1. CN105705509 - 4-{4-[(1 e)-4-(2,9-diazaspiro[5.5]undec-2-yl)but-1 -en-1 -yl]-2-methylbenzyl}-5-(propan-2-yl)-1 h-pyrazol-3-yl beta-d- glucopyranoside acetate

为SGLT1抑制剂的吡唑化合物的乙酸盐

技术领域

本发明涉及为吡唑化合物的乙酸盐的新的SGLT1抑制剂、包含所述化合物的药物组合物、使用所述化合物治疗生理病症的方法，以及可用于合成所述化合物的中间体和方法。

背景技术

本发明属于糖尿病和其它与高血糖症相关的疾病和病症的治疗领域。糖尿病是一组以高血糖水平为特征的疾病。在美国它影响着约2500万人，根据2011年美国国家糖尿病简报，它也是美国的第7大死亡原因(美国卫生与人力资源服务部，疾病控制和预防中心)。钠偶联的葡萄糖协同转运蛋白(SGLT’s)是已知负责碳水化合物如葡萄糖的吸收的转运蛋白之一。更具体地，SGLT1负责转运葡萄糖跨过小肠的刷状缘膜。对SGLT1的抑制可导致小肠中葡萄糖吸收的减少，因此提供治疗糖尿病的有用方法。

美国专利No.7,655,632公开了具有人SGLT1抑制活性的某些吡唑衍生物，它们还被公开可用于预防或治疗与高血糖症相关的疾病，如糖尿病。而且，WO 2011/039338公开了具有SGLT1/SGLT2抑制剂活性的某些吡唑衍生物，它们被还公开可用于治疗骨疾病，如骨质疏松症。

需要用于糖尿病的替代药物和治疗。本发明提供为SGLT1抑制剂的吡唑化合物的乙酸盐，因此其可适用于治疗某些病症例如糖尿病。

发明内容

因此，本发明提供式I的化合物或其水合物：

本发明还提供水合的式I化合物的晶形。

此外，本发明提供式I化合物的晶形，其是水合的，特征在于至少下列之一：

a.采用CuKα辐射的X-射线粉末衍射图，其具有在5.2°衍射角 2-θ处的强峰以及一个或多个选自7.8°、8.0°和10.7°(分别±0.2°)的强峰；和

b.13C固态NMR谱，其包含参比金刚烷的高场共振(δ＝29.5ppm) 的在下列位置的强峰：181.8、161.2、160.0、147.6和137.4ppm(分别±0.2ppm)。

本发明还提供水合的式I的晶形，其中在环境温度的含水量是约9％至约12％重量。

此外，本发明提供治疗患者的糖尿病的方法，包括向需要此类治疗的患者施用有效量的式I化合物或其水合物。本发明还提供治疗患者的1型糖尿病的方法，包括向需要此类治疗的患者施用有效量的式I化合物或其水合物。而且，本发明提供治疗患者的2型糖尿病的方法，包括向需要此类治疗的患者施用有效量的式I化合物或其水合物。本发明还提供治疗患者的葡萄糖耐量受损(IGT)、空腹血糖受损(IFG)或代谢综合征的方法，包括向需要此类治疗的患者施用有效量的式I化合物或其水合物。

此外，本发明提供用于治疗、特别地是用于治疗糖尿病的式I化合物或其水合物。而且，本发明提供用于治疗1型糖尿病的式I化合物或其水合物。而且，本发明提供用于治疗2型糖尿病的式I化合物或其水合物。本发明还提供用于治疗IGT、IFG或代谢综合征的式I化合物或其水合物。本发明还提供式I化合物或其水合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。此外，本发明提供式I化合物或其水合物在制备用于治疗1型糖尿病的药物中的用途。本发明还提供式I化合物或其水合物在制备用于治疗2 型糖尿病的药物中的用途。本发明还提供式I化合物或其水合物在制备用于治疗IGT、IFG或代谢综合征的药物中的用途。

本发明还提供药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂组合的式I化合物或其水合物。在特定实施方案中，组合物还包含一种或多种其它治疗剂。本发明还涵盖用于合成式I化合物或其水合物的新型中间体和方法。

此外，本发明提供制备结晶的SGLT1抑制剂的方法，其包括将 4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷与湿的乙酸乙酯混合。本发明还提供制备结晶的SGLT抑制剂的方法，其包括将4-{4-[(1E)-4-(2,9- 二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷与湿的乙酸乙酯混合，然后收集得到的固体。

为无定形固体的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯 -1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷(游离碱) 的分离和纯化需要使用色谱法，其可能是资源密集的。式I化合物通过消除色谱法使得能够改善分离和纯化，并提供具有改善的形式稳定性和对于药物制剂特别是药物组合物的商业生产和贮存而言的改善的处理性质的晶形。

如本文所使用，术语“强峰”意指在相关谱或粉末图谱中具有最强峰的至少5％强度的峰。

如本文所使用，术语“治疗”包括限制、减缓、停止或逆转已有症状或病症的进展或严重性。

如本文所使用，术语“患者”是指哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗或人。应理解，优选的患者为人。

如本文所使用，术语“有效量”是指本发明化合物的量或剂量，在向患者施用单个或多个剂量时，在诊断或治疗下在患者中提供所需效应。

作为本领域技术人员，主治诊断医生通过使用已知技术以及通过观察在类似情况下获得的结果，可以容易确定有效量。在确定用于患者的有效量时，主治诊断医生考虑许多因素，包括但不限于：哺乳动物物种；其大小、年龄和一般健康；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度或者牵涉或严重性；个体患者的响应；施用的具体化合物；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；所选择的给药方案；伴随给药的采用；以及其它相关情况。

