecular = 644,15)
Se agregaron 10 ml de ácido trífico a una suspensión en frío ( - 10 °C) de 1 mmoles de ff - Ac - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Gly - Z - Lys - pNA (1f) en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 50 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se trató mediante intercambio de iones en una columna Sephadex R QAE - 25, en forma cloruro, con EtOH al 50% como eluyente y se purificó sobre una columna pre - empaquetada Merck Lobar R (Lichroprep. R RP - 8 - B) con MeOH al 50% como eluyente (2 ml/minuto). El producto purificado se liofilizó.
Rendimiento: 42%.
TLC: Rf = 0,2 (Pa 6).
HPLC: 98% de pureza.
[ff] D 25 = - 63,1 ° (C = 0,5%).
Ejemplo  2
ff  - Ac - Ile - Ser - Gly - Lys - pNA - HCl (peso molecular = 602,11)
2a) ff - Boc - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 557,6)
5 mmoles de " - Z - Lys - pNATFA (preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 1a) disueltos en 25 ml de DMF se neutralizaron en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 5 mmoles de ff - Boc - Gly - OH, 5 mmoles de HOBT y 5 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó en vacío y la sustancia se precipitó con éter dietílico, hasta obtener un aceite, el cual, se solidificó en vacío.
Rendimiento: 73%.
TLC: Rf = 0,55 (P 1).
2b) ff - Boc - O - Bzl - Ser - Gly - " - Z - Lys - pNA
Se agregaron 10 ml de TFA a 5 mmoles de ff - Boc - Gly - " - Z - Lys - pNA (2a) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 25 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 5 mmoles de ff - Boc - O - Bzl -Ser - OH, 5 mmoles de HOBT y 5,1 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico en forma de un aceite, el cual solidificó en vacío.
Rendimiento: 86%.
TLC: Rf = 0,62 (P 1).
2c) ff - Boc - Ile - O - Bzl - Ser - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 848,0)
Se agregaron 10 ml de TFA a 2 mmoles de ff - Boc - O - Bzl - Ser - Gly - " - Z - Lys - pNA (2b) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 25 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 2 mmoles de ff - Boc - Ile - ONp. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 48 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento: 72%.
TLC: Rf = 0,62 (P 1).
2d) ff - Ac - Ile - O - Bzl - Ser - Gly - " - Z -Lys - pNA (peso molecular = 789,9)
Se agregaron 5 ml de TFA a 1 mmol de ff -Boc - Ile - O - Bzl - Ser - Glu - " - Z - Lys - pNA (2c) disueltos en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 10 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con 80 μl de Et 3N. Se agregaron 70 μl de anhídrido acético y la mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 2 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite y la sustancia se precipitó con agua.
Rendimiento: 85%.
TLC: Rf = 0,55 (P 1).
2) ff - Ac - Ile - Ser - Gly - Lys - pNA - HCl (peso molecular = 602,11)
Se agregaron 10 ml de ácido tríflico a una suspensión en frío ( - 10 °C) de 1 mmol de ff - Ac -Ile - O - Bzl - Ser - Gly - " - Z - Lys - pNA (2d) en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 50 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. El producto se trató mediante intercambio de iones y se purificó de la misma forma que en el Ejemplo 1.
Rendimiento: 35%.
TLC: Rf = 0,2 (Pa 6)
HPLC: 97% de pureza.
[ff] D 25 = - 50,1 ° (c = 0,5%).
Ejemplo  3
ff  - Ac - Ile - Thr - Gly - Lys - pNA - HCl (peso molecular = 616,13)
3a) ff - Boc - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 748,2)
Se agregaron 10 ml de TFA a 5 mmoles de ff - Boc - Gly - " - Z - Lys - pNA (2a) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 25 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 5 mmoles de ff - Boc - O - Bzl -Thr - OH, 5 mmoles de HOBT y 5,1 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico en forma de un aceite, el cual solidificó en vacío.
Rendimiento: 51%.
TLC: Rf = 0,65 (P 1).
3b) ff - Boc - Ile - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 862,0)
Se agregaron 10 ml de TFA a 2 mmoles de ff - Boc - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (3a) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 25 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 2 mmoles de ff - Boc - Ile - ONp. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 48 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento: 50%.
TLC: Rf = 0,7 (P 1).
3c) ff - Ac - Ile - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (peso molecular = 803,9)
Se agregaron 5 ml de TFA a 5 mmoles de ff -Boc - Ile - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (3b) disueltos en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 10 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con 80 μl de Et 3N. Se agregaron 70 μl de anhídrido acético y la mezcla se agitó durante 1 hora en frío ( - 10 °C) y 2 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite y la sustancia se precipitó en agua.
Rendimiento: 86%.
TLC: Rf = 0,55 (P 1).
3) Ac - Ile - Thr - Gly - Lys - pNAHCl (peso molecular = 616,13)
Se agregaron 10 ml de ácido tríflico a una suspensión en frío ( - 10 °C) de 1 mmol de ff - Ac - Ile - O - Bzl - Thr - Gly - " - Z - Lys - pNA (3c) en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 50 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. El producto se trató mediante intercambio de iones y se purificó de la misma forma que en el Ejemplo 1.
Rendimiento: 36%.
