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1. (CN102257151) Organic solvent pretreatment of biomass to enhance enzymatic saccharification
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用有机溶剂预处理生物质以促进酶解糖化


本专利申请要求2008年12月19日提交的美国临时申请61/139179的 权益,其公开内容全文并入本文。
发明领域
提供并公开了生产易于糖化的富集碳水化合物的木质纤维质生物质的 方法。具体地讲,通过在存在低至中等浓度氨和一种或多种亲核物质的有机 溶剂中,在高温碱性条件下同时破碎并选择性萃取木质素以制备预处理的生 物质。然后,在预处理生物质中剩余的富集碳水化合物的固体可经过酶解糖 化以获取可发酵糖,所述可发酵糖可经过进一步处理以生产目标产物。
发明背景
纤维质的和木质纤维质原料以及垃圾例如农业残余物、木材、林业垃 圾、来自造纸业的淤渣、和市政及工业固体垃圾,提供了潜力巨大的可再生 原料,用于生产化学制品、塑料、燃料和饲料。由纤维素、半纤维素、果胶 和木质素组成的纤维质的和木质纤维质的原料以及垃圾一般用多种化学、机 械和酶方法进行处理以释放主要的己糖和戊糖,它们然后能进行发酵产生有 用产物。
预处理方法常用于制造较易于受纤维素酶作用的木质纤维质生物质多 糖。纤维素酶消化的其中一个主要障碍是存在木质素、限制酶作用于其底物 的障碍、以及酶非生产性结合的表面。因为与酶解糖化相关联的高成本,希 望通过灭活木质素对酶的吸附或者完全萃取出木质素以最小化载酶量。
另一个挑战是不能酶水解纤维素,这是因为纤维素受半纤维素和木质 素的保护或是因为其结晶性。试图克服这些挑战的预处理方法包括:蒸汽爆 破、热水、稀酸、氨纤维爆破、碱解(包括氨回收过滤)、氧化去木质素和 有机溶剂。
以前用于处理木质纤维素生物质的有机溶剂方法用于生产浆液或生物 燃料,一般成功地除去木质素,该方法的糖回收率、尤其是木糖回收率不 高。例如在高温下使用弱酸性乙醇-水混合物(如EtOH 42重量%)从木质 纤维质生物质中除去木质素(Kleinert,T.N.,Tappi 57:99-102,1974)导 致大量的碳水化合物损失。在95℃用稀酸水解,然后用有机溶剂萃取并用 酶解糖化(Lee,Y-H.等人,Biotech.Bioeng.,29:572-581,1987)导致水 解期间的大量半纤维素损失、有机溶剂萃取时的附加碳水化合物损失和酶解 糖化残余时的低收率(~50%的总碳水化合物)。
用气态水和甲胺处理生物质,随后用有机溶剂萃取并且然后用水萃 取,需要三个步骤并导致大量碳水化合物损失(Siegfried,P.和R., Chem.Eng.Technol.,15:213-217,1992)。用聚胺或乙胺在水-脂肪醇混合 物加催化剂中,在高温下进行处理需要高液体/固体比率和低浓度的醇,导 致糖回收率、尤其是木糖回收率不高(美国专利4597830A)。在含水碱液 中的硫基乙醇酸盐用于在高温下处理木质纤维质生物质,随后用热水洗涤, 该处理需要使用碱金属或碱土金属的氢氧化物。这种方法需要耗费昂贵的无 机离子、高重量%硫基乙醇酸盐、以及大量水(美国专利3,490,993)。在 高温下,在硫化物/二硫化物的存在下用有机溶剂-水混合物进行的处理需要 高溶剂/固体比率和高硫含量,并导致大量碳水化合物损失(美国专利 4,329,200A)。
使用包含高浓度氨的含水有机溶剂在高温下处理木质纤维质生物质 (Park J.-K.和Phillips,J.A.,Chem.Eng.Comm.,65:187-205,1988)需 要在预处理时使用高液体/固体比率并导致半纤维素大量损失以及纤维素的 酶解糖化不佳。
以前使用方法的其他缺点包括分开的己糖和戊糖液流(例如稀酸)、 不充分的木质素萃取或不能从多糖、尤其是高木质素含量的那些原料(例如 蔗渣、软木)中分离萃取的木质素、废弃产物的处理(例如当中和酸或碱时 形成的盐)、以及由于在洗涤步骤中的破坏或损失造成的低碳水化合物回收 率。其他问题包括高能耗、资产设备、和预处理催化剂回收、以及与糖化酶 不相容。
生物质预处理的其中一个主要挑战是经由低成本的高效过程最大化木 质素萃取或化学中和作用(针对纤维素酶的非生产性结合),同时最小化碳 水化合物损失(纤维素加半纤维素)。选择性越高,在预处理和酶解糖化后 的单体糖总收率就越高。
因此,需要开发一种单步骤方法,该方法在预处理时使用大体上较低 的液体/固体比率和可回收的底料,无大量半纤维素损失,纤维素的酶解糖 化良好。当前的公开解决了这一需求。在该公开中,使用低至中等浓度的氨 在存在一种或多种亲核物质的情况下,在高温碱性条件下进行有机溶剂溶 液-介导的破碎和选择性萃取木质素。这种高性价比的方法保持生物质的半 纤维素含量,同时选择性地除去木质素并生产富集碳水化合物的生物质,所 述生物质高度易于受酶解糖化。通过本文所述方法制备的预处理生物质导致 糖化后非常高的可发酵糖(葡萄糖,以及木糖)收率,继而导致发酵后的高 目标产物(例如增值的化学制品和燃料)收率。令人惊讶的是,在一种或多 种亲核物质的存在下使用低至中等浓度的氨导致木质素破碎和萃取显著改 善,以及高碳水化合物保留,尤其是针对半纤维素更是如此。
发明概述
本发明提供生产易于糖化的、富集碳水化合物的生物质的方法,以及 从木质纤维质生物质中选择性萃取木质素同时几乎定量保留碳水化合物尤其 是半纤维素的方法。所述方法包括用包含低至中等浓度氨和一种或多种亲核 物质的有机溶剂溶液在高温碱性条件下处理木质纤维质生物质。在预处理 后,可用糖化酶聚生体进一步处理生物质以制备可发酵糖。这些糖可经过进 一步处理以生产目标产物。
因此本发明提供生产具有高保留的半纤维素的富集碳水化合物的生物 质的方法,所述方法包括:
(a)提供包含木质素、纤维素和半纤维素的木质纤维质生物质;
(b)将(a)的所述生物质悬浮在有机溶剂溶液中,所述溶液包含水、 相对于干生物质重量约2%至约20%的氨和一种或多种亲核物质, 从而在碱性条件下形成生物质-溶剂悬浮液;
(c)将所述生物质-溶剂悬浮液加热到约100-220℃的温度约5分钟至 约5小时,从而将木质素破碎并溶解在悬浮液中;并且
(d)在(c)中加热所述悬浮液之后加压过滤自由液体,从而除去溶解 的木质素并从而制备具有高保留的半纤维素的富集碳水化合物的 生物质。
在另一个实施方案中,本发明提供同时破碎并从木质纤维质生物质中 选择性萃取木质素以制备基本上不含木质素的生物质的方法,所述方法包 括:
(a)提供:
1)一定量的包含木质素和碳水化合物的木质纤维质生物质;
2)包含约40%至约70%的乙醇水溶液的多组分溶剂溶液;
3)2%至约20%的氨;
4)和一种或多种亲核物质;
(b)使所述生物质与(a)的多组分溶剂溶液接触,以形成溶剂-生物 质混合物;
(c)将所述溶剂-生物质混合物置于密封的压力容器中,从而将(b) 的所述混合物加热到约100℃至约220℃的温度约5分钟至约5小 时,从而将木质素破碎并溶解在所述溶剂中;
(d)通过过滤除去(c)的溶解的木质素;以及
(e)用有机溶剂洗涤所述残余物质,从而制备基本上不含木质素的生 物质。
所得生物质具有高度保守的碳水化合物内容物,例如与如本文所述的 预处理之前的生物质相比,所述碳水化合物内容物可大于或等于85%的所 述生物质碳水化合物。更具体地讲,所得生物质富集碳水化合物,使得与如 本文所述的预处理之前生物质中存在的碳水化合物量相比,在预处理后保留 至少约50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 98%,或100%的碳水化合物。此外,所得半纤维素内容物被保留,使得与 如本文所述的预处理之前生物质中存在的半纤维素量相比,在预处理后至少 约50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%, 或100%的半纤维素被保留下来。
