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1. CN103501806 - Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of aneurysms

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用于治疗和/或预防动脉瘤的免疫调节方法和系统


相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年11月12日提交的题目为“Immunomodulatory  Methods and Systems for Treatment and/or Prevention of Aneurysms”、案卷 号为P686-USP的美国临时申请S/N 61/413,372的优先权,该申请全文通 过引用并入本文。本申请还涉及于2002年4月5日提交的PCT申请WO  02/080954,于2011年11月11日提交的题目为“Immunomodulatory  Methods and Systems for Treatment and/or Prevention of Hypertension”、案 卷号为P694-PCT的PCT申请S/N_______,并涉及于2011年11月11日 提交的题目为“Immunomodulatory Compositions,Methods And Systems  Comprising Immunogenic Fragments Of Apob 100”、案卷号为P700-PCT的 PCT申请S/N_______,每一篇全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及尤其适于治疗或预防动脉瘤和/或其关联病况的免疫调节方 法、系统、组合物和疫苗。
发明背景
动脉瘤形成影响越来越大的人群比例。目前动脉瘤的治疗主要通过多 种类型的外科程序来进行。
例如,典型地通过外科干预,或通过密切随访观察(watchful  waiting)与血压和其他风险因素控制组合,来治疗动脉的动脉瘤。最近几 年中,已针对许多类型的动脉瘤开发了血管内技术或微创技术。
提供对动脉瘤的有效的治疗和/或预防目前仍是有挑战性的。
发明内容
本文提供了允许在若干种实施方式中治疗和/或预防个体的动脉瘤的方 法和系统,所述方法和系统在一种实施方式中可与外科干预组合使用,或 代替外科干预使用。
根据第一方面,描述了治疗和/或预防动脉瘤和/或其关联病况的方 法。方法包括给个体施用ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部 分。
根据第二方面,描述了治疗和/或预防动脉瘤和/或其关联病况的方 法。方法包括给个体施用对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性 部分特异性的CD8(+)T细胞。
根据第三方面,描述了治疗和/或预防个体的动脉瘤和/或其关联病况 的系统。所述系统包含下述的至少两种:一种或多种对ApoB-100的免疫 原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞,和一种或多种 CD8(+)T细胞增强剂。特别地,在若干种实施方式中,一种或多种对 ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞 和一种或多种CD8(+)T细胞增强剂包括在用于在本文所述方法中同时 的、组合的或相继的使用的系统中。
根据第四方面,描述了治疗和/或预防个体的动脉瘤和/或病况的系 统。所述系统包含ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活 性部分和CD8(+)T细胞;和一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段或其 免疫原性部分特异性的CD8(+)T细胞。特别地,在若干种实施方式中, ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和CD8(+)T 细胞,和一种或多种CD8(+)T细胞包括在用于在本文所述方法中同时 的、组合的或相继的使用的系统中。
本文所述的片段、细胞、组合物、方法和系统可与下述应用联系使 用,所述应用中期望个体中的动脉瘤、动脉瘤节段形成、动脉瘤破裂减少 和/或对动脉瘤的治疗或预防作用。
本发明的一种或多种实施方式的细节在下文的附图和说明书中阐明。 其他特征、目标和优势由说明书和附图和权利要求阐明。
附图简述
并入本说明书并构成其一部分的附图阐释了本发明的一种或多种实施 方式,并与详细的说明书和实施例一起用来解释本发明的原理和实施。
图1显示了根据本文所述的一个实施方式,针对节段性动脉瘤的平均 直径检查的节段位置表示图。
图2显示了根据本文所述的一个实施方式,用或不用p210免疫的小 鼠的Kaplan Meier存活曲线。
图3显示了p210免疫赋予了动脉粥样硬化防护性作用。(A)较之PBS 和cBSA/明矾组,用天然p210免疫导致主动脉动脉粥样硬化显著减少(每 组n=9-10,示出了来自每组的代表性图片)。(B)在主动脉窦斑块中,分别 通过MOMA-2(每组n=9-10)和CD11c(每组n=7-12)免疫反应性评价, P210免疫显著减少了巨噬细胞渗入和DC出现。
图4显示了p210免疫对DC的作用。初次免疫后一周,较之cBSA/明 矾组,p210/cBSA/明矾组中,免疫部位处的(A)CD11c(+)细胞或(B) CD11c(+)CD86(+)细胞显著减少。每组n=10。(C)第三次免疫后一周,较 之cBSA/明矾组,p210免疫的小鼠淋巴结中具有减少的CD11c(+)CD86(+) 细胞(每组中n=5;ANOVA后进行多个组比较)。
图5显示了p210免疫之前和之后对p210的IgM或IgG滴度 (titer)。(A)免疫之前,p210 IgG滴度是低的并且安乐死时在PBS组中依 然是低的;但在cBSA/明矾和p210/cBSA/明矾组中显著增加,在cBSA/明 矾组中具有最高的滴度。(B)在免疫之前p210 IgM滴度是低的并在安乐死 时显著增加,在小鼠的3个组之间没有差异。6-7周时间点n=5,25周时 间点n=9。
图6显示了体内免疫之后活化的淋巴细胞群。(A)较之PBS或cBSA/ 明矾组,p210/cBSA/明矾组中,淋巴结中的CD8(+)CD25(+)T-细胞群显著 较高;(B)在三个组之间,淋巴结中的CD4(+)CD25(+)T-细胞没有差异。 (C)在3个组之间,p210/cBSA/明矾组中有显著更大的脾脏 CD8(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群;(D)脾脏CD8(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞 在3个组之间没有差异。(E)cBSA/明矾组中,脾脏CD4(+)CD25(+)IL-10(+) T-细胞群显著增加,但被p210/cBSA/明矾免疫显著减弱;(F)脾脏 CD4(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组之间没有差异。(A)和(B)的每组中 n=9-10;(C)、(D)、(E)和(F)的每组中n=5。
图7显示了来自p210免疫的供体的CD8(+)T-细胞的过继转移重演 (recapitulate)了p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用,而B-细胞或 CD4(+)CD25(+)T-细胞的转移则没有。(A)较之来自其他2个组的CD8(+) T-细胞的受者小鼠,来自p210/cBSA/明矾免疫的供体的CD8(+)T-细胞的 受者小鼠发展了显著更小的动脉粥样硬化病灶(每组的n=9-10)。(B)较之来 自PBS或cBSA/明矾组的B-细胞的受者小鼠,来自p210/cBSA/明矾供体 的B-细胞的过继转移未减少动脉粥样硬化(每组n=9)。2种不同剂量(C. 1×105细胞/小鼠或D.3×105细胞/小鼠)的CD4(+)CD25(+)T-细胞的受者小鼠 (每组n=9-13)未再现p210免疫的动脉粥样硬化减少作用。
图8显示了来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T细胞提高的针对树突细 胞的体外细胞溶解活性。较之来自PBS或BSA/明矾组的那些,来自p210 免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞显著具有更高的针对树突状细胞的细胞溶解 活性。重复实验4次,每次使用从每组的5只小鼠合并得到的CD8(+)T- 细胞。每次都一式两份或一式三份进行,每组中总计共11个数据点。
图9显示了,较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些,来自p210免疫 的小鼠的CD8(+)T-细胞含有更高水平的粒酶B;而穿孔素水平没有差 异。
图10显示了p210免疫后针对KLH或TNP的IgG滴度。较之接受 PBS或cBSA/明矾的小鼠,如通过IgG抗体滴度评价的,用p210的在先免 疫不会影响随后的(A)T-细胞依赖型(KLH,每组n=3-6)或(B)T-细胞非依 赖型(TNP,每组n=4-5)免疫的效力。
图11显示了用或不用根据本文所述的一种实施方式的p210免疫的小 鼠的Kaplan Meier存活曲线。
图12显示了根据本文所述的一种实施方式,apoE-/-小鼠中抗体对 p210的应答。
图13显示了通过CD25+细胞耗尽消除了p210-免疫CD8+T细胞的细 胞溶解活性。检验培养基中缺失血脂也消除了特异性针对p210的溶解活 性。
图14显示了根据本文所述的一种实施方式,DC对FITC-标记的p210 的内吞作用。
图15显示了根据本文所述的一种实施方式,如增加的活化的CD25+ 细胞所示,DC将肽p210体外呈递至CD8+CD25-T细胞。
图16显示了根据本文所述的一种实施方式,在FITC+细胞上门控的 CD8+溶解活性。来自用下述DC进行p210-接种的小鼠的CD8+T细胞的 p210-特异性溶解活性,所述DC载有用FITC-标记的p210。
发明详述
本文描述了允许在若干种实施方式中治疗和/或预防动脉瘤和/或其关 联病况的方法和系统。
本文中使用的术语“动脉瘤”表示血管或其部分的局部被血液填充的 扩张症(dilation)。特别地,动脉瘤可以是由于血管壁薄弱而导致动脉的 一部分异常加宽或气球样变(ballooning),并且可在体内的任何脉管系统 中发生。动脉瘤可以是“真的(true)”,其中血管内层凸出到血管外层 外部;或者可以是“假的(false)”,其是动脉或静脉的渗漏的血液的收 集处。动脉瘤通常,但不限于在脑基部动脉中或携带来自心脏左心室的血 液的主要动脉中的主动脉处发生。特别地,对主动脉而言,动脉瘤可在主 动脉的不同节段处发生,所述节段包括但不限于弓的始端(beginning of  the arch)、弓的末端(the end of the arch)、顶点(the apex)、在3和5 节段之间(between segments 3 and 5)、肾上节段(the supra renal  segment)、肾下节段(the infra renal segment)、杈前(before  bifurcation)和肾动脉之间(between the renal artery)。动脉瘤的症状包括 疼痛、外围栓塞、出血和本领域技术人员可鉴定的其他症状。本文中使用 的术语“治疗”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为,所述行为是 医药上或手术上对病况的医疗护理的一部分,或在医药上或手术上对病况 进行处理。本文中使用的术语“预防”(动词形式或名词形式)表示下述 任何行为,所述行为减少个体中的来自病况的死亡率或发病率负担。这在 一级、二级和三级预防水平下发生,其中:a)一级预防避免疾病发展;b) 二级预防行为的目标在于早期疾病治疗,从而增加干预机会,以预防疾病 进展和症状出现;和c)三级预防,通过恢复功能并减少疾病相关的并发症 来减少已确定的疾病的负面影响。
本文中使用的术语“病况”(condition)表示与完整的身体、精神和 可能的社会健康状态(well-being)关联的与个体的身体状况(总体上或其 一个或多个部分)不一致的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部 分)。本文描述的病况包括但不限于病症(disorder)和疾病(disease), 其中术语“病症”表示与身体或任何其部分的功能异常关联的活个体的病 况,术语“疾病”表示活个体的下述病况,所述病况损害身体或任何其部 分的正常功能,并典型地通过有区别的体征和症状被表征。示例性的病况 包括但不限于损伤、失能、病症(包括精神和身体病症)、综合征、感染、 个体的反常行为和个体身体或其部分的结构和功能的非典型性变化。
本文中关于两个项目使用的的措辞“与…关联的”表示两个项目之间 的下述关系:第一个项目的发生伴随着第二个项目的发生,其包括但不限 于因果关系和体征/症状-疾病关系。与动脉瘤相关联的示例性病况包括邻 近结构(比如神经)的压迫,包括但不限于,导致血管所处区域的薄弱和 麻痹的压迫;以及可能导致全身性生病和破裂的感染。与动脉瘤相关联的 其他示例性病况是血管破裂,其可能引起大量出血,导致中风、残疾和死 亡。与动脉瘤相关联的其他示例性病况是动脉粥样硬化。其他病况包括动 脉瘤症状,比如疼痛、外周栓塞形成、出血和可被技术人员鉴定的其他症 状。
