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1. JP2020018305 - SYNTHETIC BRASSICA-DERIVED CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES

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Description

Title of Invention 合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド US 61/625,222 20120417 1.TWEEN

Technical Field

0001   0002   0003  

Background Art

0004   0005   0006   0007   0008   0009  

Summary of Invention

Technical Problem

0010  

Technical Solution

0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018  

Brief Description of Drawings

0019  

Description of Embodiments

0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111  

Example 1

0112   0113  

Example 2

0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123  

Example 3

0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257   0258   0259   0260   0261   0262   0263   0264   0265   0266   0267   0268   0269   0270   0271   0272   0273   0274   0275   0276   0277   0278   0279   0280   0281   0282   0283   0284   0285   0286   0287   0288   0289   0290   0291   0292   0293   0294   0295   0296   0297   0298   0299   0300   0301   0302  

Example 4

0303   0304   0305   0306   0307   0308   0309   0310   0311   0312   0313   0314   0315   0316   0317   0318   0319   0320   0321  

Example 5

0322   0323   0324   0325   0326   0327  

Claims

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76    

Drawings

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   20191004A16333全文3

Claims

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   A1633003273 0327   20191031A16333全文3

Claims

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22    

Description

合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド

US 61/625,222 20120417 1.TWEEN

Technical Field

[0001]
優先権の主張
本願は、2012年4月17日に出願された米国特許仮出願番号第61/625,22
2号の利益を主張する。
[0002]
37 C.F.R.§ 1.821(c)または(e)に従う声明−ASCIIテキス
トファイルとして提出された配列表
37 C.F.R.§ 1.821(c)または(e)に準拠して、配列表のASCI
Iテキスト版を含有するファイルが、本願とともに提出されている。
[0003]
本開示は、プラスチド含有細胞のプラスチドへターゲッティングされるポリペプチドを
遺伝的にコードし、発現するための組成物および方法に関する。特定の実施形態では、本
開示は、ポリペプチドを葉緑体(例えば、高等植物の)にターゲッティングするアミノ酸
配列および/またはそれをコードする核酸分子に関する。特定の実施形態では、本開示は
、キメラポリペプチドのプラスチドへの輸送を制御するアミノ酸配列を含むキメラポリペ
プチドおよび/またはそれをコードする核酸分子に関する。

Background Art

[0004]
植物細胞は、特徴的な膜系によって区切られており、細胞内で特殊な機能を果たす、一
般に「プラスチド」と呼ばれる、個別の細胞内オルガネラを含有する。個々のプラスチド
は、光合成、ならびに特定の化学化合物の合成および保存に関与している。すべてのプラ
スチドは、植物の成長点領域中に存在するプロプラスチドに由来する。プロプラスチドは
、例えば、葉緑体、エチオプラスト、有色体、ゲロントプラスト(gerontoplasts)、白
色体、アミロプラスト、エライオプラストおよびプロテイノプラストに発達し得る。プラ
スチドは、細胞内に半自律的に存在し、自身の遺伝子系およびタンパク質合成機構を含有
するが、その発達および生合成活性において核細胞質系との密接な協力関係に依存してい
る。
[0005]
高等植物の光合成葉細胞では、最も顕著なプラスチドは葉緑体である。葉緑体の最も必
須の機能は、光合成の光によって駆動される反応の実施である。しかし、葉緑体はまた、
植物細胞にとって重要な多数のその他の生合成プロセスも実施する。例えば、細胞の脂肪
酸のすべては、葉緑体ストロマに局在する酵素によって、そこで容易に入手可能なATP
、NAOPHおよび炭水化物を使用して製造される。さらに、光活性化された電子の還元
力は、葉緑体における亜硝酸化合物(NO )のアンモニア(NH )への還元を駆動
し、このアンモニアが、植物に、アミノ酸およびヌクレオチドの合成に必要な窒素を提供
する。
[0006]
葉緑体はまた、農業化学産業において特に重要なプロセスに参加する。例えば、多くの
除草剤が、葉緑体内で実施される機能を遮断することによって作用するということがわか
っている。最近の研究によって、いくつかの除草剤の特異的標的が同定された。例えば、
トリアジン由来除草剤は、プラストキノン分子を、光化学系IIの32kDポリペプチド
中のその結合部位から移動させることによって光合成を阻害する。この32kDのポリペ
プチドは、葉緑体ゲノム中にコードされ、オルガネラ機構によって合成される。トリアジ
ン除草剤に対して耐性である突然変異体植物が得られている。これらの植物は、トリアジ
ン除草剤によってプラストキノンが、もはや移動され得ない突然変異体32kDポリペプ
チドを含有する。スルホニル尿素は、葉緑体においてアセト乳酸シンターゼを阻害する。
アセト乳酸シンターゼは、イソロイシンおよびバリン合成に関与している。グリホサート
は、芳香族アミノ酸の合成に関与する酵素である、5−エノールピルビル−3−ホスホシ
キミ酸シンターゼ(EPSPS)の機能を阻害する。すべてのこれらの酵素は、核ゲノム
によってコードされるが、葉緑体中に転位置され、そこで実際のアミノ酸合成が起こる。
[0007]
ほとんどの葉緑体タンパク質は、植物細胞の核中にコードされ、サイトゾルにおいて大
きな前駆体タンパク質として合成され、翻訳後、葉緑体中に輸送される。ストロマへの外
包膜および内包膜を越える輸送は、ストロマ、チラコイド膜およびチラコイドルーメンに
向かう予定であるタンパク質が入るための主要な手段である。チラコイド膜およびチラコ
イドルーメンへの輸送される前駆体タンパク質の局在性は、細菌タンパク質輸送系と相同
である2種を含めた4種の別個の機序によって達成される。したがって、葉緑体における
タンパク質局在性のための機序は、幾分かは、原核生物の内部共生体に由来する。Cline
and Henry (1996), Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。
[0008]
葉緑体発現に向かう予定である前駆体タンパク質は、葉緑体輸送ペプチド(CTP)と
して知られるN末端伸長部分を含有する。輸送ペプチドは、葉緑体表面の特異的認識およ
び葉緑体包膜を越える、ゆえに、葉緑体内の種々のサブコンパートメント(例えば、スト
ロマ、チラコイドおよびチラコイド膜)へのプレタンパク質の翻訳後転位置の媒介に役立
つ。これらのN末端輸送ペプチド配列は、葉緑体タンパク質のプラスチド中への輸送に必
要な情報のすべてを含有し、輸送ペプチド配列は、プラスチド輸送にとって必要であり、
十分である。
[0009]
そのN末端に天然にコードされる輸送ペプチド配列を有すると報告される植物遺伝子と
して、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ(RuBisCo)の葉緑体小サ
ブユニット(de Castro Silva-Filho et al. (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-80; Sch
nell et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42);EPSPS(例えば、Archer et
al. (1990), J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810および米国特許第6,867,29
3号、同7,045,684号およびRe.36,449を参照のこと);トリプトファ
ンシンターゼ(Zhao et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7);プラストシアニン
(Lawrence et al. (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63);コリスミ酸シンターゼ(S
chmidt et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57);集光性葉緑素a/b結合タン
パク質(LHBP)(Lamppa et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999);およ
びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の葉緑体タンパク質(Lee et al. (2008), P
lant Cell 20:1603-22)が挙げられる。米国特許出願公開US2010/0071090
は、クラミドモナス(Chlamydomonas)種に由来する特定の葉緑体ターゲッティングペプ
チドを提供する。

Summary of Invention

Technical Problem

[0010]
しかし、葉緑体ターゲッティングペプチドによってコードされる情報の構造的必要要件
は、その高レベルの配列多様性および共通またはコンセンサス配列モチーフの欠如のため
にわかりにくいままであるが、独立した構造モチーフを有する葉緑体ターゲッティングペ
プチドの別個のサブグループがある可能性がある。Lee et al. (2008)、前掲。さらに、
これらの配列の一部のものが、高等植物における葉緑体にターゲッティングされるタンパ
ク質の異種発現において有用である。