一般来说，式I化合物在宽剂量范围内是有效的。例如，每天剂量正常落入约0.01至约30mg/kg体重的范围内。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下仍可采用较大剂量，而不导致任何有害的副作用，因此上述剂量范围不旨在以任何方式限制本发明的范围。

本发明化合物优选被配制成通过任何途径施用的药物组合物，所述途径使化合物为生物可利用的。最优选，此类组合物用于口服施用。此类药物组合物和用于制备它们的方法是本领域熟知的。(参见例如Remington： The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy编者，第21版，Lippincott, Williams & Wilkins,2006)。

本发明的另一方面，本发明化合物可以与一种或多种治疗剂如抗糖尿病药组合施用。组合施用包括同时或顺序施用。而且，组合的同时施用可以作为各治疗剂的单个组合剂量或分别剂量。抗糖尿病药的实例包括二甲双胍；DPPIV抑制剂，如西他列汀(sitagliptin)或利拉利汀(linagliptin)；磺酰脲，如格列美脲；噻唑烷二酮，如吡格列酮；基础胰岛素，如甘精胰岛素 (glargine)；速效胰岛素，如HUMALOG或NOVOLOG；GLP-1激动剂，如艾塞那肽(exenatide)或利拉鲁肽(liraglutide)；SGLT2抑制剂，如达格列净 (dapagliflozin)或依帕列净(empagliflozin)；胰高血糖素受体拮抗剂，如 LY2409021；等。

能够如在下面所述的制备例、实施例和流程中阐明地那样，制备式I 化合物。本领域普通技术人员可以容易地得到试剂和起始材料。除非另有规定，否则所有取代基如前文所定义。应理解，这些流程、制备例和实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。

拆分的实例包括选择性结晶技术或手性色谱(参见例如J.Jacques等人,“Enantiomers,Racemates,and Resolutions”,John Wiley and Sons,Inc., 1981，以及E.L.Eliel和S.H.Wilen,“Stereochemistry of Organic Compounds”， Wiley-Interscience,1994)。本领域普通技术人员还应该清楚，通过色谱、手性色谱或选择性结晶的个体非对映体或几何异构体的分离或离析，可在合成中的任何方便点发生。

如本文所使用，“δ”是指从四甲基硅烷起的低场的百万分之位移；“min”是指分钟；“THF”是指四氢呋喃；“MeOH”是指甲醇或甲基醇；“HPLC”是指高效液相色谱；

术语“Ac”是指下面结构的乙酰基取代基：

术语“Bz”是指下面结构的苯甲酰基取代基：

术语“BOC”是指叔丁基氧基羰基保护基。

具体实施方式

流程1

制备例1

(4-溴-2-甲基-苯基)甲醇

流程1，步骤A：将硼烷-四氢呋喃复合物(0.2mol，200mL，1.0M溶液) 加至4-溴-2-甲基苯甲酸(39g，0.18mol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液中。在室温18小时后，减压除去溶剂以得到固体。通过快速色谱纯化，收获为白色固体的标题化合物(32.9g，0.16mol)。1HNMR(CDCl3)：δ1.55(s,1H),2.28 (s,3H),4.61(s,2H),7.18-7.29(m,3H)。

(4-溴-2-甲基-苯基)甲醇的替代合成

在3℃将硼烷-二甲硫醚复合物(2M于THF中；116mL，0.232mol)缓慢地加至4-溴-2-甲基苯甲酸(24.3g，0.113mol)在无水四氢呋喃(THF,146mL) 中的溶液中。搅拌冷却10min后，除去冷却浴，将反应缓慢升温至环境温度。 1小时后，将溶液冷却至5℃，缓慢加入水(100mL)。加入乙酸乙酯(100mL)，分离各相。将有机层用饱和NaHCO 3 水溶液(200mL)洗涤，经Na 2 SO 4 干燥。过滤以及减压浓缩，得到残留物，其通过用15％乙酸乙酯/异己烷洗脱的二氧化硅短柱过滤来纯化，得到标题化合物(20.7g，91.2％收率)。MS(m/z)： 183/185(M+1-18)。

制备例2

4-溴-1-氯甲基-2-甲基-苯

流程1，步骤B：在0℃将亚硫酰氯(14.31mL，0.2mol)加入至(4-溴-2-甲基-苯基)甲醇(32.9g，0.16mol)在二氯甲烷(200mL)和二甲基甲酰胺 (0.025mol，2.0mL)中的溶液。在室温1小时后，将混合物倒入冰水(100g)，用二氯甲烷(300mL)萃取，用5％碳酸氢钠水溶液(30mL)和盐水(200mL)洗涤萃取液，经硫酸钠干燥，减压浓缩，得到为白色固体的粗标题化合物(35.0g，0.16mol)。材料不经进一步纯化即可用于反应的下一步骤。1H NMR (CDCl3)：δ2.38(s,3H),4.52(s,2H),7.13-7.35(m,3H)。

4-溴-1-氯甲基-2-甲基-苯的替代合成

将甲磺酰氯(6.83mL，88.3mmol)缓慢地加至于冰/水中冷却的(4-溴-2- 甲基-苯基)甲醇(16.14g，80.27mmol)和三乙胺(16.78mL；120.4mmol)在二氯甲烷(80.7mL)中的溶液。将混合物缓慢地升温至环境温度，搅拌16小时。加入更多的甲磺酰氯(1.24mL；16.1mmol)，将混合物在环境温度搅拌2小时。加入水(80mL)，分离各相。将有机层用盐酸(1N；80mL)洗涤，接着用饱和碳酸氢钠水溶液(80mL)、然后用水(80mL)洗涤，经Na 2 SO 4 干燥。过滤以及减压浓缩，得到残留物，其通过快速色谱(用己烷洗脱)纯化，得到标题化合物(14.2g；80.5％收率)。1H NMR(300.11MHz,CDCl 3 )：δ7.36-7.30(m, 2H),7.18(d,J＝8.1Hz,1H),4.55(s,2H),2.41(s,3H)。