尤其适用于本发明方法的原料包括但不限于柳枝稷、废纸、来自造纸 业的淤渣、玉米纤维、玉米芯、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、 干草、大麦、大麦秸秆、稻秆、蔗渣、甘蔗杆、黄杨、高粱、大豆、获取自 谷物加工的组分、树、树枝、根、叶、木屑、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、水 果、花、动物粪肥以及它们的组合。
发明详述
申请人特别在本公开中加入了所有引用的参考文献的全部内容。除非 另行指出,所有百分数、份数、比率等均按重量计。商标以大写体标示。此 外,当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优 选下限数值的列表形式给出时,它应理解为具体地公开由任何范围上限或优 选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围,而不管所 述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处,该范围均旨 在包含其端点,以及位于该范围内的所有整数和分数,除非另行指出。当定 义一个范围时,不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。
本发明提供处理生物质的方法,该方法用于制备易于糖化的、富集碳 水化合物的生物质以促进随后的酶解糖化步骤。使用涉及预处理步骤的方 法,所述预处理步骤其中同时破碎和使用有机溶剂在氨的存在下、在高温碱 性条件下萃取木质素。可使用附加的亲核物质以获得其他有益效果。然后过 滤并洗涤处理后的生物质以除去溶解的木质素、乙酸、乙酰胺、烷基酰胺和 过多的试剂,随后用糖化酶聚生体消化以制备可发酵糖。然后可进一步处理 所述糖以产生一种或多种目标产品。也可进一步处理除去的木质素并用于其 他目的(例如燃烧产生能量)以提高效率。
定义
在该公开中使用以下定义:
当涉及温度时,“室温”和“环境”约15℃至约25℃之间的任何温 度。
“可发酵糖”指在生产目标产物的发酵过程中糖内容物主要包括单糖 和一些二糖(微生物可利用它们作为碳源(可存在一些多糖))。“易于发 酵的糖”指不需要附加耗费的过程和/或使得发酵微生物在受抑制剂或其他 可对发酵产生不利影响的组分最小程度妨碍的情况下与所得糖接触。
“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的材料。木质纤维质材料也可 包含半纤维素。在本文所述的方法中,木质素溶解并基本上从木质纤维质生 物质中除去以制备富集碳水化合物的生物质。
“半纤维素”指杂聚的支链碳水化合物,它与纤维素一起存在于几乎 所有植物细胞壁中。它主要由戊糖组成,大部分是木糖,但也有阿拉伯糖, 通过阿拉伯糖它很多情况下被酯化成木质素。它也能够包含六碳糖醛酸和一 些己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及鼠李糖。半纤维素具有无规的无定形 结构,强度不高并且容易被稀酸或稀碱以及半纤维素酶水解。
如本文所用,“高保留的半纤维素”指保留原料中存在的≥85%的半纤 维素。
如本文所用,“溶解木质素”指溶解在有机溶剂溶液中的木质素。
“AI木质素”指酸不溶的木质素。
“自动水解”指在存在溶剂(水或有机溶剂加上水)并且加热,但无 其他附加处理的情况下水解生物质,例如不加入外来的酸或碱或水解酶。
“纤维质”指包含纤维素的组合物。
“目标产物”指发酵产生的化学制品、燃料、或化学结构物。产物按 广义使用,并且包括分子如蛋白质,包括例如肽、酶和抗体。目标产物的定 义也包括乙醇和丁醇。
“生物质的干重”意指移除全部或基本上全部水分后的生物质的重 量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(Standard  Test Method for Determination of Total Solids in Biomass)或纸浆与造纸工业 技术协会,Inc.(TAPPI)标准T-412 om-02(Moisture in Pulp,Paper and  Paperboard)进行测量。
“选择性萃取”指在除去木质素的同时基本上保留碳水化合物。
如本文所用,“溶剂溶液”和“有机溶剂溶液”是水中的有机溶剂混 合物,它包括溶解固体、液体、或气体溶质产生溶液的任何有机液体。最适 用于本发明的溶剂溶液是有机溶剂如乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁 醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇以及具有相同数目碳原子的二 醇。它们也可包括非质子溶剂。溶剂溶液可在混合物中包括与溶液一起的附 加组分,例如溶剂溶液可包括一种或多种亲核物质。
如本文所用,“生物质”和“木质纤维质生物质”指任何木质纤维质 的材料,包括纤维质的和半纤维质的材料,例如生物能作物、农业残余物、 市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业垃圾以及它们的组 合,下文进一步进行描述。生物质具有碳水化合物内容物,其包含多糖和低 聚糖,也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。
如本文所用,“高度保守的”指在本文所述工序之后的木质纤维质材 料的碳水化合物内容物。在本发明的一个实施方案中,从本文所述方法中高 度保守的碳水化合物内容物提供了在糖化后具有最小糖收率损失的、基本上 类似于理论收率的糖收率。在本发明的一个实施方案中,高度保守的碳水化 合物内容物指与如本文所述预处理之前的生物质相比,保存了大于或等于 85%的生物质碳水化合物。
如本文所用,“预加工”指在预处理之前加工木质纤维质生物质。预 加工是为预处理准备生物质的任何处理,例如机械碾磨和/或干燥至合适的 湿度。
“生物质-溶剂悬浮液”指生物质和溶剂的混合物。生物质-溶剂溶液可 包含附加组分如一种或多种烷基胺、氨、硫化物试剂等。
“糖化”指通过水解酶的作用主要从多糖中生产可发酵糖。通过纤维 素酶和半纤维素酶的酶解糖化作用从预处理生物质中生产可发酵糖。
如本文所用,“预处理生物质”或“生物质预处理”指使得天然的或 经预加工的生物质经受化学或物理作用、或它们的任何组合,致使所述生物 质在糖化之前较易于受酶解糖化或其他水解方法的作用。例如本文受权利要 求书保护的方法可称为预处理方法,该方法有助于使得生物质较易于受水解 酶作用而被糖化。
“预处理滤液”指在预处理之后与生物质接触的自由液体,并且其通 过过滤分离。
如本文所用,“预处理的生物质”指已经经受化学或物理作用、或它 们的任何组合的天然或经预加工的生物质,致使所述生物质在糖化之前较易 于受酶解糖化或其他水解方法的作用。
可通过与环境大气中的空气平衡干燥生物质进行“风干过滤后的生物 质”。
“易于糖化的生物质”指富集碳水化合物并且更易于被纤维素酶或半 纤维素酶水解以生产单体糖和低聚糖的生物质,即,如本文所述的预处理生 物质。
如本文所用,“富集碳水化合物的”指通过本文所述方法制备的生物 质。在一个实施方案中,通过本文所述方法制备的易于糖化的、富集碳水化 合物的生物质具有按干燥生物质重量计大于或等于85%的碳水化合物浓 度,同时已经除去了按干重计75%或更多的起始生物质木质素内容物。
