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1. CN1820020 - SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use

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SARS-冠状病毒病毒样颗粒以及应用方法


发明领域
本发明涉及生物技术和医药领域。具体地，本发明涉及SARS-冠状病毒样颗粒，生产这些颗粒的方法以及利用这些颗粒诱导免疫反应的方法。
背景技术
SARS冠状病毒(SARS-CoV)的爆发近来引起世界范围内大量的死亡，特别是在中国、加拿大和越南。致死性一般是由进行性呼吸衰竭引发的，它在高达大约10％的全部SARS病例中发生。目前，对于SARS没有治疗方法并且没有减小与此疾病相关联的死亡率的手段。此外，没有可靠地预防SARS感染的手段也没有任何减弱与这种感染相关联的症状的手段。考虑到SARS的重大影响以及缺乏适当的治疗方法，非常需要改善这种疾病效应的组合物和/或方法。
发明概述
本发明的一些实施方案涉及在体外和体内于诸如人细胞的细胞中表达SARS-CoV膜相关蛋白M，E和S的系统，如重组质粒、病毒和原核生物。在一些实施方案中，SARS-CoV M，E和S蛋白自发地形成SARS-CoV-病毒样颗粒(SARS-CoV-VLPs)。在这些实施方案中，SARS-CoV-VLPs可以由细胞分泌。
根据本发明的其它实施方案，它们的“天然”环境中呈现病毒蛋白质的SARS-CoV M，E和S蛋白的细胞内表达及其与形成病毒样颗粒的关联引发了免疫反应的诱导。由此，本发明的某些实施方案涉及通过鉴定有发展SARS的危险的受试者并向所述受试者施用一种或多种能够表达SARS-CoV M，E和/或S多肽的遗传构建体来在动物，如人和其它哺乳动物中产生免疫反应的方法。在一些实施方案中，一种或多种遗传构建体表达SARS-CoV M，E和S多肽，其自发形成SARS-CoV-VLPs。在一个优选的实施方案中，强烈的抗体反应以及强烈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答都得以诱导。在其它的实施方案中，只有抗体反应或CTL反应的其中一种得以诱导。
本发明的一些实施方案涉及SARS-CoV-VLPs以及产生这些颗粒的方法。其它的实施方案涉及向动物，如人或其它哺乳动物施用SARS-CoV-VLPs，从而在动物体内产生免疫应答。
在本发明的一些实施方案中，产生的VLPs包含选自SEQ ID NOs：2-5或其部分的E蛋白。在其它的实施方案中，产生的VLPs包含选自SEQ IDNOs：6-9或其部分的M蛋白。仍然在其它的实施方案中，产生的VLPs包含选自SEQ ID NOs：10-13或其部分的S蛋白。E蛋白的部分可以包括至少大约6个连续氨基酸，至少大约7个连续氨基酸，至少大约8个连续氨基酸，至少大约9个连续氨基酸，至少大约10个连续氨基酸，至少大约11个连续氨基酸，至少大约12个连续氨基酸，至少大约13个连续氨基酸，至少大约14个连续氨基酸，至少大约15个连续氨基酸，至少大约16个连续氨基酸，至少大约17个连续氨基酸，至少大约18个连续氨基酸，至少大约19个连续氨基酸，至少大约20个连续氨基酸，至少大约25个连续氨基酸，至少大约30个连续氨基酸，至少大约40个连续氨基酸，至少大约50个连续氨基酸，至少大约60个连续氨基酸，至少大约70个连续氨基酸或大于70个氨基酸。M蛋白的部分可以包括至少大约6个连续氨基酸，至少大约7个连续氨基酸，至少大约8个连续氨基酸，至少大约9个连续氨基酸，至少大约10个连续氨基酸，至少大约11个连续氨基酸，至少大约12个连续氨基酸，至少大约13个连续氨基酸，至少大约14个连续氨基酸，至少大约15个连续氨基酸，至少大约16个连续氨基酸，至少大约17个连续氨基酸，至少大约18个连续氨基酸，至少大约19个连续氨基酸，至少大约20个连续氨基酸，至少大约25个连续氨基酸，至少大约30个连续氨基酸，至少大约40个连续氨基酸，至少大约50个连续氨基酸，至少大约60个连续氨基酸，至少大约70个连续氨基酸，至少大约80个连续氨基酸，至少大约90个连续氨基酸，至少大约100个连续氨基酸，至少大约120个连续氨基酸，至少大约140个连续氨基酸，至少大约160个连续氨基酸，至少大约180个连续氨基酸，至少大约200个连续氨基酸，或大于200个连续氨基酸。S蛋白的部分可以包括至少大约6个连续氨基酸，至少大约7个连续氨基酸，至少大约8个连续氨基酸，至少大约9个连续氨基酸，至少大约10个连续氨基酸，至少大约11个连续氨基酸，至少大约12个连续氨基酸，至少大约13个连续氨基酸，至少大约14个连续氨基酸，至少大约15个连续氨基酸，至少大约16个连续氨基酸，至少大约17个连续氨基酸，至少大约18个连续氨基酸，至少大约19个连续氨基酸，至少大约20个连续氨基酸，至少大约25个连续氨基酸，至少大约30个连续氨基酸，至少大约40个连续氨基酸，至少大约50个连续氨基酸，至少大约60个连续氨基酸，至少大约70个连续氨基酸，至少大约80个连续氨基酸，至少大约90个连续氨基酸，至少大约100个连续氨基酸，至少大约120个连续氨基酸，至少大约140个连续氨基酸，至少大约160个连续氨基酸，至少大约180个连续氨基酸，至少大约200个连续氨基酸，至少大约250个连续氨基酸，至少大约300个连续氨基酸，至少大约350个连续氨基酸，至少大约400个连续氨基酸，至少大约450个连续氨基酸，至少大约500个连续氨基酸，至少大约550个连续氨基酸，至少大约600个连续氨基酸，至少大约650个连续氨基酸，至少大约700个连续氨基酸，至少大约750个连续氨基酸，至少大约800个连续氨基酸，至少大约850个连续氨基酸，至少大约900个连续氨基酸，至少大约950个连续氨基酸，至少大约1000个连续氨基酸，至少大约1050个连续氨基酸，至少大约1100个连续氨基酸，至少大约1150个连续氨基酸，至少大约1200个连续氨基酸，至少大约1250个连续氨基酸或大于1250个连续氨基酸。
本文所述的系统和方法可用于减弱SARS-CoV感染的症状。
在下列标号的段落中提供本发明的其它方面：
1.一种制备SARS-CoV病毒样颗粒(SARS-CoV-VLPs)的系统，其包含一种或多种表达SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白的重组载体。
2.权利要求1的系统，其中所述SARS-CoV E蛋白，所述SARS-CoV M蛋白和所述SARS-CoV S蛋白由单个重组载体表达。
3.权利要求1的系统，其中所述SARS-CoV E蛋白，所述SARS-CoV M蛋白，和所述SARS-CoV S蛋白由多个重组载体表达。
4.权利要求1的系统，其中所述一种或多种重组载体包含质粒。
5.权利要求1的系统，其中所述一种或多种重组载体包含重组病毒。
6.权利要求5的系统，其中所述重组病毒是麻疹病毒。
7.一种细胞，其已被改造为表达SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白。
8.权利要求7的细胞，其中所述细胞是活的。
9.权利要求8的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
10.权利要求9的细胞，其中所述细胞是其致病性已经被减弱的细菌细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述细胞是沙门氏菌(Salmonella)细胞。
12.一种诱导免疫反应的方法，包括向受试者施用一种或多种表达SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白的重组载体。
13.权利要求12的方法，其中所述SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白由单个重组载体表达。
14.权利要求12的方法，其中所述SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白由多个重组载体表达。
15.权利要求12的方法，其中所述一种或多种重组载体包含质粒。
16.权利要求12的方法，其中所述一种或多种重组载体包含病毒。
17.权利要求12的方法，其中所述一种或多种重组载体包含原核载体。
18.权利要求12的方法，其中所述受试者是人。
19.权利要求18的方法，其中所述免疫应答是细胞免疫应答。
20.权利要求18的方法，其中所述免疫应答是体液免疫应答。
21.权利要求18的方法，其中所述免疫应答是细胞免疫应答和体液免疫应答。
22.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括向所述受试者施用SARS-CoV-VLPs。
23.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括向所述受试者施用编码SARS-CoV E蛋白、SARS-CoV M蛋白和SARS-CoV S蛋白的核酸。
24.一种SARS-CoV-VLP。
25.一种分离的权利要求24的SARS-CoV-VLP。
附图简述
图1描绘了冠状病毒的图示。基因组RNA被核壳蛋白N所包裹。膜蛋白M，刺突(spike)蛋白S和E蛋白被包埋于脂双层中。几种冠状病毒还包含第四种包膜蛋白，血凝素酯酶蛋白HE(未显示)。
图2显示冠状病毒的基因组组构。显示了由MHV、HCV 229E、IBV和SARS-CoV的基因组RNA编码的主要可读框。将编码整合包膜蛋白S，M，和E的基因显示为闭合的盒。
图3描述冠状病毒基因表达。表达了共终端(coterminal)嵌套集合的mRNAs。仅有没有被包含在下一个较小mRNA的mRNA的独特区域在翻译上是有活性的。将编码整合包膜蛋白S，M，和E的基因显示为闭合的盒。
图4A描述了来自四个SARS-CoV分离株：Tor2，Urbani，HKU-39849和CUHK-W1中的E蛋白氨基酸序列的比对。
图4B描述了来自四个SARS-CoV分离株：Tor2，Urbani，HKU-39849和CUHK-W1中的M蛋白氨基酸序列的比对。突出部分(Highlighting)显示在四个分离株的每个之间都不相同的残基。
图4C描述了来自四个SARS-CoV分离株：Tor2，Urbani，HKU-39849和CUHK-W1中的S蛋白氨基酸序列的比对。突出部分(Highlighting)显示在四个分离株的每个之间都不相同的残基。