制备例3

4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基-1H-吡唑-3-醇

流程1，步骤C：在0℃将氢化钠(8.29g，0.21mol，60％分散体于油中) 加入至4-甲基-3-氧代戊酸甲酯(27.1mL，0.19mol)在四氢呋喃中的溶液。在室温30min后，加入4-溴-1-氯甲基-2-甲基-苯(35.0g，0.16mol)在四氢呋喃 (50mL)中的溶液。将所得混合物在70℃加热过夜(18小时)。加入1.0M HCl (20mL)以淬灭反应。用乙酸乙酯萃取(200mL)，用水(200mL)和盐水(200mL) 洗涤萃取液，经Na 2 SO 4 干燥，过滤，减压浓缩。将所得残留物溶解于甲苯 (200mL)中，加入肼一水合物(23.3mL，0.48mol)。在120℃用Dean-Stark装置加热混合物2小时以除去水。冷却，减压除去溶剂，将残留物用二氯甲烷(50mL)和甲醇(50mL)溶解。将该溶液缓慢地倒入含有水(250mL)的烧杯。通过真空过滤收集所得沉淀产物。于40℃在烘箱中真空干燥过夜，收获为固体的标题化合物(48.0g，0.16mol)。MS(m/z)：311.0(M+1),309.0(M-1)。

4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基-1H-吡唑-3-醇的替代合成

制备4-溴-1-氯甲基-2-甲基-苯(13.16g，59.95mmol)在乙腈(65.8mL)中的溶液。加入碳酸钾(24.86g，179.9mmol)、碘化钾(11.94g，71.94mmol)和4- 甲基-3-氧代戊酸甲酯(8.96mL；62.95mmol)。将所得混合物在环境温度搅拌 20小时。加入盐酸(2N)，得到pH 3。将溶液用乙酸乙酯(100ml)萃取，将有机相用盐水(100ml)洗涤，经Na 2 SO 4 干燥。过滤混合物，减压浓缩。将残留物溶解于甲苯(65.8mL)中，加入肼一水合物(13.7mL，0.180mol)。将所得混合物加热至回流，使用Dean和Stark装置除去水。3小时后，将混合物冷却至90℃，加入另外的肼一水合物(13.7mL；0.180mol)，将混合物加热至回流达1小时。将混合物冷却，减压浓缩。将所得固体用水(200mL)研磨，过滤，于60℃在真空烘箱中经P 2 O 5 干燥。将固体在异己烷(200mL)中研磨，过滤，得到标题化合物(14.3g；77.1％收率)。MS(m/z)：309/311(M+1)。

制备例4

4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D- 吡喃葡萄糖苷

流程1,步骤D：向1L烧瓶加入4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基 -1H-吡唑-3-醇(20g，64.7mmol)、α-D-吡喃葡萄糖基溴化物四苯甲酸酯(50g，76mmol)、苄基三丁基氯化铵(6g，19.4mmol)、二氯甲烷(500mL)、碳酸钾 (44.7g，323mmol)和水(100mL)。将反应混合物在室温搅拌过夜。用二氯甲烷(500mL)萃取。用水(300mL)和盐水(500mL)洗涤萃取液。经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化残留物，收获标题化合物(37g，64mmol)。MS(m/z)：889.2(M+1),887.2(M-1)。

制备例5

4-{4-[(1E)-4-羟基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷

流程1，步骤E：将3-丁烯-1-醇(0.58mL，6.8mmol)加至4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (3g，3.4mmol)在乙腈(30mL)和三乙胺(20mL)中的溶液。将溶液用氮气脱气 10分钟。加入三邻甲苯基膦(205mg，0.67mmol)和乙酸钯(76mg，0.34mmol)。在90℃回流2小时。冷却至室温，减压浓缩以除去溶剂。通过快速色谱纯化残留物，收获标题化合物(2.1g，2.4mmol)。MS(m/z)：878.4(M+1)。

制备例6

4-{4-[(1E)-4-氧基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷

流程1，步骤F：在0℃、将3,3,3-三乙酰氧基-3-碘苯并呋喃酮 (phthalide)(134mg，0.96mmol)加入4-{4-[(1E)-4-羟基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (280mg，0.32mmol)和碳酸氢钠(133.8mg，1.6mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。在室温15分钟后，用饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)淬灭反应。用二氯甲烷(30mL)萃取。用水(30mL)和盐水(40mL)洗涤萃取液。经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(270mg，0.31mmol)。MS(m/z)：876.5(M+1),874.5(M-1)。

制备例7

2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯

流程1，步骤G：将三乙酰氧基硼氢化钠(98mg，0.46mmol)加入至 4-{4-[(1E)-4-氧基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基 2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(270mg，0.31mmol)和2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯盐酸盐(179mg，0.62mmol)在1,2-二氯乙烷(5mL) 中的溶液。在室温30分钟后，用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭反应。用二氯甲烷(30mL)萃取。用水(30mL)和盐水(40mL)洗涤萃取液，经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(275mg，0.25mmol)。MS(m/z)：1115.6(M+1)。