“加热生物质悬浮液”指使得悬浮在溶剂中的生物质温度大于环境温 度或室温。与本文预处理相关的温度为约100至约220℃,或者约140至约 180℃,或者在这些温度范围内或接近这些温度范围的任何温度。
“加压过滤自由液体”指使得自由液体通过过滤器,在过滤器的反面 存在压力差异。
“碱”或“在碱性条件下”指pH大于7.0。在本发明中,“在碱性条 件下”也指生物质-溶剂悬浮液的pH等于或大于存在的亲核物质的pKa,使 得这些溶液是基本上去质子化的并且比它们的质子化状态反应性更高。这些 亲核物质将包括烷基胺和氨、硫醇、多硫化物以及氢硫化物(如果存在的 话)。
“二价烷烃”指具有两个开放价态的直链的、支链的或环状的烷烃。
“碳水化合物内容物”指木质纤维质生物质样品的干物质百分比,其 包括葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖,并且包括来自纤维素和半纤维素的碳水 化合物。
“基本上保留碳水化合物内容物”指在施用于木质纤维质生物质的预 处理过程中保留最大量(例如,≥85%的初始内容物)的各种葡聚糖、木聚 糖和阿拉伯糖。
“风干样品”指已经允许在环境温度和使其含水量与环境空气平衡的 压力点下风干的预处理样品,通常是≥85%的干物质。
“基本上不含木质素的生物质”指其中约≥75%的木质素被除去的预处 理样品。
“干生物质”指干物质含量为≥85%的生物质。用于干燥生物质的方法 包括暴露在环境温度至真空或者在大气压下通风和/或在烘箱或真空炉中加 热。
“多组分溶剂”指包含有机溶剂、水、和能够化学作用于木质素的试 剂的溶剂。
“压力容器”是可配备或不配备搅拌生物质/溶剂悬浮液的机构的密封 容器,其中当加热木质纤维质生物质时加正压。
“亲核物质”是能够通过提供两个成键电子与其反应物形成共价键的 化学试剂。
“水解产物”指与木质纤维素生物质接触的液体,它包含作用于生物 质的水解反应的产物(酶解或非酶解),在这种情况下包括单体糖和低聚 糖。
“有机溶剂”指有机溶剂和水的混合物,它通常与生物质接触,并且 其中木质素或其片段是可溶解的。
“酶聚生体”或“糖化酶聚生体”是酶的集合,通常由微生物分泌, 其在本发明实例中将通常包含一种或多种纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶、木 素酶和酯酶。
“单体糖”或“单糖”由单个戊糖或己糖单位组成,例如葡萄糖、木 糖和阿拉伯糖。
“去木质素”是从木质纤维质生物质中除去木质素的行为。在本专利 申请的情况下,去木质素指使用有机溶剂在高温碱性条件下,在存在氨以及 任选地存在多种亲核物质的情况下破碎具有高保留碳水化合物的木质纤维质 生物质(尤其是针对半纤维素)并从中萃取木质素。
“破碎”是其中用有机溶剂在碱性条件下处理木质纤维质生物质,将 木质素降解成较小亚基的过程。
“选择性萃取”是通过该方法溶解破碎后的木质素的过程,该方法用 有机溶剂在碱性条件下进行处理,留下多糖。
如本文所用,“同时破碎并选择性萃取”指在有机溶剂中进行的破碎 反应,该反应使得木质素片段一从批量生物质中释放出来就进入溶液。
提供了预处理木质纤维质生物质以制备易于糖化的、富集碳水化合物 的生物质的方法,所述生物质具有高保留的半纤维素。这些方法提供了使得 木质纤维质生物质组分较易于或较顺应酶解糖化的经济型方法。预处理可为 化学处理或物理处理,或者前述方法的任何组合。在该公开中预处理在存在 NH 3 并且任选地存在附加碱的情况下进行。存在的有机溶剂和碱性条件有助 于木质素的破碎和除去以及碳水化合物的回收。
此外,本公开中所述的方法最小化预处理过程中的碳水化合物损失并 最大化糖化中溶解(单体+低聚)糖的收率。
如上文所公开的那样,本文所述方法包括用包含低至中等浓度的氨和 如下文所述的一种或多种亲核物质的溶剂溶液预处理木质纤维质材料,从而 制备易于糖化的、富集碳水化合物的生物质,所述生物质具有高保留的半纤 维素。
溶剂
本文所述方法包括使用有机溶剂溶液预处理生物质以及特异性地破碎 并萃取木质素。本发明方法中使用的溶剂在本领域中很多情况下称为有机溶 剂(Organosolv)(例如E.Muurinen(2000)Organosolv Pulping,A review  and distillation study related to peroxyacid pulping Thesis,University of Oulu, pp.314;S.Aziz,K.Sarkanen,Tappi J.,72/73:169-175,1989;A.K. Varsheny和D.Patel,J.Sci.Ind.Res.,47:315-319,1988;A.A.Shatalov和 H.Pereira,BioResources 1:45-61,2006;T.N.Kleinert,Tappi J.,57:99- 102,1979;Practice of organosolv technology for biofuels,来自Kleinert,它 已经进展至试生产规模,据描述使用EtOH/H 2 O(WO 20071051269),以 及X.Pan,N.Gilkes,J.Kadla,K.Pye,S.Saka,D.Gregg,K.Ehara,D. Xie,D.Lam,和J.Saddler,Biotechnol.Bioeng.,94:851-861,2006。然而 仍旧处于实验室规模,据描述使用丙酮/H 2 O,参见美国专利4,470,851。与 使用溶剂和其他预处理方法相关的预处理技术的更多细节可见于Wyman等 人,(Bioresource Tech.,96:1959,2005);Wyman等人,(Bioresource  Tech.,96:2026,2005);Hsu,(“Pretreatment of biomass”In Handbook  on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,Taylor和Francis Eds.,p. 179-212,1996);以及Mosier等人,(Bioresource Tech.,96:673, 2005)。本文使用溶剂预处理生物质以除去木质素。去木质素通常在165- 225℃下进行,液体对生物质的比率为4∶1至20∶1,使用50%有机溶剂 (v/v)的液体组合物,并且反应时间为0.5-12小时。已经测试了许多单-和 多羟基醇作为溶剂。在这些反应中已经使用了乙醇、丁醇和苯酚(Park,J. K.,和Phillips,J.A.,Chem.Eng.Comm.,65:187-205,1988)。
在本发明方法中的有机溶剂或有机溶剂溶液预处理可包括在经选择的 条件参数下的水和有机溶剂的混合物,所述参数包括温度、时间、压力、溶 剂与水的比率和固体与液体的比率。溶剂可包括但不限于醇和非质子溶剂 (不具有在羟基中结合到氧上或在氨基中结合到氮上的氢原子的溶剂,例如 酮)。醇可包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇以及它们的异构体和 具有相同碳原子数的二醇,例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3- 己二醇。
本发明溶液中的溶剂浓度(即水)为约2至约90%(v/v),或者约 10%至约85%或约20%至约80%或约30%至约80%或更优选地约40%至约 70%(v/v)。具体地讲,为了本文方法的实施方案,检查约0%-80% (v/v)乙醇浓度的EtOH的H 2 O混合物,并且发现包含40-70%(v/v) EtOH的溶液是最有效的。
