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1. CN101142220 - Isolation of galanthamine from biological material

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从生物材料分离加兰他敏


发明领域
本发明涉及将加兰他敏及其衍生物以基本纯形式分离的方法, 这种方法克服了现知方法的缺点。
发明背景
加兰他敏,即4a,5,9,10,11,12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋 喃[3a,3,2-ef]-(2)-苯并氮杂环庚烯-6-醇,是由石蒜科(Amaryllidaceae) 例如雪花莲属(Galanthus)、水仙属(Narcissus)、雪片莲属(Leucojum) 和石蒜属(Lycoris)的植物产生的天然生物碱。图1显示它的结构。它 最早由Proskurnina和Jakovleva从Galanthus woronowi分离(J.Gen. Chem.USSR,1952,22,1899-1902)。
药理学上,加兰他敏是如同毒扁豆碱的可逆胆碱酯酶抑制剂, 但毒性要低得多。它还具有镇痛和抗氧化性质。这一独特的性质组 合使得它能用于治疗阿尔茨海默病(例如L.J.Scott和K.L.Goa,Drugs 2000,60,1095-1122)以及酒精、药物和尼古丁成瘾和其它一些疾病 (美国专利第5,643,905号)。
虽然已有多种加兰他敏合成方法得到描述(例如Kametani等,J. Chem.Soc.C,1971,6,1043-1047或者Shimizu等,Heterocycles,1977, 8,277-282及众多专利),从植物材料分离加兰他敏仍是其大规模制 造的有效替代途径。从植物材料分离加兰他敏的已知方法的共同缺 点是缺乏适于大规模分离的粗放性和可放大性。这些方法通常是为 加工一种确定来源的植物材料而特制的。它们如用于加工另一种植 物材料,则不能够生产出足够基本纯的加兰他敏。有毒的和/或对环 境有害的溶剂如二氯乙烷和其它氯代烃类及二乙醚的使用,也会阻 碍这些方法用于大规模生产。而且,这些现知方法中采用的一些操 作难以放大,例如初级提取物的浓缩至干和残余物在另一溶剂中的 溶解。
专利DE 1,193,061描述的从石蒜科植物分离加兰他敏,是用二 氯乙烷或其它氯代烃类(二氯甲烷、氯仿)提取已用氨水碱化的植物材 料。所获得的初级提取物进一步用稀硫酸处理,其附带的生物碱类 用氨水沉淀。留在溶液中的加兰他敏用二乙醚或二氯甲烷萃取并进 一步纯化。美国专利第5,877,172号提供了对这个方法的实质改进。 粉碎的植物材料(Narcissus pseudonarcissus“Carlton”)在提取前先与粉 末化碳酸钠混合,然后用二氯乙烷萃取。初级提取物的进一步加工 与以上所述类似,但乳浊液的形成减至最低。尽管如此,所用的溶 剂二氯乙烷和二乙醚并不适合于工业规模分离。
美国专利第5,877,172号还描述了这样提取植物材料:提取前先 加入粉末化碳酸钠将植物材料碱化,然后用汽油萃取获得初级提取 物。将初级提取物蒸发至干,干残余物溶于稀硫酸中,溶液的pH调 至约4,用二乙醚萃取非生物碱性质的附带成分。将所获得的精制水 溶液碱化至pH9,生物碱类被萃取到二乙醚中。将二乙醚提取物浓 缩至干,然后从2-丙醇中结晶,产生加兰他敏。虽然取消了有毒二 氯乙烷的使用,该方法仍要使用二乙醚。此外,用汽油来萃取效率 低下,且需要大量的溶剂。而且,将初级萃取物蒸发成干残余物并 不方便。该方法包括几个用来从大量非生物碱成分分离生物碱的操 作,但确保加兰他敏与其它生物碱类分离的唯一操作是生物碱浓缩 物从2-丙醇的结晶。这个事实意味着该方法并不足够粗放,以确保 从如下所述的复杂材料分离出纯加兰他敏。