制备例8

4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷二盐酸盐

流程1，步骤H：将氯化氢(4.0M于1,4-二噁烷中的溶液，0.6mL，2.4mmol) 加入至2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺 [5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯(275mg，0.25mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在室温过夜(18小时)后，减压浓缩以除去溶剂，收获为固体的标题化合物 (258mg，0.24mmol)。MS(m/z)：1015.6(M+1)。

流程2

制备例9

4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷

流程2，步骤A：向1L烧瓶加入4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基-1H-吡唑-3-醇(24g，77.6mmol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基溴化物(50.4g，116mmol)、苄基三丁基氯化铵(5g，15.5mmol)、二氯甲烷(250mL)、碳酸钾(32g，323mmol)和水(120mL)。将反应混合物在室温搅拌过夜。用二氯甲烷萃取(450mL)。用水(300mL)和盐水(500mL)洗涤萃取液。经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(36.5g，57mmol)。MS(m/z)：638.5(M+1),636.5(M-1)。

4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D- 吡喃葡萄糖苷的替代合成

将试剂4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基-1H-吡唑-3-醇(24.0g，77.6mmol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基溴化物(50.4g， 116mmol)、苄基三丁基氯化铵(4.94g，15.52mmol)、碳酸钾(32.18g， 232.9mmol)、二氯甲烷(250mL)和水(120mL)合并，将混合物在环境温度搅拌18小时。将混合物在二氯甲烷(250mL)和水(250mL)之间分配。有机相用盐水(250mL)洗涤，经Na 2 SO 4 干燥，过滤，减压浓缩。通过快速色谱(用10％在二氯甲烷中的乙酸乙酯至70％在二氯甲烷中的乙酸乙酯洗脱)纯化所得残留物，得到标题化合物(36.5g，74％收率)。MS(m/z)：639/641(M+1)。

制备例10

4-{4-[(1E)-4-羟基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷

流程2，步骤B：将3-丁烯-1-醇(6.1mL，70mmol)加入至4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (15g，23.5mmol)在乙腈(200mL)和三乙胺(50mL)中的溶液。将溶液用氮气脱气10分钟。加入三邻甲苯基膦(1.43g，4.7mmol)和乙酸钯(526mg， 2.35mmol)。在90℃回流2小时后，冷却，减压浓缩以除去溶剂。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(7.5g，11.9mmol)。MS(m/z)：631.2(M+1),629.2(M-1)。

制备例11

4-{4-[(1E)-4-氧基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷

流程2，步骤C：在0℃将3,3,3-三乙酰氧基-3-碘苯并呋喃酮(2.1g, 4.76mmol)加入至4-{4-[(1E)-4-羟基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2- 基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.5g，2.38mmol) 和碳酸氢钠(2g，23.8mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液。在室温15分钟后，用饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)淬灭反应。用二氯甲烷(30mL)萃取，用水 (30mL)和盐水(40mL)洗涤萃取液。经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(0.95g，1.51mmol)。MS (m/z)：628.8(M+1),626.8(M-1)。

制备例12a

2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷 -9-甲酸叔丁酯

流程2，步骤D：将三乙酰氧基硼氢化钠(303mg，1.4mmol)加入至 4-{4-[(1E)-4-氧基丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(600mg，0.95mmol)和2,9-二氮杂螺 [5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯盐酸盐(333mg，1.2mmol)在1,2-二氯乙烷(30mL) 中的溶液。在室温30分钟后，用饱和碳酸氢钠水溶液(15mL)淬灭反应。用二氯甲烷(60mL)萃取。用水(30mL)和盐水(60mL)洗涤萃取液。经硫酸钠干燥有机相，过滤，减压浓缩。通过快速色谱纯化所得残留物，收获标题化合物(500mg，0.58mmol)。

MS(m/z)：866.8,867.8(M+1),864.8,865.8(M-1)。

制备例13

4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷二盐酸盐

流程2，步骤E：将氯化氢(4.0M于1,4-二噁烷中的溶液，1.5mL，5.8mmol) 加入至2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5] 十一烷-9-甲酸叔丁酯(500mg，0.58mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。在室温2小时后，减压浓缩以除去溶剂，收获为固体的标题化合物(480mg， 0.57mmol)。MS(m/z)：767.4(M+1)。

流程3

制备例14

4-丁-3-炔基-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯

流程3，步骤A：将碳酸铯(46.66g，143.21mmol)加入至4,9-二氮杂螺[5.5] 十一烷-9-甲酸叔丁酯盐酸盐(16.66g，57.28mmol)在乙腈(167mL)中的混悬液。将混合物在环境温度搅拌10分钟，然后加入4-溴丁炔(6.45mL，68.74mmol)。将反应加热至回流，搅拌18小时。将混合物冷却，减压浓缩。将残留物在水(200mL)与乙酸乙酯(150mL)之间分配。分离各相，水层用乙酸乙酯(100mL)萃取。将合并的有机层用水(200mL)、然后用盐水(150mL) 洗涤，经MgSO 4 干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(17.2g，98％收率)。 1H NMR(300.11MHz,CDCl3)：δ3.43-3.31(m,4H),2.53-2.48(m,2H), 2.37-2.29(m,4H),2.20(s,2H),1.94(t,J＝2.6Hz,1H),1.44(s,17H)。

制备例15

4-[(E)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)丁-3-烯基]-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯的合成

流程3，步骤B：将三乙胺(5.62mmol；0.783mL)、4,4,5,5-四甲基-1,3,2- 二氧硼杂环戊烷(8.56mL，59.0mmol)和二茂锆氯化物(1.45g，5.62mmol)加至4-丁-3-炔基-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯(17.21g， 56.16mmol)。将所得混合物加热至65℃达3.5小时。将混合物冷却，溶解于二氯甲烷(150mL)中。将所得溶液通过～4cm厚硅胶垫，用二氯甲烷(2x 200mL)洗脱。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(21.2g，87％收率)。1H NMR(300.11MHz,CDCl3)：δ6.65-6.55(m,1H),5.49-5.43(m,1H),3.42-3.29(m, 4H),2.40-2.27(m,6H),2.25-2.08(m,2H),1.70–1.13(m,29H)。