在一些实施方式中,通过给个体施用有效量的ApoB-100的一种或多 种免疫原性片段或其免疫原性活性部分,可提供动脉瘤的治疗和/或预防。
本文中使用的术语“施用(administer)”或“施用 (administering)”或“施用(administration)”表示以任何方式给个体提 供物质的任何方法,所述方式包括但不限于本文讨论的那些。
本文中使用的术语“个体”(单数或复数形式)表示单个生物体,比 如高等动物和尤其是脊椎动物(比如哺乳动物),更尤其是人类。在一些 实施方式中,先前已基于通常与增加的动脉瘤风险相关联的病况(例如, 较高的血压、动脉粥样硬化)的检测将个体鉴定为具有增加的动脉瘤风 险。在一些实施方式中,个体未被鉴定为有增加的动脉瘤风险。在一些实 施方式中,未对个体的动脉瘤风险进行研究。
本文中使用的术语“免疫原性片段”或“抗原片段”表示能产生免疫 应答的任何长度的多肽的一部分,比如抗原。抗原是被免疫系统识别的分 子。ApoB100的抗原片段因此是呈现抗原性质的apoB-100的一部分。可 用可被技术人员鉴定的技术和程序来检测片段或其他分子产生免疫应答、 特别是细胞和/或体液应答的能力。
在本发明的意义上,术语“ApoB100的片段”不仅包括来自ApoB100 的任何长度的片段,还包括通过遗传重组或化学合成产生的包含来自 ApoB100的序列的肽。在本发明的意义上,术语“免疫原性片段”还包括 任何片段的衍生物,比如突变片段(包括具有替代的、添加的或缺失的残基 的片段)、氧化衍生物和/或用MDA或铜处理的肽,其保持了原片段的可检 测的抗原性质(例如,特异性的体液或细胞应答)。
本文中使用的关于第一肽(例如,免疫原性片段)的术语“衍生物”, 表示结构上与第一肽相关并通过下述修饰源自第一肽同时保留第一肽功能 性质的第二肽,所述修饰引入不在第一肽中存在的特性。因此,通过对与 原多肽或其部分不具有的其他功能可能关联或不关联的氨基酸序列进行修 饰,免疫原性片段或其任何部分(例如其表位)的衍生肽通常与原免疫原性 片段或其部分不同。但是免疫原性片段或其任何部分的衍生肽保留了本文 描述的与免疫原性片段或其部分有关的一种或多种免疫原性活性。使用比 如已针对免疫原性片段描述的那些方法和系统和对技术人员而言可鉴定的 其他方法和系统,可检验抗原性质。典型地,免疫原性片段的衍生物包含 免疫原性片段的至少一种表位。
在本发明的意义上术语“免疫原性活性部分”表示可引起特异性免疫 应答的参照抗原的任何部分。示例性的免疫原性活性部分是典型地由免疫 原性片段内的5个或更多个残基形成的表位。在一些实施方式中,一个或 多个片段内的表位可重叠。
可通过重组技术(比如与亲和标记物或表位标记物的融合)、游离的 或与载体蛋白轭合的寡肽的化学合成、或本领域已知表达ApoB-100肽的 任何其他方法,来表达免疫原性片段。
ApoB100的示例性的片段是下述肽,每一种肽包含如在实施例部分中 更详细描述的在序列表中作为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:302列出的序 列之一,或基本上由如在实施例部分中更详细描述的在序列表中作为SEQ  ID NO:1至SEQ ID NO:302列出的序列之一组成。适于鉴定在本发明的意 义上的免疫原性片段的方法和系统描述在WO 02/080954中,这里通过引 用并入该文献。其他方法在实施例部分中示出(见,例如实施例1)。
本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”表示由两种或多种 氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长 度的氨基酸聚合物(包括全长的蛋白质或肽),以及其类似物和片段。三 个或更多个氨基酸的肽也被称为寡肽。本文中使用的术语“氨基酸”、 “氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指二十种氨基酸之任何,包括具有非 天然侧链的合成氨基酸并包括D和L两种光学异构体。术语“氨基酸类似 物”是指其中一个或多个个别原子已用不同的原子、同位素或不同的功能 基团替代的氨基酸,但所述氨基酸在其他方面与其天然氨基酸类似物是等 同的。
在一种实施方式中,适于治疗动脉瘤的ApoB100的一种或多种免疫原 性片段与动脉粥样硬化减少相关联。
鉴定与动脉粥样硬化减少关联的分子的方法可被技术人员鉴定,并且 所述包括描述于WO 02/080954(其全文通过引用并入本文)中的示例性 程序。特别地,可使用可被技术人员鉴定的程序,在以合适量施用分子后 的动物模型中测试分子减少动脉粥样硬化的能力。例如,如在实施例部分 中阐释的,皮下施用本文所述的分子之后,可在小鼠中测试分子影响动脉 粥样硬化的能力。阅读本发明后,技术人员将能鉴定其他程序、施用时间 表和剂量。
因此,在示例性实施方式中,可如下鉴定出与动脉粥样硬化减少关联 的免疫原性分子:鉴定能在感兴趣的个体中提供细胞和/或体液应答的候选 免疫原性分子;并测试能减少动脉粥样硬化的候选免疫原性分子,以选择 与动脉粥样硬化减少相关联的候选免疫原性分子。
特别地,在一些实施方式中,ApoB100的免疫原性片段是产生与个体 中的或动物模型中的动脉粥样硬化减少相关联的免疫应答的免疫原性片 段。在这些实施方式中的一些中,动脉粥样硬化减少的百分比为至少约 20%或至少约30%,从约40%至约60%或从约50%至约80%。
参考实施例部分,其中关于免疫原性片段p210示例了本发明的实施 方式,所述免疫原性片段p210与约57.6%的动脉粥样硬化减少相关联,还 与由血管紧缩素输注诱导的动脉瘤切片的数目有关;(见实施例2),并 且被预期降低由动脉瘤破裂导致的死亡率(见实施例部分)。特别预期与 动脉粥样硬化减少相关联的其他片段在动脉瘤的治疗和/或预防中是有效的 (见实施例部分)。
在一些实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的免疫原性片段包含下述肽的至少一种,所述每一种肽包含p1 (SEQ ID NO:1)、p2(SEQ ID NO:2)、p11(SEQ ID NO:11)、p25(SEQ ID  NO:25)、p45(SEQ ID NO:45)、p74(SEQ ID NO:74)、p99(SEQ ID  NO:99)、p100(SEQ ID NO:100)、p102(SEQ ID NO:102)、p103(SEQ ID  NO:103)、p105(SEQ ID NO:105)、p129(SEQ ID NO:129)、p143(SEQ ID  NO:143)、p148(SEQ ID NO:148)、p210(SEQ ID NO:210)或p301(SEQ ID  NO:301)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽,其中每一种肽包 含p2(SEQ ID NO:2)、p11(SEQ ID NO:11)、p45(SEQ ID NO:45)、p74 (SEQ ID NO:74)、p102(SEQ ID NO:102)、p148(SEQ ID NO:148)或p210 (SEQ ID NO:210)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含两种肽,所述每一种肽包含p143 (SEQ ID NO:143)或p210(SEQ ID NO:210)。在一种实施方式中,与动脉 粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫原性片段包含三种肽,其中每一种 肽包含p11(SEQ ID NO:11)、p25(SEQ ID NO:25)或p74(SEQ ID NO:74) 之一。在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫 原性片段包含五种肽,其中每一种肽包含p99(SEQ ID NO:99)、p100 (SEQ ID NO:100)、p102(SEQ ID NO:102)、p103(SEQ ID NO:103)和 p105(SEQ ID NO:105)之一。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽,其中每一种肽包 含p2(SEQ ID NO:2)、p45(SEQ ID NO:45)、p74(SEQ ID NO:74)、p102 (SEQ ID NO:102)或p210(SEQ ID NO:210)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含下述肽,所述肽包含人类apoB- 100的氨基酸16-35(p2;SEQ ID NO:2)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含下述肽,所述肽包含人类apoB- 100的氨基酸661-680(p45;SEQ ID NO:45)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含下述肽,所述肽包含人类apoB- 100的氨基酸3136-3155(P210;SEQ ID NO:210)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含下述肽,所述肽包含人类apoB- 100的氨基酸4502-4521(P301;SEQ ID NO:301)。
在一种实施方式中,与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预 防动脉瘤的一种或多种免疫原性片段包含下述肽,所述肽包含人类apoB- 100的氨基酸1-20(P1;SEQ ID NO:1)。
显示上述肽与动脉粥样硬化减少相关联的示例性数据在本发明的实施 例5和国际申请WO 02/080954中示出,该文献全文通过引用并入(特别见 表1、表2、表A和表B)。特别地,对于这些肽中的一些或其组合而言, 已检测到64.6%(p143和p210)、59.6%(p11、p25和p74)、56.8%(p129、 p148和p167),p67.7(p2)、57.9%(p210)、55.2%(p301)、47.4%(p45)、 31%(p1)的减少百分比(见通过引用全文并入本文的WO/02080954,特别见 表B)。
技术人员可使用电子(in silico)和/或体外方法,鉴定包含本文所述 序列之任一的免疫原性肽或这些肽的免疫原性活性部分。例如,电子方法 可用来鉴定基于本文所述序列任一的表位或免疫原性肽。参考例如文献[44] 至[51],其每一篇全文通过引用并入本文。
这些文献描述了各种算法,比如Tepitope(Radrizzani等2000)、Adept (Maksuytov等1993)、抗原指数(antigenic index)(Jameson等1988)和其 他可用来鉴定包含所述序列或任何有关表位的免疫原性分子的算法。
可被技术人员用来证实电子数据和/或鉴定包含本文所述序列之任一或 这些序列的免疫原性活性部分的免疫活性分子的、适于单独使用或连同电 子鉴定一起使用的其他体外和/或体内测试和实验室程序(例如ELISA、抗 原-特异性T细胞增殖检验、ELISPOT、抗体测量)是可以被技术人员鉴定 的。
因此,在示例性实施方式中,可通过对本文所述的序列之任一进行电 子分析来鉴定候选肽、候选活性部分和/或候选衍生物,和通过对候选肽、 候选活性部分和/或候选衍生物进行体外和/或体内测试来鉴定免疫原性 肽、免疫原性活性部分和/或衍生物,来鉴定本文所述的免疫原性肽、其免 疫原性活性部分以及其衍生物。特别地,可用适于鉴定分子或其部分的免 疫原性的算法,通过分析候选序列,进行电子分析。类似地,体外和/或体 内测试包括直接鉴定候选肽、候选活性部分和/或衍生物的免疫原性以及这 些分子对动脉瘤的作用(特别是关于形成或衰退)的方法。阅读本发明 后,技术人员可鉴定合适的方法和技术。
在若干种实施方式中,预期免疫原性肽、其活性部分及其衍生物包括 至少约5个氨基酸的序列,和如WO 02/080954中所示的表位的典型长度 一致,所述文献其全文通过引用并入本文。
在一种实施方式中,用一种或多种本文所述的免疫原性分子进行的免 疫减少进行中的主动脉动脉瘤破裂的发生率(例如实施例2)。
在一种实施方式中,用一种或多种本文所述的免疫原性分子的免疫减 少了主动脉动脉瘤节段形成。特别地,在这些实施方式的一些中,动脉瘤 减少可在主动脉的不同节段处发生,所述节段包括但不限于弓的始端、弓 的末端、顶点、在3和5节段之间、肾上节段、肾下节段、杈前和肾动脉 之间(见,例如实施例3)。当与对照测量值相比较时,免疫后预期动脉 瘤减少至少约20%,特别地,约20%-80%。
在一种实施方式中,用本文描述的一种或多种免疫原性分子的免疫降 低了与主动脉动脉瘤破裂相关联的死亡率(见,例如实施例4)。
本文中使用的术语“有效量”意欲描述诱导抗原特异性免疫应答的抗 原(例如P210)的量。
本文所述的治疗和/或预防动脉瘤的免疫原性片段和一种或多种免疫原 性分子的有效量取决于其中进行活化的个体,并且阅读本发明后可被技术 人员鉴定。例如在一种实施方式中,可用从约100μg到约少于约1000μg 的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分,进行T细胞活化。在一 种实施方式中,可用从约1至约100mg的有效量的免疫原性片段或其免 疫原性活性部分进行动脉瘤治疗和/或预防。考虑到其中进行活化的个体和 期望的活化,技术人员可确定其他有效量。
在一种实施方式中,用于治疗或预防的有效量可为约100μg或更多。 特别地,预期用100μg P210治疗可预防动脉瘤破裂(见,例如实施例 2)。在一些实施方式中,治疗和/或预防可用1mg或更多,例如高至100 mg的量来进行。