图5描述在转染在于真核生物启动子控制下携带有关基因的质粒后，被转染的组织培养细胞产生SARS-CoV蛋白。
图6描述在用在真核生物启动子控制下携带有关基因的重组病毒感染后，组织培养细胞产生SARS-CoV蛋白。
图7描述在加入携带在真核启动子控制下的SARS-CoV S-，M-和E-基因的原核载体后，组织培养细胞产生SARS-CoV蛋白。
图8描述在SARS-CoV S-，M-和E-基因表达后，组织培养细胞产生SARS-CoV样颗粒。将所述颗粒释放到组织培养上清液中。
图9以图表举例说明没有用Triton-X100(无)处理的完好病毒颗粒的密度梯度离心以及溶解的蛋白(Triton-X100)在蔗糖梯度中的迁移的结果。
发明详述
本发明的一些方面提供表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)M，E和S基因的产物的传递载体。所述传递载体可以是适合于此目的的任何类型的载体。例如，载体可以是质粒载体、病毒载体或原核载体。所述载体在体内产生SARS-CoV-病毒样颗粒(SARS-CoV-VLPs)并可包含任何如下：
a.携带所有三个基因(M，E，和S的)的一种载体，或
b.两种载体，一种携带任何两个前述基因的组合，另一个携带前述基因的其中之一，或
c.三种载体，每种携带前述基因的其中之一。
SARS-CoV-样颗粒有效用于在没有发生疾病或SARS相关症状的动物中刺激免疫应答。
可通过刺激细胞和/或体液免疫系统获得针对冠状病毒关联的传染病的有效宿主防御。在一个实施方案中，本文公开的系统将由于病毒抗原的胞内表达和通过释放作为病毒样颗粒(VLPs)组分的天然包膜蛋白产生高效抗体而刺激T细胞应答。在另一个实施方案中，所述抗原将在黏膜位点，诸如肺产生和存在。
可将VLPs用于在所需的宿主，诸如人中诱导免疫应答。尽管充分保护性的免疫应答是理想的，将理解的是不具充分保护性的免疫应答也是有益的。因此，本发明意欲诱导充分保护性的免疫应答以及非充分保护性的免疫应答。
在本发明的一些实施方案中，使用SARS冠状病毒的基因或多肽制备SARS-CoV-VLPs。例如，本发明的一个实施方案意欲应用载体来表达足够产生VLPs的SARS-CoV M，E和S基因或其部分。用于这种表达的载体的实例是适合于编码蛋白在合适细胞类型中的有效表达的任何载体。这些载体可包括，但不限于，质粒载体、病毒载体和原核载体。所谓“原核载体”指一种微生物，其包含具有编码一种或多种的SARS-CoV-相关颗粒的一种或多种基因的一种或多种质粒。应用这些载体的合适的细胞类型来自人和其它哺乳动物。
在本发明的一些实施方案中，使用将DNA转移到细胞，诸如人细胞中的合适传递系统。例如，在一个实施方案中，可皮内传递裸DNA。在另一个实施方案中，传递系统可将所有三个基因传递到肺细胞中以在感染位点诱导黏膜免疫性。使用单一质粒，多个质粒或其它能一次转移数个基因的其它系统，如原核或病毒基因传递系统可传递基因。
在本发明的一些实施方案中，所述SARS-CoV基因，M，E和S表达自提供给组织培养物的载体。在一些实施方案中，将所述SARS-CoV M，E和S蛋白质与自组织培养物细胞释放的VLPs结合。在某些实施方案中，表达自本发明公开的载体的SARS-CoV-VLPs当在体内表达时，诱导体液和/或细胞免疫应答。
在本发明的其它实施方案中，分离了产自细胞培养物的SARS-CoV-VLPs，将其配制成免疫原并施用给有风险被SARS感染的受试者由此诱导受试者的体液和/或细胞免疫应答。
冠状病毒分类
冠状病毒是nidovirales的成员，nidovirales是在第10次国际病毒大会上确定的目(order)(Jerusalem，1996)。所述目由冠状病毒科(coronaviridae)和arteriviridae科，正链RNA病毒组成，它们被归于相同的目是因为它们在基因组组构上的相似性和它们相似的复制策略。冠状病毒以它们在电子显微镜下类似于corona solis的由伸出病毒体表面的大的刺突蛋白造成的特征外观命名。
冠状病毒感染包括人的多种哺乳动物，主要造成呼吸或肠感染。表1中给出了聚簇在至少三个独特抗原组中的冠状病毒的实例以及它们各自的宿主。最近的研究显示SARS冠状病毒可能是II型冠状病毒组的成员。
表1：冠状病毒和它们的宿主
组      宿主  名称                    首字母缩略词    疾病
I       小鼠  小鼠肝炎病毒            MHV            肝炎/脑炎/肠的
        牛    牛冠状病毒              BCV            肠炎
        人    人冠状病毒OC43          HCoV OV43      肠炎
        猪    猪血凝脑脊髓炎          HEV            呼吸感染
              (encephalomyelitis)病毒
        大鼠  大鼠冠状病毒            RCV            呼吸感染
        火鸡  火鸡冠状病毒            TCV            呼吸感染
II      狗    犬冠状病毒              CCV            肠炎
        猫    猫感染性腹膜炎病毒      FIPV           呼吸感染
        猫    猫肠冠状病毒            FECV           肠炎
        人    人冠状病毒229E          HCoV 229E      呼吸感染
        猪    猪传染性腹泻病毒        PEDV           肠炎
              猪可传递的胃肠炎
        猪    病毒                    TGEV           肠炎
        火鸡  火鸡冠状病毒            TCV            呼吸感染
III     鸡    禽类感染性支气管病毒    IBV            呼吸感染
未指定  人    严重的急性呼吸症状冠    SARS CoV       呼吸感染
的            状病毒
冠状病毒结构
冠状病毒是有包膜的病毒。病毒体是80-200nm的多形颗粒并且宿主细胞起源的脂双层环绕被核壳蛋白包裹的基因组RNA。来自早期研究的证据显示冠状病毒核壳体的包装形式是螺旋状的(MacNaughton等，1978)。然而，出现的较新的数据显示，在更高等级，核壳体被包装在病毒体中的二十面形式中(Risco等，1996)。将冠状病毒体的图表形式显示于图1中。
除核壳体结构之外，冠状病毒包含其它的各种结构多肽。例如，冠状病毒包含三重跨膜M蛋白(20-25kD)，其是最丰富的包膜蛋白。另一个结构蛋白是刺突蛋白，S(180kD)，其在病毒体表面上形成包膜粒。S结合于冠状病毒受体并诱导细胞-细胞融合和病毒-细胞融合以及中和抗体。最近，发现小的包膜蛋白，E是病毒体的部分(Liu和Inglis，1991)。所述E蛋白似乎对于病毒的装配是必需的(Venemma等，1996)。上述结构特点的每个在图1中有所描述。
冠状病毒基因组组构
冠状病毒的基因组RNA涵盖27-32kB。5′的2/3的基因组编码在两个大的重叠可读框中的复制酶基因。结构蛋白S，M，E和N由基因组的3′末端编码(见图2)。另外，存在散布于结构基因之间的几个小的可读框(ORFs)。然而，一直不清楚ORFs是否和怎样进行表达的，也一直不清楚这些可读框的作用。已经有了一些关于这些小ORFs在病毒发病机理中可能起的一些作用的推测。
冠状病毒复制和基因表达
感染后，冠状病毒RNA被翻译从而产生由重叠的可读框1a和1b编码的依赖RNA的RNA聚合酶。后者ORF仅在(-1)核糖体移码事件发生后被表达，所述移码事件以多至约30％的频率发生。由于冠状病毒基因组是正极性的，负链RNA的合成在复制周期中的下一步发生。负链RNA依次充当新的正链基因组RNA的模板。除了复制酶基因的所有基因翻译自在嵌套集合的3′-共末端mRNAs，其在5-末端包含独特区域并包括一种或多种ORFs，所述独特区域不被包括在下一个较小mRNA中。通常，冠状病毒基因组包括在每个可读框之前的转录相关序列(TAS)元件。图3显示使用HCV 229E作为实例的典型的冠状病毒基因组组构。对于HCV 229E，TAS是UCUAAACU(SEQ ID NO：1)。
膜相关的冠状病毒结构蛋白M，E和S
M蛋白质
所述M蛋白是冠状病毒病毒体中的最丰富的膜蛋白。该蛋白跨越病毒膜三次从而使N-末端位于病毒体的外部而C-端位于内部(Armstrong等1984，Rottier等，1986)。M具有约100个氨基酸的可能包埋在膜中的长胞质尾区。大多数冠状病毒的M蛋白是N-或O-糖基化的。
所述M蛋白对于病毒体形成来说是必需的(Holmes等，1981，Rottier等，1981)。例如，在M和S之间的相互作用对于包膜粒插入病毒体是重要的(Opstelten等，1994，1995)。另外，M和N之间的相互作用可能对于将核心结合入芽殖病毒体是必需的(Sturman等，1980)。
小的膜蛋白E
直到20世纪90年代初期，才认为约为10kD的小膜蛋白E是结构蛋白质(Liu和Inglis，1991)。E是高度疏水的膜蛋白但在C-末端包含许多带电的残基。在TGEV中，已显示该蛋白的C-末端位于膜的外部(Godet等，1992)。E似乎既没有被糖基化也没有被磷酸化。尽管，清楚的是E蛋白是对病毒体装配而言重要的蛋白(Vennema等，1996)，其在该过程中的确定功能留待阐明。
S蛋白质
冠状病毒的刺突蛋白是1100-1450个氨基酸的I型糖蛋白。将一些冠状病毒的S蛋白以蛋白水解的方式裂解成为两个亚基，S1和S2。然而，对该裂解的作用留待阐明。比较不同冠状病毒的刺突蛋白序列显示S2亚基比S1亚基更为保守(Cavanagh，1995)。预期在蛋白质N-末端的信号序列，预期蛋白质在ER中膜转位后被裂解。多至35个潜在N-糖基化位点存在于刺突蛋白的胞外结构域中，但是没有检测到明显的融合蛋白。已经鉴定了接近于刺突蛋白的羧基端的跨膜的锚。