制备例16

2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基} 甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯

流程3，步骤C：将4-(4-溴-2-甲基苄基)-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(20g，31.3mmol)、4-[(E)-4-(4,4,5,5- 四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)丁-3-烯基]-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9- 甲酸叔丁酯(16.3g，37.5mmol)和碳酸钾(12.97g，93.82mmol)在四氢呋喃 (200mL)和水(40mL)中的溶液通过鼓泡氮气穿过其而脱气15min。加入 Pd(OAc) 2 (140mg，625μmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三-异丙基-1,1'-联苯 (0.596g，1.25mmol)，将反应加热至回流达16h。将溶液冷却至环境温度，加入甲醇(200mL)。30分钟后将溶剂减压除去。将混合物在乙酸乙酯(500mL) 和盐水(500ml)之间分配，加入MgSO 4 水溶液(1M；500ml)以助于各相分离。分离各层，将有机层经MgSO 4 干燥，通过10cm硅胶垫过滤，用乙酸乙酯 (～1.5L)洗脱。弃去滤液，将二氧化硅垫用5％于THF(2L)中的MeOH冲洗。将甲醇滤液减压浓缩，得到标题化合物(20.1g,92％)。

MS(m/z)：699(M+1)。

流程4

制备例17

4-[(E)-4-[4-[(3-羟基-5-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基]-3-甲基-苯基]丁-3- 烯基]-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯

流程4，步骤A：在室温，将4-[(E)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)丁-3-烯基]-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯(35.8kg,82.4 mol)的甲醇(130L)溶液加入到(4-[(4-溴-2-甲基-苯基)甲基]-5-异丙基-1H-吡唑-3-醇(23.9kg,77.3mol)的甲醇(440L)溶液中。加入水(590L)和磷酸三钾(100kg,471.7mol)，并将反应置于氮气气氛下。向搅拌的溶液中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(1.42kg,1.55mol)和二-叔丁基甲基四氟硼酸盐 (775g,3.12mol)的甲醇(15L)混悬液。将得到的混合物在75℃加热2小时。冷却混合物并通过硅藻土过滤。将滤饼用甲醇(60L)淋洗，并在减压下浓缩滤液。加入乙酸乙酯(300L)，分离各层，并用15％盐水(3x 120L) 洗涤有机层。在减压下浓缩有机层，加入乙酸乙酯(300L)，将混合物搅拌 18至20小时。加入庚烷(300L)，冷却混合物至10℃，并将混合物再搅拌 18至20小时。通过过滤收集得到的固体，用乙酸乙酯/庚烷(2:3,2x 90L)淋洗滤饼，并在40℃在真空下干燥，得到标题化合物(29.3kg,70.6％收率)，为白色固体。1HNMR(400MHz,CD 3 OD):δ7.14(s,1H),7.07(d,J＝8.0Hz, 1H),6.92(d,J＝7.6Hz,1H),6.39(d,J＝16.0Hz,1H),6.25-6.12(m,1H),3.63 (s,2H),3.45-3.38(bs,3H),3.34(s,3H),3.33(s,3H),2.85-2.75(m,1H), 2.49-2.40(m,5H),2.33(s,3H),1.68-1.62(m,2H),1.60-1.36(m,15H),1.11 (s,3H),1.10(s,3H).

制备例12b

2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯的替代制备

流程4，步骤B:在室温，合并4-[(E)-4-[4-[(3-羟基-5-异丙基-1H- 吡唑-4-基)甲基]-3-甲基-苯基]丁-3-烯基]-4,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯(17.83kg,33.2mol)、乙腈(180L)和苄基三丁基氯化铵(1.52kg,4.87 mol)。缓慢加入碳酸钾(27.6kg,199.7mol)，并将混合物搅拌2小时。加入 2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基溴化物(24.9kg,60.55mol)，将反应混合物升温至30℃并搅拌18小时。在减压下浓缩混合物，加入乙酸乙酯 (180L)，随后加入水(90L)。分离各层，用15％盐水(3x 90L)洗涤有机相，浓缩混合物，采用硅胶柱色谱法纯化(63kg,乙酸乙酯/庚烷作为洗脱剂 (1:2→1:0))，提供标题化合物(19.8kg,94％纯度,68.8％收率)，为黄色泡沫状物。1H NMR(400MHz,CDCl 3 ):δ7.13(s,1H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H), 6.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.36(d,J＝16.0,1H),6.25-6.13(m,1H),5.64(d,J＝ 8.0Hz,1H),5.45-5.25(m,2H),5.13-4.95(m,2H),4.84-4.76(m,1H),4.25-4.13(m,2H),4.10-4.00(m,2H),3.90-3.86(m,1H),3.58-3.50(m,2H), 3.40-3.22(m,4H),2.89-2.79(m,1H),2.10-1.90(m,18H),1.82(s,3H), 1.62-0.82(m,22H).