氨是低成本试剂,因此提供生物质预处理的经济型手段。氨在预处理 期间或预处理之后也能够回收到预处理反应器中,从而获得附加的经济有益 效果。氨分成液相和蒸汽相,并且气态氨能够比液态更容易地扩散通过生物 质,导致在较低浓度下进行更有效的预处理。例如在预处理后,当温度降低 到适于糖化时,可任选地在真空下释放氨气,并且可将其回收。在连续方法 中,可连续回收氨。
在一个实施方案中,低至中等浓度的氨预处理提高生物质中的碳水化 合物回收率。因为NH 3 与多糖链的还原末端形成亚胺,该反应可能抑制在 碱性pH下通过“剥落”导致糖损失的β-消除反应。NH 3 也能促进木质素的 氨解作用,这可能随着通过降低NH 4 +/NH 3 的pKa提高的EtOH浓度而提高 (提高NH 3 /NH 4 +比率)。该反应也可减少醌甲基化物的形成。因此加入低 至中等浓度NH 3 的结果是在较高浓度EtOH的H 2 O溶液预处理条件下进一 步增加保留的葡聚糖和木聚糖。
在另一个实施方案中,氨(NH 3 )可单独使用,或者除NaOH之外作为 溶剂溶液的附加组分使用。在本发明方法中使用的氨浓度是足以保持生物 质-氨水混合物碱性pH的最低浓度,其相对于生物质干重最大不超过约 16wt%,或约0%,2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18%或 20%。根据本发明方法,这种低浓度氨足以进行预处理。已经报道了使用高 浓度氨和有机溶剂的组合预处理以去木质素(Park,J.-K.,和Phillips,J. A.,Chem.Eng.Commun.,65,187-205,1988)。这些实验需要在预处理 时使用高液体/固体比率并导致半纤维素大量损失以及纤维素的酶解糖化不 佳。
如本文实施例3所示,当氨与低浓度NaOH一起补充时,它在受权利 要求书保护的方法中是较有效的。使用氨作为碱源,尤其是在本专利申请中 公开的低至中等浓度的氨,不存在单独使用NaOH时不可避免的处理问 题,因为能够容易地回收任何未反应的氨。
此外,本公开中所述的方法最小化预处理过程中的碳水化合物损失并 最大化糖化中溶解(单体+低聚)糖的收率。
如上文所公开的那样,本文所述方法包括用包含如下文所述组分的溶 剂溶液预处理木质纤维质材料,从而制备易于糖化的、富集碳水化合物的生 物质,所述生物质具有高保留的半纤维素。
溶剂溶液的附加组分
在一个实施方案中,可使用NaOH作为溶剂溶液的附加组分。可在 EtOH的H 2 O溶剂溶液中专门使用NaOH,并且NaOH的用途可包括加入催 化剂如蒽醌到溶剂溶液中以进一步破碎木质素。
NaOH可在多个浓度使用,例如其量为至少约0.5至约20%(w/w生物 质)。较合适的浓度包括约1至约10%(w/w生物质)。最合适的浓度为约 2-8%(w/w生物质)。加入约8%(w/w生物质)的NaOH到包含20-80% 乙醇水溶液(v/v)和~0.5%蒽醌(AQ)(w/v)作为木质素破碎催化剂的溶 剂中导致与自动水解(仅在EtOH/H 2 O中进行)相比,预处理中保留的木聚 糖增加。
本发明方法的实施方案包括包含20-80%v/v乙醇的H 2 O溶液与2%至 20%NH 3 (w/w生物质)和0.5%至8%NaOH(w/w生物质)的溶剂溶液。 蔗渣在40-70%EtOH的H 2 O(v/v)溶液和6%NH 3 (w/w生物质)以及2% NaOH(w/w生物质)条件下观察到最佳回收率。观察到木质素萃取随着 H 2 O中的EtOH增加而增加,这可能反映出木质素片段的溶解度提高,而 NH 3 /NH 4 +随着H 2 O中的EtOH增加而增加归因于溶剂极性的降低。用NH 3 加NaOH比单独用NH 3 的酶解糖收率和木质素萃取更高,这可能是前者的 pH更高导致的结果,pH越高导致未质子化的NH 3 浓度越高,使得越多的木 质素和半纤维素酯键氨解,在存在NaOH的预处理中,水解增加是由于OH-浓度更高,而减少的pH降幅是由于半纤维素乙酰基的水解。
根据本发明方法,含氨的有机溶剂溶液可任选地包含至少一种附加 (无机的)的碱,例如氢氧化钠(如上文所述)、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸 钾、氢氧化钙和碳酸钙。可加入所述至少一个附加的碱,加入的量使其与氨 结合形成的总碱量相对于生物质的干重小于约20重量%百分比。优选地一 种附加碱加氨的总量为相对于生物质干重小于约20%,或约0%,2%, 4%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18或20%。
可使用不同浓度的无机碱,其浓度至少为0.5%至约16%(干生物质重 量%)。较适用的浓度是1%至10%。最适用的浓度为2%至8%。
木质纤维质生物质
本文预处理的木质纤维质生物质包括但不限于生物能作物、农业残余 物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭园垃圾、木材和 林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余(如玉米壳、玉米 秸秆)、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废 纸、蔗渣、甘蔗杆、黄杨、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木 屑、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。
在一个实施方案中,木质纤维质生物质包括农业残余物如玉米秸秆、 小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秆、卡诺拉秸秆、和大豆秸秆;草如柳 枝稷、芒草、米草、和草芦;纤维加工残余如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残 渣和废弃物以及蔗渣;甘蔗杆和高粱;林业垃圾如黄杨、白杨木、其他硬 木、软木和锯屑;和消费者用过的纸制品垃圾;以及其他作物或足够丰富的 木质纤维质材料。
在另一个实施方案中,用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合 物含量的生物质,它们相对密集,和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处 理。
在本发明的另一个实施方案中,有用的生物质包括玉米芯、玉米秸 秆、蔗渣甘蔗杆、黄杨和柳枝稷。
木质纤维质生物质可来源于单一来源,或者可包括来源于一种以上来 源的混合物;例如,生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物、或者杆或茎 和叶片的混合物。
在本发明的方法中,预处理期间生物质干重为初始浓度至少约9%至约 80%的生物质-溶剂悬浮液重量。最适合的是,生物质干重为浓度约15%至 约70%,15%至约60%,或约15%至约50%的生物质-溶剂悬浮液重量。生 物质-溶剂悬浮液中的生物质百分比保持高水平以降低预处理材料的总体 积,减少所需的溶剂和试剂量并使得该方法更经济。
生物质当从来源获取时可直接使用,或者可经过一些预加工,例如可 向生物质施加能量以减少尺寸、提高暴露的表面积、和/或在方法的第二步 和第三步分别使得生物质中存在的木质素和纤维素、半纤维素、和/或低聚 糖更易于受有机溶剂预处理和使用的糖化酶的作用。用于减小尺寸、增加暴 露的表面积、和/或提高生物质中存在的木质素、纤维素、半纤维素、和/或 低聚糖对有机溶剂预处理和对用于从预处理的生物质中生产糖的糖化酶的可 用性的能量装置包括但不限于研磨、压碎、碾磨、切碎、剁碎、盘磨、超声 波、和微波。这种能量的施加可发生于预处理之前或期间,糖化之前或期 间,或它们的任何组合。