以上对从植物材料提取加兰他敏的技术现状的概述给出了证 据,证明仍需要有粗放的方法来从不同植物材料大规模提取和纯化 加兰他敏以提供高纯产物。
附图简述
图1.加兰他敏的结构式。
图2.实施例1获得的初级提取物的HPLC分析。
图3.实施例1获得的粗生物碱浓缩物的HPLC分析。
图4.实施例1获得的纯化加兰他敏的HPLC分析。
图5.实施例1获得的盐酸加兰他敏的HPLC分析。
图6.实施例1获得的加兰他敏的碱的HPLC分析。
图7.实施例2获得的加兰他敏的碱的HPLC分析。
图8.实施例3获得的初级提取物的HPLC分析。
图9.实施例3获得的加兰他敏的碱的HPLC分析。
发明概述
在一个方面,本发明提供用以从所有已知产生加兰他敏的植物 大规模分离加兰他敏的粗放且有效的方法,所述植物为石蒜科植物, 例如雪花莲属、水仙属、雪片莲属和石蒜属的植物。所用的植物材 料可以是干燥的,例如干燥植物叶子或全部地上部分,或者是新鲜 的,例如粉碎的鳞茎和/或地上部分。
在另一个方面,本发明提供分离加兰他敏的方法,所述方法包 括用无机酸或有机酸的水溶液提取植物材料从而获得初级提取物, 将初级提取物中的有机化合物吸附到吸附剂上,用水洗涤吸附剂和 用水混溶性有机溶剂将有机化合物从吸附剂上洗脱下来,从而获得 生物碱类的浓缩物。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化生物碱类的浓缩物的方 法,所述方法包括使生物碱类的浓缩物中的生物碱类吸附在阳离子 交换聚合物树脂上,和用无机碱的水溶液将生物碱类从树脂上洗脱 下来,获得含水生物碱浓缩物。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化含水生物碱浓缩物的方 法,所述方法包括将含水生物碱浓缩物中的生物碱类萃取到与水不 混溶的有机溶剂中,和将萃取物浓缩获得粗生物碱浓缩物。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化粗生物碱浓缩物的方法, 所述方法包括用与水不混溶的有机溶剂作为流动相,在氧化铝上对 粗生物碱浓缩物进行色谱纯化获得加兰他敏级分,从而获得纯化的 加兰他敏。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化加兰他敏的方法,所述 方法包括将纯化的加兰他敏从合适的溶剂中结晶出来,获得纯化的 结晶加兰他敏。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化加兰他敏的方法,所述 方法包括将结晶加兰他敏从甲基异丁基酮或叔丁基甲基醚中重结 晶。
在另一个方面,本发明提供进一步纯化加兰他敏的方法,所述 方法包括将加兰他敏碱从盐酸加兰他敏中释放出来,和将其从甲基 异丁基酮或叔丁基甲基醚中结晶出来。
在另一个方面,本发明提供除去那维定(narwedine)的方法,即 用能够将那维定的羰基还原成仲醇基的合适还原剂还原那维定。
在另一个方面,本发明提供从所有上述类型的植物材料分离高 纯加兰他敏的方法。分离的加兰他敏的纯度超过80%优选超过90%, 甚至更优选超过99%。
在另一个方面,本发明提供不需使用高度有毒的溶剂或对环境 有害的溶剂例如氯化烃类来分离基本纯的加兰他敏的方法。
发明详述
本发明提供从生物质分离高纯度加兰他敏的方法。生物质这个 术语指能产生加兰他敏的植物的干燥或新鲜部分,所述植物为石蒜 科植物,例如雪花莲属、水仙属、雪片莲属和石蒜属的植物。所述 方法由几个连续步骤组成,这些步骤经设计能使分离过程的效率和 除去不需要的生物碱类的能力最优化,不需要的生物碱类存在于植 物材料中,必须将其认为是加兰他敏的潜在杂质。对各个步骤进行 设计,以避免使用有毒的溶剂或对环境有害的溶剂如氯代烃类和低 沸点溶剂如二乙醚、丙酮和石油醚。各个步骤的顺序经设计能使总 体过程有效率。