将MHV A59用作实例，描述了冠状病毒刺突蛋白的成熟和转运。首先，将刺突蛋白合成为120kD的被在共翻译上糖基化的蛋白质(Niemann和Klenk，1981)。另外，将在胞外结构域中的42个半胱氨酸残基中的一些形成链内的二硫键(Luytyes等，1987)。S单体在可能涉及某些七残基重复序列区域的ER中缓慢寡聚化(Venemma等，1990；Delmas和Laude等，1990)。在寡聚化之前，S蛋白质中的一些与ER中的单体的M蛋白质相互作用，这是后来到病毒体的结合的首要必备条件(Opstelten等，1993，1994)。正确折叠后，刺突蛋白迁移到中间区室，在其中它们被棕榈酰化。中间区室正是芽殖位点(Tooze等，1987)。由于M和E独立地足够于病毒的包膜装配(Venemma等，1996)，仅有已经与M结合的S蛋白质被插入芽殖的病毒中(Opstelten等，1994，1995)。装配的病毒体使用组成性途径的小泡到达被感染的细胞的表面(Tooze等，1987)。当小泡与膜融合时，小泡的内容物被释放。
S蛋白质是宿主细胞向性的主要决定子。除了负责病毒包膜和细胞膜之间的融合以外，S是被病毒受体识别的病毒蛋白质，例如，在HCoV 229E情形中的hCD13(氨肽酶N)。
流行病学和发病机理
使用人呼吸道和猪肠道冠状病毒作为实例在下面描述了冠状病毒的流行病学和发病机理。在上世纪60年代初，于美国和英国，已首次将人冠状病毒描述为急性呼吸道疾病的原因。在1965年，Tyrell等从患有感冒的一个男孩的鼻灌洗液中分离到人冠状病毒株B814。一年后，在芝加哥，菌株229E适应于在组织培养物中生长(Hamre和Prochnow，1966)。在1967年，Macintosh等分离了一系列仅可在器官培养物中复制的毒株。在这些毒株中，HCV OC43和HCV 229E，现今被认为是人冠状病毒的两个在血清学上独立的群体的原型。
在对冠状病毒流行病学的一系列临床研究中，已经显示超过20％的所有急性呼吸道疾病是由冠状病毒引起的(Cavallaro和Monto，1970；Macnaughton等，1983)。与鼻病毒、腺病毒和副黏病毒一起，它们是该类疾病的最主要的原因。通常人冠状病毒感染上呼吸道的上皮细胞。与感染关联的临床症状是头痛、发烧、咳嗽和打喷嚏。但是，已经报道了冠状病毒还可导致具有更严重症状的呼吸性疾病(Matsumoto和Kawana，1992)。主要的传递路径通过呼吸道分泌物的气溶胶或通过机械传递进行。而且，已经显示1类人冠状病毒的成员还与胃肠道疾病相关(Zhang等，1994)。再次感染在整个生命阶段中发生，显示频繁接种针对冠状病毒感染的疫苗可是有益的。
TGEV和PEDV对猪的感染可导致肉类生产工业中的严重问题。在Switzerland自1987年进行的免疫学研究揭示50％的具有急性肠道问题的动物对于PEDV是具有血清反应阳性的。而且，每群血清反应阳性的动物的百分比范围在17-100％(Hofmann和Wyler，1987)。感染的病毒主要通过被感染的动物的粪便进行传递。这些冠状病毒的致病作用很大程度上是由幼猪、饲养的猪和正在长肥的猪的腹泻引起的。感染的临床征象是有时呕吐和沮丧在先的水样腹泻。上皮细胞的感染和破坏导致了被感染动物的脱水。幼小动物的感染可导致它们的死亡。PED和TGE的非常相似的致病机制导致相同的免疫学状况。针对病毒感染的保护基于肠黏膜的免疫，其被局限于感染后的短期时间内。催乳免疫，但不是循环抗体对于未断奶的小猪具有保护性。现在不能获得将保护猪免于感染的疫苗。
针对冠状病毒感染的免疫应答
体液免疫应答的诱导
被MHV感染的小鼠产生主要针对S，但也针对M，E和N的抗体。一些直接针对S的单克隆抗体体外中和病毒，尽管逃避中和抗体的病毒突变株在组织培养物中形成(Grosse等1993)。Kolb等证明了在重组动物的奶中的抗体以及通过获得催乳免疫的天然发生的那些将保护传递到下一代。在哺乳动物中，被动免疫由作为免疫球蛋白G和分泌的免疫球蛋白A的被通过胎盘和奶传递到子代的中和抗体来提供。已经产生了携带编码抗体轻链和重链的转基因的小鼠，所述抗体能够中和鼠肝炎病毒(MHV-JHM)的向神经JHM毒株。MHV-JHM在小鼠和大鼠的敏感毒株中导致急性脑炎和急性及慢性脱髓鞘。衍生自不同转基因品系的奶的体外分析揭示在抗体表达和病毒中和活性之间的线性相关，说明重组抗体是鼠奶中MHV-JHM中和的主要决定子。
在以前的实验中，转基因的子代和对照小鼠被致死剂量的MHV-JHM攻击。由非转基因母兽(dam)哺乳的幼仔(litter)死于致命的脑炎，而由转基因母兽(dam)哺乳的幼仔(litter)被充分保护免于攻击，不管它们是否是转基因的。这些实验证明在转基因小鼠的奶中表达的单一中和抗体足以彻底保护未断奶的子代免于MHV-JHM-诱导的脑炎。
细胞免疫应答的诱导
在过去，已经有一些关于清除冠状病毒感染的细胞免疫应答的重要性的报道。最近，Seo等报道感染性支气管病毒(IBV)感染和相关疾病可通过免疫T淋巴细胞的被动转运大大改变。具体而言，将在感染后10天收集的淋巴细胞在用病毒攻击前转移给幼鸡。如通过呼吸性疾病和病毒量所确定的，同源T淋巴细胞的转移保护鸡免于攻击感染，而在接受了来自未被感染的鸡的MHC相容性淋巴细胞的鸡中没有观察到保护。在接受于富集的alphabeta淋巴细胞的细胞的鸡中，观察到病毒感染和疾病几乎被完全清除。相反，gammadelta T淋巴细胞的去除仅对于它们保护鸡的潜能具有极小影响。采用的富集的CD8(+)或CD4(+)T淋巴细胞的转移显示保护也是携带CD8的细胞的主要功能。这些结果说明具有CD8(+)抗原的alphabeta T淋巴细胞在保护鸡免于IBV感染中是重要的。
综合这些数据，刺激免疫系统的两臂从而保护宿主免于感染并在感染后清除病毒可是有益的。然而，将理解的是，有益的结果还可通过刺激免疫系统的仅一臂来获得。本发明的实施方案具体意欲刺激免疫系统的一个和/或两个臂的方法。
目前在兽医学中的疫苗方法
亚单位疫苗
编码导致猫感染性腹膜炎的冠状病毒的融合刺突蛋白的基因已经与牛痘病毒的基因组(Vennema等，1990)重组。该重组载体在小鼠中诱导刺突-蛋白质特异性，体外中和抗体。然而，当用重组病毒免疫小猫时，仅获得了低滴度的中和抗体。象这样，没有观察到保护。
在Venemma等的第二个报道中，对用FIPV膜(M)和核壳体(N)蛋白进行的相似的免疫进行评价。表达克隆基因的疫苗病毒重组体在被免疫的小猫中诱导抗体。用N蛋白质重组体进行的免疫对攻击的后果没有明显影响。但是，与对照组的8只小猫中有一只相比，用M蛋白重组体免疫的8只小猫中有三只在攻击后存活。然而，因为样本过少，这些数量没有统计学上的显著性。
减毒病毒
在1989年，Christianson等开发了温度敏感性(ts)FIPV毒株，其在31℃复制，而在39℃不复制。该毒株在组织培养物和同时发生的UV-照射中连续传99代后产生该毒株。由Pfizer在1991年将该ts毒株市场化为商品名为Primucell的FIPV疫苗。将所述疫苗通过鼻内途径进行传递并由于所述病毒是温度敏感性的，其在“冷”的上呼吸道中仅微弱复制。该减毒的毒株可能是最有效的冠状病毒疫苗；然而有大量报道指出与对照组相比，所述疫苗在被接种的组中没有减少FIPV感染的发生率。
灭活的病毒
在1984年，Cavanagh等报道了用蔗糖梯度纯化的IBV蛋白质接种鸡，然后用IBV攻击接种的鸟。尽管S-蛋白质导致抗体产生，其在将IBV保护/抗性给予被接种的鸡中是无效的，如通过它们对于典型IBV呼吸道感染的敏感性所证明的。
Rotavec Corona是包含灭活的牛轮状病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌F5(K99)的市场化的联合疫苗。按照标签，该产品不用于预防感染，而是用于诱导病毒释放。由于该产品不能用于预防感染，其作为疫苗的效率不是非常高。
在最近的领域研究中，Takamura等(2002)使用来自被感染的细胞的牛冠状病毒的抽提物给Holstein奶牛进行肌内接种。毫不令人惊奇的是，疫苗是(i)安全的且(ii)能够诱导抗体应答。然而，保护数据没有包括在研究报告中。
简而言之，看来灭活的病毒制剂似乎不是开发针对冠状病毒感染的有效预防措施的有前景的途径。本发明提供诱导针对SARS病毒的免疫应答的更有效的途径。
严重急性呼吸综合征(SARS)
从2002年末开始，在中华人民共和国的广东省报道了数百例未知病原的严重的非典型肺炎。在2003年2月和3月期间，于香港、越南和加拿大的患者中检测到相似的病例后，世界卫生组织(WHO)发布了全球性的对于被称为“严重急性呼吸综合征”(SARS)的疾病警报。到2003年4月末，世界上超过25个国家向WHO报告了超过4300个SARS病例和250个SARS-相关死亡。
SARS影响的严重性是可变的。对于这种疾病的培养时期通常是2-7天。感染的特征通常是发烧，几天后是干，非产生性的咳嗽和呼吸短促。死于进行性呼吸衰竭的死亡发生在约3％到几乎10％的病例中(Poutanen等，2003；Lee等，2003；Tsang等，2003)。当美国、加拿大、德国和香港的实验室从SARS患者中分离了新的冠状病毒(SARS-CoV)时，鉴定SARS爆发的病原学的尝试在2003年3月的第3周取得成功。不象其它的人冠状病毒，在非洲绿猴肾细胞株系中繁殖SARS-CoV是可能的。SARS-CoV感染的证据已经在全世界范围内的SARS患者中得以体现。在呼吸样本中已频繁检测到SARS-CoV RNA并且来自SARS患者的康复阶段的血清样品包含与SARS-CoV反应的抗体。有强烈的证据说明该新病毒在流行病学上与SARS的爆发有联系(Ksiazek等，2003；Peiris等，2003；Drosten等，2003)。最近已经报道了两个分离株的序列(Rota等，2003；Marra等，2003)。系统分析和序列比较显示了SARS-CoV与任何以前鉴定的冠状病毒都不接近。
减少SARS感染的影响的系统和方法
本发明的一些实施方案涉及将携带SARS-CoV M，E和S基因的载体应用于诱导免疫应答。在一个优选的实施方案中，所述载体诱导人免疫系统的两臂，体液和细胞部分的应答，但是仅诱导一臂的载体也是有益的并且在本发明的一些实施方案中具体涉及。本发明描述的免疫原制剂是安全的，因为危险的SARS-CoV没有机会能够从用于形成免疫原的基因中产生。在一些实施方案中，所述DNA被传递给人的细胞，其中SARS病毒蛋白被表达。产自SARS M，E和S基因的病毒蛋白质自发形成VLPs，其分泌自细胞，正如病毒在感染过程中被分泌。抗原的胞外存在诱导抗体应答的表达，因此有效制备SARS病毒感染的免疫系统。在一个实施方案中，免疫原性的SARS-CoV基因诱导细胞的免疫应答。
质粒载体