Technical Solution

[0011]
植物におけるポリペプチドのプラスチドターゲッティングのための組成物および方法が
、本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象とするヌクレ
オチド配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド(例えば、
TraP8ペプチドおよびTraP9ペプチド)をコードする少なくとも1種のヌクレオ
チド配列を含む核酸分子を含む。特定の実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植
物または双子葉植物における、対象とするヌクレオチド配列によってコードされるポリペ
プチドの発現およびターゲッティングにとって有用であり得る。対象とするヌクレオチド
配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドをコードする少な
くとも1種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターが、さらに記載される。
[0012]
いくつかの実施形態では、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列は
、アブラナ属種遺伝子(例えば、セイヨウアブラナ(B. napus)、B.ラパ(rapa)、カ
ラシナ(B. juncea)およびアビシニアガラシ(B. carinata))から得られた参照ヌクレ
オチド配列に由来するヌクレオチド配列またはその機能的変異体であり得る。いくつかの
実施形態では、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列は、アブラナ属
種遺伝子に由来するヌクレオチド配列をコードする部分CTPまたはその機能的変異体を
含むキメラヌクレオチド配列であり得る。特定の実施形態では、合成アブラナ属由来CT
Pをコードするヌクレオチド配列は、参照アブラナ属種CTPおよびアブラナ属種の異な
る遺伝子、異なるアブラナ属種または異なる生物(例えば、植物、原核生物および下等光
合成真核生物)に由来するCTPまたは前記のもののいずれかの機能的変異体の各々から
得られた連続するヌクレオチド配列を含有し得る。特定の実施形態では、連続するヌクレ
オチド配列は、参照アブラナ属種遺伝子(例えば、異なるアブラナ属種ゲノム)の異なる
生物のオーソログから得られる参照アブラナ属CTPのオーソロガスヌクレオチド配列か
ら得られ得る。これらおよびさらなる実施形態では、合成アブラナ属由来CTPをコード
するヌクレオチド配列は、2種以上のCTPをコードするヌクレオチド配列を含むキメラ
ヌクレオチド配列であり得る。
[0013]
いくつかの例では、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列は、セイ
ヨウアブラナ(B. napus)およびB.ラパ(rapa)のいずれかの由来の部分CTPヌクレ
オチド配列またはその機能的変異体を含むキメラヌクレオチド配列であり得る。特定の例
では、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列は、セイヨウアブラナ(
B. napus)およびB.ラパ(rapa)のいずれかから得られた連続ヌクレオチド配列または
その機能的を変異体を含有し得る。
[0014]
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするた
めの少なくとも1種のアブラナ属由来の手段を含む核酸分子を含む。対象とするヌクレオ
チド配列と作動可能に連結している、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするため
の少なくとも1種のアブラナ属由来の手段を含む核酸分子を含む核酸分子がさらに記載さ
れる。特定の実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植物または双子葉植物におけ
る、対象とするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現およびターゲ
ッティングにとって有用であり得る。本開示の目的上、ポリペプチドを葉緑体にターゲッ
ティングするためのアブラナ属由来の手段とは、特定の合成ヌクレオチド配列を指す。特
定の実施形態では、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのアブラナ属由来
の手段は、TraP8およびTraP9と本明細書において呼ばれるポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列からなる群から選択される。
[0015]
また、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来CT
Pをコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む植物材料(例え
ば、限定するものではないが、植物、植物組織および植物細胞)も本明細書において記載
される。いくつかの実施形態では、植物材料は、そのゲノム中に安定に組み込まれたこの
ような核酸分子を有し得る。いくつかの実施形態では、植物材料は、対象とするヌクレオ
チド配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来CTPをコードする少なくとも1
種のヌクレオチド配列を含む核酸分子の産物を一時的に発現し得る。いくつかの実施形態
では、植物材料は、それから植物体が再生され得ない植物細胞である。
[0016]
プラスチド含有細胞(例えば、植物)において、プラスチド含有細胞のプラスチド(例
えば、葉緑体)においてヌクレオチド配列を発現するための方法も記載される。特定の実
施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来
CTPをコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、対象とするヌ
クレオチド配列の発現生成物と融合している合成アブラナ属由来CTPを含む前駆体融合
ポリペプチドが、植物細胞の細胞質において産生され、次いで、融合ポリペプチドが、植
物細胞の葉緑体中にin vivoで輸送されるよう、植物細胞を形質転換するために使
用され得る。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物体に再生できない。
[0017]
対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成アブラナ属由来CTPをコ
ードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むトランスジェニック植
物の製造のための方法がさらに記載される。また、このようなトランスジェニック植物か
ら製造される植物商品生産物(例えば、種子)も記載される。いくつかの実施形態では、
これらのトランスジェニック植物または植物商品生産物は、それから植物体が再生され得
ないトランスジェニック細胞を含有する。
[0018]
以下およびその他の特徴は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の以下
の詳細な説明から、より明らかとなる。