分离过程的第一步是生物质的提取。实验发现无机酸或有机酸 的稀水溶液是提取植物材料的极好手段。与使用有机溶液的现知方 法对比,水提取法具有以下几个优点:1)不必在提取前将植物材料碱 化,这从提取方法中省去一个机械操作(如美国专利第5,877,172号中 所述的将植物材料与粉末化碳酸钠混合);2)当提取溶剂是水时,对 环境的影响减至最低;3)不必从被提取材料中除去溶剂,这从提取方 法中再省去一个操作(废生物质的干燥);4)还省去了所用溶剂的回收 过程。从提取效率和选择性方面来看,选择使用何种酸并不重要。 酸的选择决定于其价格、处理和对所用设备(如有的话)的腐蚀的影 响。使用浓度为约0.1%(w/w)的磷酸有利。当要提取新鲜的植物材 料例如鳞茎时,采用生物质水提取法的另一个优点显现。由于这种 材料含有很多水,用与水不混溶的有机溶剂来提取将会达不到预期 目标。
生物质的提取可通过不同的方式来实现,不过使用一组渗滤器 会非常方便。使用渗滤器组能使初级提取物的体积减至最低。实施 例1证明从1kg的鳞茎只获得约1.5l的初级提取物。不过,当使干 燥生物质在渗滤器组上进行提取时,由于被提取材料的堆密度低和 渗滤器中死体积大,初级提取物的体积还是大得多。另一方面,如 实施例3(使用15∶1(v/w)的初级提取物与干燥植物材料之提取比达到 定量提取)所证明,干燥材料当在渗滤器组上提取时不需要进行粉碎。
分离过程的下一个操作是将初级提取物中存在的有机化合物吸 附在吸附剂上。实验发现非离子聚合物树脂对此目的来说是非常适 合的吸附剂。实验还发现,在初级提取物中以盐形式存在的生物碱 类必须通过加入一些无机碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)将其转化成碱 形式。然后生物碱类就非常有效地与初级提取物中存在的其它一些 中等极性有机化合物一起被吸附在树脂上。极性有机化合物如糖类 和无机化合物不被吸附,因此这个操作等于是一个重要的纯化步骤。 适合于吸附的聚合物树脂是任何任何聚(苯乙烯-二乙烯基苯)共聚 物。对于吸附的效率或选择性而言,树脂的颗粒大小分布和孔径大 小并不是关键参数。吸附可例如通过将树脂与碱化的初级提取物混 合来实现,不过最方便的是在填充在柱子中的树脂上的吸附。这样 可只将碱化的初级提取物荷载在柱子上,然后用水洗涤柱子,用可 与水混溶的有机溶剂或这种溶剂与水的混合物(便利的是用60%(v/v) 乙醇水溶液)洗脱生物碱类和其它有机化合物,获得生物碱类的浓缩 物。该浓缩物含有初级提取物中存在的所有生物碱类和其它一些有 机化合物。
使生物碱类的浓缩物进一步进行生物碱类在阳离子交换聚合物 树脂上的吸附。发现可将从非离子聚合物树脂洗脱获得的生物碱类 的浓缩物直接荷载在填充有阳离子交换剂的柱子上。虽然成功使用 了几种类型的阳离子交换剂,但最佳结果是用凝胶类型的强酸性阳 离子交换树脂获得的,该树脂是用不超过4%的二乙烯基苯交联的聚 磺酸化(苯乙烯-二乙烯基苯)共聚物。使用这种类型的阳离子交换树 脂,生物碱类被定量保留,而浓缩物中存在的其它有机化合物则被 除去。然后通过用合适无机碱的水溶液(便利的是稀释的氨水)进行洗 脱,将生物碱类从柱子上解吸下来,从而获得含水生物碱浓缩物。
在有机化合物的浓缩物中生物碱类之外的有机化合物含量低的 情况下,生物碱类在阳离子交换剂上的吸附可省略。这种情况在实 施例3中说明。这样可将从非离子聚合物树脂洗脱获得的生物碱类 的浓缩物进行浓缩以除去有机溶剂,残余水溶液可通过加入氨水进 行碱化,按这种方式获得的含水生物碱浓缩物可与从阳离子交换剂 洗脱获得的含水浓缩物一样,按类似的方式进行下一步纯化。