在预处理之前的干燥也可通过常规手段进行,例如暴露在环境温度至 真空或在大气压下通风和/或在大气压下的烘箱中或真空炉中加热。
预处理条件
在任何合适容器中用包含氨和一种和多种亲核物质的有机溶剂溶液在 碱性条件下预处理生物质。通常该容器是能耐压的容器,具有加热机构和混 合内容物的机构。可商购获得的容器包括例如Zipperclave反应器 (Autoclave Engineers,Erie,PA)、Jaygo反应器(Jaygo Manufacturing, Inc.,Mahwah,NJ)、和蒸汽喷射反应器(如一般方法所述;Autoclave  Engineers,Erie,PA)。可使用具有相似能力的更大型反应器。作为另外一 种选择,生物质和有机溶剂溶液可在容器中结合,然后转移到另一个反应器 中。生物质也可以在一个容器中进行预处理,然后在另一个反应器如蒸汽喷 射反应器(如一般方法所述;Autoclave Engineers,Erie,PA)中进行进一 步处理。
可在任何合适的容器中进行预处理反应,例如分批反应器或连续反应 器。本领域的技术人员将认识到,在更高温度下(超过100℃)将需要压力 容器。适宜的容器可配备如叶轮的装置,以用于搅拌生物质-有机溶剂混合 物。反应器设计在Lin,K.-H.,和Van Ness,H.C.(Perry,R.H.和 Chilton,C.H.(编辑),Chemical Engineer’s Handbook,第5版(1973) Chapter 4,McGraw-Hill,NY中)中进行了讨论。预处理反应可用分批方法 或连续方法进行。
在使得所述生物质与溶剂接触之前,可对包含生物质的容器施加真 空。通过从生物质孔中抽出空气,可将溶剂更好地渗透到生物质中。施加真 空的时间和施加到生物质上的负压的量将取决于生物质类型,并且能根据经 验进行测定,以获得最佳的生物质预处理效果(通过糖化后可发酵糖的产量 进行测量)。
生物质与溶剂一起加热,加热温度为约100℃至约220℃,约150℃至 200℃,约165℃至约195℃。加热溶液可迅速冷却至室温。在另一个实施方 案中,生物质加热在约180℃进行。生物质-溶剂悬浮液可加热约5分钟至约 5小时,或者约30分钟至约3小时,或者更优选地约1至2小时。
用有机溶剂溶液和氨预处理生物质在碱性条件下进行,pH等于或大于 存在的亲核物质的pKa。在这些高pH条件下,至少50%的亲核物质处于去 质子化状态。去质子化通常提高亲核物质的反应性。存在的亲核物质除氨之 外还能够包括烷基胺、多硫化物(氢多硫化物)和硫化物(氢硫化物)、以 及硫醇。
就本文所述预处理方法而言,温度、pH、预处理时间和反应物浓度如 有机溶剂和氨以及附加的亲核物质、生物质浓度、生物质类型和生物质粒度 是相关的;因此这些变量可根据每种类型生物质的需要进行调节以优化本文 所述的预处理方法。
在高温下预处理之后,加压过滤生物质。过滤可在冷却之前或之后。 在过滤后,可用水合有机溶剂在高温或环境温度下洗涤生物质一次或多次。 然后可用水洗涤或干燥以除去有机溶剂,随后进行糖化。干燥生物质的方法 如上所述。
为了评估预处理的效果,即,生产易于糖化的、富集碳水化合物的生 物质,其具有高保留的半纤维素,以及随后的糖化(分别评估或一起评 估),可测定来源于生物质原料的糖的理论收率并与测得的收率进行比较。 预处理效果可通过将总体系统性能中载酶量与其对目标产物收率的影响相关 联进行进一步评估。
进一步加工
糖化
在预处理后,易于糖化的、富集碳水化合物的生物质包含有机溶剂、 氨、亲核物质、破碎并萃取的木质素和多糖的混合物。在进一步加工之前, 可从预处理的生物质中通过过滤和用EtOH的H 2 O(0%至100%EtOH v/v) 溶液洗涤样品除去氨、亲核物质和木质素片段。可用水洗涤生物质或干燥生 物质以除去EtOH,产生富集碳水化合物的、易于糖化的生物质,并且可使 用本领域熟知的分析手段测定所述生物质的葡聚糖、木聚糖和酸不溶解的木 质素内容物的浓度。本发明的有益效果是预处理的生物质既可用水洗涤也可 干燥用于糖化。易于糖化的富集碳水化合物的生物质具有高保留的半纤维 素,它然后可在糖化酶聚生体的存在下进一步水解以释放水解产物中的低聚 糖和/或单糖。
可加入表面活性剂如Tween 20或Tween 80或聚氧乙烯如PEG 2000、 4000或8000以改善糖化方法(美国专利7,354,743B2,以引用方式并入本 文)。将表面活性剂(例如Tween 20)加到酶解糖化过程中常常提高单体 糖释放的速率和收率。可能是表面活性剂覆盖在任何残余的木质素上,减少 酶对木质素的非生产性结合。供选择的替代方法是提高预处理中的木质素萃 取或者化学性修饰木质素使得木质素吸附造成的酶损失减少。
用于生物质处理的糖化酶和方法参见Lynd,L.R.等人,(Microbiol. Mol.Biol.Rev.,66:506-577,2002)。糖化酶聚生体可包含一种或多种糖苷 酶;糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶和淀粉水解糖苷 酶。糖化酶聚生体中的其他酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和酯酶。
糖化酶聚生体包括一种或多种酶,所述酶主要选自但不限于:“糖苷 酶”类,所述酶水解二糖、低聚糖、和多糖的醚键,存在于广义“水解酶” (EC 3.)的分类酶EC 3.2.1.x中(Enzyme Nomenclature 1992,Academic  Press,San Diego,CA with Supplement 1(1993),Supplement 2(1994), Supplement 3(1995,Supplement 4(1997)and Supplement5[分别在Eur.J. Biochem.,223:1-5,1994;Eur.J.Biochem.,232:1-6,1995;Eur.J. Biochem.,237:1-5,1996;Eur.J.Biochem.,250:1-6,1997;和Eur.J. Biochem.,264:610-6501999中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它 们水解的生物质组分进行分类。本发明的方法可用的糖苷酶包括纤维素水解 糖苷酶(例如,纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解 酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如,木聚糖酶、内木聚糖 酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳 糖酶、果胶酶、葡糖醛酸酶)、和淀粉水解糖苷酶(例如,淀粉酶、α-淀粉 酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外,它可用 于将其他活性加入糖化酶聚生体中,如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC  3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)、和阿魏酸酯酶(EC  3.1.1.73),以帮助从生物质的其他组分中释放多糖。本领域熟知生产多糖 水解酶的微生物常常表现出某种活性,如纤维素降解,该活性由若干种酶或 一组具有不同底物特异性的酶催化。因此,来自微生物的“纤维素酶”可包 括一组酶,所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方 案,商业或非商业酶制剂,如纤维素酶,可包括多种酶。因此,本发明方法 的糖化酶聚生体可包括酶活性,如“纤维素酶”,然而人们认识到该活性可 被一种以上的酶催化。