Brief Description of Drawings

[0019]
[fig. 1] 対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列(例えば、TraP8、およびTraP9)の特定の例を代表するmRNA分子を示す図である。いくつかの実施形態において、mRNA分子(例えば、示されているもの)は、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成アブラナ属由来CTPをコードする配列を含むオープンリーディングフレームを含むDNA分子から転写され得る。対象とするヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態において、対象とするペプチドをコードする配列であってもよく、例えば、限定されないが、プラスチドにターゲティングされるマーカー遺伝子産物またはペプチドであってもよい。
[fig. 2] プラスミドマップpDAB101977を示す図である。
[fig. 3] プラスミドマップpDAB101908示す図である。
[fig. 4] タバコ葉組織に浸潤させたTraP8−YFPがタバコ葉組織の葉緑体に移動したことを示す顕微鏡画像を示す図である。
[fig. 5] タバコ葉組織に浸潤させたTraP9−YFPがタバコ葉組織の葉緑体に移動したことを示す顕微鏡画像を示す図である。
[fig. 6] タバコ葉組織の葉緑体に取り込まれなかったタバコ葉組織に浸潤させた非標的化YFP対照の顕微鏡画像を示す図である。
[fig. 7] プラスミドマップpDAB106597を示す図である。
[fig. 8] トウモロコシプロトプラストの葉緑体に移動したことを示す、トウモロコシプロトプラストに形質転換して入れたTraP8−YFP構築物の顕微鏡画像を示す図である。
[fig. 9] プラスミドマップpDAB105526を示す図である。
[fig. 10] プラスミドマップpDAB105527を示す図である。
[fig. 11] プラスミドマップpDAB109807を示す図である。
[fig. 12] プラスミドマップpDAB107687を示す図である。
[fig. 13] プラスミドマップpDAB111481を示す図である。
[fig. 14] プラスミドマップpDAB111479を示す図である。
[fig. 15] プラスミドマップpDAB111338を示す図である。
[fig. 16] プラスミドマップpDAB112710を示す図である。
[fig. 17] 図17は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)(配列番号1)およびブラシカ・ラパ(Brassica rapa)(配列番号2)由来のEPSPSタンパク質について予測された葉緑体輸送ペプチドのアラインメントを含む。アスタリスクは、配列が切断され、再結合されて、TraP8とTraP9を形成した場所を示す。
[fig. 18] プラスミドマップpDAB107527を示す図である。
[fig. 19] プラスミドマップpDAB105530を示す図である。
[fig. 20] プラスミドマップpDAB105531を示す図である。
[fig. 21] プラスミドマップpDAB105532を示す図である。
[fig. 22] プラスミドマップpDAB105533を示す図である。
[fig. 23] プラスミドマップpDAB105534を示す図である。
[fig. 24] プラスミドマップpDAB107532を示す図である。
[fig. 25] プラスミドマップpDAB107534を示す図である。
[fig. 26] プラスミドマップpDAB107533を示す図である。
[fig. 27] プラスミドマップpDAB4104を示す図である。
[fig. 28] プラスミドマップpDAB102715を示す図である。
[fig. 29] プラスミドマップpDAB102716を示す図である。
[fig. 30] プラスミドマップpDAB102717を示す図である。
[fig. 31] プラスミドマップpDAB102785を示す図である。
[fig. 32] プラスミドマップpDAB102719を示す図である。
[fig. 33] プラスミドマップpDAB102718を示す図である。
[fig. 34] プラスミドマップpDAB107663を示す図である。
[fig. 35] プラスミドマップpDAB107664を示す図である。
[fig. 36] プラスミドマップpDAB107665を示す図である。
[fig. 37] プラスミドマップpDAB107666を示す図である。
[fig. 38] プラスミドマップpDAB109812を示す図である。
[fig. 39] プラスミドマップpDAB101556を示す図である。
[fig. 40] プラスミドマップpDAB107698を示す図である。
[fig. 41] プラスミドマップpDAB108384を示す図である。
[fig. 42] プラスミドマップpDAB108385を示す図である。
[fig. 43] プラスミドマップpDAB108386を示す図である。
[fig. 44] プラスミドマップpDAB108387を示す図である。配列表 添付の配列表に列挙される核酸配列は、37 C.F.R.§ 1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準文字略語を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は示された鎖への任意の参照によって含まれると理解される。添付の配列表において、 配列番号1は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)EPSPS葉緑体輸送ペプチドのアミノ酸を示す。 配列番号2は、ブラシカ・ラパ(Brassica rapa)EPSPS葉緑体輸送ペプチドのアミノ酸を示す。 配列番号3は、TraP8キメラ葉緑体輸送ペプチドのアミノ酸を示す。 配列番号4は、TraP9キメラ葉緑体輸送ペプチドのアミノ酸を示す。 配列番号5は、TraP8キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号6は、TraP9キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号7は、リンカー配列をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号8は、TraP8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号9は、TraP9 v2キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号10は、cry2aa遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号11は、vip3ab1v6遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号12は、vip3ab1v7遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号13は、アミノ酸配列、Ser−Val−Ser−Leuを有するペプチドを示す。 配列番号14は、配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)EPSPS葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号15は、配列番号2のブラシカ・ラパ(Brassica rapa)EPSPS葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号16は、dgt−28 v5をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号17は、dgt−28 v6をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号18は、コドン最適化されたdgt−1のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号19は、コドン最適化されたdgt−3 v2(G173A)のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号20は、コドン最適化されたdgt−3 v3(G173A;P178S)のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号21は、コドン最適化されたdgt−3 v4(T174I;P178S)のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号22は、コドン最適化されたdgt−7 v4(T168I;P172S)のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号23は、コドン最適化されたdgt−32 v3のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号24は、コドン最適化されたdgt−33 v3のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号25は、コドン最適化されたdgt−31 v3のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号26は、輸送ペプチドTraP4 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号27は、輸送ペプチドTraP5 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号28は、輸送ペプチドTraP8 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号29は、輸送ペプチドTraP9 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号30は、輸送ペプチドTraP12 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号31は、輸送ペプチドTraP13 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号32は、TraP4 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号33は、TraP5 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号34は、TraP8 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号35は、TraP9 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号36は、TraP12 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号37は、TraP13 v2:dgt−28 v5のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号38は、輸送ペプチドTraP14 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号39は、輸送ペプチドTraP23 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号40は、輸送ペプチドTraP24 v2をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号41は、TraP14 v2と融合された輸送ペプチドdgt−32 v3をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号42は、TraP24 v2と融合された輸送ペプチドdgt−33 v3をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号43 は、TraP23 v2と融合された輸送ペプチドdgt−31 v3をコードするポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号44は、DSM2Aプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号45は、DSM2Sプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号46は、DSM2 Cy5プローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号47は、DGT28Fプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号48は、DGT28Rプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号49は、TAFFY−HEXプローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号50は、TAFII15−Fプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号51は、TAFII15−Rプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号52は、dgt−28遺伝子発現カセット確認のために使用されるフォワードオリゴのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号53は、dgt−28遺伝子発現カセット確認のために使用されるリバースオリゴのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号54は、AT26410LPプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号55は、AT26410RPプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号56は、DGT28Fプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号57は、DGT28Rプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号58は、GAAD1Fプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号59は、GAAD1Pプローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号60は、GAAD1Rプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号61は、IV−プローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号62は、IVF−Taqプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号63は、IVR−Taqプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号64は、zmDGT28 Fプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号65は、zmDGT28 FAMプローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。 配列番号66は、zmDGT28 Rプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。