将加兰他敏和其它亲脂性生物碱类进一步从水溶液萃取到有机 溶剂中。然后将萃取物浓缩,所获得的粗生物碱浓缩物进一步在氧 化铝上进行色谱纯化。任何与水不混溶的溶剂(除脂族烃外)都可用于 从含水浓缩物提取生物碱类,但优选的溶剂是甲苯、甲基异丁基酮 和/或一些乙酸酯例如乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯和乙酸异丁 酯。使用它们的优点在于这个事实,即可用相同的溶剂对粗生物碱 浓缩物进行氧化铝色谱纯化,使得不同溶剂的混合减至最少,溶剂 回收非常简单。
粗生物碱浓缩物的色谱纯化是能够分离出单独生物碱的第一个 操作。特别是如实施例1所说明的(比较图3和图4),主要存在于从 水仙属植物获得的浓缩物的heamanthamine可通过这个操作得到有效 分离。上述溶剂使得能够以无梯度方式进行加兰他敏与heamanthamine 和其它一些生物碱类的色谱分离,这对于大规模制备是非常方便的。 加兰他敏作为主要级分(纯化的加兰他敏)从色谱柱洗脱出来,而其它 一些生物碱类(主要是heamanthamine)则被捕获在柱子上。纯化的加 兰他敏的组成达到了能通过结晶以特别高的得率获得相对较纯的加 兰他敏的地步。加兰他敏从纯化的加兰他敏的结晶可通过两种方式 实现:作为与盐酸所成的盐或者作为碱。虽然加兰他敏的盐的结晶 能得出非常高的结晶产物得率,但它对产物纯度的效果仅为中等。 意外发现,加兰他敏的碱能从一些在文献中未提到的溶剂例如甲基 异丁基酮或叔丁基甲基醚结晶出来。从这些溶剂的结晶能非常有效 地除去大多数的潜在杂质。如实施例1所述的以下两种可能操作的 组合非常有效:将盐酸加兰他敏结晶然后再释放出加兰他敏碱和将 加兰他敏碱结晶。虽然分离过程中涉及到两个结晶步骤,但累积得 率惊人地高,且两个不同结晶步骤的组合产生出纯度高于99%的加 兰他敏。
如实施例1和3所说明,氧化铝色谱和结晶操作的组合使得有 可能除去大部分的潜在杂质,例外的是N-去甲加兰他敏和那维定。 那维定这种加兰他敏生物合成前体物往往存在于用来分离加兰他敏 的植物材料中。它通过如上所述的简单氧化铝色谱几乎不被除去, 通过结晶只被部分除去。本发明的另一公开内容使得有可能将那维 定从加兰他敏除去。发现含有超过约0.5%那维定的结晶加兰他敏可 通过将那维定还原来纯化,所使用的还原剂能够将那维定的羰基还 原,从而提供加兰他敏的仲醇基或表加兰他敏。这种还原可通过多 种还原剂来实现,但特别方便的是使用硼氢化钠。将含有那维定的 盐酸加兰他敏溶于水中,加入少量的硼氢化钠。如实施例2所说明, 从这种反应混合物分离的加兰他敏几乎不含有任何那维定。
本发明的方法能够从所有上述植物材料分离高纯度的加兰他 敏。产物的纯度取决于所用的植物材料,但从未低于99%,在一些 情况下,分离的加兰他敏的纯度甚至超过99.5%。而且本发明方法的 得率非常高,如实施例1和3所说明通常超过计算量的80%。
本发明在以下实施例中进行描述。
实施例
以下实施例意在说明而不是限制本发明。
实施例1
从水仙的鳞茎分离盐酸加兰他敏:
将含有0.12%加兰他敏(HPLC测定)的水仙(Narcissus pseudonarcissus“Carlton”)的鳞茎粉碎,加料到中试渗滤器组4×100l (一个提取器加入75kg的粉碎鳞茎)中。将加了料的各个提取器连接 成组,用0.1%(w/w)磷酸水溶液以逆流方式提取。从一个提取器获 得125l的初级提取物。图2给出了初级提取物的HPLC分析记录结 果。将来自一个提取器的初级提取物用10%氢氧化钾水溶液碱化至pH 9-10,并将溶液荷载到填充有非离子树脂SP-825L的60l柱子上。 接着用100l的水洗涤柱子,用60%(v/v)乙醇水溶液进行洗脱以将有 机化合物从树脂上解吸下来,获得220l的生物碱类的浓缩物。将此 浓缩物再荷载在含有阳离子交换树脂SK 104的3l柱子上,所有的 生物碱类都被吸附。用水洗涤该柱子,用0.5%(w/w)氨水将生物碱 类从柱子上洗脱下来,获得30l的含水生物碱浓缩物。