糖化酶可以分离形式商购获得,例如SpezymeCP纤维素酶 (Genencor International,Rochester,NY)和Multifect木聚糖酶 (Genencor)。此外,糖化酶可在生物燃料植物的宿主生物中表达,包括使 用重组微生物。
本领域的技术人员将懂得如何测定在复合酶中使用的酶的有效量,以 及如何调节条件以获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在 复合酶中的此类酶的所需活性,以在选择条件下获得给定预处理产物的最佳 糖化效果。
优选地,糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温 度的条件下进行。在本发明的方法中糖化酶聚生体使用的最佳温度在约15 ℃至约100℃的范围内。在另一个实施方案中,最佳温度范围为约20℃至约 80℃,最常见的为45-50℃。最佳pH范围为约2至约11。在另一个实施方 案中,本发明方法中使用的糖化酶聚生体的最佳pH范围为约4至约5.5。
糖化可进行约若干分钟至约120小时,优选约若干分钟至约48小时。 反应时间将取决于酶浓度和比活性,以及使用的底物、其浓度(即载入的固 体)和环境条件如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物 和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化能分批进行或以连续方法进行。糖化也能一步进行或多步进行。 例如,糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。能用酶在某个温 度和pH下进行首次处理,随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二 次或第三次(或更多次)处理。此外,用不同酶在连续步骤中进行的处理可 以在相同pH和/或温度下进行,或在不同pH和温度下进行,例如使用在更 高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理,随后用在更低pH和 温度下有活性的纤维素酶处理。
糖化后来自生物质的糖的溶解度能通过测量释放的单糖和低聚糖进行 监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如,还原糖的浓度能使 用1,3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller,G.L.,Anal.Chem.,31: 426-428,1959)。作为另外一种选择,可使用适当的柱,经由HPLC测定 糖,如下文所述。
发酵成目标产物
通过本发明方法制备的具有高保留的半纤维素、易于糖化的、富集碳 水化合物的生物质可通过如上所述的酶水解以制备可发酵糖,然后可将其发 酵成目标产物。“发酵”指任何发酵过程或包括发酵步骤的过程。目标产物 包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二 醇、山梨醇、和木糖醇);有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血 酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、 葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、 丙酸、琥珀酸、和木质酸);酮(例如丙酮);氨基酸(例如天冬氨酸、谷 氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸);气体(例如甲烷、氢 (H 2 )、二氧化碳(CO 2 )、和一氧化碳(CO))。
发酵过程也包括用于消费醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业 (例如发酵乳产品)、皮革工业、和烟草工业的过程。
除上文所述之外,如本文所述糖化预处理生物质制备的糖一般来讲可 用于制备有机产品、化学制品、燃料、商品和特定化学制品如木糖、丙酮、 乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1,3-丙二醇、丁二醇、甘 油、乙二醇、糠醛、聚羟基链烷酸、顺式,顺式-粘康酸、和动物饲料 (Lynd,L.R.,Wyman,C.E.,和Gerngross,T.U.,Biocom.Eng., Biotechnol.Prog.,15:777-793,1999;以及Philippidis,G.P.,Cellulose  bioconversion technology,in Handbook on Bioethanol:Production and  Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor & Francis,Washington,D.C.,179- 212,1996;和Ryu,D.D.Y.,以及Mandels,M.,Cellulases:biosynthesis  and applications,Enz.Microb.Technol.,2:91-102,1980)。
也可制备潜在的共生产品,例如从发酵碳水化合物中得到的多个有机 产品。在预处理和发酵后保留的富含木质素的残余可转化成木质素来源的化 学制品、化学结构物或用于发电。
发酵和/或糖化的常规方法是本领域已知的,包括但不限于糖化、发 酵、分开水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发 酵(SSCF)、复合水解和发酵(HHF)、和直接的微生物转化(DMC)。
SHF使用分开的工序以首先酶促水解纤维素成糖如葡萄糖和木糖,然 后将糖发酵成乙醇。在SSF中,将纤维素的酶促水解和葡萄糖发酵成乙醇 合并成一个步骤(Philippidis,G.P.,同上)。SSCF包括多糖的共发酵 (Sheehan,J.和Himmel,M.,Bioethanol,Biotechnol.Prog.,15:817-827, 1999)。HHF包括在相同反应器中进行的两个分开步骤,但是温度不同, 即,高温酶解糖化后在发酵菌种能够承受的较低温度下进行SSF。DMC将 所有三个过程(纤维素酶生产、纤维素水解、和发酵)合并在一个步骤中 (Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S., Microbiol.Mol.Biol.Rev.,66:506-577,2002)。
这些方法可用于从富集碳水化合物的生物质中制备目标产物,所述生 物质具有高保留的半纤维素,通过本文所述的预处理方法制备。
本方法的优点
本发明所述的方法用于预处理木质纤维质生物质,预处理在高温碱性 条件下使用低至中等浓度的氨破碎并选择性萃取木质素,产生显著改善的木 质素破碎效果和高碳水化合物(尤其是半纤维素)保留,因此提供获得用于 酶解糖化的、富集碳水化合物的生物质的高性价比方法。此类生物质然后产 生高收率的可发酵糖(葡萄糖、以及木糖),它们生物转化成增值的化学制 品和燃料。