制备例18

2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷

流程4，步骤C:合并2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-[(2,3,4,6- 四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑-4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1- 基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯(19.6kg,22.6mol)和二氯甲烷 (120L)，并冷却至0℃。缓慢加入三氟乙酸(34.6L,51.6kg,452mol)并搅拌 9小时。用冰水(80L)淬灭反应物，加入氢氧化铵(85-90L)以调节反应混合物至pH(8-9)。加入二氯甲烷(120L)，使反应混合物升温至室温，分离各层。用水(75L)、盐水洗涤有机层，在减压下浓缩，提供标题化合物(16.2kg,95.0％纯度,93％收率)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl 3 ):δ7.08(s, 1H),6.99(d,J＝8.0Hz,1H),6.76(d,J＝7.6Hz,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H), 6.00-5.83(m,1H),5.31(d,J＝7.6Hz,1H),5.25-5.13(m,4H),4.32(dd,J＝12.8, 9.2Hz,1H),4.14(d,J＝11.2Hz,1H),3.90(d,J＝10.0Hz,1H),3.75-3.50(m, 3H),3.30-3.00(m,5H),2.85-2.75(m,1H),2.70-2.48(m,3H),2.25(s,1H), 2.13-1.63(m,19H),1.32-1.21(m,1H),1.14(s,3H),1.13(s,3H),1.12(s,3H), 1.10(s,3H).

实施例1

水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐

4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}- 5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷(游离碱)的第一种替代制备

流程1，步骤I:将氢氧化钠(0.5mL,0.5mmol,1.0M溶液)加入到 4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷二盐酸盐(258mg,0.24mmol)的甲醇(2mL)溶液中。在40℃2小时后，在减压下浓缩以除去溶剂，得到残留物，将其通过制备HPLC方法纯化：高 pH,25％B，4min；25-40B％，4min；@85mL/min，采用30x 75mm,5μm C18XBridge ODB柱,溶剂A–含有NH 4 HCO 3 的H 2 O@pH 10,溶剂B– MeCN，得到为固体的标题化合物(游离碱)(46mg,0.08mmol).MS(m/z): 598.8(M+1),596.8(M-1).

4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}- 5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷(游离碱)的第二种替代制备

流程2，步骤F:将甲醇(5mL)、三乙胺(3mL)和水(3mL)加入到 4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷二盐酸盐(480mg,0.24mmol)中。在室温18小时(过夜)后，在减压下浓缩至干。通过制备HPLC方法纯化得到的残留物：高pH,25％B,4min；25-40B％,4 min；@85mL/min，采用30x 75mm,5μm C18XBridge ODB柱,溶剂A–含有NH 4 HCO 3 的H 2 O@pH 10,溶剂B–MeCN，得到为固体的标题化合物(游离碱)(50mg,0.08mmol).

MS(m/z):598.8(M+1),596.8(M-1).1H NMR(400.31MHz,CD 3 OD): δ7.11(d,J＝1.3Hz,1H),7.04(dd,J＝1.3,8.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.0Hz,1H), 6.36(d,J＝15.8Hz,1H),6.16(dt,J＝15.8,6.3Hz,1H),5.02(m,1H),3.81(d, J＝11.7Hz,1H),3.72(d,J＝16.8Hz,1H),3.68(d,J＝16.8Hz,1H),3.64(m, 1H),3.37-3.29(m,4H),2.79(m,1H),2.72(t,J＝5.8Hz,4H),2.44-2.33(m, 6H),2.30(s,3H),2.26(宽s,2H),1.59(m,2H),1.50(m,2H),1.43(m,2H), 1.36(m,2H),1.11(d,J＝7.0Hz,3H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H).

4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}- 5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷的第三种替代制备

流程3，步骤D:将三氟乙酸(32.2mL；0.426mol)加入到在冰水中冷却的2-{(3E)-4-[3-甲基-4-({5-(丙-2-基)-3-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-1H-吡唑 -4-基}甲基)苯基]丁-3-烯-1-基}-2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸叔丁酯 (14.87g；21.28mmol)的二氯甲烷(149mL)溶液中。使溶液升到室温，30分钟后，将混合物缓慢加入到氨的MeOH溶液(2M；300mL)中，必要的话应用冷却以保持恒定温度。将溶液在室温搅拌15min。将混合物在减压下浓缩，采用SCX-2树脂纯化残留物。将碱性滤液在减压下浓缩，并将残留物在乙酸乙酯中研磨/声处理，过滤并干燥。将得到的固体溶解在MeOH (200mL)中，并在真空中浓缩。将其重复数次，得到标题化合物(游离碱) (12.22g,收率96％).MS(m/z):599(M+1)；[α]D20＝-12°(C＝0.2, MeOH).

最终的标题化合物：水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2- 基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐的 制备

将4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷(902mg)置于圆底烧瓶 (100mL)中，并用湿的乙酸乙酯(18mL)处理。[注解-湿的乙酸乙酯如下制备：混合乙酸乙酯(100mL)和去离子水(100mL)。混合后，将各层分离，并移出顶部湿的乙酸乙酯层，待用。乙酸是乙酸乙酯的水解产物，并存在于湿的乙酸乙酯中。]随着湿的乙酸乙酯加入，化合物溶解，尽管溶解不完全。数分钟后，形成白色沉淀。加入另外量的湿的乙酸乙酯(2mL)，以溶解剩余的化合物。在未加盖的情况下将溶液在室温搅拌过夜，在此期间溶剂部分蒸发。在真空下从产物浆体中除去剩余的溶剂，将得到的固体在氮气流下干燥，得到为结晶固体的最终标题化合物。通过固态NMR在产物中鉴定小量的无定形材料。该结晶的最终标题化合物可以用作制备另外的结晶最终标题化合物的晶种。

最终标题化合物：水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2- 基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐的 替代制备