将含水生物碱浓缩物用30l的甲基异丁基酮萃取,萃取物蒸发 获得约1升的粗生物碱浓缩物。根据HPLC分析,该浓缩物含有45.8% (干燥)的加兰他敏——HPLC记录结果在图3中给出。用甲基异丁基 酮作为流动相,使该浓缩物在含有2kg碱性氧化铝的柱子上进行色 谱分离。将含有加兰他敏的级分(经TLC检测)集中并浓缩,获得134g 的干残余物(纯化的加兰他敏)。其HPLC分析结果在图4中给出。将 纯化的加兰他敏溶于450ml乙醇中,加入浓盐酸将溶液的pH调至 约4。将结晶盐酸加兰他敏的悬浮液在冰箱中冷却,然后滤出结晶产 物,用100ml乙醇洗涤并干燥,获得106g的盐酸加兰他敏。其HPLC 分析结果在图5中给出。
将30g的以上制备的盐酸加兰他敏溶于50ml的热水中,向溶 液中加入12ml的氨水。通过过滤分离出加兰他敏的结晶碱并干燥。 将干燥的加兰他敏碱从100ml的甲基异丁基酮重结晶,获得21.9g 的加兰他敏,其纯度经HPLC测定为99.4%(HPLC记录结果在图6 中给出)。未算从母液所作的第二次回收,到该加兰他敏碱为止,过 程得率达理论得率的85.0%。
实施例2
盐酸加兰他敏的纯化
将根据HPLC分析含有1.1%那维定的实施例1制备的30g盐酸 加兰他敏溶于120ml的水中,在约30分钟内搅拌下分六批加入1.2g 的硼氢化钠。将溶液在实验室温度下再搅拌30分钟,然后向溶液加 入12ml的25%(w/w)氨水和200ml的甲基异丁基酮。分离有机相, 浓缩至体积约100ml,放在冰箱中让其结晶24小时。通过过滤分离 出加兰他敏的结晶碱并干燥,获得19.3g的加兰他敏,其纯度经HPLC 测定为99.7%,那维定的含量为0.04%(HPLC记录结果在图7中给 出)。
实施例3
从夏雪片莲(Leucojum aestivum,L.)的干叶分离加兰他敏(碱):
将40kg的含有0.26%加兰他敏(HPLC测定)的夏雪片莲 (Leucojum aestivum,L.)干叶粉碎,加到中试渗滤器组4×100l(一个 提取器加入10kg的粉碎叶)中。将加了料的各个提取器连接成组, 用0.1%(w/w)磷酸水溶液以逆流方式提取。从一个提取器获得150l 的初级提取物。图8给出了初级提取物的HPLC分析记录结果。将 来自一个提取器的初级提取物直接吸附在60L的充入柱子中的非离 子树脂SP-825L上,用100l的水洗涤,用90%(v/v)的乙醇水溶液(200 l)然后是50l的水解吸,获得生物碱类的浓缩物。
将从所有四个提取器获得的生物碱类的浓缩物合并,蒸发至体 积为75l,用水稀释至最终体积为300l,加入氨水调节溶液的pH至 约10,获得含水生物碱浓缩物。将该浓缩物在连续逆流提取器中用 200l的甲基异丁基酮进行萃取。将所得的萃取物蒸发至体积为约1000 l,荷载在填充有1000g碱性氧化铝的柱子上。用甲基异丁基酮洗脱 该柱,将含有加兰他敏(经TLC检测)的级分集中并蒸发至干,获得 112.5g的残余物(纯化的加兰他敏)。将残余物从340ml的叔丁基甲 基醚重结晶,获得83.6g的加兰他敏,其纯度经HPLC测定为99.0% (HPLC记录结果在图9中给出)。未算从母液所作的第二次回收,该 过程的得率达理论得率的80.0%。
本发明的方法还可适合加兰他敏衍生物。虽然就本发明的某些 具体实施方案描述和说明了本发明,但本领域技术人员会认识到, 可不偏离本发明的精神和范围,对各个程序和方案作出各种改编、 变化、修改、替换、删除或添加。因此,本发明由所附权利要求书 的范围限定,且这个权利要求书应尽其合理性作宽泛的解释。