可用于产生SARS-CoV-VLPs的一种载体是质粒DNA。大量质粒适合于产生免疫原诸如SARS-CoV-VLPs。通常，用于产生免疫原的质粒具有用于产生抗原的DNA插入的克隆位点，质粒复制需要的DNA序列，在宿主细胞诸如细菌细胞中选择的标记基因，促进抗原在真核细胞中表达的启动子/增强子和多腺苷酸化信号。大量这种质粒是可商购的并且大多数具有一些或所有的共同特点。为了使染色体整合的可能性最小化，质粒DNA与人基因组中的序列的同源性优选地受限。抗原的表达可被任何合适的启动子或启动子/增强子组合所驱动。例如，在一些实施方案中，表达由巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的启动子/增强子或来自劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)的启动子所驱动。在一些实施方案中，可将卡那霉素抗性基因用于选择具有各自质粒DNA的大肠杆菌，但可使用任何合适的可选择标记。不推荐使用β-内酰胺抗生素，例如，氨苄青霉素因为在一些个体中有变态反应的报道。在一些载体中，在细菌宿主中的质粒DNA的复制由pMBl(ColE1)复制起点所调节；然而，可以使用任何合适的基本载体起点。
在本发明的一些实施方案中，可将已经被具体设计用于开发DNA疫苗的pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于表达SARS-CoV M，E和/或S多肽。pVAX1的构建与食物和药物的施用的各个规定(FDA，1996)一致。另外，该载体的小尺寸使其适合于对在一个构建体中的多个产生抗原的cDNAs进行亚克隆。
将理解的是，本发明不局限于pVAX1。可以使用其它载体，质粒和非质粒的。其它典型质粒载体包括，但不限于，Rapid VACC和pDNA-VACC(Nature Technology Corporation，Lincoln，NE)以及其它真核表达载体诸如pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(InternationalBiotechnologies，Inc.)，和pTDT1(ATCC，#31255)。
病毒载体
典型地，活的减毒RNA病毒对于激发免疫原应答的目的是高度有效的。非常成功的活的减毒RNA病毒载体包括，但不限于Sabin脊髓灰质炎病毒，Schwarz麻疹病毒(MV)和黄热病毒的17D毒株。将这些病毒用作疫苗已经导致了相应感染和它们相关病理学的大大减少。
出于接种疫苗的目的，减毒的RNA病毒具有长时间的安全性和有效记录。另外，这些载体易于产生、不贵并享有广泛范围的分布系统。当被用于产生免疫原性的应答时，在单一低剂量注射后，减毒的麻疹病毒诱导强的，寿命长的体液和细胞免疫性。MV基因组非常稳定并且从未观察到病毒逆转到病原状态。MV在细胞质中排外地复制，并因此其基因组从不整合在宿主DNA上。另外，已经建立了对应于MV的Edmonston和Schwarz/Moraten毒株的基因组的感染性cDNA克隆。已经建立了拯救相应病毒的程序(EMBO J.145773-5784，1995)。已将在长度上多至5kb的cDNA在这些载体中成功表达。因此，活的减毒的，重组MV病毒载体是用于在人群中激发针对麻疹和SARS二者的潜在良好的载体。
作为质粒DNA的备选，可将重组病毒用作载体来传递一种或多种目的SARS-CoV基因。例如，在本发明的一些实施方案中，使用重组麻疹病毒。可将如本文描述进行制备的克隆的cDNAs用于产生重组麻疹病毒。在本发明的一些实施方案中，重组病毒仅携带SARS-CoV cDNAs的其中之一。在其它的实施方案中，重组病毒携带编码M，S或E多肽的两个或多个cDNAs。
在本发明的一些实施方案中，将对应于SARS-CoV M，E或S基因的一种或多种的cDNAs克隆在麻疹病毒载体中，其代表麻疹病毒的基因组RNA的重组cDNA质粒形式。重组病毒可通过在组织培养物中的标准拯救实验(Takeda等，2000)产生自这些质粒。
将理解的是，本发明的基于病毒的实施方案并不局限于MV载体的应用。其它示范性病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒，和慢病毒载体。
原核载体
活的减毒细菌容许一种通过黏膜表面进行抗原传递和免疫原性刺激以及特异性靶向到在免疫系统的诱导性位点上的抗原呈递细胞的备选方法。一种方法利用将减毒的胞内细菌作为真核抗原表达载体的传递系统。候选载体细菌包括，但不限于，沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)和李斯特氏菌属(Listeria)种类的减毒菌株。这些种类中的某些成员已经在以前显示将编码免疫原性的抗原的DNA传递给人细胞。编码抗原的DNA的传递和免疫原性应答的产生已经在几种传染病和肿瘤的实验动物模型中证明是有效的。
为了有效，活的减毒的原核菌株应该在减毒作用和免疫原性之间维持平衡。这些菌株不导致任何疾病或削弱宿主的生理学并在同时能够在口服施用后定居在肠和消化道相关的淋巴组织或在通过一些其它途径施用后定居在其它淋巴器官中从而具有免疫原性。作为抗原载体，重组沙门氏菌已经显示在活疫苗中是特别有用的(对于综述，见，Curtiss等Essentials ofMusocal Immunology，Kagnoff和Kiyono，Eds.，Academic Press，San Diego，1996，pp.599-611；Doggett和Brown，Mucosal Vaccines，Kiyono等，Eds.，Academic Press，San Diego，1996pp 105-118；还见Hopkins等Infect Immun.63：3279-3286，1995；Srinavasin等Vaccines 95，R.N.Chanock等，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.，p 273-280，1995)。当被用作重组抗原传递媒介时，已经将伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的减毒菌株用作针对伤寒症以及针对异种抗原的人疫苗。(Forrest，CRC PressInc.，1994，pp.59-80；Levine等，New Generation Vaccines Woodrow andLevine，Eds.，Marcel Decker，Inc.，New York，1990，pp.269-287)。
在本发明的一些实施方案中，将减毒的伤寒沙门氏菌用于将编码SARS-CoV抗原性蛋白质的所需基因传递给人。所述方法包括选择细菌诸如伤寒沙门氏菌的菌株，所述菌株具有(i)灭活的促细胞调亡(pro-apoptotic)基因，(ii)灭活的液泡维持基因(iii)使菌株减毒的一种或多种的灭活突变，和(iv)编码SARS-CoV S-，M-和E-的多肽的重组基因。然后将所述菌株施用给人。使菌株减毒的一种或多种灭活的突变体可在一个基因中包含突变或在两个或更多基因的每个中包含突变。另外，减毒的沙门氏菌株包含至少一个能表达SARS-CoV基因的重组基因，其容许将它们用作将基因产物传递给受试者，诸如人的载体或传递媒介。至于传递所需的基因，意为将编码SARS-CoV产物的核酸，DNA或RNA传递给受试者。沙门氏菌属菌株还可传递对应于病毒复制子或感染性，减毒的病毒诸如，但不限于，Sabin脊髓灰质炎病毒，黄热病毒17D或麻疹病毒的RNA。当病毒RNA在被感染的细胞的细胞质中传递时，病毒的复制或复制子开始并且作为复制的结果，抗原序列被进一步扩增并观察到更好的表达。
在本发明的一些实施方案中，伤寒沙门氏菌的应用促进被统称为黏膜相关淋巴组织的肠道相关淋巴组织(GALT)，鼻相关淋巴组织(NALT)或支气管相关淋巴组织(BALT)的任一个的入侵和定居。在使用伤寒沙门氏菌作为传递系统中获得的一些优点中，是细菌能够使所需的SARS-CoV基因产物如果通过口服施用传递或定居于肠道淋巴组织，如果通过鼻内施用传递或定居于鼻淋巴组织并且如果通过其它途径施用传递或定居于其它淋巴器官的事实。另外，应用减毒的伤寒沙门氏菌是一种对于将核酸分子传递到人细胞的有效的并且不贵的方法。
在本发明的一些实施方案中，减毒的沙门氏菌能够定居于淋巴集结或包括，例如其它在人中的GALT的淋巴组织的相似的组织，而不会破坏被入侵的细胞。这种作用在口服施用后，提供高免疫原性。而且，GALT的连滤泡淋巴组织的M细胞是在功能上，形态上和结构上和与体内的其它黏膜相关性淋巴样组织(MALT)，诸如结膜相关淋巴组织(CALT)、支气管相关淋巴组织(BALT)和鼻相关淋巴组织(NALT)，以及在直肠中的淋巴组织等相关的M细胞是相同的。如此，当施用通过合适的途径，例如口、鼻内和直肠时，沙门氏菌能够侵入并定居于所有的这些组织。
针对SARS-CoV-VLPs的免疫应答的诱导
在本发明的一些实施方案中，在有风险发展SARS的受试者中诱导针对SARS-CoV-VLPs的免疫应答。这些受试者包括动物诸如鸟和哺乳动物。本发明的一些实施方案涉及在鸡和其它的家禽中诱导针对SARS-CoV-VLPs的免疫应答。在一些实施方案中，在哺乳动物中诱导针对SARS-CoV-VLPs的免疫应答，所述哺乳动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、山羊、绵羊和猴。在一个优选的实施方案中，在人中诱导针对SARS-CoV-VLPs的免疫应答。
意欲可实际上将包括质粒或其它核酸载体形式的裸DNA的任何类型的载体用于与广泛种类的免疫方案联合产生免疫应答，所述免疫方案包括，但不限于，肠胃外、黏膜和基因枪接种。
免疫原的制剂以及编码作为活性成分的免疫原的遗传构建体通常是本领域较好理解的，如通过美国专利号6,716,823；5,703,057；4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770中所例证的。典型地，将SARS-CoV-VLPs，编码可形成SARS-CoV-VLPs的SARS-CoV多肽或其部分的遗传构建体和/或包含这种遗传构建体的原核载体制备成可注射的，液体溶液或混悬液，或配制成适合在注射前成为溶液或混悬液的固体形式。还可将这些制剂进行乳化。活性免疫原性的成分经常与药用并与活性成分相容的赋形剂混和。合适的赋形剂是，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物及其组合。此外，如果需要，所述制剂可包含小量的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增加制剂的免疫原效能的佐剂。