Description of Embodiments

[0020]
I.いくつかの実施形態の概要
葉緑体輸送ペプチド(CTP)(またはプラスチド輸送ペプチド)は、CTPを含むポ
リペプチドをプラスチド(例えば、葉緑体)に向かわせるよう、同時翻訳的または翻訳後
に機能する。本発明のいくつかの実施形態では、内因性葉緑体タンパク質または異種タン
パク質のいずれかが、CTPを含む大きな前駆体ポリペプチドとして、このようなタンパ
ク質の発現によって葉緑体に向けられ得る。特定の実施形態では、CTPは、例えば、限
定されるものではないが、異なる生物から得られたオーソロガス遺伝子に由来する少なく
とも1種の連続する配列またはその機能的変異体を組み込むことによって、アブラナ属種
遺伝子から得られたヌクレオチド配列から駆動され得る。
[0021]
例示的な一実施形態では、各々、CTPをコードする核酸配列を、セイヨウアブラナ(
Brassica napus)(NCBIデータベース受託番号P17688)およびブラシカ・ラパ
(Brassica rapa)(NCBIデータベース受託番号AAS80163)から得られたE
PSPS遺伝子配列から単離した。CTPをコードする核酸配列は、EPSPS遺伝子配
列を、ChloroP予測サーバーを用いて解析することによって単離した。Emanuelsso
n et al. (1999), Protein Science 8:978-84(cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能
)。単離されたCTPをコードする配列の予測されるタンパク質産物は、およそ60〜7
0個のアミノ酸長の輸送ペプチドである。この例では、天然セイヨウアブラナ(B. napus
)CTPを、参照配列として使用し、セイヨウアブラナ(B. napus)CTP中の特定の位
置にその他のCTPから得られた連続する配列を融合することによって例示的合成アブラ
ナ属由来CTPを設計した。この設計プロセスは、アブラナ属種核酸配列からの、いくつ
かの態様による、新規合成CTPの開発を例示する。これらの例示的合成アブラナ属由来
CTPは、本開示内容を通じて、TraPs8および9と呼ばれる。これらの例示的合成
TraPを、プラスチドをターゲッティングする機能について試験し、個々に、少なくと
も、天然アブラナ属配列について観察されたものと同程度に好都合であるプラスチドター
ゲッティングを示すとわかった。
[0022]
さらなる例示的一実施形態では、各々、本発明の合成TraPペプチドをコードする核
酸配列を独立に合成し、黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする核酸配列と作動可能
に連結させて、各々、キメラTraP:YFP融合ポリペプチドをコードする合成核酸分
子を製造した。各々、キメラTraP:YFPポリペプチドをコードするこのような核酸
分子を、各々、TraP:YFPをコードする核酸配列が、AtUbi10プロモーター
と作動可能に連結されるよう、各々、バイナリーベクターに導入した。
[0023]
なおさらなる例示的一実施形態では、各々、AtUbi10プロモーターと作動可能に
連結されたTraP:YFPをコードする核酸配列を含むバイナリーベクターを、独立に
、アグロバクテリウム媒介性形質転換によってタバコ(Nicotiana benthamiana)に一時
的に形質転換した。共焦点顕微鏡観察およびウエスタンブロット解析によって、各Tra
Pが、YFPをタバコ葉緑体に成功裏にターゲッティングしたことを確認した。
[0024]
さらなる例示的一実施形態では、各々、本発明の合成TraPペプチドをコードする核
酸配列を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連
結させた。TraP配列を、除草剤耐性形質(例えば、dgt−28およびdgt−14
)に融合して、各々、キメラTraP:DGT−28またはTraP:DGT−14融合
ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。各々、キメラTraP:DGT−2
8またはTraP:DGT−14ポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各T
raP:dgt−28またはTraP:dgt−14をコードする核酸配列が、プロモー
ターおよびその他の遺伝子調節エレメントと作動可能に連結されるようにバイナリーベク
ター中に導入した。TraP:dgt−28またはTraP:dgt−14をコードする
核酸配列を含有するバイナリーを使用して、バロピス(varopis)植物種を形質転換した
。トランスジェニック植物を、DGT−28またはDGT−14酵素の葉緑体への発現お
よび転位置の結果としての除草剤耐性についてアッセイした。
[0025]
さらなる例示的一実施形態では、各々、本発明の合成TraPペプチドをコードする核
酸配列を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連
結させた。TraP配列を、昆虫耐性形質(例えば、cry2Aaおよびvip3ab1
)を付与する遺伝子と融合して、各々、キメラTraP:Cry2AaまたはTraP:
Vip3Ab1融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。各々、キメラT
raP:Cry2AaまたはTraP:Vip3ab1ポリペプチドをコードするこのよ
うな核酸分子を、各TraP:Cry2AaまたはTraP:Vip3ab1をコードす
る核酸配列が、プロモーターおよびその他の遺伝子調節エレメントと作動可能に連結され
るように、各々、バイナリーベクターに導入した。TraP:Cry2AaまたはTra
P:Vip3ab1をコードする核酸配列を含有するバイナリーを使用して、種々の植物
種を形質転換した。トランスジェニック植物を、Cry2AaまたはVip3Ab1酵素
の葉緑体への発現および転位置の結果としての昆虫抵抗性についてバイオアッセイした。
[0026]
上記の詳細な実施例を考慮して、本発明の合成アブラナ属由来CTP配列およびそれを
コードする核酸は、任意のポリペプチドを、様々なプラスチドを含有する細胞中のプラス
チドに向かわせるために使用され得る。例えば、本開示によって当業者に利用可能になっ
た方法によって、任意の第2のペプチド配列のN末端に融合された合成アブラナ属由来C
TP配列を含むキメラポリペプチドを、第2のペプチド配列のプラスチドターゲッティン
グのためにプラスチド含有宿主細胞中に導入してもよい(またはそこで発現させてもよい
)。したがって、特定の実施形態では、本発明のTraPペプチドは、天然CTPと比較
した場合に、プラスチド発現が望まれるペプチドの輸送およびプロセシングの増大された
効率を提供し得る。
[0027]
II.略語
CTP 葉緑体輸送ペプチド
Bt バチルス・チューリンゲンシス(bacillus thuringiensis)
EPSPS 3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ
YFP 黄色蛍光タンパク質
Ti 腫瘍誘導性(A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)に由来するプラ
スミド)
T−DNA トランスファーDNA
[0028]
III.用語
本開示の種々の実施形態の再調査を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供
する:
[0029]
葉緑体輸送ペプチド:本明細書において、用語「葉緑体輸送ペプチド」(CTP)(ま
たは「プラスチド輸送ペプチド」)とは、ポリペプチドのN末端に存在する場合に、ポリ
ペプチドの輸送を、プラスチドを含有する細胞(例えば、全植物体または植物細胞培養物
などの中の植物細胞)のプラスチド中に向かわせるアミノ酸配列を指し得る。CTPは、
一般に、タンパク質の輸送を、宿主細胞のプラスチド(例えば、一次、二次または葉緑体
などの三次プラスチド)中に向かわせるのに必要であり、十分である。推定葉緑体輸送ペ
プチドは、いくつかの利用可能なアルゴリズム(例えば、PSORTおよびChloro
P(cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能))のうち1種によって同定され得る。C
hloroPは、CTPの特に良好な予測を提供し得る。Emanuelsson et al. (1999), P
rotein Science 8:978-84。しかし、機能的CTPの予測は、いずれの既存のアルゴリズ
ムによっても100%の効率では達成されない。したがって、同定された推定CTPが、
例えば、in vitroまたはin vivo方法論において意図されるように実際に
機能することを確認することは重要である。
[0030]
葉緑体輸送ペプチドは、プラスチド中に輸送されるポリペプチドのN末端に位置し得る
。CTPは、CTPを含むポリペプチドの、プラスチドへの同時翻訳輸送または翻訳後輸
送を容易にし得る。葉緑体輸送ペプチドは、通常、約40個から約100個の間のアミノ
酸を含み、このようなCTPは、特定の共通する特徴を含有することが観察された。例え
ば、CTPは、あったとしても、極めて少ない負に帯電したアミノ酸(アスパラギン酸、
グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンなど)しか含有しない;CTPのN末端領
域は、帯電したアミノ酸、グリシンおよびプロリンを欠く;CTPの中央領域はまた、極
めて高い割合の塩基性またはヒドロキシル化アミノ酸(セリンおよびトレオニンなど)を
含有する可能性が高い;CTPのC末端領域は、アルギニンが豊富であり、両親媒性のベ
ータシート構造を含む能力を有する可能性が高い。プラスチドプロテアーゼは、ポリペプ
チドのプラスチド中への輸送後に、CTPを、CTPを含むポリペプチドの残部から切断
し得る。
[0031]
接触:本明細書において、用語、細胞、組織または生物(例えば、植物細胞;植物組織
;および植物体)「と接触する」または「によって取り込まれる」は、核酸分子に関して
、核酸分子の、生物への内部移行、例えば、限定されるものではないが、生物を核酸分子
を含む組成物と接触させること;および生物を核酸分子を含む溶液に浸漬することを含む
[0032]
内因性:本明細書において、用語「内因性」とは、特定の生物、組織または細胞内に起
因する物質(例えば、核酸分子およびポリペプチド)を指す。例えば、植物細胞において
発現された「内因性」ポリペプチドは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られ
た同一種の細胞において正常に発現されるポリペプチドを指し得る。いくつかの例では、
アブラナ属種から得られた内因性遺伝子(例えば、EPSPS遺伝子)が、参照アブラナ
属CTP配列を得るために使用され得る。
[0033]
発現:本明細書において、コード配列(例えば、遺伝子または導入遺伝子)の「発現」
とは、核酸転写単位(例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含む)のコードされた情報
が、細胞の作動可能な、作動可能でない、または構造的部分に変換されるプロセスを指し
、タンパク質の合成を含むことが多い。遺伝子発現は、外部シグナル;例えば、遺伝子発
現を増大または減少させる薬剤に対する細胞、組織または生物の曝露によって影響を受け
得る。遺伝子の発現はまた、DNAからRNAへ、タンパク質への経路のどこでも調節さ
れ得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、RNA輸送およびプロセシング、m
RNAなどの中間分子の分解に対して作用する制御によって、または特定のタンパク質分
子の、製造された後の活性化、不活性化、コンパートメント化もしくは分解によって、ま
たはそれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、当技術分野で公知の任意の方法、例
えば、限定されるものではないが、ノーザンブロット;RT−PCR;ウエスタンブロッ