当前文献中描述的有机溶剂方法的主要缺点在于:预处理后的碳水化 合物(尤其是木糖)的回收率低、需要分开的己糖和戊糖液流、产生糖降解 产物、使用大量溶剂和高资金耗费。例如某些现有的方法包括使用酸性有机 溶剂条件,该条件产生半纤维素和纤维素的水解产物。在酸性条件下半纤维 素的不稳定性较高,导致形成单体木糖降解产物(例如糠醛),大量减少木 糖的回收(Pan等人,同上)。在这种方法的一个版本中(Arato,C., Pye,E.K.,和Gjennestad,G.,Appl.Biochem.Biotech.121-124:871-882, 2005),将半纤维素在酸性条件下水解,并且在中和后将纤维素酶促水解。 在糖化之前中和酸的需求、部分损失的木糖、和分开的戊糖和己糖液流处理 都增加了该方法的成本。此外,使用酸性条件需要在反应器和管道中使用合 金,这很大程度上增加了设备的资金成本。
这一公开描述了高选择性方法的开发,其中使用廉价的试剂选择性破 碎并萃取木质素,并且半纤维素和纤维素在生物质中保持在一起直到后期的 酶解糖化。这一方法尤其允许保持高浓度的生物质半纤维素。萃取到有机溶 剂溶液中的木质素的量为≥75%,并且残余生物质中的木聚糖和葡聚糖回收 率接近定量,因此克服了文献中描述的程序的缺点,所述程序用于如上文所 述的有机溶剂生物质预处理。根据本专利申请所述的方法,多糖的高回收率 是由于以下原因导致:使用减少半纤维素水解和糖降解的碱性条件、使用低 至中等浓度的氨阻止多糖在碱性条件下剥落、以及减少半纤维素水解并产生 不溶性木糖低聚物的高乙醇含量的有机溶剂溶液。此外,使用的碱性条件不 需要在设备中使用外来的合金,从而降低资金成本。在反应物或产物中使用 少量无机盐或不使用无机盐(例如NaOH、NaCO 3 、CaSO 4 )实施该方法导 致与最终处理无机废物相关联的少量成本或无成本。未反应的试剂(例如 EtOH、NH 3 )是可回收的,提供附加的节省成本有益效果。文献中描述的 许多方法使用较大的溶剂对生物质的比率。在本发明的实例中,使用碱性条 件并通过加入亲核物质基本上破碎木质素意味着溶剂液流能够积聚高浓度的 木质素,减少需要的大溶剂体积并同时减少痕量溶解碳水化合物的损失。最 后,使用酶将残余碳水化合物充分糖化,这可能是因为预处理中的高水平木 质素片段萃取、半纤维素和木质素之间酯键的有效破坏、和多糖聚合程度的 一些降低。使用有机溶剂改善生物质的可润湿性和酶进入底物孔中的能力。
实施例
预处理生物质以获取易于糖化的、富集碳水化合物的生物质
下述实验工作的目标是开发木质纤维素的经济型预处理方法,该方法 最大化预处理中的木质素萃取和糖保留,并且制备易于糖化的、富集碳水化 合物的生物质,其具有高保留的半纤维素,可进行进一步加工以在酶解糖化 后获取最大的单体糖收率。采用的方法为选择性破碎木质素并将其萃取到合 适溶剂中,同时保留固体残余中的糖。以下实验显示有机溶剂溶液的开发, 其结合存在的亲核物质如NH 3 用于选择性萃取木质素。组合存在的有机溶 剂和低至中等浓度的NH 3 以及任选地附加碱选择性破碎并溶解生物质的木 质素组分,产生包含高水平碳水化合物尤其是半纤维素的预处理生物质。
蔗渣在预处理前被Wiley切碎机切碎通过1mm的筛网。
实施例中使用以下缩写:“HPLC”为高效液相色谱(High Performance  Liquid Chromatography),“C”为摄氏度;“%”为百分比;“wt”为重 量;“w/w”为重量比;“mL”为毫升;“OD”为外径;“ID”为内径; “h”为小时;“rpm”为每分钟转数;“EtOH”为乙醇;“mg/g”为毫克 每克;“g/100mL”为克每100毫升;“N”为正常值;“g”为克; “NaOH”为氢氧化钠;“w/v”为重量体积比;“v/v”为体积比; “NH 3 ”为氨;“mm”为毫米;“mL/min”为毫升每分钟;“min”为分 钟;“mM”为毫摩尔每升。
材料
硫酸、氢氧化铵、乙酸、乙酰胺、酵母提取物、2-吗啉乙磺酸 (MES)、磷酸钾、葡萄糖、木糖、胰蛋白胨、氯化钠、柠檬酸、单甲基 和二甲胺购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。Spezyme CP和Multifect  CX12L得自Genecor(Genencor International,Palo Alto,CA),Novozyme  188得自Novozyme(Bagsvaerd,Denmark)。
实施例1
有效乙醇浓度
该实施例的目标是检查水中的溶剂(例如乙醇)浓度在不控制pH的情 况下对碳水化合物回收和木质素溶解/萃取的效应。将蔗渣(0.2g,95.78% 干物质)悬浮在1.56mL EtOH/水溶液中,该溶液包含不同浓度(从0至 80%)的EtOH。将悬浮液载入316型不锈钢管(1/4英寸ID,3/8英寸 OD,4英寸长度),该管用Swagelock装置(Penn Fluid System  Technologies,Huntingdon Valley,PA)封端。将这些管子置于流化砂浴 (Techne Model SBS-4,Techne Inc.,Burlington,NJ)中并加热到180℃ 2 小时,并且在室温下将其投入水浴使其迅速冷却。将样品从管中移出并使用 Spin-X过滤器(Costar,Corning Inc.,Corning NY)在14,000rpm离心过滤 以除去溶解的木质素,过滤在室温下进行,使用台上离心机(Spectrifuge  16M,Labnet International Inc.,Edison,NJ)。保留下的每个样品用0.5mL  EtOH/H 2 O洗涤(4x),使用与180℃处理(0-80%EtOH的H 2 O溶液)中所 用EtOH浓度相同的浓度。然后在室温下风干样品(干燥至~92%的干物 质),并且使用National Renewable Energy Laboratory(NREL)方法 (Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass-Version  2006,Amie Sluiter等人,得自NREL网站)测定残余物的葡聚糖、木聚糖 和酸不溶解的木质素含量。
后续的酶解糖化
将上文制备的风干样品以~14%的固体载量悬浮在pH 4.6的50mM柠檬 酸缓冲液中。加入的糖化酶如Spezyme CP、Multifect CX12L和Novozyme  188,其浓度分别为6∶3∶6mg/g纤维素。也加入1%(w/v)Tween 20和0.01% (w/v)NaN 3 ,后者阻止微生物生长。将样品(~0.4mL)置于其中包含两 个5mm玻璃珠的螺帽小瓶中,以250rpm在旋转振荡器上,在46℃培养。 从起始点开始在4h并且每隔24h的间隔移出等分试样,并且用0.01N H 2 SO 4 稀释41.25倍用于分析。然后通过Spin-X过滤器过滤样品,并且通过HPLC 分析滤液(Agilent系列1100/1200,Agilent Technologies,Wilmington, DE)。使用BioRad HPX-87H Aminex柱(Bio-Rad Laboratories,Hercules  CA 94547分离释放的糖,其使用0.01N H 2 SO 4 作为流动相,流量为0.6mL/ 分钟。柱子保持在60℃。使用示差折光率检测器检测洗脱的糖,并且保持 在55℃。葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的保留时间分别为9.05、9.72和10.63分 钟)。表1A列出了以0%-80%的EtOH浓度进行预处理后葡聚糖和木聚糖 的回收百分比和酸不溶解(AI)木质素含量的百分比变化。蔗渣浓度为 (0.2g/1.56mM)可变浓度EtOH,在180℃使用2h。