可将免疫原制剂常规通过，例如，皮下地或肌内地注射，肠胃外地进行施用。适合于施用的其它方式包括鼻内施用的粉末，口服制剂和栓剂。
通常在存在过量粉末化的赋形剂时，通过在疏水赋形剂的水溶液中悬浮不可溶的核酸构建体或VLPs并将所述溶液干燥以产生包含分散在干燥的赋形剂材料中的核酸构建体或VLPs的粉末，来制备鼻施用的粉末。在起始溶液中，核酸构建体或VLP与亲水性赋形剂的重量比率是与所意图的应用一致的任何比率。优选地，在起始溶液中，核酸构建体或VLP与亲水性赋形剂的比率是1∶1-1∶10。可通过将液滴喷射到流动的气流中(喷雾干燥)或通过真空干燥来进行干燥以产生粗粉末，随后对其进行研磨以产生终粉末。在意图用于肺传递的颗粒的情形中，具有0.5μm-5μm大小的颗粒是理想的。
口服制剂包括这些通常使用的赋形剂，如，例如，药物级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可采取溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末并且，在一些实施方案中，包含约10-95％的活性组分，优选地约25-约70％。
对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括，例如，polyalkalene二醇或甘油三酯。这些栓剂可形成自包含活性成分的混合物。在一些实施方案中，所述栓剂形成自包含范围在约0.5％-约10％，优选地约1-约2％的活性组分的混合物。
在本发明的一些实施方案中，以与剂型相容的方式且以是免疫原性的且在治疗上有效的量来施用免疫原性的制剂。施用的量取决于待治疗的受试者，包括，例如，受试者免疫系统合成抗体的能力，和所需的保护程度。需要被施用的活性成分的精确的量取决于专业人员的判断。然而，在优选的实施方案中，合适的剂量范围是每剂量的数百微克的等级。起始施用的合适的方案和加强剂量也是可变的，但是由起始的施用代表，随后进行后来的接种或其它施用。
在许多情形中，具有免疫制剂的多重施用将是理想的。在一些实施方案中，施用将正常地是以2-12周的间隔，但更通常地以3-5周的间隔。以1-5年，通常是3年的周期加强对于维持免疫原应答的保护水平是理想的。免疫过程后可以是对于靶抗原的抗体的测定。所述测定可以通过用常规标记，诸如，放射性核素、酶、荧光等进行标记。这些技术是众所周知的并可见于广泛种类的专利，诸如美国专利号3,791,932；4,174,384和3,949,064。
实施例
本发明的一些实施方案通过不应被认为是限制性的如下的实施例来进一步举例说明。本领域技术人员将理解的是在随后的实施例中公开的技术代表在本文描述的发明中的实施方案的实践中具有良好功能的技术，并因此可认为其组成这些实施方案的实施的优选的方式。然而，关于本说明书，那些本领域技术人员将理解的是可以在不背离本发明精神和范围的情况下，在具体实施方案中作出许多变化并仍旧获得类似或相似的结果。
实施例1
比较来自四个SARS分离株的SARS-CoV M，E和S多肽
进行对于已知的SARS-CoV病原毒株的M，E和S多肽之间的关系的分析以确定开发有效用在产生针对大多数或所有的SARS-CoV分离株的免疫原性应答的可广泛适应的SARS-CoV-VLP的潜力。
使用在该分析中的SARS-CoV分离株是Tor2、Urbani、HKU-39849和CUHK-W1。在基因组科学中心，英属哥伦比亚癌症研究中心，600West 10thAvenue，Vancouver，BC V5Z 4E6，加拿大，分离SARS-CoV毒株Tor2。确定所述基因组的序列，然后以登记号：AY274119(完整基因组，29751bp)(SEQ ID NO：14))将其保存在Genbank中。SARS-CoV毒株Urbani分离于Division of Viral and Rickettsial Diseases，Centers for Disease Control andPrevention，1600Clifton RD，NE，Atlanta，GA 30333，USA。确定所述基因组序列，然后将其以登记号：AY278741(完整基因组，29727bp)(SEQID NO：15)保存在Genbank中。SARS-CoV毒株HKU-39849分离于动物系，香港大学，Pokfulam Road，香港，HK 00000，中国。确定所述基因组序列，然后，将其以登记号：AY278491(完整基因组，29742bp)(SEQ ID NO：16)保存在Genbank中。SARS-CoV毒株CUHK-W1分离于生化系，香港中文大学，MMW Bldg.Rm 608，Shatin，NT SAR，中国。确定基因组的序列，然后以登记号：AY278554(完整基因组，29736bp)(SEQ ID NO：17)保存在Genbank中。
已经分离了SARS-CoV的另外的毒株，但是对它们的基因组仅进行了部分测序。这些毒株没有包括在该分析中，但描述如下：SARS-CoV毒株BJ01，BJ02，BJ03，BJ04分离自微生物和流行病学研究所，中国军事医学科学院/北京基因组研究所，中国科学院，北京101300，中国。对这些毒株的每个的基因组进行部分测序并分别以登记号：AY278488，AY278487，AY278490，AY279354保存在Genbank中。SARS-CoV毒株GZ01分离自微生物和流行病学研究所，中国军事医学科学院/北京基因组研究所，中国科学院，北京101300，中国。对该毒株的基因组进行部分测序并以登记号：AY278489保存在Genbank中。
通过ORF分析和与其它已知冠状病毒的同源性比较从基因组序列确定M，E和S多肽的氨基酸序列。对于四个毒株的每个，使用具有blosum62mt2matrix的序列比对程序AlignX来比较M，E和S多肽的序列，其开放罚分(opening penalty)为10，空位拓展罚分(gap extension penalty)为0.05。E，M和S多肽的序列比对分别显示于图4A-C。
序列排比的结果显示M，E和S多肽在本文测试的四个SARS-CoV毒株中是高度保守的。E多肽序列的比较显示对于四个SARS-CoV分离株的每个而言，序列是100％的相同(图4A)。所述M多肽序列仅在四个毒株中显示微小的变化。具体而言，毒株HKU-39849不同于其它毒株的地方在于在67位置上是缬氨酸而不是丙氨酸。毒株Urbani不同于其它毒株的地方在于位置154包含脯氨酸而不是丝氨酸(见图4B)。所述S多肽也仅显示了微小变化。具体而言，毒株CUHK-W1在位置77包含天冬氨酸而不是甘氨酸，在位置244上包含苏氨酸而不是异亮氨酸。毒株Tor2在位置577包含丙氨酸而不是丝氨酸(见图4C)。
序列比较的结果说明形成自来自本文测试的毒株的任一个的M，E和S多肽的VLP将产生不仅特异性针对VLP构建自其中的毒株还针对大量不同的SARS-CoV毒株的免疫应答。
尽管本发明的一些实施方案涉及使用来自单一SARS-CoV毒株的基因构建VLPs，将理解的是其它实施方案意欲将来自多个SARS-CoV毒株的基因应用于产生VLPs。另外，本发明的其它实施方案，涉及包含对应于多个SARS-CoV毒株的VLPs的混合物，其中通过使用单一SARS-CoV毒株的基因来产生每个VLP。
实施例2
制备SARS-CoV cDNA
在该实施例和下面的实施例中，将SARS-CoV毒株Urbani cDNAs逆向转录自SARS-CoV毒株Urbani基因组RNA的RNA制备物。逆向转录的方法是本领域众所周知的。将制备的cDNA用作PCR反应和本文描述的其它应用的模板。表2列出了用于本文的cDNAs的序列鉴定号(SEQ IDNO)。
表2：用在质粒构建中的cDNAs
  cDNA   SEQ ID NO：
  S-蛋白质的cDNA   SEQ ID NO：18
  M-蛋白质的cDNA   SEQ ID NO：19
  E-蛋白质的cDNA   SEQ ID NO：20
  IRES的cDNA   SEQ ID NO：21
  RSV-LTR启动子的cDNA   SEQ ID NO：22
  SV40多聚腺苷酸化信号的cDNA   SEQ ID NO：23
实施例3
制备表达SARS-CoV M，E和S多肽的质粒
在该实施例中，构建了表达所有的三个SARS-CoV多肽的单一质粒。
使用如下的引物：
RSVBACK：5’-AATAACTGCAGCGATGTACGGGCCAGATATAC-3’(SEQ ID NO：24)；
RSVFOR：5’-AATAAGCGGCCGCGGAGGTGCACACCAATGTGG-3’(SEQ ID NO：25).
(SEQ ID NO：25)通过聚合酶链式反应(PCR)(Sambrook等，2001)扩增包含劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子的411 bp DNA片段。
设计引物从而使PstI-位点将出现在得到的PCR产物的5’-末端，并且NotI-位点将出现在3’-末端。这些限制性位点容许RSV-LTR启动子被插入在pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)(SEQ ID NO：26)的多克隆位点的唯一Pst-和NotI-位点。
除了RSV-LTR启动子之外，使用如下引物：
SV40BACK：5’-TTATTAAGCTTATGTACTCATICGTTTCGGAAG-3’(SEQ ID NO：27)；
SV40FOR：5’-TATTGGTACCGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3’
(SEQ ID NO：28)，通过PCR扩增包含猿猴病毒(SV)40多腺苷酸化信号的240bp DNA片段。
使用上述引物的扩增将HindIII-位点加到得到的SV40的多聚腺苷酸化信号的5’-末端并且将KpnI-位点加到3’-末端。然后，将该PCR片段插入已经包含RSV-LTR启动子的pVAX1-衍生物的唯一HindIII和KpnI-位点。将得到的质粒称为pCSRB。
使用如下引物：
SARS-S-BACK：
5’-TAATATCTAGAGCCGCCGCCATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCAC-3’(SEQID NO：29)；and
SARS-S-FOR：
5’-TAATAGTTTAAACTTATCATGTGTAATGTAATTTGACACCC3’(SEQ ID NO：30).