取决于如在本发明中阐释的期望的作用,在一些实施方式中可使用更 大的浓度。例如,在其中期望治疗动脉瘤的实施方式中,预期用约25μg 或更多,特别地用约500μg的有效量进行治疗。在其中动脉瘤是处于早期 阶段检测的动脉瘤的另一实施方式中,较之用于治疗的量(例如从100至 250μg),预期治疗动脉瘤的有效量为更低的量,即使在一些案例中,在 250μg或500μg或更高范围内的量也预期是有效的,这也取决于影响个体 中分子的药理学活性的其他因素。
特别地,也预期有效量取决于下述因素而变化:针对每种具体疫苗利 用的肽的数目和组合,和被治疗的个体的病况和具体特征(例如免疫系统膳 食和总体健康和可被技术人员鉴定的其他因素)。更特别地,取决于多种因 素,比如个体的重量、年龄、性别以及可被技术人员鉴定的其他因素,预 期在所定义的范围内的更低或更高的量对个体是有效的。
在一些实施方式中,本文所述的免疫原性肽或相关的免疫原性活性部 分可与适于影响并特别地提高肽或其活性部分的免疫原性的佐剂或其他载 体组合施用。特别地,在一些实施方式中,根据对技术人员而言可鉴定的 程序,免疫原性肽或其活性部分可与佐剂或载体轭合。合适的载体包括 BSA,特别是阳离子化的BSA,人血清白蛋白(HSA),特别是阳离子化 的HSA,铝盐,比如磷酸铝和氢氧化铝和其他可被技术人员鉴定的载体。
在一些实施方式中,本文所述的免疫原性分子可以以如下的免疫原性 分子∶载体∶铝的重量与重量比率施用:约1∶2∶35、1∶2∶20.6、1∶2∶7.7、 1∶2∶3.3、1∶1∶13.8。特别地,在一些实施方式中,可提供这样的比率,其中 肽的数目与每一载体分子轭合,同时最小化铝(佐剂)的量。特别地在一种 实施方式中,可提供导致高至2.7mg轭合物/mL的浓度的比率。
在一种实施方式中,根据下述施用时间表进行施用,所述施用时间表 考虑期望的作用来确定。特别地,预期按照下述剂量和时间表进行施用, 所述剂量和时间表基于将被治疗的个体的病况和期望的作用而被确定。例 如可基于个体病况,通过进行单次施用或以一定的间隔多次施用(例如2次 施用或更多次,特别地高至6次施用)本文所述的免疫原性片段或其免疫原 性活性部分来进行施用,以获得期望的免疫。
在一些实施方式中,可根据考虑到个体的适应性免疫系统所需的时间 量而设计的施用时间表,来施用本文所述的免疫原性分子,以发动对免疫 原的第一次暴露的应答。典型地,应答被预期在暴露后2-3周达到平台期 (plateau)。随后的暴露通常引起更为快速的应答。在各种实施方式中, 随后的时间表和施用方式可遵循:(1)单次施用,(2)间隔2-3周的两次施 用,(3)三次每周一次的施用,(4)以每3周1次的时间表进行高至6次施 用。通过下述方式施用疫苗:(1)皮下注射;(2)腹膜内注射;(3)鼻腔装 置;(4)皮下输注。
免疫途径可取决于本文描述的免疫目的而改变。小鼠中成功的动脉瘤 预防和治疗通过皮下渗透泵注射来进行(实施例2、3和4)。触发的免疫应 答类型很大程度上是由免疫途径决定的。可使用各种途径,包括皮下的、 肠胃外的和全身性的,以及其他。特别地,气管和肠的粘膜衬里含有淋巴 组织,所述淋巴组织当暴露于抗原时,引起抗炎性的、免疫抑制的应答。 当通过鼻腔或口腔途径进行抗原暴露时,呼吸和肠粘膜的不同的免疫特性 导致部分不同的防护性免疫类型。
在一种实施方式中,施用一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性 部分可通过皮下或肌肉进行。
在一些实施方式中,提供了预防个体的动脉瘤和/或其关联病况的方 法,所述方法包括增加个体中的对本文所述的ApoB-100的免疫原性片段 或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+)T细胞。
本文中使用的术语“T细胞”表示T淋巴细胞,属于称为淋巴细胞的 白细胞的一个组,并参与体液或细胞-介导的免疫。通过其细胞表面上特殊 标记物比如T细胞受体(TCR)的存在,T细胞可与其他淋巴细胞类型比如 B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。鉴定T细胞的其他标记物包括 CD1a、CD3或技术人员所知道的可能与T细胞状态和/或功能关联的其他 标记物。
术语“CD8(+)T细胞”表示在其表面上表达CD8糖蛋白的T细胞, 其中CD8(分化簇8)糖蛋白是跨膜糖蛋白,其作为T细胞受体(TCR)的辅 助受体发挥作用。类似于TCR,CD8与主要的组织相容性复合体(MHC)分 子结合,但对I类MHC蛋白是特异性的。示例性的CD8T细胞包括细胞 毒性记忆CD8T细胞、调控CD8T细胞、细胞毒性效应器(effector) CD8T-细胞和技术人员可鉴定的其他细胞。蛋白质存在两种同种型——α 和β,每一种由不同的基因所编码。在人类中,两种基因都位于染色体2 上的2p12位置。
本文中使用的术语“活化的”和“活化”表示下述过程,通过所述过 程,在导致T细胞在免疫系统内具有预先指定的免疫作用(例如细胞毒性) 的条件下,T细胞与呈递特异性抗原的抗原呈递细胞相互作用一段时间。 术语“抗原-呈递细胞”(antigen-presenting cell,APC)表示在其表面上显示 (display)具有主要组织相容性复合体(MHC)的抗原复合物的细胞。T-细 胞使用其T-细胞受体(TCR)识别该复合物。示例性的APC包括树突细胞 (DC),所述树突细胞已知在联系先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用, 见参考文献(3,4),且这两种免疫应答都参与动脉粥样硬化形成,见参考 文献(5),(6)。
T细胞,特别是CD8(+)T细胞的检测,可通过单独的标记物(比如 CD8)或与TCR和可由技术人员鉴定的其他标记物组合的标记物(比如 CD8)的检测来进行。可使用适于检测表面标记物的方法和技术,通过检 测T细胞标记物,特别是比如CD25、CD44、CD62的标记物,和可由技 术人员鉴定的其他标记物,进行活化的CD8(+)T细胞的检测。
本文中使用的术语“检测”(动词形式或名词形式)表示测定有限部 分的空间(包括但不限于样品、反应混合物、分子复合物和底物)中分子 或细胞的存在、出现或事实。本文中使用的“检测”(动词形式或名词形 式)可包括对目标物的化学和/或生物性质的测定,所述性质包括但不限于 与其他化合物相互作用特别是结合的能力、活化另一化合物的能力和阅读 本发明后可由技术人员鉴定的其他性质。检测可以是定量的或定性的。当 检测表示、涉及或包括对目标物或信号的数量或量进行测量时,检测是 “定量的”(也称为定量分析),其包括但不限于被设计为测定目标物或信 号的量或比例的任何分析。当检测表示、涉及或包括按照对另一目标物或 信号的相对丰度对目标物或信号的品质或种类进行鉴定时,检测是“定性 的”,其不是被量化的。
适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的 适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚 物或六聚物,以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方 法中,如在实施例部分中描述的,通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。 适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当 分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或 六聚物,以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方法 中,如在实施例部分中所述,通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。在本 文描述的T细胞、组合物、方法和系统的一些实施方式中,可使用 ApoB100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化CD8(+)T 细胞。
特别地,通过在活化CD8(+)T细胞的条件下,使CD8(+)T细胞与选 自由p1(SEQ ID NO:1)、p2(SEQ ID NO:2)、p11(SEQ ID NO:11)、p25 (SEQ ID NO:25)、p45(SEQ ID NO:45)、p74(SEQ ID NO:74)、p99(SEQ ID  NO:99)、p100(SEQ ID NO:100)、p102(SEQ ID NO:102)、p103(SEQ ID  NO:103)、p105(SEQ ID NO:105)、p129(SEQ ID NO:129)、p143(SEQ ID  NO:143)、p148(SEQ ID NO:148)、p210(SEQ ID NO:210)或p301(SEQ ID  NO:301)组成的组的一种或多种肽或其免疫原性活性部分接触一段时间, 可获得对ApoB100的免疫原性片段特异性的活化的CD8(+)T细胞,其中 所述活化的CD8(+)T细胞对一种或多种肽或其免疫原性活性部分是特异 性的。
本文描述的活化的T细胞对一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活 性部分是特异性的。本文中使用的关于免疫原性应答的措辞“特异性 的”、“特异性地”或“特异性”是指免疫制剂指导针对抗原的免疫活 性、同时不指导或显著更少地指导对可能存在的其他抗原的免疫活性的能 力。因此,本文中的CD8(+)T细胞对用来活化它们的免疫原性片段或活 性部分而不是其他抗原是特异地有活性的。
可用来鉴定对免疫原性片段特异性的CD8T细胞的示例性的抗原性质 包括可以使用如实施例部分中示例的那些方法和技术以及可由技术人员鉴 定的其他方法和技术来检测的体液和/或细胞应答。在本发明的意义上用于 检测抗原性质的示例性的方法和系统包含ELISA,特别是血清ELISA,和 在实施例部分中示例的其他方法。
在一种实施方式中,活化的CD8(+)T细胞对与治疗或预防动脉粥样 硬化相关联的在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:302之间任何一种或多种肽或 其免疫原性活性部分而言是特异性的。在一些实施方式中,免疫原性片段 包括肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、 SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:210的一种或多种或其免 疫原性活性部分。在一些实施方式中,免疫原性片段包括肽SEQ ID  NO:2、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:102、SEQ ID  NO:210的一种或多种或其免疫原性活性部分。甚至更特别地,在一些实 施方式中,免疫原性片段包括人类apoB-100的氨基酸3136-3155(P210; SEQ ID NO:210)或其免疫原性活性部分。一般而言,证明或预期与个体的 动脉瘤治疗和/或预防相关联的免疫原性片段的相同组合还被预期能够活化 将要用于个体的动脉瘤治疗和/或预防的CD8(+)T细胞。特别地,可使用 以适于治疗或预防动脉瘤的量、体内施用的本文所述的分子的任何一种, 进行T细胞活化(见例如实施例部分)。还可使用比如参考文献[52]描述的方 法和程序以及可被技术人员鉴定的其他程序,体外进行T细胞活化。
在一种实施方式中,可通过给个体施用有效量的活化的CD8(+)T细 胞,进行个体中的CD8(+)T增加,以治疗和/或预防动脉瘤。
在一种实施方式中,有效量被预期包含在约500,000个至2,000,000个 之间的细胞。在实施方式中,有效量被预期包含在约750,000个至约 1,500,000个之间的细胞。在一种实施方式中,有效量被预期为约 1,000,000个细胞。
特别地,在一种实施方式中,预期施用约1,000,000个细胞会导致动 脉粥样硬化的治疗和预防二者,并因此预期对动脉瘤的治疗和预防也是有 效的。施用被预期按照下述剂量和时间表进行,所述剂量和时间表基于将 被治疗的个体的病况和期望的作用而被确定。例如在用于预防的施用中, 可以基于个体病况,通过单次施用或有间隔的多次施用(例如3次或更多次 施用,特别地高至6次施用)本文描述的活化的CD8(+)T细胞,来进行有 效量的活化的CD8(+)T细胞的施用,从而获得期望的免疫。特别地,无 论什么时候期望延长免疫作用,均可进行多次施用。
在一些实施方式中,根据施用时间表,本文所述的活化的CD8+T细 胞被预期是有效的,其中每日(高至21天)施用所述细胞和按照每10天的 时间表(0、10、20天)施用所述细胞。预期有效的其他时间表可由技术人 员基于其他病况(比如HIV和/或癌症)的细胞治疗来确定。
按照对技术人员而言可鉴定的使个体免疫的方法,进行本文描述的 CD8(+)T细胞的施用。在一种实施方式中,可通过胃肠外施用进行施用。 胃肠外施用是通过消化道之外的途径给予物质的全身性施用途径,其包括 但不限于静脉注射施用、动脉内施用、肌肉注射施用、皮下施用、真皮内 施用、腹膜内施用和膀胱内输注。特别地,在一种实施方式中,可通过静 脉注射施用进行施用。
在一种实施方式中,可通过施用活化的CD8(+)T细胞(典型地通过 静脉内途径)一次进行施用,施用一次或多次,这取决于免疫作用的期望 的持续时间。