ト;またはin vitro;in situ;およびin vivoタンパク質活性ア
ッセイ(複数可)によって、RNAレベルまたはタンパク質レベルで測定され得る。
[0034]
遺伝物質:本明細書において、用語「遺伝物質」は、DNAおよびRNAなどのすべて
の遺伝子および核酸分子を含む。
[0035]
異種:本明細書において、用語「異種」とは、特定の生物、組織または細胞内に起因し
ない物質(例えば、核酸分子およびポリペプチド)を指す。例えば、植物細胞において発
現された「異種」ポリペプチドとは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られた
同一種の細胞において正常には発現されないポリペプチド(例えば、同一生物の異なる細
胞または異なる生物の細胞において発現されるポリペプチド)を指し得る。
[0036]
単離された:本明細書において、用語「単離された」とは、分子が天然に存在する生物
の細胞において、分子が正常には関連している同種のその他の分子(例えば、その他の核
酸分子およびその他のポリペプチド)から実質的に分離または精製されている分子(例え
ば、核酸分子およびポリペプチド)を指す。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が
天然に存在する生物の細胞において、染色体DNAまたは染色体外DNAから実質的に分
離または精製され得る。したがって、この用語は、その他の核酸分子、ポリペプチドおよ
び細胞成分が除去されるように生化学的に精製された組換え核酸分子およびポリペプチド
を含む。この用語はまた、組換え核酸分子、化学合成された核酸分子および組換えによっ
て製造されたポリペプチドを含む。
[0037]
本明細書において、用語「実質的に精製された」とは、その天然状態ではそれと正常に
関連しているその他の分子から分離されている分子を指す。実質的に精製された分子が、
組成物中に存在する主な種であり得る。実質的に精製された分子は、例えば、天然混合物
中に存在する溶媒以外に、その他の分子を少なくとも60%含まない、少なくとも75%
含まない、または少なくとも90%含まないものであり得る。用語「実質的に精製された
」は、その天然状態で存在する分子を指さない。
[0038]
核酸分子:本明細書において、用語「核酸分子」とは、ヌクレオチドのポリマー形態を
指し、RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンスおよびアンチセンス鎖の両方ならびに上
記のものの合成形態および混合ポリマーを含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド
、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す場合
もある。本明細書において「核酸分子」とは、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同
義語である。核酸分子は、特に断りのない限り、普通、少なくとも10塩基長である。こ
の用語は、DNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。核酸分子は、二量体の(いわゆる、
タンデム)形態および核酸分子の転写産物を含む。核酸分子は、天然に存在する、および
/または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結している、天然に存在す
るヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
[0039]
当業者には、容易に理解されるように、核酸分子は、化学的または生化学的に修飾され
得るか、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。このような修飾
として、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうち1個または複数の
類似体との置換、ヌクレオチド間修飾(例えば、無電荷結合:例えば、メチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど;電荷結合:例えば、ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエートなど;懸垂部分:例えば、ペプチド;介入物:
例えば、アクリジン、ソラレンなど;キレート剤;アルキル化剤;および修飾された結合
:例えば、アルファアノマー核酸など)が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、一本鎖
、二本鎖、部分二本鎖、三本鎖、ヘアピン、環状およびパドロック型(padlocked)コン
ホメーションを含めた任意のトポロジカルコンホメーションも含む。
[0040]
本明細書において、DNAに関して、用語「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列
」または「構造的核酸分子」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写およ
びmRNAによってポリペプチドに最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。RNA
に関して、用語「コード配列」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳さ
れるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、5’末端の翻訳開始コドンおよび3
’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列として、それだけには限らない
が、ゲノムDNA;cDNA;EST;および組換えヌクレオチド配列が挙げられる。
[0041]
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、例えば、イオン交換クロマトグラフィー
などの分離方法を使用して;分子の大きさに基づく排除によって、または親和性によって
、種々の溶媒における溶解度に基づく分画技術ならびに増幅、クローニングおよびサブク
ローニングなどの遺伝子工学の方法によって、単離、精製または部分精製され得るヌクレ
オチド配列を含む。
[0042]
配列同一性:本明細書において、2種の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語
「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致を求め
てアラインされた場合に同一である2種の配列中の残基を指し得る。
[0043]
本明細書において、用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、2種の最適にアライン
された配列(例えば、核酸配列およびアミノ酸配列)を比較ウィンドウにわたって比較す
ることによって決定される値を指し得、ここで、比較ウィンドウ中の配列の部分は、2種
の配列の最適アラインメントを求めて参照配列(付加または欠失を含まない)に対して比
較されると付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、両配
列中に同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、対応する位置の
数を得ること、対応する位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって除すること
および結果に100を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出され
る。
[0044]
比較のために配列をアラインするための方法は、当技術分野で周知である。種々のプロ
グラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981), Adv
. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443; Pearson
and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (198
8), Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989), CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (198
8), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992), Comp. Appl. Biosci. 8:1
55-65; Pearson et al. (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999
), FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アラインメント方法およ
び相同性算出の詳細な検討事項は、例えば、Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 21
5:403-10に見出すことができる。
[0045]
米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Info
rmation)(NCBI)Basic Local Alignment Search
Tool(BLAST(商標);Altschul et al. (1990))は、いくつかの配列解析プロ
グラムに関連して使用するために、米国国立バイオテクノロジー情報センター(Beth
esda、MD)およびインターネットを含め、いくつかの供給源から入手可能である。
このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、BLAST(商標)の「
ヘルプ」セクションの下でインターネットで入手可能である。核酸配列を比較するために
、BLAST(商標)(Blastn)プログラムの「BLAST2配列」機能が、デフ
ォルトパラメータに設定されたデフォルトBLOSUM62マトリックスを使用して用い
られ得る。参照配列に対してさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって
評価されると、増大する同一性パーセンテージを示す。
[0046]
特異的にハイブリダイズ可能な/特異的に相補的な:本明細書において、用語「特異的
にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、核酸分子および標的核酸分
子間で安定な、特異的な結合が生じるよう、十分な相補性度を示す用語である。2種の核
酸分子間のハイブリダイゼーションは、2種の核酸分子の核酸配列間の逆行性アラインメ
ントの形成を含む。次いで、2種の分子は、反対の鎖の対応する塩基と水素結合を形成し
て二本鎖分子を形成でき、これは十分に安定である場合には当技術分野で周知の方法を使
用して検出可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列に
対して100%相補的である必要はない。しかし、特異的であるハイブリダイゼーション
のために存在しなくてはならない配列相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション
条件の関数である。
[0047]
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択され
るハイブリダイゼーション方法の性質および組成物およびハイブリダイズする核酸配列の
長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーシ
ョンバッファーのイオン強度(特に、Na および/またはMg ++濃度)が、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーを左右するが、洗浄時間も、ストリンジェンシーに
影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを得るのに必要なハイブリダイゼーショ
ン条件に関する計算は、当業者には公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual, 2 nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins
(eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に論じられている。核酸
のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および案内は、例えば、Tijssen,
「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid prob
e assays」, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybri
dization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびA
usubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene P
ublishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出すことができる。
[0048]
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、ハイ
ブリダイゼーション分子および標的核酸分子内の相同配列間に20%未満のミスマッチが
ある場合にのみ起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらに特定のレ
ベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書において、「中程度のストリン
ジェンシー」条件とは、20%を超える配列ミスマッチを有する分子が、ハイブリダイズ
しないものであり;「高ストリンジェンシー」の条件とは、10%を超えるミスマッチを
有する配列が、ハイブリダイズしないものであり;「極めて高ストリンジェンシー」の条
件とは、5%を超えるミスマッチを有する配列が、ハイブリダイズしないものである。
[0049]
以下は、代表的な、限定するものではないハイブリダイゼーション条件である。
高ストリンジェンシー条件(少なくとも90%の配列同一性を共有する配列を検出す
る):65℃で16時間の5×SSCバッファー中でのハイブリダイゼーション;室温で
各15分の2×SSCバッファーでの2回の洗浄;および65℃で各20分間の0.5×
SSCバッファーでの2回の洗浄。
中程度のストリンジェンシー条件(少なくとも80%の配列同一性を共有する配列を
検出する):65〜70℃で16〜20時間の5×〜6×SSCバッファー中でのハイブ
リダイゼーション;室温で各5〜20分の2×SSCバッファーでの2回の洗浄;および
55〜70℃で各30分間の1×SSCバッファーでの2回の洗浄。
非ストリンジェント対照条件(少なくとも50%の配列同一性を共有する配列がハイ
ブリダイズする):室温〜55℃で16〜20時間の6×SSCバッファーでのハイブリ
ダイゼーション;室温〜55℃で各20〜30分の2×〜3×SSCバッファーでの少な
くとも2回の洗浄。
[0050]
本明細書において、用語「実質的に相同な」または「実質的相同性」とは、連続する核
酸配列に関して、ストリンジェントな条件下で、参照核酸配列とハイブリダイズする連続
するヌクレオチド配列を指す。例えば、参照核酸配列に対して実質的に相同である核酸配
列とは、ストリンジェントな条件(例えば、上記で示される、中程度のストリンジェンシ
ー条件)下で、参照核酸配列とハイブリダイズする核酸配列である。実質的に相同な配列
は、少なくとも80%配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同な配列は、約80%
〜100%配列同一性、例えば、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、
約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、
約94%約95%、約96%、約97%、約98%、約98.5%、約99%、約99.
5%、および約100%を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーシ
ョンと密接に関連している。例えば、核酸分子は、特異的結合が望まれる条件下で、例え
ば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸の、非標的配列との非特
異的結合を避けるための十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能
である。
[0051]
本明細書において、用語「オーソログ」(または「オーソロガス」)とは、共通の先祖
ヌクレオチド配列から進化した2種以上の種における遺伝子を指し、2種以上の種におい
て同一機能を保持し得る。
[0052]
本明細書において、2種の核酸配列分子は、5’から3’方向に読まれる配列のどのヌ
クレオチドも、3’から5’方向に読まれる場合のもう一方の配列のどのヌクレオチドと
も相補的である場合に、「完全相補性」を示すといわれる。参照ヌクレオチド配列に対し
て相補的であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補配列に対して配列同
一性を示す。これらの用語および説明は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に
容易に理解される。
[0053]
アミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージを決定する場合には、アラインメントによ
って提供された所与の位置におけるアミノ酸の同一性は、アラインされた配列を含むポリ
ペプチドの所望の特性に影響を及ぼすことなく異なり得るということは、当業者には周知
である。これらの例では、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸間の類
似性を説明するよう調整され得る。これらの調整は、当業者には周知であり、よく使用さ
れる。例えば、Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11
-7を参照のこと。
[0054]
本発明の実施形態は、例示的プラスチド輸送ペプチドアミノ酸配列の機能的変異体およ
びそれをコードする核酸配列を含む。例示的輸送ペプチド配列の機能的変異体は、例えば
、例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片(N末端またはC末端断片など)、または全長
の例示的輸送ペプチドアミノ酸配列もしくは例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片の修
飾された配列であり得る。例示的輸送ペプチドアミノ酸配列は、修飾され得、いくつかの
実施形態では、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を導入し得る。「保存的」アミノ酸
置換とは、アミノ酸残基が、同様の機能的側鎖、同様の大きさおよび/または同様の疎水
性を有するアミノ酸残基によって置き換えられているものである。保存的置換を導入する
ために同一ファミリーの別のアミノ酸を置き換えるために使用され得るアミノ酸のファミ
リーは、当技術分野で公知である。例えば、これらのアミノ酸ファミリーとして、塩基性
アミノ酸(例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン);酸性アミノ酸(例えば、ア
スパラギン酸およびグルタミン酸);無電荷(生理学的pHで)極性アミノ酸(例えば、
グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシトシン)
;非極性アミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フ
ェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン);ベータ−分岐アミノ酸(例えば、
トレオニン、バリンおよびイソロイシン);および芳香族アミノ酸(例えば、チロシン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン)が挙げられる。例えば、Sambrook
et al. (Eds.), 前掲;およびInnis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and A
pplications, 1990, Academic Press, NY, USAを参照のこと。
[0055]
作動可能に連結された:第1のヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列が、第2
のヌクレオチド配列と機能的関係にある場合に、第2のヌクレオチド配列と「作動可能に
連結している」。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発
現に影響を及ぼす場合に、コード配列と作動可能に連結している。組換えによって作製さ
れた場合には、作動可能に連結しているヌクレオチド配列は、一般に、連続しており、2
つのタンパク質コード領域をつなげる必要がある場合には、同一リーディングフレーム中
にある。しかし、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結されるよう連続している必要はな
い。
[0056]
用語「作動可能に連結された」とは、調節配列およびコード配列に関して使用される場
合には、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調
節配列」または「制御エレメント」とは、関連しているコード配列の転写のタイミングお
よびレベル/量、RNAプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオ
チド配列を指す。調節配列は、プロモーター;翻訳リーダー配列;イントロン;エンハン
サー;ステム−ループ構造;リプレッサー結合性配列;終結配列;ポリアデニル化認識配
列などを含み得る。特定の調節配列は、それに作動可能に連結しているコード配列の上流
および/または下流に配置され得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の
調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に配置され得る。
[0057]
2種以上のアミノ酸配列に関連して使用される場合には、用語「作動可能に連結してい
る」とは、第1のアミノ酸配列が、少なくとも1種のさらなるアミノ酸配列と機能的関係
にあることを意味する。例えば、輸送ペプチド(例えば、CTP)は、輸送ペプチドが、
ポリペプチドまたは第2のアミノ酸配列の発現または輸送に影響を及ぼす場合に、両配列
を含むポリペプチド内の第2のアミノ酸配列と作動可能に連結している。
[0058]
プロモーター:本明細書において、用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流で
あり得る、RNAポリメラーゼおよび転写を開始するためのその他のタンパク質の認識お
よび結合に関与し得るDNAの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のために
コード配列と作動可能に連結され得るか、またはプロモーターは、細胞における発現のた