TLC: Rf = 0,21 (Pa 6)
HPLC: 97% de pureza.
[ff] D 25 = - 53,2 ° (c = 0,3%).
Ejemplo  4
ff  - Ac - Ile - Glu - Glyc - Arg - pNAHCl (peso molecular = 673,18)
4a) Glyc - Arg - pNAHCl (peso molecular = 388,8)
5 mmoles de Arg - pNA2HBr disueltos en 30 ml de DMF se neutralizaron en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 5 mmoles de ácido glicólico, 5 mmoles de HOBT y 5,1 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 72 horas a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se purificó sobre una columna Sephadex R QAE - 25, en forma cloruro, con EtOH al 90% como eluyente.
Rendimiento: 74%.
TLC: Rf = 0,35 (A).
4b) ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - Glyc - Arg -pNAHCl (peso molecular = 708,2)
A 5 mmoles de Glyc - Arg - pNAHCl disueltos en 30 ml de DMF y enfriados a - 10 °C, se agregaron 5 mmoles de ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - OH, 5 mmoles de HOBT, 0,5 mmoles de DMAP y 5,1 mmoles de DCCl. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 48 horas a temperatura ambiente. El DCU formado se separó por filtración y la solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, el EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento:  66%.
TLC: Rf = 0,35 (PA 6).
4c) ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Glyc -Arg - pNAHCl (peso molecular = 821,3)
Se agregaron 10 ml de TFA a 2 mmoles de ff - Boc - γ - O - Bzl - Glu - Glyc - Arg - Lys -pNAHCl (4b) disueltos en 20 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 25 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con Et 3N. A la solución se agregaron 2 mmoles de ff - Boc - Ile - ONp. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 48 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite, el cual, se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCO 3 al 2%, KHSO 4 al 2% y H 2O. Después de secado con Na 2SO 4, la fase EtOAc se evaporó y la sustancia se precipitó con éter dietílico.
Rendimiento: 69%.
TLC: Rf = 0,43 (Pa 6).
4d) ff - Ac - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Glyc -Arg - pNAHCl (peso molecular = 763,3)
Se agregaron 5 ml de TFA a 1 mmol de ff - Boc - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Glyc - Arg - pNAHCl (4c) disueltos en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la sustancia se precipitó con éter dietílico. La sustancia seca se disolvió en 10 ml de DMF y se neutralizó en frío ( - 10 °C) con 130 μl de Et 3N. Se agregaron 120 μl de anhídrido acético y la mezcla se agitó durante 1 hora en frío y 2 horas a temperatura ambiente. La solución se evaporó en vacío hasta obtener un aceite y la sustancia se precipitó con agua.
Rendimiento: 94%.
TLC: Rf = 0,34 (Pa 6).
4) ff - Ac - Ile - Glu - Glyc - Arg - pNAHCl. (peso molecular = 673,18)
Se agregaron 10 ml de ácido tríflico a una suspensión en frío ( - 10 °C) de 1 mmol de ff - Ac - Ile - γ - O - Bzl - Glu - Glyc - Arg - pNAHCl (4d) en 10 ml de cloruro de metileno. La mezcla se agitó durante 50 minutos a temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. La sustancia se trató mediante intercambio de iones y se puridicó de la misma forma que en el Ejemplo 1.
Rendimiento: 31%.
TLC: Rf = 0,45 (A)
HPLC: 98% de pureza.
[ff] D 25 = -60,6 ° (c = 0,4%).
Comparación  de los sustratos cromogénicos usando un ensayo LAL cromogénico de una sola etapa 
Se ensayaron una serie de soluciones conteniendo endotoxina, a partir de las cuales se obtuvo una curva estándar dentro del intervalo de 0,1-1,2 EU/ml, tal como se describe a continuación, usando los diferentes sustratos cromogénicos. Las pendientes de las curvas estándar resultantes se compararon, considerándose que la pendiente para el sustrato S-2423 era del 100%.
A un volúmen igual de muestra, se agregó un reactivo (100 μl) formado por una mezcla de LAL (50% de la concentración de coagulación) y el sustrato cromogénico (4,4 mM) en un tampón Tris de pH 7,9. La reacción resultante (activación del LAL y la posterior hidrólisis del sustrato cromogénico) se realizó a 37 °C. Después de 15 minutos, la reacción se terminó mediante la adición de 400 μl de ácido acético y se leyó la absorbancia a 405 nm.
La Tabla I muestra los resultados de la LAL activada con sustratos medida mediante la concentración de pNA hidrolizada. El sustrato S-2423 (Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNAHCl) se consideró como estándar.
 Lisato de amebocito de Limulus (H. C. Hemker, véase cita anterior).
TABLA I
Rastreamiento del sustrato para determinar la endotoxina mediante un procedimiento de una sola etapa con concentración de sustrato 2,2 mM (en la solución de reacción) (So = 2,2 mM)
Sustrato Secuencia de péptido Actividad relativa
Esta Tabla muestra claramente que cuando se usa Gly-Lys o Glyc-Arg como secuencia carboxiterminal en el sustrato, la actividad es sorprendentemente considerablemente más alta que cuando se usa el sustrato conocido S-2423, el cual tiene Gly-Arg como secuencia carboxi-terminal.