在其中提供了治疗和/或预防个体的动脉瘤和/或其关联病况的方法的 一些实施方式中,有效量的对ApoB100的免疫原性片段特异性的CD8(+) T细胞可单独施用或与有效量的本文所述的一种或多种免疫原性片段或其 免疫原性活性部分组合施用。特别地,可以以与治疗和/或预防动脉瘤所需 的相同或更少的量,施用一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部 分。
在其中提供了治疗和/或预防个体的动脉瘤和/或其关联病况的方法的 一些实施方式中,活化的CD8(+)T细胞和/或ApoB100的免疫原性片段或 其免疫原性活性部分的有效量有所变化,免疫途径也有所变化,所述免疫 途径可取决于本文描述的免疫目的而改变。可使用各种途径,包括皮下 的、肠胃外的和全身的以及其他。特别地,气管和肠的粘膜衬里含有淋巴 组织,当所述淋巴组织暴露于细胞时,引起抗炎性的、免疫抑制的应答。
在一些实施方式中,可与CD8(+)T细胞活化的增强剂组合进行免疫 原性片段和/或CD8(+)T细胞的施用。
当涉及有关CD8T细胞的分子时,术语“增强剂”和“增强”是指分 子通过促进免疫系统的细胞的活化而改进免疫应答的能力。选择合适的增 强剂可允许控制免疫应答的活化。示例性的增强剂包括细胞因子,比如 IL-10、IL-2、IL-12、IL-4、IL-16。本文中使用的术语“细胞因子”是指细 胞信号转导的分子,其起免疫调节剂的作用,并且包括蛋白质如对技术人 员而言可被鉴定的白细胞介素和干扰素。选择合适的细胞因子可在合适的 条件下导致优先诱导体液或细胞的免疫应答。
在一种实施方式中,增强剂可以是白细胞介素2(IL2)、白细胞介素10 (IL-10)、白细胞介素15(IL-15)、TGF-β(TGF-β)、IL2-抗IL-2抗体复合 物和/或阅读本发明后可由技术人员鉴定的其他增强剂。参考参考文献 Mitchell等2010[38]、Perret等2008[39]和Kamimura等2007[40],所述 文献描述了有关T细胞活化的增强剂的示例性用途,每一篇文献全文都通 过引用并入。
特别地,在一些实施方式中,通过减少个体中的树突细胞对CD86的 表达和/或IL12的分泌,进行所述增强。
在一些实施方式中,还用提供的用于治疗和/或预防个体的动脉瘤和/ 或其关联病况的方法,与有效量的对ApoB100免疫原性片段特异性的 CD8(+)T细胞和可能地一种或多种增强剂一起施用ApoB-100的免疫原性 片段。
如本文所公开的,可提供本文所述的免疫原性片段或其免疫原性活性 部分、CD8(+)T细胞和增强剂作为治疗和/或预防动脉瘤或其关联病况的 系统的一部分。
在一种实施方式中,系统包含以下的至少两种:呈递ApoB-100的免 疫原性片段的表位的一种或多种CD8(+)T细胞和能增强活化的CD8(+)T 细胞的一种或多种细胞因子。
在一种实施方式中,系统包含以下的至少两种:ApoB-100的一种或 多种免疫原性片段和一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段特异性的活 化的CD8(+)T细胞。
在一种实施方式中,系统包含下述的至少两种:apoB-100的一种或多 种免疫原性片段和CD8(+)T细胞,和一种或多种呈递有ApoB-100的免疫 原性片段的表位的CD8(+)T细胞,并且还包含能增强CD8(+)T细胞的一 种或多种细胞因子。
系统可以多部件试剂盒的形式提供。在多部件试剂盒中,本文描述的 CD8(+)T细胞、免疫原性片段和用于进行本文描述的方法的其他试剂可以 独立地包含在试剂盒中。本文描述的CD8(+)T细胞可包含在一种或多种 组合物中,并且每一种本文描述的CD8(+)T细胞可连同合适的载剂存在 于组合物中。
其他组件可包括,能检测本文描述的CD8(+)T细胞的增强剂分子, 比如标记的分子,特别是标记的抗体、标记、微流控芯片、参照标准物和 阅读本公发明后技术人员可确定的其他组件。本文中使用的作为复合物部 件或分子的术语“标记”和“标记的分子”是指能检测的分子,包括但不 限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、发色团、酶、酶底物、酶辅 因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶、配体(比如生 物素、抗生素蛋白、抗生蛋白链菌素或半抗原)等等。术语“荧光团”是指 能在可检测的图像中显示荧光的物质或其部分。因此,本文中使用的措辞 “标记信号”表示从允许标记检测的标记发射的信号,包括但不限于放射 性、荧光、化学发光、在酶反应结果中产生化合物等等。
在一些实施方式中,本文描述的CD8(+)T细胞或免疫原性片段的检 测也可通过基于荧光的读出器进行,其中标记的抗体用荧光团标记,所述 荧光团包括(但并非穷尽性地),小分子染料、蛋白质发色团、量子点和 金纳米颗粒。阅读本公开后其他技术可由技术人员鉴定并将不会进一步详 细地讨论。
特别地,为了进行本文描述的方法,可提供具有合适的说明书和其他 必要试剂的试剂盒的组件。试剂盒通常含有在单独的容器中的组合物。在 试剂盒中通常包括用于进行检验的在纸上或电子支持物(比如磁带或CD- ROM)上的说明书,例如书面说明书或音频说明书。取决于使用的具体方 法,试剂盒还可含有其他包装的试剂和材料(例如洗涤缓冲液等等)。
在一些实施方式中,本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+) T细胞和/或增强剂可与合适的载体一起包括在组合物中。
本文中使用的术语“载体”表示下述各种介质中的任何,所述介质对 包含在组合物中作为活性成分的T细胞而言通常作为溶剂、载体、粘合剂 或稀释剂发挥作用。
在其中组合物被施用给个体的一些实施方式中,组合物可以是医药抗 炎症性组合物,并包含T细胞和医药上可接受的载剂。
特别地,在一些实施方式中,本文公开了医药组合物,其含有与一种 或多种相容的医药上可接受的载剂组合的,特别是与医药上可接受的稀释 剂或赋形剂组合的,本文描述的至少一种免疫原性片段、其活性部分、 CD8(+)T细胞和/或增强剂。在这些医药组合物中,本文描述的免疫原性 片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂可作为活性成分被施用, 用于治疗或预防个体的病况。
本文中使用的术语“赋形剂”表示用作药物活性成分的载体的非活性 物质。本文公开的用于医药组合物的合适的赋形剂包括增强个体身体吸收 本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂的能 力的任何物质。合适的赋形剂还包括可用来增大含有本文所述的免疫原性 片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂的配方量以允许便利和准 确的剂量的任何物质。除了它们在单剂量数量中的用途以外,赋形剂可在 制造过程中使用,以帮助处理本文描述的免疫原性片段、其活性部分、 CD8(+)T细胞和/或增强剂。取决于施用的途径和药物形式,可使用不同 的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于抗粘着剂、粘合剂、涂覆崩解 剂、填充剂、香料(比如甜味剂)和颜料、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸着 剂。
本文中使用的术语“稀释剂”表示用于稀释或携带组合物的活性成分 的稀释试剂。合适的稀释剂包括可降低药物制剂的粘性的任何物质。
在一种实施方式中,本文描述的组合物还可包含佐剂。本文中使用的 术语“佐剂”表示可刺激免疫系统并增加对疫苗的应答,而其本身不具有 任何特异性抗原作用的试剂。措辞“佐剂”来自拉丁文adjuvare,其意思 是帮忙或帮助。典型地,免疫学佐剂被定义为当与特异性疫苗抗原组合使 用时起加速、延长或增强抗原-特异性免疫应答作用的任何物质。
在一些实施方式中,医药组合物可包括(1)单独施用的本文描述的 肽或其他免疫原性分子;(2)本文所述的肽或其他免疫原性分子+(一种或 多种)载体;(3)本文所述的肽或其他免疫原性分子+佐剂;(4)本文所述的 肽或其他免疫原性分子+载体+佐剂。特别地,用于示例性组合物(1)至(4) 的每一种的载体可分别包括:(1)cBSA、(2)rHSA、(3)KLH、(4)霍乱毒素 B亚基,其每一种可以是基于矿物质盐的。本领域技术人员知道的其他载 体被预期是合适的,并将被技术人员鉴定出。这些佐剂的例子包括具有 Th2作用的佐剂、具有佐剂性质的载体,例如,白喉类毒素,和能作为载 体起作用的佐剂,例如,水包油乳液。在一些实施方式中,对医药组合物 而言必要的、和在某些情况下充分的组件是免疫原性肽。如技术人员所已 知的,可选择组合物的其他组件来调控本文所述的肽或其他免疫原性分子 的免疫效果。
下文的详细公开将使本发明的其他优势和和特征更加明了,所述公开 仅以阐述的方式涉及实验部分。
实施例
本文描述的方法和系统在下述实施例中进一步阐释,所述方法和系统 通过阐释的方式提供并且并非意图限制。
特别地,下述实施例阐释了示例性的免疫原性片段,以及用于对个体 免疫以治疗或预防动脉瘤的方法,特别是使用片段p210的方法。
本领域技术人员会意识到使本部分详细描述的特征适合于其他免疫原 性片段的可行性和必要的改进,所述免疫原性片段按照本发明的实施方式 皮下施用或使用其他施用途径体内或体外施用。
除非另外指出,下文报告的实施例中遵循下述材料和方法。
用于免疫的肽的选择及其制备 已报道了人类apoB-100肽的确定和筛 选(8)。基于申请人的初步试验和先前报道,见参考文献(9)、(10),申请人 选择了肽210(p210,KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH-SEQ ID NO:210) 作为候选免疫原。使用先前描述的方法,见参考文献(3)、(4),使天然 p210肽(Euro-Diagnostica AB,瑞典)与用作载体的阳离子牛血清白蛋白 (cBSA)轭合。明矾被用作佐剂,并与肽/cBSA轭合物用体积比1∶1的比 率混合。肽轭合物以及与明矾的混合物在每次免疫之前新鲜制备。
免疫方案 雄性apoE-/-)小鼠(Jackson实验室)饲养在由美国实验室 动物管理认证协会(American Association of Accreditation of Laboratory  Animal Care)认可的动物设施中,并进行无限制得到水和食物的12-小时 日/夜周期的喂养。Cedars-Sinai医学中心的实验动物护理与使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee of Cedars-Sinai Medical  Center)批准了实验方案。在初步实验中,较之25或50μg剂量,使用 100μg剂量的p210免疫赋予了最佳的动脉粥样硬化-减少。因此,100μg 剂量用于所有随后的实验。以正常食物膳食饲养的小鼠,在6-7周龄时在 肩胛骨之间的脊背区域接受皮下的初次免疫,随后在9和12周龄时加强 剂量。最后一次加强剂量后一周,膳食被转变为高胆固醇食物(TD 88137,Harlan-Teklad),并持续至在25周龄时安乐死。在相同的免疫时 间点下接受PBS或cBSA/明矾的单独小鼠组作为对照。一些小鼠在8或13 周龄时被处死以评价对p210的免疫应答。
组织收获和制备 安乐死时,收获心脏并包埋进OCT化合物(Tissue- Tek)中用于冷冻切片。全部的主动脉被清洁、处理并用油红O染色,从 而用计算机辅助的组织形态测量技术前位分析(en face)来评价动脉粥样 硬化程度,见参考文献(3)、(4)。
免疫组织化学和组织形态测量 使用标准方案,将来自主动脉窦的切片 用MOMA-2(Serotec)或CD 11c(eBioscience)抗体染色,以免疫组织 化学地鉴定巨噬细胞或树突细胞。使用标准方案进行针对斑块尺寸的油红 O染色。如前文所述进行计算机辅助的形态测量分析来评价组织形态,见 参考文献(3)、(4)。
血清ELISA 使用标准方案,将平底96-孔聚苯乙烯平板(MaxiSorp, 德国)分别用100μl(20μg/ml)p210、KLH、TNP-KLH(Biosearch  Technologies T-5060)或BSA(针对IgG为2μg/ml或针对IgM为10μg/ml)预 先涂覆,在4℃孵育过夜,以评价抗体水平。初步实验中最佳化涂覆浓 度。山羊抗-小鼠HRP-IgG(Pierce 31437)或IgM(Southern Biotech)用作检 测抗体,并通过在作为底物的ABTS(Southern Biotech)中显影检测结合抗 体,并在405nm下记录光密度值。
流式细胞计量分析 使用标准方案用下文表1中列出的抗体和FACScan (Becton Dickinson)或CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)进行流式细胞计 量分析。对于细胞内的细胞因子染色,将Brefeldin A(3μg/ml)添加至培养 过的细胞2小时,之后细胞经受染色程序。可渗透化处理细胞膜,用于染 色细胞内的分子。
表1