在氮气气氛下，合并4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1- 烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D- 吡喃葡萄糖苷(2.1kg,2.74mol)、甲醇(4.4L)、四氢呋喃(4.2L)和水(210 mL)。加入碳酸钾(460g,3.33mol)并搅拌4至6小时，然后过滤反应混合物，以除去固体。在减压下浓缩滤液，然后加入乙醇(9.0L)，随后加入乙酸(237mL,4.13mol)，并在室温搅拌1小时。向搅拌的溶液中，历经5小时缓慢地加入湿的乙酸乙酯(10L,含有约3w/w％水)，随后加入水(500 mL)。将混悬液搅拌12小时，历经8小时加入湿的乙酸乙酯(4.95L,含有约3w/w％水)。将混悬液搅拌12小时，历经16小时缓慢地加入另外的湿的乙酸乙酯(11.5L,含有约3w/w％水)。将混悬液搅拌12小时，通过过滤收集固体并用湿的乙酸乙酯(3.3L,含有约3w/w％水)淋洗固体。在烘箱中在减压、30℃以下干燥，得到为灰白色结晶固体的标题化合物(1.55kg,2.35 mol,96.7％纯度,72.4w/w％效能(potency),基于效能68.0％收率)。 HRMS(m/z):599.3798(M+1).

X-射线粉末衍射(XRD)

在装配有CuKα源和Linxeye检测器、在40kV和40 mA运行的Bruker D8Advance X-射线粉末衍射仪上获得所述结晶固体的XRD图。将样品在4至40°2-θ间扫描，步长为0.0084°2-θ，扫描速率为 0.5秒/步，并且具有0.2mm的发散狭缝。将干粉末安置于低背景硅石样品座上，利用玻璃载玻片获得平滑的表面。在22℃和42％相对湿度采集晶形衍射图。在结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的晶形，由于某些因素例如晶体形态学引起的优选定向，衍射峰的相对强度可能改变。在优选定向效应存在时，峰强度被改变，但是多晶型物的特征峰位置未被改变。参见例如美国药典(The United StatesPharmacopeia)#23，国家处方集 (National Formulary)#18,1843-1844页,1995。此外，在结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的晶形，角度峰位置可能稍微改变。例如，由于样品被分析处的温度或湿度改变、样品移位或者存在或不存在内标，峰位置可能移动。在本案中，±0.2 2-θ的峰位置变化将考虑在内，这些可能的变化不会阻碍所指示的晶形的明确鉴定。可以基于区别峰(以°2-θ为单位)通常是比较突出的峰的任何独特组合，确认晶形。基于在8.853和26.774度 2-θ的National Bureau of Standards(NBS)675标准峰，调整在环境温度和相对湿度采集的晶形衍射图。

水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐的制备的样品特征在于采用CuKα辐射、具有下面表1中描述的衍射峰(2-θ值) 的XRD数据 ，其特别是具有在5.2°的峰以及一个或多个选自7.8°、8.0°和10.7° (分别±0.2°)的峰。

水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]- 2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐的X-射线粉末衍射峰

表1

13 C固态NMR( 13C ssNMR)

采用在100.622MHz的碳频率和400.131MHz的质子频率运行且装配有Bruker 4mm双共振探头的Bruker Avance II 400MHz NMR波谱仪获得13C交叉极化/魔角旋转NMR(固态NMR或ssNMR)谱。使用TOSS边带抑制以及应用SPINAL64去偶和RAMP100成形的H-核CP脉冲的交叉极化。采集参数如下：2.6μs的90°质子r.f.脉冲宽度，接触时间为2.0ms，脉冲重复时间3s，MAS频率10kHz，波谱宽度30kHz，采集时间为34ms，扫描数为18,661。在各实验中，化学位移参比金刚烷(δ＝29.5ppm)。

水合的结晶的4-{4-[(1E)-4-(2,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-2-基)丁-1-烯-1-基]-2-甲基苄基}-5-(丙-2-基)-1H-吡唑-3-基β-D-吡喃葡萄糖苷乙酸盐的代表性13CssNMR共振包括：181.8,161.2,160.0,147.6,137.4,135.9,135.3, 132.6,131.6,129.4,127.3,126.4,122.2,101.9,99.7,98.5,97.9,78.3,77.7,77.2, 76.3,75.6,69.1,68.1,64.2,62.6,60.1,56.1,54.2,41.7,40.5,39.1,34.7,32.3, 31.5,31.0,29.2,27.8,26.4,23.8,20.8,19.9,18.4和16.9ppm(分别±0.2 ppm)。

钠依赖性葡萄糖转运蛋白1(SGLT1)和SGLT2测定

编码人SGLT1(slc5a1,NM_000343)、人SGLT2(slc5a2,NM_003041) 和小鼠SGLT1(slc5a1,NM_019810.4)的cDNA分别购自Openbiosystems、 Invitrogen和Openbiosystems。将cDNA克隆到pcDNA3.1+中用于哺乳动物表达，使用标准哺乳动物转染操作将其稳定地转染到中国仓鼠卵巢 (CHO)-K1细胞中。基于对新霉素(遗传霉素,Invitrogen)的抗性和14C-α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷(14C-AMG)摄取测定(参见下文)中的活性，选择每个过表达细胞系的SGLT表达亚克隆。使用标准细胞培养技术保持稳定SGLT 表达细胞。