通过PCR扩增编码SARS-Cov株Urbani(Genbank登记号：AY278741)的刺突(S)糖蛋白的3792bp的cDNA片段(SARS_S)。
使用上述引物，将XbaI-位点和Kozak(Kozak，1987)共有序列加入SARS_S cDNA PCR产物的5’-末端。所述Kozak序列是在大多数真核生物的mRNAs中发现的短的识别序列，其大大促进起始mRNA与核糖体小亚基的结合。脊椎动物中起始翻译起始的共有序列是(GCC)GCCA/ G CCATGG(SEQ ID NO：31)。在SARS_S cDNA的3’-末端，加入了两个翻译终止密码子和PmeI-位点由此使该序列作为Xbal/PmeI-片段插入在pCSRB中的RSV-LTR启动子下游的唯一XbaI-和PmeI-位点。
最终，使用如下引物：
SARS-M-BACK：
5’-TAATAGCTAGCGCCGCCGCCATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3’(SEQ ID NO：32)；
SARS-M-FOR1：
5’-GAGCTGTTTTAATCATTACTGTACTAGCAAAGCAATATTGTC-3’(SEQ ID NO：33)；
IRES-BACK：5’-GCTAGTACAGTTAAAACAGCTCTGGGGTTGTAC-3’(SEQ ID NO：34)；
IRES-FOR：5’-CGAATGAGTACATTATGATACAATTGTCTGATTG-3’(SEQ ID NO：35)；
SARS-E-BACK1：5’-TTGTATCATAATGTACTCATTCGTTTCGGAAG-3’(SEQ ID NO：36)；and
SARS-E-FOR1：
5’-TATTACTTAAGTTATCAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3’(SEQ ID NO：37).
通过PCR对编码SARS-CoV M多肽的cDNAS(SARS_M cDNA)和编码E-多肽的cDNAS(SARS_E cDNA)和包含Mahoney毒株脊髓灰质炎病毒类型I内核糖体进入位点(IRES)的片段进行扩增。
设计引物从而在SARS_M cDNA的3’-末端和IRES的5’-末端之间以及在IRES的3’-末端和SARS_E CDNA的5’-末端之间引入～25bp的重叠。另外，将NheI-位点和Kozak共有序列加入SARS_M cDNA产物的5’-末端。将两个翻译终止密码子加入SARS_M cDNA产物的3’-末端并将两个翻译终止密码子和AflII-位点引入SARS_E cDNA产物的3’-末端。在最终的PCR反应中，将这三个片段通过重叠延伸进行连接，导致被本文称为M_IRES_E的片段。使用限制性内切酶NheI和AflII，M_IRES_E位于已包含SARS-S cDNA的pCSRB-衍生物的CMV启动子的下游。将得到的构建体称为pMES。
实施例4
制备表达SARS-CoV M和E多肽的质粒
在该实施例中，使用pVAX1构建表达SARS-CoV M和E多肽的质粒。将得到的质粒命名为pME。通过将编码来自SARS-CoV的M和E蛋白质的双顺反子构建体插入pVAX1的多接头区域来构建pME。使用如下引物：
SARS-M-BACK：
5’-TAATAGCTAGCGCCGCCGCCATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3’(SEQ ID NO：38)；
and
SARS-E-FOR2：
5’-TATTAGTTTAAACTTATCAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3’(SEQ ID NO：39).
通过从pMES(见实施例3)再扩增M_IRES_E片段来制备M/E双顺反子构建体。
用SARS-M-BACK和SARS-E-FOR2进行的扩增产生M_IRES_E片段，其在其5’-末端被改造加入NheI-位点并在其3’-末端包括PmeI-位点。这些位点容许将所述片段插入在CMV启动子下游的pVAX1的多克隆位点的唯一NheI-和最3’-端的PmeI-位点，由此产生pME。
实施例5
制备表达SARS-CoV S多肽的质粒
在该实施例中，使用pVAX1构建表达SARS-CoV S多肽的质粒。将该构建体命名为pS。通过将作为XbaI/PmeI-片段的SARS_S cDNA(如实施例3所产生)插入pVAX1中的CMV启动子下游的NheI-和PmeI-位点来构建pS。注意XbaI和NheI产生相配的突出。
实施例6
制备表达SARS-CoV M多肽的质粒
在该实施例中，使用pVAX1构建表达SARS-CoV M多肽的质粒。将该构建体命名为pM。为了产生pM，使用如下引物：
SARS-M-BACK：
5’-TAATAGCTAGCGCCGCCGCCATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3’(SEQ ID NO：40)；
SARS-M-FOR2：
5’-TAATAGTTTAAACTCATTACTGTACTAGCAAAGCAATATTGTC-3’(SEQ ID NO：41).
通过PCR扩增SARS_M cDNA。
然后，将SARS_M cDNA产物作为NheI/PmeI-片段连接到CMV启动子下游的pVAX1的多克隆位点，由此产生质粒，pM。
实施例6
制备表达SARS-CoV E多肽的质粒
在该实施例中，使用pVAX1构建表达SARS-CoV E多肽的质粒。将该构建体命名为pE。为了产生pE，使用如下引物：
SARS-E-BACK2：
5’-TTATTGCTAGCATGTACTCATTCGTTTCGGAAG-3’(SEQ ID NO：42)；and
SARS-E-FOR2：
5’-TATTAGTTTAAACTTATCAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3’(SEQ ID NO：43).
通过PCR扩增SARS_E cDNA。
然后将SARS_E cDNA产物作为NheI/PmeI-片段连接到CMV启动子下游的pVAX 1的多克隆位点，由此产生质粒，pE。
实施例7
制备表达SARS-CoV多肽的病毒
该实施例描述表达SARS-CoV基因的重组麻疹病毒(MV)的构建。
MV重组质粒衍生自质粒p(+)MV，其携带反基因组的MV标记Edmonston B或MV序列的Schwarz/Moraten疫苗毒株。将包含插入可读框(ORFs)的限制性酶切位点的两个另外的转录单位(ATU)引入MVcDNAs。第一个ATU位于P基因的下游并且第二个ATU位于H基因的下游。将这些工程化的质粒用于插入编码M和E多肽的SARS-CoV基因。
使用Pfu聚合酶和包含对于随后克隆到MV载体中的唯一BsiWI和BssHII位点的引物通过PCR来扩增编码S蛋白质和M/E蛋白质的SARS-CoV cDNAs(见实施例3)。所述引物还编码人工起始和终止密码子。终止密码子后包括另外的核苷酸从而符合“6的规则(rule of six)”，所述“6的规则”要求MV基因组的核苷酸数目必须是6的倍数。将SARS CoV结构基因引入在pMV载体的第一个和第二个ATU位点中。
由Radecke等描述(EMBO J.145773-5784，1995)，使用基于辅助细胞的拯救系统从质粒中回收重组MV-SARS-CoV病毒。简而言之，使用磷酸钙方法，以不同的pMV/SARS-CoV基因质粒(5μg)和表达MV聚合酶L基因的质粒共转染稳定表达T7RNA聚合酶和麻疹N和P蛋白质的人辅助细胞。于37℃过夜温育后，用新鲜的培养基置换转染的培养基并将细胞进行热休克(43℃2小时)。于37℃温育两天后，将被转染的细胞转移到70％的汇合非洲绿猴肾细胞株系细胞层并于37℃温育。培养2-5天后，合胞体(syncytia)出现在非洲绿猴肾细胞株系细胞中。将单一合胞体转移到35-mm直径的非洲绿猴肾细胞株系细胞的孔中。然后将被感染的细胞扩展到T-75或T-150烧瓶中。当合胞体达到80-90％，通过在3ml的MEM培养基中刮擦细胞来收集病毒，随后进行一轮冻融。然后通过离心使上清液从细胞碎片中得以澄清并保存于-80℃。
实施例8
构建表达SARS-CoV多肽的原核载体
在该实施例中，将减毒的伤寒沙门氏菌用于传递SARS-CoV M，E和S基因。将上述的在pS，pM和pE中的克隆cDNAs用于产生携带不同的沙门氏菌特异的复制起点(ori)以及可选择标记，例如卡那霉素的质粒。然后，在组织培养物中测试重组细菌对于SARS-CoV特异蛋白质的产生。然后，将减毒的伤寒沙门氏菌菌株用于将SARS-CoV M，E和S基因传递给人。
实施例9
针对SARS-CoV多肽的抗体
该实施例描述能够结合SARS-CoV M，E和/或S多肽的多克隆抗体的产生。具体而言，成熟SARS-CoV M，E和S多肽的每个的氨基端和羧基端的15个氨基酸以化学方法进行合成并随后用于免疫兔。所用序列如下：
S蛋白质N-端：DLDRCTTFDDVQAPN(SEQ ID NO：44)
S蛋白质/C-端：DDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO：45)
M蛋白质N-端：MADNGTITVEELKQL(SEQ ID NO：46)
M蛋白质/C-端：TDHAGSNDNIALLVQ(SEQ ID NO：47)
E蛋白质N-端：MYSFVSEETGTLIVN(SEQ ID NO：48)
E蛋白质/C-端：VKNLNSSEGVPDLLV(SEQ ID NO：49)
每次用200μg的肽激发被免疫的动物，每月1次，总共3次。在随后的实验中，将得到的血清用作检测M，E和S多肽的工具。
实施例10
表达SARS-CoV多肽
在体外检验来自本文描述的构建体的每个的SARS-CoV多肽的克隆和表达。对于质粒在pVAX1中的构建，噬菌体T7启动子促进通过T7RNA聚合酶体外合成编码SARS-CoV抗原多肽的mRNAs。在体外转录编码SARS-CoV抗原的mRNAs，然后将其用作当存在35S-甲硫氨酸和/或35S-半胱氨酸时，在网织红细胞裂解物中的体外翻译反应的模板。通过标准的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离放射性标记的翻译的SARS-CoV抗原，并通过荧光自显影显现。或者，使用针对M，E，和/或S多肽产生的抗血清使放射性标记的抗原进行免疫沉淀(见实施例9)。通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖沉淀免疫复合物，通过PAGE进行分离并通过荧光自显影显现。
可以在组织培养物中检验本文描述的质粒构建体的功能性。在这些实验中，用编码产生SARS-CoV-VLPs所必需的多肽的遗传构建体的任何组合来转染组织培养细胞。例如，可用pMES转染细胞；用pME和pS对其进行共转染；用pM，pE，和pS进行共转染。在这些实验中，按照生产商手册使用脂转染胺(Invitrogen)来转染约2×106细胞。24小时后，在含SDS的聚丙烯酰胺凝胶样品缓冲液中裂解细胞。然后，将蛋白质在商购的8-20％PAA凝胶中进行分离并经过蛋白质印迹。转移到硝化纤维素上后，将在实施例9中描述的兔抗血清用于检测在组织培养细胞中表达的SARS-CoV多肽。
图5显示在质粒的转染后，被转染的组织培养细胞产生SARS-CoV M，E和S多肽，所述质粒携带在真核启动子控制下的这些SARS-CoV基因。
可将包含SARS-CoV多肽的病毒构建体用于感染细胞培养物并如上述检验这些多肽的表达。图6举例说明在用携带这些SARS-CoV基因的重组麻疹病毒转染后，组织培养物细胞产生SARS-CoV M，E和S多肽。
还可在组织细胞培养物中，检验包含遗传构建体的原核传递载体构建体，诸如本文所述的质粒的诱导SARS-CoV蛋白质表达的能力。图7举例说明了组织培养细胞，所述细胞在用携带遗传构建体的减毒沙门氏菌菌株转导后产生SARS-CoV蛋白质，所述构建体具有在真核启动子控制下的SARS-CoV M，E和S基因。
实施例11
制备SARS-CoV-VLP
本实施例证明M，E和S蛋白质足以产生SARS-CoV样颗粒，其由细胞分泌并且所述VLP包括所有的三个蛋白质。如在前面实施例中所描述的，用质粒DNA转染或用重组病毒感染或用携带SARS-CoV M，E和S基因的重组细菌转导约2×107的组织培养物细胞。将细胞培养物温育约24小时，然后收集上清液。在24小时培养阶段中，SARS-CoV多肽由细胞产生，病毒样颗粒形成，芽殖发生并且VLPs通过细胞进行释放。图8举例说明组织培养物细胞，所述细胞在表达SARS-CoV M，E和S基因后产生SARS-CoV-VLPs，然后将这些VLPs释放到组织培养物上清液中。
为了说明M，E和S多肽都是VLPs的部分，使用了未处理和溶解的细胞上清液制备物的密度离心。对于溶解的制备物，将Triton-X 100加入上清液的等分试样到终浓度为1％，因此有效溶解病毒包膜。溶解后，M，E和S多肽按照它们自己的分子量自由经过梯度来迁移。与此相反，在未处理的材料中的蛋白质按照VLP的更高分子量迁移。图9举例说明没有用Triton-X100(无)处理的完整病毒颗粒的密度梯度离心以及溶解的蛋白质(Triton-X100)在蔗糖梯度中的迁移。
收集对应于梯度的单个区域的级分并通过如上所述的蛋白质印迹进行分析。该结果显示：(i)SARS-CoV-VLPs由被用SARS-CoV基因M，E和S转染的真核细胞产生；和(ii)所有的SARS-CoV多肽是SARS-CoV-VLP的部分。
将理解的是，使用本领域众所周知的方法，可将SARS-CoV-VLPs从组织培养培养基中分离并将其配制成免疫原性的药物制剂。或者，可将产生SARS-CoV-VLP所需的编码多肽的基因的所有或部分通过本文描述的方法施用给受试者。在受试者中的基因的表达将容许免疫原性的SARS-CoV-VLPs的产生。
实施例12
传递给受试者的载体制剂
质粒载体的制剂
通过使用乙醇沉淀和通过离心收集质粒可制备用于传递的质粒DNA。随后使用70％的乙醇对质粒进行彻底洗涤并简单干燥。可将任何合适的制剂用于施用DNA。在一个实施方案中，将DNA在磷酸盐缓冲溶液中溶解然后可将其用于注射。
作为备选方案，可将质粒DNA配制成干燥的粉末。干燥的粉末核酸组合物包括分散在亲水赋形剂材料中的基质中的不可溶的核酸构建体(典型地小颗粒)以形成大的气溶胶颗粒。对于肺传递，粉末化的气溶胶颗粒具有通常在0.5μm-5μm范围内的平均颗粒大小，更大的大小对于传递到其它湿润靶向位置是有效的。
将干粉核酸组合物如下制备：通常在存在过量粉末化的赋形剂时，将不可溶的核酸构建体悬浮在亲水性赋形剂的水溶液中并干燥所述溶液来产生，包含在干燥的赋形剂材料中分散的核酸构建体的颗粒的粉末。在起始溶液中的核酸构建体与亲水性赋形剂的重量比率优选地从1∶1-1∶10，并且所述溶液可通过喷射液滴到流动的气流(喷雾干燥)或通过真空干燥进行干燥来产生粗粉末，随后对其进行研磨以产生终粉末。
在准备用于肺传递的具有0.5μm-5μm的颗粒大小的颗粒中，每个颗粒通常包含103-104的核酸构建体。可将所述构建体均匀或不均匀地分散在每个颗粒中，并且所述颗粒依次将通常以通常在1∶10-1∶500的重量比率(核酸构建体：游离于核酸的赋形剂粉末)过量存在于粉末化的赋形剂中。
传递核酸构建体的方法包括将包含核酸构建体的干燥粉末定向于宿主中的湿的靶向位置，其中当被暴露于湿的靶向位点时，所述颗粒的亲水性赋形剂基质材料将溶解，使更小的核酸构建体颗粒与细胞自由相互作用。在一个优选的实施方案中，靶向位置是肺并且所述颗粒通过吸入定向于肺。
干燥粉末组合物是特别有利的，由于亲水性赋形剂将稳定核酸构建体以备贮存。过量的粉末化亲水性赋形剂还可增加干燥粉末在气溶胶中的分散，并且因其高水溶性，促进组合物的溶解以将核酸构建体沉积在与靶膜，诸如宿主的肺表面膜的密切接触中。
病毒载体的制剂
使用Akta FPLC系统，将麻疹病毒载体通过大小排阻层析法进行纯化。用于层析法的缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。然后，可将重组病毒通过不同的路径，例如，鼻内或口服，直接用于感染动物。
原核载体的制剂
使细菌生长在选择性培养基中直到生长的稳定时期(例如，在1∶500接种后在几个1L烧瓶中的24小时)。通过离心沉淀所述细胞并弃去上清液。用3升PBS将细胞沉淀洗涤5次，然后重悬于200ml。准备所述溶液用于通过各种途径的体内转导(例如，鼻内或口服)。
实施例13
免疫方法
该方法描述在随后的实施例中使用的免疫方法。用表达全长SARS-CoV M，E和S结构蛋白的质粒、病毒载体或细菌载体免疫小鼠。或者，用分离自细胞培养培养基中的SARS-CoV-VLPs免疫小鼠。用多至100μg的质粒每两星期多至三次的通过口服、静脉内或腹膜内对小鼠进行免疫。在病毒载体的情形中，将约107-1010的感染性病毒每两周施用多至3次。将包含一种或多种的本文描述的表达SARS-CoV多肽的构建体的105-106原核传递载体每两周施用多至3次。对于SARS-CoV-VLPs，介于约1μg和约10mg之间的浓度每两周施用多至3次。
通过一种或多种如下测定分析细胞-介导的针对免疫的免疫应答：
淋巴细胞增殖测定：
用Con A对脾细胞(spleenocyte)进行脉冲，或不对其进行刺激，从而测量通过3H-胸苷结合的促细胞分裂原驱动的增殖。为了测量抗原特异的增殖，如上培养淋巴细胞，但是用具有或不具有IL-2的0.1-10μg/ml的SARS-CoV重组蛋白质，或部分纯化的SARS-CoV-VLPs对其进行脉冲处理，并在7天后收集。在没有任何抗原培养物中测定自发增殖。
淋巴因子应答
为了测定刺激淋巴因子的产生，将脾细胞(5-10×105)用或不用特异性抗原或Con A以三次重复培养进行温育。培养基是包含1％的正常小鼠血清和抗生素的RPMI。于37℃温育48小时后，移去100μl的等分试样的培养基并进行冷冻。用响应于淋巴因子刺激的HT2细胞对培养基中的淋巴因子含量进行测定。
酶联免疫斑点(ELISpot)
使用细胞分选仪来纯化CD4+-CD8-细胞的群体。进行ELISpot测定以评价每个T-细胞部分的作用。用于检测SARS-CoV细胞应答的测定包括T细胞增殖，IL-4和IFN-γ酶联免疫斑点。用于这些测定的方法是本领域众所周知的。
CTLs
使用脾细胞进行CTL测定。通过常规51铬-释放测定测量CTL活性。通过如前所述的再刺激来测量再次CTL应答。将用表达SARS抗原的质粒转染的EL4和EG7细胞用作靶。为了确定CTL前体水平，我们使用特异性的四聚体MHC类别1分子或酶联免疫斑点。该技术允许对通过用本文描述的SARS-CoV免疫原制剂免疫产生的T-细胞前体的数目进行直接定量。
作为肿瘤排异抗原的SARS蛋白质
表达病毒抗原的肿瘤的排异主要由细胞介导的免疫应答所调节。针对表达编码病毒编码的肿瘤的细胞介导的免疫应答可能包括CD4+和CD8+T细胞。
将本文描述的SARS-CoV免疫原制剂用于在小鼠中诱导保护性肿瘤免疫性。用表达SARS M，E或S抗原的质粒、病毒载体或细菌载体来腹膜内地免疫小鼠。末次接种7天后，用1×105的表达相应SARS抗原的B16，10倍于致死50％的动物的剂量(LD 50 )的剂量对动物进行中胁两侧地激发。通过用表达SARS-CoV抗原的鼠逆转录病毒载体感染B16来构建B16，EL4和EG7细胞系。确定局部肿瘤生长和小鼠存活。在平行实验中，确定CTL活性是否与肿瘤排异相关。另外，为使肿瘤排异活性与免疫方案相关，确定了肿瘤排异活性对剂量的数量和接种大小的依赖。
实施例14
SARS-CoV免疫原的施用
将前面实施例所述的分离的SARS-CoV-VLPs制备物或能够产生SARS-CoV-VLPs的遗传构建体的制备物，接种在C57blk/6小鼠中。可将所述制备物口服地、静脉内地或腹膜内地进行接种。特异抗体在小鼠中的诱导通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。每两周分析来自被接种的动物的血清，共10周以确定抗体应答的发展。
在其它实验中，用在前面实施例中描述的增加量的分离的SARS-CoV-VLPs制备物或能产生SARS-CoV-VLPs的遗传构建体的制备物来接种动物，从而确定接种物的大小是否能决定特异性抗体产生的水平。另外，为了确定免疫的优选的感染方案，用固定量的免疫原性的制剂一次、两次、三次或四次进行腹膜内地接种。使用标准的ELISA测定，确定在血清中与SARS病毒结构蛋白反应的抗体的效价。
本文描述的方法允许通过制备表达不同的SARS-CoV抗原蛋白质的重组载体来使针对多种抗原决定簇的同时接种成为可能的策略的发展。为了测试这种可能性，用表达单个以及多个SARS-CoV多肽的质粒接种小鼠。识别SARS病毒蛋白质的每个的抗体的效价可通过ELISA来确定。该方法在确定单独表达的SARS-CoV抗原是否能诱导针对SARS病毒的保护性免疫应答中是有用的。还可将这种方法用于比较单一抗原方法的功效和多个抗原方法的功效。不管确定的哪种方法更好，将理解的是诱导针对SARS病毒的任何水平的免疫应答是有益的，并且没有充分保护性的免疫应答的诱导在本发明的范围内。
实施例15
诱导针对SARS-CoV的免疫应答
将被较好接受的是中和抗体是免疫应答的重要组成，所述免疫应答提供针对通过黏膜表面到达受试者的病原体的保护。例如，已经显示，通过经过分泌乳汁的重组动物的奶来传递中和抗体，可传递免疫性(Kolb等，2001)。
下面的实施例证明基于体外测定进行选择的抗体在动物中是有益的。在这些实验中，用在上面实施例中描述的能够形成VLPs的载体接种小鼠。具体而言，对小鼠接种数次从而诱导高效价的抗体并在4-6周后取血。将来自被接种的动物的血清用于进行SARS-CoV中和测定。
没有在组织培养物中中和病毒的抗-SARS-CoV抗体可在体内，特别是在黏膜表面具有有益效果。例如，与天然病毒体结合的抗体可促进通过补体介导的病毒清除、病毒破坏，抑制到靶组织的运输或胞转，或通过黏液层单一减少病毒的移动性(Robert-Guroff，2000)。这些效果的每个都减少病毒导致SARS的能力。
用表达SARS-CoV结构蛋白质的重组载体接种小鼠从而诱导能与完整SARS-CoV病毒体结合的高效价的抗体。在一个实验中，收集来自被免疫的小鼠的血清并用于免疫沉淀SARS-CoV-VLPs。进行蛋白质印迹从而在沉淀的病毒体级分中检测SARS-CoV结构蛋白。进一步检验具体SARS-CoV抗原组合在非人灵长类模型中的疾病保护，鉴定所述具体SARS-CoV抗原组合诱导与天然病毒体结合的抗体。
细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)在于它们的表面上识别结合于主要组织相容性的复合物类别I分子的抗原肽后杀死肿瘤性转化或病毒感染的细胞。用被正常杀死的病原体或它们的蛋白质的免疫通常不激发CTLs。
CTL在针对病毒的保护性免疫应答中的作用没有被充分理解。然而，因为CTLs在清除包括其它冠状病毒的广泛种类的胞内病原体中是重要的，刺激CTL的产生在诱导针对SARS-CoV的免疫应答中是有益的。另外，在针对呼吸性疾病的保护中，CTLs保护呼吸性黏膜免于病毒侵害中起着重要作用。通过来自被接种的动物的CTL的转移还可将保护赋予天然动物。
随后的实施例证明本文描述的免疫原性SARS-CoV制剂激发有效CTL应答的能力。在用免疫原性的SARS-CoV制剂接种小鼠和猕猴后，显示了高水平的CTL活性以及高水平的CTL前体。此外，证明了免疫保护小鼠免于随后的用以SARS抗原转染的肿瘤的激发。
本文描述的方法，组合物和系统是目前优选的实施方案的代表，是示例性的，并且不倾向于作为在本发明范围上的限制。本领域技术人员将作出在本发明精神范围内并被本发明范围限定的变化和其它应用。因此，对于本领域技术人员显而易见的是可以在不背离本发明范围和精神前提下对本发明作为各种替换和修改。
用在下面的权利要求和本说明书全文的术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”，和“包括(comprising)”没有将要求的发明限制于排除任何改变或添加。相反，术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”，和“包括(comprising)”意为“包括，但不必需限定于”。例如，可精确认为包含A，B，和C的方法、装置、分子或其它项目包括A和B。同样，“包括A和B”的方法、装置、分子或其它项目可包括任何数目的另外的步骤、组成、原子或其它项目。
用于下面的权利要求和本说明书全文时，至于短语“基本由.....组成”意为在短语后列出的任何成分，并将其它成分限定于不干扰或显著有助于在本发明书中的对于所列出的成分的特异活性或作用。因此，短语“基本上组成”说明列出的成分是被需要或强制性的，但是其它成分是任选的，并且取决于它们是否明显影响所列出的成分的活性或作用，可以或不可以出现。
在本说明书中引用的参考文献没有显示这些参考文献的任一个是在本领域之前的技术或这些参考文献的任一个的内容组成对于那些本领域普通技术人员而言的普通或一般的知识。
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ucuaaacu    8
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<212>PRT
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Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
 1               5                  10                  15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
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<400>4
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
 1               5                  10                  15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