过继转移实验 如前面段落中描述的,常规饮食的雄性apoE(-/-)小鼠 接受皮下免疫并在13周龄时被处死作为供体。将来自相同处理组的脾细 胞合并,之后进行细胞分离。根据制造商的方案,使用Dynabeads  FlowComp(Invitrogen),将供体CD8(+)T-细胞、CD4(+)CD25(+)T-细胞或 B-细胞分离。CD4(+)T-细胞被从脾细胞中阴性选择出,随后阳性选择 CD4(+)CD25(+)细胞。阴性分离B细胞,而CD8(+)T-细胞首先被阳性分 离并从珠粒中释放出。合并的CD8(+)T-细胞、CD4(+)CD25(+)T-细胞和 B-细胞的纯度分别为90%、80%和70%。接着将分离的CD8(+)T-细胞 (1×106细胞/小鼠)、CD4(+)CD25(+)T-细胞(1×105或3×105细胞/小鼠)或B- 细胞(2×107细胞/小鼠)通过尾部静脉注射过继转移至6-7周龄的未经实验 的雄性apoE-/-)受者小鼠。在公开的血管生物学文献中,过继转移的淋巴 细胞数目大大不同。对于B-细胞转移,基于两个先前报道,见参考文献 (11)、(12),选择2×107个细胞/小鼠的数量。对于CD4(+)CD25(+)T-细胞 转移,在公开的文献(13)、(14)、(15)中,转移的细胞数目范围从5×104细 胞/小鼠至1×106细胞/小鼠。因此申请人选择了2个中间剂量用于我们的实 验。对CD8(+)T-细胞而言,基于自身免疫性疾病领域的报道,见参考文 献(16),选择了1×106个细胞。申请人未过继转移CD4(+)T-细胞,因为未 经实验的或初次与抗原接触的(antigen-primed)CD4(+)T-细胞已知是致 动脉粥样硬化的,见参考文献(17)、(18)。受者小鼠被正常食物喂养,直 到13周龄时,将食物转变为高胆固醇膳食,直到25周龄时安乐死。收获 主动脉来评价动脉粥样硬化的程度。
KLH或三硝基苯基-脂多糖(TNP-LPS)免疫 申请人还测试了p210免疫 是否影响随后用其他抗原进行免疫的效力。选择KLH作为原型T-细胞依 赖型抗原,TNP作为T-细胞非依赖型抗原。如针对apoE-/-)小鼠的前面 段落中描述的,常规饮食的雄性C57/BL6小鼠接受用p210轭合物或佐剂 对照的皮下免疫。在13和15周龄时,用100μg KLH(用明矾作为佐剂)在 远离p210部位的注射部位使小鼠皮下免疫,或用100μg TNP-LPS(Sigma) 腹膜内注射。在单独的小鼠组中进行KLH或TNP免疫。在安乐死(16周龄 时)时通过眼球后穿刺收集血液。
BM-来源的树突细胞(BMDC)的体外产生 从先前的出版物(见参考文 献(19))通过改变改造得到用GM-CSF产生BMDC的方法。简而言之,将 来自雄性apoE-/-小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞涂布在带有含10ng/ml GM- CSF(R&D Systems)和10ng/ml IL-4(Invitrogen)的20ml完全RPMI-1640的 10cm培养平板(Falcon)上。在第3天和第5天时,通过去除旧的培养基, 随后用具有GM-CSF和IL-4的新鲜培养基再补充,来洗涤并喂养细胞。 第8天,在显微镜下未成熟的DC作为非粘附细胞出现,通过强力吸打 (pipetting)被收获,并在1.5ml培养基中有2×105DC的新培养平板中再 次培养。
体外CD8+T-细胞分离和与树突细胞共培养 根据前面段落中描述的时 间表,用PBS、cBSA/明矾或cBSA/明矾/P210使CD8(+)T-细胞的供体小 鼠[雄性apoE-/-)小鼠]免疫并在13周龄时收获脾细胞。使用CD8选择 Dynabeads试剂盒(Invitrogen),按制造商方案,阴性分离CD8(+)T-细胞。 接着将选择的CD8(+)T-细胞与DC以3∶1的CD8∶DC比率共培养。已进行 了一系列的初步研究以确定用于该检验的最佳CD8∶DC比率。共培养4小 时后,收集并处理细胞,用于通过LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)进行 CD 11c和7-AAD的流式细胞计量测定,并且用Summit V4.3软件分析数 据。在共培养中没有CD8(+)T-细胞的树突细胞死亡被用作基线,并使用 前述的方法,计算细胞特异性溶解的百分比,见参考文献(20)。
统计学 数据以均值±Std表示。每个组的动物数目在正文或图说明中 列出。通过ANOVA,随后通过Newman-Keuls多组间比较或适当的时候 通过t-检验分析数据。认为P<0.05是统计学上显著的,每个图中的水平 条表示组间在统计学上显著差异。
实施例1:ApoB-100的免疫原性片段
通过关注LDL中出现的单个蛋白——载脂蛋白B-100(apo B),表征 了特异性免疫原性表位。产生了由长度为20个氨基酸残基的302个肽组 成的肽文库,其覆盖人类Apo B-100的全部的4563个氨基酸序列。产生的 肽具有5个氨基酸重叠,以覆盖断点处所有的序列。如下文 表2 中所示 的,从apo B的N-末端开始,肽编号为1-302。
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P1: EEEML ENVSL VCPKD ATRFK aa 1-20 SEQ ID NO:1
P2: ATRFK HLRKY TYNYE AESSS aa 16-35 SEQ ID NO:2
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P3: AESSS GVPGT ADSRS ATRIN aa 31-50 SEQ ID NO:3
P4: ATRIN CKVEL EVPQL CSFIL aa 46-65 SEQ ID NO:4
P5: CSFIL KTSQC TLKEV YGFNP aa 61-80 SEQ ID NO:5
P6: YGFNP EGKAL LKKTK NSEEF aa 76-95 SEQ ID NO:6
P7: NSEEF AAAMS RYELK LAIPE aa 91-110 SEQ ID NO:7
P8: LAIPE GKQVF LYPEK DEPTY aa 106-125 SEQ ID NO:8
P9: DEPTY ILNIK RGIIS ALLVP aa 121-140 SEQ ID NO:9
P10: ALLVP PETEE AKQVL FLDTV aa 136-155 SEQ ID NO:10
P11: FLDTV YGNCS THFTV KTRKG aa 151-170 SEQ ID NO:11
P12: KTRKG NVATE ISTER DLGQC aa 166-185 SEQ ID NO:12
P13: DLGQC DRFKP IRTGI SPLAL aa 181-200 SEQ ID NO:13
P14: SPLAL IKGMT RPLST LISSS aa 196-215 SEQ ID NO:14
P15: LISSS QSCQY TLDAK RKHVA aa 211-230 SEQ ID NO:15
P16: RKHVA EAICK EQHLF LPFSY aa 226-245 SEQ ID NO:16
P17: LPFSY NNKYG MVAQV TQTLK aa 241-260 SEQ ID NO:17
P18: TQTLK LEDTP KINSR FFGEG aa 256-275 SEQ ID NO:18
P19: FFGEG TKKMG LAFES TKSTS aa 271-290 SEQ ID NO:19
P20: TKSTS PPKQA EAVLK TLQEL aa 286-305 SEQ ID NO:20
P21: TLQEL KKLTI SEQNI QRANL aa 301-320 SEQ ID NO:21
P22: QRANL FNKLV TELRG LSDEA aa 316-335 SEQ ID NO:22
P23: LSDEA VTSLL PQLIE VSSPI aa 331-350 SEQ ID NO:23
P24: VSSPI TLQAL VQCGQ PQCST aa 346-365 SEQ ID NO:24
P25: PQCST HILQW LKRVH ANPLL aa 361-380 SEQ ID NO:25
P26: ANPLL IDVVT YLVAL IPEPS aa 376-395 SEQ ID NO:26
P27: IPEPS AQQLR EIFNM ARDQR aa 391-410 SEQ ID NO:27
P28: ARDQR SRATL YALSH AVNNY aa 406-425 SEQ ID NO:28
P29: AVNNY HKTNP TGTQE LLDIA aa 421-440 SEQ ID NO:29
P30: LLDIA NYLME QIQDD CTGDE aa 436-455 SEQ ID NO:30
P31: CTGDE DYTYL ILRVI GNMGQ aa 451-470 SEQ ID NO:31
P32: GNMGQ TMEQL TPELK SSILK aa 466-485 SEQ ID NO:32
P33: SSILK CVQST KPSLM IQKAA aa 481-500 SEQ ID NO:33
P34: IQKAA IQALR KMEPK DKDQE aa 496-515 SEQ ID NO:34
P35: DKDQE VLLQT FLDDA SPGDK aa 511-530 SEQ ID NO:35
表2
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P68: LKFVT QAEGA KQTEA TMTFK aa 1006-1025 SEQ ID NO:68
P69: TMTFK YNRQS MTLSS EVQIP aa 1021-1040 SEQ ID NO:69
P70: EVQIP DFDVD LGTIL RVNDE aa 1036-1055 SEQ ID NO:70
P71: RVNDE STEGK TSYRL TLDIQ aa 1051-1070 SEQ ID NO:71
P72: TLDIQ NKKIT EVALM GHLSC aa 1066-1085 SEQ ID NO:72
P73: GHLSC DTKEE RKIKG VISIP aa 1081-1100 SEQ ID NO:73
P74: VISIP RLQAE ARSEI LAHWS aa 1096-1115 SEQ ID NO:74
P75: LAHWS PAKLL LQMDS SATAY aa 1111-1130 SEQ ID NO:75
P76: SATAY GSTVS KRVAW HYDEE aa 1126-1145 SEQ ID NO:76
P77: HYDEE KIEFE WNTGT NVDTK aa 1141-1160 SEQ ID NO:77
P78: NVDTK KMTSN FPVDLS DYPK aa 1156-1175 SEQ ID NO:78
P79: SDYPK SLHMY ANRLL DHRVP aa 1171-1190 SEQ ID NO:79
P80: DHRVP ETDMT FRHVG SKLIV aa 1186-1205 SEQ ID NO:80
P81: SKLIV AMSSW LQKAS GSLPY aa 1201-1220 SEQ ID NO:81
P82: GSLPY TQTLQ DHLNS LKEFN aa 1216-1235 SEQ ID NO:82
P83: LKEFN LQNMG LPDFH IPENL aa 1231-1250 SEQ ID NO:83
P84: IPENL FLKSD GRVKY TLNKN aa 1246-1260 SEQ ID NO:84
P85: TLNKN SLKIE IPLPF GGKSS aa 1261-1280 SEQ ID NO:85
P86: GGKSS RDLKM LETVR TPALH aa 1276-1295 SEQ ID NO:86
P87: TPALH FKSVG FHLPS REFQV aa 1291-1310 SEQ ID NO:87
P88: REFQV PTFTI PKLYQ LQVPL aa 1306-1325 SEQ ID NO:88
P89: LQVPL LGVLD LSTNV YSNLY aa 1321-1340 SEQ ID NO:89
P90: YSNLY NWSAS YSGGN TSTDH aa 1336-1355 SEQ ID NO:90
P91: TSTDH FSLRA RYHMK ADSVV aa 1351-1370 SEQ ID NO:91
P92: ADSVV DLLSY NVQGS GETTY aa 1366-1385 SEQ ID NO:92
P93: GETTY DHKNT FTLSC DGSLR aa 1381-1400 SEQ ID NO:93
P94: DGSLR HKFLD SNIKF SHVEK aa 1396-1415 SEQ ID NO:94
P95: SHVEK LGNNP VSKGL LIFDA aa 1411-1430 SEQ ID NO:95
P96: LIFDA SSSWG PQMSA SVHLD aa 1426-1445 SEQ ID NO:96
P97: SVHLD SKKKQ HLFVK EVKID aa 1441-1460 SEQ ID NO:97
P98: EVKID GQFRV SSFYA KGTYG aa 1456-1475 SEQ ID NO:98
P99: KGTYG LSCQR DPNTG RLNGE aa 1471-1490 SEQ ID NO:99
P100: RLNGE SNLRF NSSYL QGTNQ aa 1486-1505 SEQ ID NO:100
表2
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P134: PIKVP LLLSE PINII DALEM aa 1996-2015 SEQ ID NO:134
P135: DALEM RDAVE KPQEF TIVAF aa 2011-2030 SEQ ID NO:135
P136: TIVAF VKYDK NQDVH SINLP aa 2026-2045 SEQ ID NO:136
P137: SINLP FFETL QEYFE RNRQT aa 2041-2060 SEQ ID NO:137