表1A
根据实施例1在预处理后的葡聚糖和木聚糖回收率
表1A中显示的结果指示木质素萃取可能随着EtOH含量的提高而提 高,因为木质素的溶解度随着EtOH浓度的提高而提高。然而,萃取的木质 素的量甚至在高乙醇浓度下保持在中等水平。
半纤维素水解和木糖低聚物的溶解度随着EtOH的提高而降低,提高了 残余中木聚糖和木糖低聚物的回收率。预处理释放的乙酸的量也随着EtOH 含量的提高而降低,这与EtOH浓度提高降低生物质的自动水解一致。
表1B显示在不同EtOH浓度下,在预处理后酶解糖化96h后的葡萄糖 和木糖收率。当预处理中的EtOH浓度从0提高到20%时,纤维素的糖化提 高,但是随后随着提高的EtOH预处理浓度而降低。在高于20%EtOH的浓 度下观察到部分水解的木质素和纤维素可能的减少(纤维素聚合程度提高, 这降低随后糖化过程中的葡萄糖收率-表1B)。
表1B
酶解糖化96h后的单体葡萄糖和木糖收率,如实施例1所述进行预处理
单体糖(尤其是木糖)的总回收率(表1B)在较低EtOH浓度下相当 低。在低EtOH浓度下进行的预处理,通过在高温下水解半纤维素乙酰基产 生的酸性条件水解半纤维素。预处理后进行的过滤和洗涤损失溶解的木糖和 一些葡萄糖。在较高的EtOH浓度下,纤维素、半纤维素和木质素的部分水 解较少,这降低糖化收率。在低和高乙醇浓度下的表现一起导致单体葡萄糖 和木糖的低总收率。
实施例2
碱性有机溶剂溶液预处理对木质素萃取的效应
本实施例的目标是为了检查提高pH对不同EtOH对H 2 O的比率下有机 溶剂溶液预处理、碳水化合物保留和木质素萃取以及在随后的酶解糖化期间 的单体糖的效应。假定自动水解降低pH、水解木聚糖、并且提高木糖的损 失,加入NaOH提高预处理的pH。较高pH对木糖回收率的效应如下文所 示。将蔗渣(0.25g,95.78%干物质)悬浮在1.75mL溶剂中,所述溶剂包含 EtOH(20-80%水溶液)和8%NaOH(w/w生物质)加1mg蒽醌(AQ,木 质素破碎的催化剂)。该溶液的初始pH为~13.7。将悬浮液载入封端的316 型不锈钢管,在168℃处理140分钟并在室温下的水中冷却。如上文实施例 1所述从压力容器中移出样品,将其过滤、洗涤、风干并分析全部样品。表 2A显示预处理后葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖含量和木质素含量的改变。
随后如实施例1所述进行酶解糖化,不同的是在存在1%Tween 20 (w/v)的情况下Spezyme∶Multifect∶Novozymes 188比率是12∶6∶1.2mg/g干固 体。表2B显示酶糖化生物质96h后的单体糖收率,之前在不同EtOH浓度 下进行预处理。
表2A
在根据实施例2进行预处理后的葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖收率
表2B
酶解糖化96h后的单体葡萄糖和木糖收率,如实施例2所述进行预处理
可从表2A和2B中看出这一实验的碱性条件与实施例1的自动水解实 验相比基本上增加了预处理保留的木糖。这种效应在低EtOH浓度下最明 显。NaOH阻止溶液变成酸性(最终pH~10.7)并因此保护半纤维素不受酸 催化水解。此外,萃取了显著更多的木质素,可能是因为通过碱催化了木质 素的破碎。在糖化后的总单体糖收率比实施例1中观察到的那些收率高得 多。预处理中较高的糖回收率和较多的木质素萃取提高了随后的酶解糖化的 收率。作为两个相对过程的结果,木糖和葡萄糖糖化收率的峰值在~45% EtOH,即,在较高EtOH时(它趋于提高糖收率)提高木质素的萃取,而 当进一步提高EtOH浓度时降低纤维素和木质素的部分水解。可能是醌甲基 化物的形成(它能与糖再聚合或反应)、和多糖的“剥落”与碱破坏反应一 起导致糖总收率受限。
实施例3
在氨的存在下在预处理后进一步提高糖化收率
该实施例的目标是研究有机溶剂溶液中存在的氨在预处理后对碳水化 合物收率和木质素含量以及糖化后对单体糖收率的效应。虽然pH的提高很 大程度上改善了木聚糖回收率,在实施例2列出的碱性预处理方法中仍有大 量的糖损失。这些损失可能是由于“剥落”,即,从多糖链的还原末端夺去 糖。虽然与自动水解相比,在碱性条件下水解更有效,木质素形成醌甲基化 物也是可能的,它能够与还原糖再聚合或反应。因此意欲阻止这两种现象, 检查将NH 3 加入有机溶剂溶液的效应。
将蔗渣(0.375g,95.78%干物质)悬浮在1.125mL溶剂中,所述溶剂包 含不同百分比的EtOH(0%-70%水溶液)。此外,溶剂包含6%NH 3 和2% NaOH(w/w生物质)。这种溶液的初始pH是13.2并且被提高的EtOH浓 度提高到pH 14.0。将这些条件用于类似的蔗渣样品,将所述样品单独悬浮 在70%EtOH的H 2 O(v/v)溶液中,该溶液包含8%NH 3 (w/w生物质), 其中初始pH是12.2。将悬浮液载入封端的316型不锈钢压力容器(3/16英 寸ID,1/4英寸OD,4英寸长度)并如上文实施例1所述处理,不同的是 载入固体更多并且样品在168℃加热140分钟。
随后如实施例1所述进行酶解糖化,不同的是在存在1%Tween 20 (w/v)的情况下Spezyme∶Multifect∶Novozymes 188比率是 6.68∶3.34∶1.67mg/g干固体。载入固体为14重量%。
表3A概述了不同EtOH浓度下的预处理结果。表3B概述了在6%NH 3 加2%NaOH(w/w生物质)的存在下,在不同EtOH浓度下预处理96h后的 糖化情况。
表3A
实施例3中列出的预处理后的葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖回收率
表3B
酶解糖化96h后的单体葡萄糖和木糖收率,如实施例3所述进行预处理
从表3A和3B列出的结果中清楚地看出用碱性氨预处理与单独用 NaOH预处理相比,残余中的碳水化合物回收率大幅提高(实施例2)。此 外,加入低浓度的NH 3 导致样品酶解糖化的单体葡萄糖和木糖收率的大幅 提高,所述样品在较高浓度EtOH H 2 O溶液预处理条件下进行预处理。这些 结果与NH 3 阻止“剥落”反应或降低醌甲基化物浓度或同时导致两种效应 的作用一致。在存在NH 3 的情况下具有低浓度NaOH显著提高预处理的功 效,可能是因为在存在NaOH时pH较高,较多的NH 3 处于去质子化状态。
实施例4
在包含氨的有机溶剂溶液预处理中加入甲胺和元素硫的效应
在存在加入的亲核物质、甲胺和元素硫的情况下检查用氨进行的预处 理,所述物质在碱性预处理条件下不成比例的形成多硫化物和硫化物。预处 理如实施例3所述进行,不同的是蔗渣包含1%元素硫(w/w生物质)并悬 浮在70%EtOH H 2 O溶液中(v/v),溶液加入14%MA(甲胺),7%NH 3 +7%MA,10%NH 3 +4%MA,或14%NH 3 (全部是w/w生物质)。将样 品在压力容器中,在187℃加热1小时,然后在水浴中迅速冷却至室温。如 前文所述将残余过滤、洗涤并干燥。如实施例5所述进行酶解糖化,不同的 是在存在或不存在0.5%PEG 2000(w/w生物质)的情况下进行。
表4
实施例11中所述的处理后单体糖收率
如表9所示,用甲胺置换氨不对预处理时的葡聚糖和木聚糖回收产生 影响。然而随着单体葡萄糖和木糖的糖化收率逐渐提高,甲胺对氨的置换更 加广泛(表4)。在有或没有PEG 2000的情况下进行糖化,其差异最高仅 为百分之几。需要对总过程进行经济分析以测定是否在预处理中用甲胺置换 氨或在糖化时加入PEG 2000能导致较高的糖产量,抵消MA或PEG带来的 成本增加。