        35                  40                  45
Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val
65                  70                  75
<210>5
<211>76
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>5
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
 1               5                  10                  15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
        35                  40                  45
Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val
65                  70                  75
<210>6
<211>221
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>6
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
 1               5                  10                  15    
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
        115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>7
<211>221
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>7
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
 1               5                  10                  15
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
        115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Pro Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>8
<211>221
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>8
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
 1               5                  10                  15
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Val Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
        115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>9
<211>221
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>9
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
 1               5                  10                  15
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
         115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>10
<211>1255
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>10
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1                5                  10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
                85                  90                  95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
            100                 105                 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
                245                 250                 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
        275                 280                 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
    290                 295                 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305                 310                 315                 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
        355                 360                 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
    370                 375                 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
                405                 410                 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
            420                 425                 430
Thr Gly Asr Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
        435                 440                 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
    450                 455                 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
                485                 490                 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
            500                 505                 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
        515                 520                 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
    530                 535                 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
                565                 570                 575
Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
            580                 585                 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
        595                 600                 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
    610                 615                 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625                 630                 635                 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
                645                 650                 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
            660                 665                 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
        675                 680                 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
    690                 695                 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705                 710                 715                 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Lau Leu Leu
                725                 730                 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
            820                 825                 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
        835                 840                 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
                885                 890                 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
            900                 905                 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
        915                 920                 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
            980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
    1010                1015                1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025                1030                1035                1040
Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
                1045                1050                1055
Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro
            1060                1065                1070
Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
        1075                1080                1085
Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
    1090                1095                1100
Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr
1105                1110                1115                1120
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
                1125                1130                1135
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
            1140                1145                1150
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
        1155                1160                1165
Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
    1170                1175                1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185                1190                1195                1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
                1205                1210                1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
            1220                1225                1230
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
        1235                1240                1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1250                1255
<210>11
<211>1255
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>11
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
 1               5                  10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
                85                  90                  95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
            100                 105                 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
                245                 250                 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
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Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
    290                 295                 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305                 310                 315                 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
        355                 360                 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
    370                 375                 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
                405                 410                 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
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Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
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Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
    450                 455                 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
                485                 490                 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
            500                 505                 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
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Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
    530                 535                 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
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Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
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Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
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Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
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His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
                645                 650                 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
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Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
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Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
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Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
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Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
                725                 730                 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
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Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
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Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
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Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
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Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
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Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
            980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
    1010                1015                1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
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Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
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Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
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Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr
1105                1110                1115                1120
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