P138: RNRQT IIVVV ENVQR NLKHI aa 2056-2075 SEQ ID NO:138
P139: NLKHI NIDQF VRKYR AALGK aa 2071-2090 SEQ ID NO:139
P140: AALGK LPQQA NDYLN SFNWE aa 2086-2105 SEQ ID NO:140
P141: SFNWE RQVSH AKEKL TALTK aa 2101-2120 SEQ ID NO:141
P142: TALTK KYRIT ENDIQ IALDD aa 2116-2135 SEQ ID NO:142
P143: IALDD AKINF NEKLS QLQTY aa 2131-2150 SEQ ID NO:143
P144: QLQTY MIQFD QYIKD SYDLH aa 2146-2165 SEQ ID NO:144
P145: SYDLH DLKIA IANII DEIIE aa 2161-2180 SEQ ID NO:145
P146: DEIIE KLKSL DEHYH IRVNL aa 2176-2195 SEQ ID NO:146
P147: IRVNL VKTIH DLHLF IENID aa 2191-2210 SEQ ID NO:147
P148: IENID FNKSG SSTAS WIQNV aa 2206-2225 SEQ ID NO:148
P149: WIQNV DTKYQ IRIQI QEKLQ aa 2221-2240 SEQ ID NO:149
P150: QEKLQ QLKRH IQNID IQHLA aa 2236-2255 SEQ ID NO:150
P151: IQHLA GKLKQ HIEAI DVRVL aa 2251-2270 SEQ ID NO:151
P152: DVRVL LDQLG TTISF ERIND aa 2266-2285 SEQ ID NO:152
P153: ERIND VLEHV KHFVI NLIGD aa 2281-2300 SEQ ID NO:153
P154: NLIGD FEVAE KINAF RAKVH aa 2296-2315 SEQ ID NO:154
P155: RAKVH ELIER YEVDQ QIQVL aa 2311-2330 SEQ ID NO:155
P156: QIQVL MDKLV ELTHQ YKLKE aa 2326-2345 SEQ ID NO:156
P157: YKLKE TIQKL SNVLQ QVKIK aa 2341-2360 SEQ ID NO:157
P158: QVKIK DYFEK LVGFI DDAVK aa 2356-2375 SEQ ID NO:158
P159: DDAVK KLNEL SFKTF IEDVN aa 2371-2390 SEQ ID NO:159
P160: IEDVN KFLDM LIKKL KSFDY aa 2386-2405 SEQ ID NO:160
P161: KSFDY HQFVD ETNDK IREVT aa 2401-2420 SEQ ID NO:161
P162: IREVT QRLNG EIQAL ELPQK aa 2416-2435 SEQ ID NO:162
P163: ELPQK AEALK LFLEE TKATV aa 2431-2450 SEQ ID NO:163
P164: TKATV AVYLE SLQDT KITLI aa 2446-2465 SEQ ID NO:164
P165: KITLI INWLQ EALSS ASLAH aa 2461-2480 SEQ ID NO:165
P166: ASLAH MKAKF RETLE DTRDR aa 2476-2495 SEQ ID NO:166
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P167: DTRDR MYQMD IQQEL QRYLS aa 2491-2510 SEQ ID NO:167
P168: QRYLS LVGQV YSTLV TYISD aa 2506-2515 SEQ ID NO:168
P169: TYISD WWTLA AKNLT DFAEQ aa 2521-2540 SEQ ID NO:169
P170: DFAEQ YSIQD WAKRM KALVE aa 2536-2555 SEQ ID NO:170
P171: KALVE QGFTV PEIKT ILGTM aa 2551-2570 SEQ ID NO:171
P172: ILGTM PAFEV SLQAL QKATF aa 2566-2585 SEQ ID NO:172
P173: QKATF QTPDF IVPLT DLRIP aa 2581-2600 SEQ ID NO:173
P174: DLRIP SVQIN FKDLK NIKIP aa 2596-2615 SEQ ID NO:174
P175: NIKIP SRFST PEFTI LNTFH aa 2611-2630 SEQ ID NO:175
P176: LNTFH IPSFT IDFVE MKVKI aa 2626-2645 SEQ ID NO:176
P177: MKVKI IRTID QMQNS ELQWP aa 2641-2660 SEQ ID NO:177
P178: ELQWP VPDIY LRDLK VEDIP aa 2656-2675 SEQ ID NO:178
P179: VEDIP LARIT LPDFR LPEIA aa 2671-2690 SEQ ID NO:179
P180: LPEIA IPEFI IPTLN LNDFQ aa 2686-2705 SEQ ID NO:180
P181: LNDFQ VPDLH IPEFQ LPHIS aa 2701-2720 SEQ ID NO:181
P182: LPHIS HTIEV PTFGK LYSIL aa 2716-2735 SEQ ID NO:182
P183: LYSIL KIQSP LFTLD ANADI aa 2731-2750 SEQ ID NO:183
P184: ANADI GNGTT SANEA GIAAS aa 2746-2765 SEQ ID NO:184
P185: GIAAS ITAKG ESKLE VLNFD aa 2761-2780 SEQ ID NO:185
P186: VLNFD FQANA QLSNP KINPL aa 2776-2795 SEQ ID NO:186
P187: KINPL ALKES VKFSS KYLRT aa 2791-2810 SEQ ID NO:187
P188: KYLRT EHGSE MLFFG NAIEG aa 2806-2825 SEQ ID NO:188
P189: NAIEG KSNTV ASLHT EKNTL aa 2821-2840 SEQ ID NO:189
P190: EKNTL ELSNG VIVKI NNQLT aa 2836-2855 SEQ ID NO:190
P191: NNQLT LDSNT KYFHK LNIPK aa 2851-2870 SEQ ID NO:191
P192: LNIPK LDFSS QADLR NEIKT aa 2866-2885 SEQ ID NO:192
P193: NEIKT LLKAG HIAWT SSGKG aa 2881-2900 SEQ ID NO:193
P194: SSGKG SWKWA CPRFS DEGTH aa 2896-2915 SEQ ID NO:194
P195: DEGTH ESQIS FTIEG PLTSF aa 2911-2930 SEQ ID NO:195
P196: PLTSF GLSNK INSKH LRVNQ aa 2926-2945 SEQ ID NO:196
P197: LRVNQ NLVYE SGSLN FSKLE aa 2941-2960 SEQ ID NO:197
P198: FSKLE IQSQV DSQHV GHSVL aa 2956-2975 SEQ ID NO:198
P199: GHSVL TAKGM ALFGE GKAEF aa 2971-2990 SEQ ID NO:199
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P200: GKAEF TGRHD AHLNG KVIGT aa 2986-3005 SEQ ID NO:200
P201: KVIGT LKNSL FFSAQ PFEIT aa 3001-3020 SEQ ID NO:201
P202: PFEIT ASTNN EGNLK VRFPL aa 3016-3035 SEQ ID NO:202
P203: VRFPL RLTGK IDFLN NYALF aa 3031-3050 SEQ ID NO:203
P204: NYALF LSPSA QQASW QVSAR aa 3046-3065 SEQ ID NO:204
P205: QVSAR FNQYK YNQNF SAGNN aa 3061-3080 SEQ ID NO:205
P206: SAGNN ENIME AHVGI NGEAN aa 3076-3095 SEQ ID NO:206
P207: NGEAN LDFLN IPLTI PEMRL aa 3091-3110 SEQ ID NO:207
P208: PEMRL PYTII TTPPL KDFSL aa 3106-3125 SEQ ID NO:208
P209: KDFSL WEKTG LKEFL KTTKQ aa 3121-3140 SEQ ID NO:209
P210: KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH aa 3136-3155 SEQ ID NO:210
P211: KKNKH RHSIT NPLAV LCEFI aa 3151-3170 SEQ ID NO:211
P212: LCEFI SQSIK SFDRH FEKNR aa 3166-3185 SEQ ID NO:212
P213: FEKNR NNALD FVTKS YNETK aa 3181-3200 SEQ ID NO:213
P214: YNETK IKFDK YKAEK SHDEL aa 3196-3215 SEQ ID NO:214
P215: SHDEL PRTFQ IPGYT VPVVN aa 3211-3230 SEQ ID NO:215
P216: VPVVN VEVSP FTIEM SAFGY aa 3226-3245 SEQ ID NO:216
P217: SAFGY VFPKA VSMPS FSILG aa 3241-3260 SEQ ID NO:217
P218: FSILG SDVRV PSYTL ILPSL aa 3256-3275 SEQ ID NO:218
P219: ILPSL ELPVL HVPRN LKLSL aa 3271-3290 SEQ ID NO:219
P220: LKLSL PHFKE LCTIS HIFIP aa 3286-3305 SEQ ID NO:220
P221: HIFIP AMGNI TYDFS FKSSV aa 3301-3320 SEQ ID NO:221
P222: FKSSV ITLNT NAELF NQSDI aa 3316-3335 SEQ ID NO:222
P223: NQSDI VAHLL SSSSS VIDAL aa 3331-3350 SEQ ID NO:223
P224: VIDAL QYKLE GTTRL TRKRG aa 3346-3365 SEQ ID NO:224
P225: TRKRG LKLAT ALSLS NKFVE aa 3361-3380 SEQ ID NO:225
P226: NKFVE GSHNS TVSLT TKNME aa 3376-3395 SEQ ID NO:226
P227: TKNME VSVAK TTKAE IPILR aa 3391-3410 SEQ ID NO:227
P228: IPILR MNFKQ ELNGN TKSKP aa 3406-3425 SEQ ID NO:228
P229: TKSKP TVSSS MEFKY DFNSS aa 3421-3440 SEQ ID NO:229
P230: DFNSS MLYST AKGAV DHKLS aa 3436-3455 SEQ ID NO:230
P231: DHKLS LESLT SYFSI ESSTK aa 3451-3470 SEQ ID NO:231
P232: ESSTK GDVKG SVLSR EYSGT aa 3466-3485 SEQ ID NO:232
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P233: EYSGT IASEA NTYLN SKSTR aa 3481-3500 SEQ ID NO:233
P234: SKSTR SSVKL QGTSK IDDIW aa 3496-3515 SEQ ID NO:234
P235: IDDIW NLEVK ENFAG EATLQ aa 3511-3530 SEQ ID NO:235
P236: EATLQ RIYSL WEHST KNHLQ aa 3526-3545 SEQ ID NO:236
P237: KNHLQ LEGLF FTNGE HTSKA aa 3541-3560 SEQ ID NO:237
P238: HTSKA TLELS PWQMS ALVQV aa 3556-3575 SEQ ID NO:238
P239: ALVQV HASQP SSFHD FPDLG aa 3571-3590 SEQ ID NO:239