SGLT活性被如下描述的以上细胞系中的钠依赖性14C-AMG摄取来测量。将100μL含有30,000个细胞的培养基接种至96孔BioCoat聚-D-赖氨酸板(Becton Dickson)的各孔，在37℃培养过夜。吸取培养基，将细胞用 200μL反应缓冲液(140mM NaCl、2mM KCl、1mMCaCl 2 、MgCl 2 和14mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(Hepes)，pH 7.5)洗涤两次。将过量缓冲液抽取到纸巾上。将35μL反应缓冲液加至各孔。含有不同浓度的试验化合物或不含化合物(作为对照)的5μL 10％于反应缓冲液中的二甲基亚砜(DMSO) 分散于各孔中。通过加入10 μ L于反应缓冲液中的14C-AMG以使最终浓度为4μM来起始反应。将平板在37℃温育125分钟。通过吸取反应缓冲液、然后用200μL冰冷的反应缓冲液洗涤三次来终止反应。应用手动抽吸以确保反应缓冲液完全除去。将10μL 0.1N NaOH加入至各孔，然后加入100μL Supermix闪烁合剂(PerkinElmer)。混合后，将平板中的闪烁信号于 MicroBeta(PerkinElmer)中计数。使用ActivityBase(ID Business溶液)将10 剂量响应曲线拟合至经验四参数模型，以确定在半数最大抑制时的抑制剂浓度(IC 50 )。基本上如上所述测试实施例1的游离碱。

表2：实施例1的游离碱针对SGLT1和SGLT2的体外功效

更具体地，表2中的数据表明：实施例1的游离碱体外抑制人和小鼠 SGLT1，并且体外对人和小鼠SGLT1比对人SGLT2更有效。

口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中的葡萄糖降低效应

通过将1％羟基乙基纤维素、含有0.05％止泡剂的0.25％80的媒介物加入至预称重的试验化合物以制备1mg/ml溶液，来配制试验化合物。将混合物探针超声处理约30秒。所得溶液用作储备溶液，由储备溶液通过用媒介物稀释来制备较低浓度剂量溶液。

在试验日之前的午后，通过移除食物将单个关养的C57Bl/6小鼠禁食过夜。第二天早上，对小鼠称重，通过剪尾巴采集单个空腹血样，用血糖仪(Roche AccuChek)测量葡萄糖。研究组(n＝5)基于空腹血糖而确定，并且优选包括在80-100mg/dl葡萄糖范围内的动物。

分组后，用10ml/kg试验化合物制剂对第一小鼠经口管饲并且启动计时器。以1分钟半的间隔对各后续动物给药。第一化合物治疗启动后3小时，采集基线血样用于测量葡萄糖(来自第一动物，经由剪尾巴)。然后立即以3g/kg给予动物50％葡萄糖(Hospira)的口服剂量。通过尾静脉采集葡萄糖的血样，确切地以1分钟半的间隔，以使在葡萄糖剂量后20、40、60 和120分钟在各动物中收集血液。

表3.OGTT中的葡萄糖降低效应

如上表3中示出，于正常血糖C57Bl/6小鼠中服用50％葡萄糖的口服大丸剂后，实施例1的游离碱产生葡萄糖波动的剂量依赖性下降。实施例1的游离碱还表明在OGTT期间经基线调节的葡萄糖曲线下面积(AUC)的剂量依赖性下降。而且，实施例1的游离碱在OGTT期间剂量依赖性地降低血浆葡萄糖的平均最大浓度(Cmax)。

在混合膳食耐量试验中患有链脲霉素诱导的糖尿病的雄性大鼠的葡萄糖值

已施用链脲霉素(STZ)的大鼠患上糖尿病。在这些动物中调节葡萄糖水平的活性剂据信可用于治疗人的糖尿病。

通过将1％羟基乙基纤维素(HEC)、含有0.05％止泡剂的0.25％ 80的媒介物加入至预称重的试验化合物以得到2.5mg/ml溶液，来配制试验化合物。将混合物探针超声处理约30秒。所得溶液用作储备溶液，由储备溶液、通过用媒介物稀释来制备较低浓度剂量溶液。通过以3ml等分试样溶解于0.1M柠檬酸盐缓冲液来配制45mg/kg的STZ，且在未施用时于暗处贮存于冰上。利用包含脂肪热量(60％)、碳水化合物热量(26％)和蛋白质热量(15％)的高脂肪含量混合餐(Rodent Diet F3282High Fat)。使单个关养的Sprague Dawley大鼠适应3至7天的时间。

为了确保动物最近未被喂养，下午施用STZ，约6小时进入光照循环 (6am开灯，6pm关灯)。用异氟烷麻醉动物，将STZ经由尾静脉注射递送。一旦动物恢复知觉，将它们返回关养，允许恢复7天。

在膳食耐量试验(MTT)前两天，对所有大鼠给予少量(2-4g)的F3282饮食，于是它们在实验期间接受饮食之前对它适应。在实验前的晚上，将大鼠移入清洁笼子，移除它们的食物。第二天早上，对动物称重，通过剪尾巴采集血样以用于葡萄糖测量(AbbottAlphaTRAKTM血糖仪：编码29)。基于禁食体重和葡萄糖将动物分组n＝6。口服施用试验化合物后30分钟，收集两个葡萄糖测量结果。然后给予5克球团状饮食3282。20分钟后，取走剩余食物并称重。在20、40、60和120分钟采集血样以用于葡萄糖测量。

表4.在混合MTT中患有STZ-诱导的糖尿病的雄性大鼠的葡萄糖值

如上文表4中所示，相比于媒介物对照，在MTT中实施例1的游离碱显著地且剂量依赖性地降低葡萄糖。相比于对照，阿卡波糖(其为阳性对照) 在任何时间点未显著地降低葡萄糖。此外，葡萄糖基线调节的AUC的剂量依赖性下降与实施例1的游离碱治疗相关。阿卡波糖使葡萄糖AUC显著地降至与10mg/kg的实施例1类似的水平。表4表明实施例1的游离碱调节雄性大鼠的葡萄糖水平。