                1125                1130                1135
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
            1140                1145                1150
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
        1155                1160                1165
Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
    1170                1175                1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185                1190                1195                1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
                1205                1210                1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
            1220                1225                1230
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
        1235                1240                1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1250                1255
<210>12
<211>1255
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>12
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
 1               5                  10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
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Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
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Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
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Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
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Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
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Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
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Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
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        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
            820                 825                 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
        835                 840                 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
                885                 890                 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
            900                 905                 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
        915                 920                 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
            980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly GIn Ser Lys Arg Val Asp Phe
    1010                1015                1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025                1030                1035                1040
Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
                1045                1050                1055
Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro
            1060                1065                1070
Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
        1075                1080                1085
Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
    1090                1095                1100
Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr
1105                1110                1115                1120
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
                1125                1130                1135
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
            1140                1145                1150
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
        1155                1160                1165
Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
    1170                1175                1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185                1190                1195                1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
                1205                1210                1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
            1220                1225                1230
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
        1235                1240                1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1250                1255
<210>13
<211>1255
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>13
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
 1               5                  10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
                85                  90                  95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
            100                 105                 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
                245                 250                 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
        275                 280                 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
    290                 295                 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305                 310                 315                 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
        355                 360                 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
    370                 375                 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
                405                 410                 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
            420                 425                 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
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Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
    450                 455                 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
                485                 490                 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
            500                 505                 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
        515                 520                 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
    530                 535                 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
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Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
            580                 585                 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
        595                 600                 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
    610                 615                 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625                 630                 635                 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
                645                 650                 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
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Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
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Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
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Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705                 710                 715                 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
                725                 730                 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
            820                 825                 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
        835                 840                 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
                885                 890                 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
            900                 905                 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
        915                 920                 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
            980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
    1010                1015                1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
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Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
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Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
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Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
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    1170                1175                1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185                1190                1195                1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
                1205                1210                1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
            1220                1225                1230
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
        1235                1240                1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1250                1255
<210>14
<211>29751
<2l2>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>14
atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt  60
ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac  120
gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct  180
tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc  240
gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca  300
cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg  360
gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt  420
ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa  480
cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg  540
gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc  600
gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt  660
ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat  720
cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa  780
ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc  840
ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg  900
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gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag  1020
acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag  1080
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actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt  1200
aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag  1260
acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa  1320
ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc  1380
tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac  1440
attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc  1500
tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc  1560
tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag  1620
atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag  1680
gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag  1740
agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc  1800
aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca  1860
ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt  1920
gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt  1980
atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc  2040
aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg  2100
ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag  2160
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<210>16
<211>29742
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>16
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