P240: FPDLG QEVAL NANTK NQKIR aa 3586-3605 SEQ ID NO:240
P241: NQKIR WKNEV RIHSG SFQSQ aa 3601-3620 SEQ ID NO:241
P242: SFQSQ VELSN DQEKA HLDIA aa 3616-3635 SEQ ID NO:242
P243: HLDIA GSLEG HLRFL KNIIL aa 3631-3650 SEQ ID NO:243
P244: KNIIL PVYDK SLWDF LKLDV aa 3646-3665 SEQ ID NO:244
P245: LKLDV TTSIG RRQHL RVSTA aa 3661-3680 SEQ ID NO:245
P246: RVSTA FVYTK NPNGY SFSIP aa 3676-3695 SEQ ID NO:246
P247: SFSIP VKVLA DKFIT PGLKL aa 3691-3710 SEQ ID NO:247
P248: PGLKL NDLNS VLVMP TFHVP aa 3706-3725 SEQ ID NO:248
P249: TFHVP FTDLQ VPSCK LDFRE aa 3721-3740 SEQ ID NO:249
P250: LDFRE IQIYK KLRTS SFALN aa 3736-3755 SEQ ID NO:250
P251: SFALN LPTLP EVKFP EVDVL aa 3751-3770 SEQ ID NO:251
P252: EVDVL TKYSQ PEDSL IPFFE aa 3766-3785 SEQ ID NO:252
P253: IPFFE ITVPE SQLTV SQFTL aa 3781-3800 SEQ ID NO:253
P254: SQFTL PKSVS DGIAA LDLNA aa 3796-3815 SEQ ID NO:254
P255: LDLNA VANKI ADFEL PTIIV aa 3811-3830 SEQ ID NO:255
P256: PTIIV PEQTI EIPSI KFSVP aa 3826-3845 SEQ ID NO:256
P257: KFSVP AGIVI PSFQA LTARF aa 3841-3860 SEQ ID NO:257
P258: LTARF EVDSP VYNAT WSASL aa 3856-3875 SEQ ID NO:258
P259: WSASL KNKAD YVETV LDSTC aa 3871-3890 SEQ ID NO:259
P260: LDSTC SSTVQ FLEYE LNVLG aa 3886-3905 SEQ ID NO:260
P261: LNVLG THKIE DGTLA SKTKG aa 3901-3920 SEQ ID NO:261
P262: SKTKG TLAHR DFSAE YEEDG aa 3916-3935 SEQ ID NO:262
P263: YEEDG KFEGL QEWEG KAHLN aa 3931-3950 SEQ ID NO:263
P264: KAHLN IKSPA FTDLH LRYQK aa 3946-3965 SEQ ID NO:264
P265: LRYQK DKKGI STSAA SPAVG aa 3961-3980 SEQ ID NO:265
表2
表2
序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P297: ELSAT AQEII KSQAI ATKKI aa 4441-4460 SEQ ID NO:297
P298: TKKII SDYHQ QFRYK LQDFS aa 4457-4476 SEQ ID NO:298
P299: LQDFS DQLSD YYEKF IAESK aa 4472-4491 SEQ ID NO:299
P300: IAESK RLIDL SIQNY HTFLI aa 4487-4506 SEQ ID NO:300
P301: HTFLI YITEL LKKLQ STTVM aa 4502-4521 SEQ ID NO:301
P302: STTVM NPYMK LAPGE LTIIL aa 4517-4536 SEQ ID NO:302
ApoB100的全长序列可在各种出版物,比如参考文献(43)中找到(特别 见图1),其全文通过引用并入本文。
实施例2:用apoB-100免疫原性片段的免疫减少了主动脉动脉瘤破裂
用以下任一在7、10和12周龄时对雄性apoE KO小鼠皮下免疫:第1 组:使用明矾作为佐剂的P210/cBSA轭合物(100μg P210);第2组:对照 -100μg的cBSA/明矾(cBSA);第3组:对照PBS(PBS)。检查14 P210、 17cBSA、16PBS和8盐水注射的小鼠。
在10周龄时通过植入的皮下渗透泵递送AngII(1000ng/Kg/min)4周, 以在所有三个组中引起动脉瘤。将盐水递送给对照组。将小鼠在14周龄 时处死。实验持续期间,对小鼠喂养正常饮食。
研究了动脉瘤形成(包括破裂)和发生率。结果在下面的表3A和表 3B中阐释。
表3A
表3B
如在上表中所阐释的,P210免疫降低了由动脉瘤破裂导致的死亡率。 在开始血管紧缩素II输注后的第28天,用apoB-100相关的肽P210的免 疫具有90.5%的存活机会,而cBSA组和PBS组分别仅有69.9%或64.9% 的存活机会。
本文提供的仅用于指导目的并且不意图限制的可能的行为机制是: p210免疫降低了BP;2.p210免疫的作用通过CD8介导至与在随后的例子 中阐释的针对动脉粥样硬化减少而检测到的相同或可比较的程度。因此, 引起T细胞应答的能力是对p210特异性的(抗原特异性),并且其他apoB- 100肽预期显示类似的抗原-特异性的CD8作用。
实施例3:用ApoB-100的免疫原性片段的免疫减少了主动脉动脉瘤节段 形成
用以下任一在7、10和12周龄时对雄性apoE KO小鼠皮下免疫:第 1组:使用明矾作为佐剂的P210/cBSA轭合物(100μg P210);第2组:对 照-100μg的cBSA/明矾(cBSA);第3组:对照PBS(PBS)。检查42 P210、46cBSA、37PBS和8盐水注射的小鼠。
在10周龄时通过植入的皮下渗透泵递送AngII(1000ng/Kg/min)4周, 从而在所有三个组中引起动脉瘤。将盐水递送给对照组。将小鼠在14周 龄时处死。实验持续期间,对雄性apoE KO小鼠喂养正常饮食。
在下述8个节段处进行主动脉的测量:1)弓始端、2)弓术端、3) 尖水平、4)3和5之间、5)肾上、6)肾下、7)杈前和8)肾动脉之间 (见图1的图示)。
下表4中报道了图1中阐释的每一节段的平均直径,其中圆形区是节 段动脉瘤。
表4
在下表5中阐释的表4数据的其他详尽细节,提示了p210免疫显著减 少了动脉瘤切片形成。而cBSA对照的动脉瘤节段/总节段百分比为 29.6%,PBS对照的动脉瘤节段/总节段百分比为23.4%,p210免疫将动脉 瘤节段/总节段百分比减少至14.3%。
表5
实施例4:用ApoB 100的免疫原性片段的免疫减少了与主动脉的动 脉瘤破裂相关联的死亡率
用以下任一在7、10和12周龄时对雄性apoE KO小鼠皮下免疫:第1 组:使用明矾作为佐剂的P210/cBSA轭合物(100μg P210);第2组:对照 -100μg的cBSA/明矾(cBSA);第3组:对照PBS(PBS)。检查42 P210、 46cBSA、37PBS和8盐水注射的小鼠。
在10周龄时通过植入的皮下渗透泵递送AngII(1000ng/Kg/min)4周, 从而在所有三个组中引起动脉瘤。将盐水递送给对照组。将小鼠在14周 龄时处死。检查42 P210、46 cBSA、37 PBS和8盐水注射的小鼠。将小鼠 在14周龄时处死。实验持续期间,对雄性apoE KO小鼠喂养正常饮食。
结果展示于图2的图表中,图2显示了,相对于对照组,用P210处 理的小鼠的存活。如图2的阐释所示的,植入用于血管紧缩素II输注的渗 透泵以引起动脉瘤形成之后28天时,P210的存活率为90.5%,cBSA的 存活率为69.6%,PBS的存活率为64.9%,盐水对照的存活率为0%。
实施例5:p210免疫的动脉粥样硬化-防护性作用
疫苗制剂由使用前面3;4所述的方法与作为载剂的阳离子牛血清白蛋白 (cBSA)轭合的p210肽(Euro-Diagnostica AB,瑞典)组成。明矾用作佐剂, 并与轭合的肽/cBSA以1∶1体积比率混合。在免疫那天进行肽轭合,并在 每次免疫之前与明矾新鲜混合。正常饮食膳食饲养的小鼠在6-7周龄时在 肩胛骨之间的脊背区域接受皮下的初次免疫,随后在10和12周龄时加强 剂量。最后一次加强剂量后一周,膳食转变为高胆固醇饮食(TD 88137, Harlan-Teklad),并继续直到25周龄时安乐死。
较之PBS和cBSA/明矾组,用p210的免疫分别减少57%和50%的主 动脉动脉粥样硬化( 图3A ),而不影响循环胆固醇水平或体重( 表6 )。
表6  PBS、cBSA/明矾和p210/cBSA/明矾组的小鼠的循环胆固醇水平和体 重
来自p210/cBSA/明矾组的主动脉窦斑块含有分别通过MOMA-2和CD 11c免疫-染色评价的显著减少的巨噬细胞和DC免疫反应性( 图3B ),动脉 粥样硬化硬化病灶没有差异(PBS组0.40±0.13mm2,n=10;cBSA/明矾组 0.42±0.09mm2,n=10;p210/cBSA/明矾组0.40±0.08mm2,n=9)。
实施例6:p210-免疫引起的免疫应答的表征
鉴于DC是细胞免疫应答和体液免疫应答二者上游的主要细胞类型, 申请人测定了这些细胞是否受免疫策略影响。初次免疫后一周,分离来自 皮下免疫部位的细胞用于流式细胞计量分析。PBS组不包括在该分析中, 因为接受PBS注射的小鼠在注射部位未出现肿胀或细胞累积。
较之cBSA/明矾组,p210/cBSA/明矾组在免疫部位有显著更少的 CD11c(+)和CD11c(+)CD86(+)细胞(图4A和4B)。第三次免疫后1周对LN 细胞进行流式细胞计量时,与cBSA/明矾组相比较,CD11c(+)CD86(+)细 胞也显著减少(图4C)。
申请人接下来评价了抗体应答以定义对p210的体液免疫应答。免疫 之前,所有3组小鼠对p210具有低水平的IgG滴度。安乐死时,对p210 的IgG滴度在PBS组中仍然是低的,但在cBSA/明矾组中显著提高。用 p210/cBSA/明矾的免疫与PBS组相比较导致p210IgG滴度提高,但与 cBSA/明矾组相比较显著降低(图5A)。与p210 IgG应答相反,在所有组中 p210 IgM滴度显著提高(图5B),表明了对p210的内源性免疫应答。
IL-2Rα(CD25)是定义明确的淋巴细胞活化标记物。申请人因此分析了 CD25在来自初次免疫一周后的小鼠浅颈淋巴结和腋窝淋巴结(LN)的 CD4(+)T细胞或CD8(+)T细胞上的表达,以评估T细胞免疫应答。当与 PBS或cBSA/明矾组相比较时,p210/cBSA/明矾组的淋巴结中的 CD8(+)CD25(+)T-细胞群显著较高(图6A),而淋巴结中的CD4(+)CD25(+) T-细胞在3个组之间没有差异(图6B)。
当与PBS或cBSA/明矾组相比较时,在p210/cBSA/明矾组中有显著更 大的脾脏CD8(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群(图6C),脾脏 CD8(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组间没有差异(图6D)。cBSA/明矾组 中的脾脏CD4(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群显著增加。但是,该增加的应 答通过p210/cBSA/明矾免疫显著衰减(图6E);而脾脏 CD4(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在三个组之间没有差异(图6F)。
实施例7:来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞过继转移至未经实验的 受者重演p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用
用相同的分组,即:PBS或cBSA/明矾或p210/cBSA/明矾,使供体 apoE(-/-)小鼠经受相同的免疫方案。在6-7周龄时,用供体细胞注射未经 试验的受者雄性apoE(-/-)小鼠,并喂养正常饮食直到13周龄,将饮食转 变为高胆固醇膳食,直到25周龄时安乐死。
安乐死时,较之用来自PBS或cBSA/明矾组的CD8(+)T-细胞注射的 受者小鼠,用来自p210/cBSA/明矾组的CD8(+)T-细胞注射的受者小鼠发 展了显著更少的动脉粥样硬化病灶,这强烈暗示了由疫苗诱导的效应器T 细胞是CD8+并且在机制上是参与的(图7A)。
该主动脉病灶减少与降低的脾脏CD11c(+)DC(PBS组:4.3±1.7%; cBSA/明矾组:3.4±0.3%;p210/cBSA/明矾组:1.5±0.3%;每组n=5,p <0.05p210/cBSA/明矾组对PBS或cBSA/明矾组,通过ANOVA分析)相 关,在3个组之间总胆固醇循环水平没有差异(PBS组:1083±296 mg/dl;cBSA/明矾组:975±401mg/dl;p210/cBSA/明矾组:1098±379 mg/dl)。
较之接受来自其他供体的B细胞的小鼠,分离自p210免疫的供体小 鼠的脾的B细胞的过继转移不影响受者小鼠的动脉粥样硬化(图7B)。这些 观察结果排除了B细胞作为p210免疫的动脉粥样硬化-防护性作用的介 体。
为了排除CD4(+)CD25(+)T-细胞作为通过皮下p210免疫诱导的可能 的动脉粥样硬化防护性介体,申请人以1×105细胞/小鼠的剂量将 CD4(+)CD25(+)T-细胞过继转移进未经实验的受者apoE-/-小鼠中。3个 CD4(+)CD25(+)T-细胞受者组之间的病灶尺寸没有差异。来自CD8+细胞池 的CD25+细胞的耗尽消除了在p210/cBSA/明矾受者小鼠中观察到的动脉粥 样硬化的减少,这进一步支持这样的观点,CD8+CD25+T细胞在机制上参 与针对动脉粥样硬化的疫苗的防护性作用(图7C)。以3×105细胞/小鼠的较 高数目的CD4(+)CD25(+)T-细胞的转移没有减少所有3个受者组中的病灶 尺寸(图7D)。
实施例8:来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T细胞针对树突细胞的的增加 的体外细胞溶解活性
鉴于观察到p210免疫减少了免疫部位中的DC和动脉粥样硬化斑块, 并且来自p210免疫的供体的CD8(+)T-细胞的过继转移使得受者中的脾脏 DC减少,申请人推测DC是CD8(+)T-细胞的可能的靶标。
为测试这一点,申请人共培养得自骨髓的DC和来自各种免疫组的 CD8(+)T-细胞。来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞较之来自PBS或 BSA/明矾组的那些显著增加了DC死亡的百分比(图8)。该CD8(+)T-细胞 增加的细胞溶解功能与增加的粒酶B表达而非穿孔素相关(图9)。
实施例9:用p210的免疫不会影响对其他T-细胞依赖型或非依赖型抗原 的适应性免疫应答
鉴于观察到p210免疫减少了CD11c(+)DC并减少了对p210的适应性 IgG应答,申请人接下来测试p210免疫对DC的此类调控是否会改变对其 他抗原的宿主免疫应答。
申请人首先如前面部分中描述的用p210使小鼠免疫,随后两次单独 的皮下KLH免疫或腹膜内注射TNP-LPS。使用KLH-或TNP-IgG滴度作 为个体免疫效力的代替,申请人发现在p210免疫的小鼠的KLH-或TNP- IgG滴度和来自PBS或cBSA/明矾组的小鼠的滴度之间没有差异(图10)。
实施例10:用apoB-100免疫原性片免疫降低血管紧缩素II-诱导的主动脉 动脉瘤的死亡率和高血压
在7、10和12周龄时,用p210/cBSA/明矾(p210;100μg)使ApoE(- /-)小鼠免疫。接受PBS或cBSA/明矾(cBSA)的小鼠作为对照。10周龄时, 对小鼠皮下植入释放AngII(1mg/Kg/min)的渗透泵,并在4周后进行安乐 死。收获主动脉、脾和淋巴结(LN)。较之对照,由于AA破裂,p210疫 苗显著降低了死亡率(见 图11 )。
对LN和脾中的树突状细胞(DCs)的流式细胞分析显示了p210组中的 细胞内IFN-γ表达被上调。在p210组中,通过原位二氢乙啶方法测量的主 动脉过氧化物产生和通过Western印迹测量的主动脉AT1受体(AT1R)表 达显著减小。在13周龄时,p210疫苗显著减小了平均动脉BP(见 表7 )。
p210疫苗显著降低了AngII诱导的AA破裂造成的死亡率。该保护性 作用与DC中IFN-γ表达的上调和主动脉中的降低的动脉BP、AT1R表达 和过氧化物生产相关联。疫苗可能是用于AA的有希望的新的非侵入性治 疗。
表7     树突状细胞(DCs)的细胞内IFN-γ表达的流式细胞分析
实施例11:来自apoB-100免疫原性片段免疫的小鼠的CD8(+)T细胞的
提高的细胞溶解活性对脂质关联的抗原是特异性的
申请人已显示,用apoB-100相关的-肽p210免疫显著减少了apoE-/- 小鼠中的动脉粥样硬化,并减少了apoE-/-小鼠中的斑块内CD11c+树突状 细胞(DCs)。过继转移实验显示了,动脉粥样硬化-保护是通过CD8+T细胞 介导的。因为apoB-100存在于血脂的LDL组分上,申请人评估了对通过 DC呈递的脂质关联的抗原特异性的p210免疫的小鼠的CD8+T细胞的细 胞溶解活性。
用p210/cBSA/明矾、cBSA/明矾或PBS,在7、9和12周龄时免疫 ApoE-/-小鼠。第三次免疫后一周,使小鼠安乐死,以收集脾CD8+T细 胞。得自骨髓的DC与未经实验的apoE-/-小鼠是分化的,并被用作靶细 胞。在有10%FBS的培养基中,使用3∶1的CD8比DC比率,进行四小时 溶解检验。接着收集细胞并对CD11c染色以鉴定DC和7-AAD,来使用流 式细胞术评估细胞溶解。较之cBSA/明矾和pBS,来自p210/cBSA/明矾免 疫的小鼠的CD8+T细胞有显著更大的溶解活性(表)。在有脱脂的FBS的 培养基中进行检验时,消除了特异性针对来自p210/cBSA/明矾免疫的小鼠 的CD8+T细胞的溶解活性( 表8 ),这暗示了培养基中的FBS脂质级分提 供了抗原来源。溶解检验之前用FITC-标记的p210对DC进行负载24小 时,表明了来自p210/cBSA/明矾免疫的小鼠的CD8+T细胞的溶解活性的 特异性和抗原摄取(见 表8 )。
这些结果显示了,靶向DC的CD8+T细胞的细胞溶解功能对与脂质 相关联的抗原,特别是apoB-100的p210片段是特异性的,并且这可成为 p210免疫的保护性作用的基础。
表8 CD8(+)T细胞的细胞溶解活性的流式细胞分析。
实施例12:对p210疫苗的抗体应答
在免疫之前,对p210的抗体滴度是低的。在25周龄安乐死时,在所 有组中的p210 IgM滴度显著增加(图12),这暗示了对自身肽p210的内源 性免疫应答。较之PBS组,在cBSA/明矾组和p210/cBSA/明矾组二者中 p210IgG滴度均显著增加,但令人吃惊地,在2个对应组之间,在cBSA/ 明矾中滴度更高。在cBSA/明矾组和p210/cBSA/明矾组中存在作为佐剂的 明矾可能导致对IgG应答的IgM种类转变,所述转变在PBS组中没有出 现。
实施例13:CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞对p210疫苗的应答
初次免疫后一周,收集来自小鼠的颈浅和腋窝淋巴结(LN)的T细胞 周,来评估T细胞免疫应答。淋巴结中的CD4+CD25+T细胞在3个组中没 有差异(表1)。cBSA/明矾组中脾脏CD4+CD25+IL-10+T细胞群显著增加。 但是,这种增加的应答被p210/cBSA/明矾免疫显著削弱( 表9 )。令人感兴 趣地,cBSA/明矾组中的脾脏CD4+CD62L+T细胞(表1)群更低。
初次免疫后一周,较之PBS或cBSA/明矾组,p210/cBSA/明矾组中, 淋巴结中的CD8+CD25+T细胞群显著更高(表2)。较之PBS或cBSA/明矾 组,p210/cBSA/明矾组中的脾脏CD8+CD25+IL-10+T细胞群显著更大(表 2)。较之PBS或cBSA/明矾组的脾脏CD8+CD62L+T细胞群,p210/cBSA/ 明矾组中的脾脏CD8+CD62L+T细胞群显著更高( 表9 )。其他时间点下的 T细胞谱图在组之间没有显著不同。
表9 对p210疫苗的CD4(+)和CD8(+)T细胞应答
实施例14:CD8+CD25+T细胞的效应器作用涉及细胞毒性功能
疫苗减少了p210/cBSA/明矾受者小鼠脾中和斑块中( 图3 )的DC的存 在,这暗示了免疫后CD8+T细胞的效应器作用被证实为减少斑块中的 DC。申请人因此评价了疫苗对于针对得自同源骨髓的DC的CD8+T细胞 的细胞毒性活的影响。使用CD8选择Dynabeads试剂盒(Invitrogen)阴性分 离来自免疫组的CD8+T细胞,随后在补充有10%FBS的RPMI中以 CD8∶DC为3∶1的比率与DCs共培养。收集细胞并处理,用于4小时后 CD11c+和7-AAD的流式细胞测定20。在共培养中没有CD8+T细胞的树突 状细胞死亡被用作基线,并且使用前面描述的方法计算细胞的特异性溶解 百分比20
较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些,来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞显著增加了DC溶解的百分比( 图13 ,A组)。CD8+T细胞这种增加 的细胞溶解功能与增加的粒酶B表达而非穿孔素相关联。CD25+细胞的耗 尽消除了特异性针对来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞的增加的细胞溶 解活性( 图13 ,B组),这表示CD8+CD25+T细胞是效应器群。使用补充有 脱脂血清的培养基时,对来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞特异性的增 加的细胞溶解功能也丢失了( 图13 ,C组),这表示在通过CTL识别的靶 DC上的抗原得自培养基中的含有apoB-100的血清LDL。
实施例15:p210肽被DC体外内吞。
使用用FITC(来自Pierce的FITC轭合试剂盒)标记的p210,限定在 BMDC上负载的肽。树突状细胞中FITC荧光的存在表示通过树突状细胞 摄取p210。特别参见 图14 ,其显示了FITC-标记的p210被DC内吞,这 表示抗原摄取。
实施例16:p210肽通过DC呈递至CD8+T细胞。
p210肽含有apoB-100分子的蛋白聚糖结合位点。这种肽是细胞-穿膜 肽,其能有效地递送抗原,用于交叉呈递至细胞毒性CD8+T细胞53。申 请人因此评估了与用p210负载并用LPS成熟化的DC共培养的 CD8+CD25-T细胞的活化。较之未处理的或仅用LPS处理的共培养物,与 用LPS处理的用p210-负载的DC共培养后48小时,CD8+CD25+T细胞显 著增加( 图15 )。结果暗示了p210抗原通过DC呈递给CD8+T细胞。
实施例17:p210-负载的DC被免疫CD8+T细胞特异性靶向。
上述实施例16中所示结果支持这样的观点,p210通过DC呈递至 CD8+T细胞。针对DC的溶解活性是否特异性针对p210抗原仍旧不清 楚。申请人因此使用FITC-标记的p210负载的BMDC作为靶标重复了溶 解检验。来自p210/cBSA/明矾小鼠的CD8+T细胞中,针对FITC+DC的溶 解活性显著增加( 图16 ),这暗示了抗原特异性的溶解活性。
总之,在若干个实施方式中,本文描述了免疫调节试剂、T细胞、组 合物、方法和系统,用于在个体中治疗和/或预防动脉瘤和/或其关联的病 况。
提供了上文阐明的实施例,以给予本领域的普通技术人员对于怎样制 造和使用本发明的分子、组合物、系统和方法的实施方式的一个完整的公 开和说明,并且不意图限制发明人认定为他们发明的范围。本申请中的所 有的专利和出版物表示本发明所属领域技术人员的技术水平。
在发明背景、发明内容、发明详述和实施例中引用的每一篇文献(包括 专利、专利申请、期刊论文、摘要、实验室手册、书籍或其他公开)的全部 公开内容据此通过引用被并入本文。在本申请中引用的所有参考文献在相 同程度上被并入,好像每一篇参考文献以其整体通过引用被单独地并入。 但是,如果引用的参考文献和本发明之间有任何矛盾之处,本发明有优先 权。另外,本文于2011年11月11日创建的txt文档“P686-PCT-2011-11- 11--序列表_ST25”中提交的的序列表形成了本申请不可或缺的部分,并且 其全部内容通过引用并入本文。
已在本文中使用的术语和表达用作说明书的术语并且不是限制性的, 并且没有意图在这种术语和表达的使用中排除所示和所述的特性或其部分 的任何等同物,而是应当意识到,在本发明的范围内各种改变是可能的。 因此,应当理解,尽管本发明已被优选的实施方式、示例性实施方式和任 选的特征具体公开,但是本领域技术人员可采用本文公开的概念的修饰和 变型,并且这种修饰和变型被认为在由附加的权利要求限定的本发明的范 围内。
应当理解,本文中使用的术语仅意图描述具体实施方式,并且不意图 是限制性的。如在该说明书和附加的权利要求中使用时,除非内容清楚地 指出,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括 复数指示物。除非内容清楚地指出,术语“多数”包括两种或多种指示 物。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科技术语具有本发明涉及的 本领域技术人员所通常理解的相同的含义。
当本文中使用马库什组或其他分组时,组的所有单独的成员和组的所 有组合和可能的亚组合意图单独地被包括在本发明中。除非另外指出,本 文描述的或示例性的组分或材料的每一种组合可用来实施本发明。本领域 技术人员将意识到,除了具体示例的那些之外的方法、设备元件和材料可 用在本发明的实施中,而不用借助过度实验。任何这种方法、设备元件和 材料的所有本领域已知的功能等同物意图包括在本发明中。无论何时在说 明书中给出一个范围,例如温度范围、频率范围、时间范围或组合范围, 在范围内包括的所有中间范围和亚范围,以及所有单独的值意图包括在本 发明中。本文公开的范围或组的任何一个或更多单独的成员可从本发明的 权利要求中排除。本文中例证性描述的本发明可合适地在缺失本文没有特 别公开的任何元件或多个元件、限制或多个限制的情况下实施。
本文已描述了本发明的大量实施方式。本文提供的具体实施方式是本 发明有用的实施方式的例子,并且本领域技术人员明白可使用本发明中阐 释的设备、设备组件、方法步骤的大量变型实施本发明。如对本领域技术 人员而言显而易见的,用于本方法的方法和设备可包括处理元件和步骤的 大量任选的组合。
特别地,应当理解在不会背离本发明的精神和范围的情况下可做出各 种修饰。因此,其他实施方式在所附权利要求的范围内。
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