めにコード配列と作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と
作動可能に連結され得る。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できる
プロモーターであり得る。発達制御下にあるプロモーターの例として、葉、根、種子、繊
維、木部導管、仮導管または厚壁組織などの特定の組織における転写を優先的に開始する
プロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、「組織優先型」と呼ばれる。特
定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細
胞種特異的」プロモーターは、主に、1種または複数の器官中の特定の細胞種、例えば、
根または葉中の維管束細胞において発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターとは、
環境制御下にあるプロモーターであり得る。誘導プロモーターによる転写を開始し得る環
境条件の例として、嫌気性条件および光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、
細胞種特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成す
る。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件下で活性であり得るプロモーター
である。
[0059]
本発明のいくつかの実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et
al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366参照のこと。誘導プロモーターを用いると、
誘導物質に応じて転写の速度が増大する。例示的誘導プロモーターとして、それだけには
限らないが、銅と反応するACEI系;ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤と反応する
トウモロコシ由来のIn2遺伝子;Tn10由来のTetリプレッサーに由来するプロモ
ーター;およびステロイドホルモン遺伝子由来の誘導プロモーターが挙げられ、糖質コル
チコステロイドホルモンによってそれらの転写活性が誘導され得る(Schena et al. (199
1), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421)。
[0060]
例示的構成プロモーターとして、それだけには限らないが、CaMV由来の35Sプロ
モーター;コメアクチン遺伝子由来のプロモーター;ユビキチンプロモーター;pEMU
;MAS;トウモロコシH3ヒストンプロモーター;およびALSプロモーター、セイヨ
ウアブラナ(Brassica napus)ALS3構造遺伝子の5’のXba1/NcoI断片(ま
たは前記Xba1/NcoI断片と同様のヌクレオチド配列)(国際PCT出願番号WO
96/30530)などの植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
[0061]
本発明のいくつかの実施形態では、さらに、任意の組織特異的または組織優先的プロモ
ーターが利用され得る。組織特異的プロモーターと作動可能に連結しているコード配列を
含む核酸分子で形質転換された植物は、もっぱら、または優先的に特定の組織においてコ
ード配列の産物を製造し得る。例示的組織特異的または組織優先的プロモーターとして、
それだけには限らないが、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根優先的プロモーター;
cabまたはリブロース二リン酸カルボキシラーゼ由来のものなどの葉特異的および光誘
導性プロモーター;LAT52由来のものなどの別の特異的プロモーター;Zm13由来
のものなどの花粉特異的プロモーター;およびapg由来のものなどの小胞子優先的プロ
モーターがある。
[0062]
形質転換:本明細書において、用語「形質転換」または「形質導入」とは、1種または
複数の核酸分子の細胞への転移を指す。細胞は、核酸分子の細胞ゲノムへの組み込みまた
はエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞によって安定に複製されるように
なった場合に、細胞に軽質導入される核酸分子によって「形質転換される」。本明細書に
おいて、用語「形質転換」は、核酸分子が、このような細胞中に導入され得るすべての技
術を包含する。例として、それだけには限らないが:ウイルスベクターを用いるトランス
フェクション;プラスミドベクターを用いる形質転換;エレクトロポレーション(Fromm
et al. (1986), Nature 319:791-3);リポフェクション(Felgner et al. (1987), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7);マイクロインジェクション(Mueller et al. (1978
), Cell 15:579-85);アグロバクテリウム媒介性転移(Fraley et al. (1983), Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 80:4803-7);直接DNA取り込み;および微粒子銃(Klein et al.
(1987), Nature 327:70)が挙げられる。
[0063]
導入遺伝子:外因性核酸配列。いくつかの例では、導入遺伝子は、少なくとも1種の合
成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドをコードする配列であり得る。特定の例では
、導入遺伝子は、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPおよびプラスチド発現が望
ましい、少なくとも1種のさらなるペプチド配列(例えば、除草剤抵抗性を付与するペプ
チド配列)を含むポリペプチドをコードし得る。これらおよびその他の例では、導入遺伝
子は、導入遺伝子のコード配列と作動可能に連結している調節配列(例えば、プロモータ
ー)を含有し得る。本開示の目的上、用語「トランスジェニック」は、生物(例えば、植
物)を指すために使用される場合には、外因性核酸配列を含む生物を指す。いくつかの例
では、外因性核酸配列を含む生物は、分子形質転換技術によって核酸配列が導入された生
物であり得る。その他の例では、外因性核酸配列を含む生物は、例えば、遺伝子移入また
は植物における他家受粉によって核酸配列が導入された生物であり得る。
[0064]
輸送:本明細書において、用語「輸送」、「ターゲッティング」、および「転移」とは
、宿主細胞の核から宿主細胞のプラスチドへの、アミノ酸配列を含むポリペプチドの移動
を促進する、本発明の特定のアミノ酸配列の特性を指す。特定の実施形態では、このよう
なアミノ酸配列(すなわち、合成アブラナ属由来CTP配列)は、アミノ酸配列を含むポ
リペプチドの約100%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85
%、少なくとも約80%、少なくとも約70%、少なくとも約60%、および/または少
なくとも約50%を、宿主細胞のプラスチド中に輸送できる可能性がある。
[0065]
ベクター:例えば、形質転換された細胞を製造するために、細胞中に導入されるような
核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にす
る核酸配列を含み得る。ベクターの例として、それだけには限らないが、プラスミド;コ
スミド;バクテリオファージ;または外因性DNAを細胞中に運ぶウイルスが挙げられる
。ベクターはまた、1種または複数の遺伝子、アンチセンス分子および/または選択マー
カー遺伝子および当技術分野で公知のその他の遺伝子エレメントを含み得る。ベクターは
、細胞を形質導入、形質転換または感染し、それによって、細胞に、ベクターによってコ
ードされる核酸分子および/またはタンパク質を発現させ得る。ベクターは、任意選択で
、核酸分子の細胞(例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなど)への侵入の達成
を補助する物質を含んでもよい。
[0066]
具体的に示され、暗示されない限り、用語「1つの(a)」、「1つの(an)」および
「その(the)」は、本明細書において「少なくとも1つの」を示す。
[0067]
具体的に説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学
用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を
有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B.,Genes V, Oxford
University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al. (eds.), The Encyclop
edia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);お
よびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk
Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる
。別に記載されない限り、すべてのパーセンテージは、重量によるものであり、すべての
溶媒混合物割合は、容量によるものである。すべての温度は、摂氏度である。
[0068]
IV.合成アブラナ属由来CTPをコードする配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、本開示は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結し
ている合成アブラナ属由来CTPをコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む
核酸分子を提供する。特定の実施形態では、対象とするヌクレオチド配列は、対象とする
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり得る。特定の例では、TraP8また
はTraP9配列が対象とするポリペプチドのN末端と融合しているポリペプチドをコー
ドする単一の核酸分子が、提供される。
[0069]
合成アブラナ属由来CTPは、アブラナ属EPSPS遺伝子から導くことができる。こ
のような実施形態の特定の実施例では、アブラナ属EPSPS遺伝子は、配列番号14と
して示される核酸配列もしくは異なるEPSPS遺伝子に由来する相同核酸配列を含むも
のであり得るか、または配列番号14として示される核酸配列を含むアブラナ属EPSP
S遺伝子のオーソログ(例えば、配列番号15として示される核酸配列を含むアブラナ属
EPSPS遺伝子)であり得る。
[0070]
いくつかの実施形態では、合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドは、キメラアブラナ
属由来CTPであり得る。合成キメラアブラナ属由来CTPは、参照アブラナ属CTP配
列内に含まれる第1の連続するアミノ酸配列を、異なるCTP配列(例えば、第2のアブ
ラナ属CTP配列)内に含まれる第2の連続するアミノ酸配列をつなげることによって参
照アブラナ属CTP配列から導くことができる。特定の実施形態では、第2の連続するア
ミノ酸配列を含む異なるCTP配列は、参照配列が得られたアブラナ属の種のもの以外(
例えば、異なるアブラナ属の種、アブラナ属の種以外の植物;下等光合成真核生物、例え
ば、緑藻植物;および原核生物、例えば、シアノバクテリアまたはアグロバクテリウム)
のゲノムから得られた相同遺伝子配列によってコードされ得る。したがって、合成アブラ
ナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列は、参照アブラナ属CTP配列の連続する
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、参照アブラナ属CTP配列の残部と相同
である異なるCTP配列に由来する連続するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
と融合することによって、参照アブラナ属CTPをコードする遺伝子配列から導くことが
できる。これらおよびその他の例では、参照アブラナ属CTP配列の連続するアミノ酸配
列は、合成アブラナ属由来CTPの5’末端または3’末端に位置され得る。
[0071]
いくつかの実施形態では、合成キメラアブラナ属由来CTPは、1種のアブラナ属CT
P配列内に含まれる連続するアミノ酸配列を、異なるアブラナ属CTP配列内に含まれる
連続するアミノ酸配列とつなげることによって複数のアブラナ属CTP配列(参照アブラ
ナ属CTP配列を含む)から導くことができる。特定の実施形態では、複数のアブラナ属
CTP配列は、異なるアブラナ属の種中のオーソロガス遺伝子配列によってコードされ得
る。いくつかの例では、複数のアブラナ属CTP配列は、正確に2種のアブラナ属CTP
配列であり得る。したがって、合成キメラアブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチ
ド配列は、一方のアブラナ属CTP配列の連続するアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を、第1のアブラナ属CTP配列の残部と相同であるもう一方のアブラナ属CTP
配列に由来する連続するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と融合することによ
って、2種の相同な(例えば、実質的に相同な)アブラナ属CTPをコードする遺伝子配
列(例えば、オーソロガス遺伝子配列)から導くことができる。TraP8およびTra
P9は、このような合成キメラアブラナ属由来CTPの具体例である。
[0072]
当業者ならば、参照アブラナ属CTP配列内の第1の連続するアミノ酸配列の選択後に
、前述の誘導プロセスに従う、相同なCTP配列の残部からの連続するアミノ酸配列の同
定および選択は、明白なものであり、自動的であるということは理解されよう。いくつか
の例では、第1の連続するアミノ酸配列は、約25から約41個の間のアミノ酸長(例え
ば、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36
、37、38、39、40、41および42個のアミノ酸長)であり得る。いくつかの実
施形態では、参照アブラナ属CTP配列内の第1の連続するアミノ酸配列は、一部のアブ
ラナ属EPSPS遺伝子内で保存されている「SVSL」(配列番号13)モチーフの3
’末端の位置によって定義される。
[0073]
前記のプロセスに従う、合成キメラアブラナ属由来CTP配列の例は、配列番号3およ
び配列番号4によって表される。当業者によれば、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらの
ペプチドをコードするヌクレオチド配列の種類は、すぐに思い浮かぶ。このようなポリヌ
クレオチド配列の例として、配列番号5、6、8および9が挙げられる。これらの特定の
例は、セイヨウアブラナ(B. napus)ESPSP遺伝子のいくつかのESPSPオーソロ
グの1種から得た相同CTPに由来する連続する配列を組み込むことによって、合成キメ
ラアブラナ属由来CTPの構造的特徴を例示する。
[0074]
いくつかの実施形態は、合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドおよび/またはそれを
コードする核酸の機能的変異体を含む。このような機能的変異体として、例えば、限定す
るものではないが、配列番号14および/または配列番号15として示されるアブラナ属
CTPの一方または両方をコードする配列の相同体および/もしくはオーソログから導か
れた合成アブラナ属由来CTPをコードする配列ならびに/またはそれによってコードさ
れるCTP;配列番号1および/または配列番号2内の連続するアミノ酸配列を含む合成
アブラナ属由来CTPをコードする核酸および/またはそれによってコードされるCTP
;配列番号5、6、8および9のうち1種内の連続する核酸配列を含む末端切断型合成ア
ブラナ属由来CTPをコードする配列;配列番号5、6、8および9のうち1種に対して
実質的に相同である、連続する核酸配列を含む末端切断型合成アブラナ属由来CTPをコ
ードする配列;配列番号3および4内の連続するアミノ酸配列を含む末端切断型合成アブ
ラナ属由来CTP;配列番号5、6、8および9のうち1種内の連続するアミノ酸配列を
含む合成アブラナ属由来CTPをコードする核酸および/またはそれによってコードされ
るCTP;1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号3および4のうち1
種内の連続するアミノ酸配列を含む合成アブラナ属由来CTPをコードする核酸および/
またはそれによってコードされるCTP;ならびに、作動可能に連結しているペプチドを
プラスチドを含有する細胞中のプラスチドに向けると実証されている、1つまたは複数の
非保存的アミノ酸置換を有する、配列番号3および4のうち1種内の連続するアミノ酸配
列を含む合成アブラナ属由来CTPをコードする核酸および/またはそれによってコード
されるCTPが挙げられる。
[0075]
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を
含む合成キメラアブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含
む。このような核酸分子は、例えば、分子生物学の技術における本発明のCTPをコード
する配列の製造を容易にすることにおいて有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態
では、本発明のCTPをコードする配列は、発現ベクターに配列をサブクローニングする
ために適したベクター中に導入され得るか、または本発明のCTPをコードする配列は、
対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結しているCTPをコードする配列を含むさ
らなる核酸分子の製造を容易にする核酸分子中に導入され得る。これらのおよびさらなる
実施形態では、合成キメラアブラナ属由来CTPの配列中の1つまたは複数のアミノ酸位
置が欠失している場合がある。例えば、合成キメラアブラナ属由来CTPの配列は、配列
中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16
、17、18、19または20位のアミノ酸(複数可)が欠失されるよう修飾され得る。
相同CTP配列のアラインメントを使用して、どのアミノ酸が、合成CTPの機能に影響
を及ぼすことなく欠失され得るかについてのガイダンスが提供され得る。
[0076]
特定の例では、合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドは、80個未満のアミノ酸長で
ある。例えば、合成アブラナ属由来CTPは、79、78、77、76、75、74、7
3、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60
個またはそれより少ないアミノ酸長であり得る。特定の例では、合成アブラナ属由来CT
Pは、約65、約68、約72または約74個のアミノ酸長であり得る。これらおよびさ
らなる例では、合成アブラナ属由来CTPは、配列番号3および4のうち1種に示される
アミノ酸配列または前記のもののいずれかの機能的変異体を含み得る。したがって、合成
アブラナ属由来CTPは、合成アブラナ属由来CTPの長さが、80個未満のアミノ酸長
である、配列番号3および4のうち1種を含むアミノ酸配列またはその機能的変異体を含
み得る。特定の例では、合成アブラナ属由来CTPは、例えば、配列番号3および4のう
ち1種に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、
少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるアミノ酸配列を含み得る
[0077]
特定の合成アブラナ属由来CTP、例えば、配列番号3のTraP8ペプチドおよび配
列番号4のTraP9ペプチドまたは任意の特定の欠失および/もしくは保存的アミノ酸
置換を含む前記のもののいずれかの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列のすべて
が、本開示を考慮して当業者には認識されよう。遺伝暗号の縮重は、特定のアミノ酸配列
について有限数のコード配列を提供する。合成アブラナ属由来CTPをコードするよう特
定の配列を選択することは、実施者の判断の自由の範囲内にある。異なる適用では、異な
るコード配列が望ましいものであり得る。例えば、特定の宿主における合成アブラナ属由
来CTPの発現を増大するために、宿主のコドン使用バイアスに影響を及ぼすコード配列
が、選択され得る。例として、合成アブラナ属由来CTPは、配列番号5、6、8および
9の1種として示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
[0078]
本発明のいくつかの実施形態において提供される核酸分子では、合成アブラナ属由来C
TPをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンおよび対象とするヌクレオチド配列の
第1のコドンは、例えば、イントロンまたは「停止」をコードしない任意の数のヌクレオ
チドトリプレットによって離れている場合もある。いくつかの例では、天然前駆体ポリペ
プチドにおいて葉緑体輸送ペプチドと普通関連している成熟タンパク質の第1のアミノ酸
をコードする配列が、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド配列の最後の
コドンと、対象とするヌクレオチド配列の第1のコドンの間に存在し得る。合成アブラナ
属由来CTPをコードするヌクレオチド配列と、対象とするヌクレオチド配列の第1のコ
ドンを分離する配列は、例えば、コードされるアミノ酸配列が、キメラポリペプチドの翻
訳およびプラスチドへのその転位置を大幅に変更する可能性が低いような任意の配列から
なり得る。これらおよびさらなる実施形態では、合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド
をコードするヌクレオチド配列の最後のコドンは、位相レジスタにおいて、対象とするヌ
クレオチド配列の第1のコドンとそれと直接連続して、または合成ヌクレオチドリンカー
(例えば、融合を達成するために使用されることばあるヌクレオチドリンカー)によって
コードされるような短いペプチド配列だけそれから離れて融合され得る。
[0079]
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主におけるコード配列の発現を増強するた
めに、対象とするヌクレオチド配列および/または単一コード配列にそれと融合している
合成アブラナ属由来CTPをコードする配列のヌクレオチドを修飾することが望ましい場
合がある。遺伝暗号は、64種の可能性あるコドンと重複しているが、ほとんどの生物は
、これらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も多く利用されるコド
ンは、最適コドンと呼ばれ、あまり多くは利用されないものは、稀に使用されるコドンま
たは低使用コドンとして分類される。Zhang et al. (1991), Gene 105:61-72.コドンは、
「コドン最適化」と呼ばれることもあるプロセスにおいて、特定の宿主の好ましいコドン
使用を反映するよう置換され得る。例えば、翻訳の速度を高めるよう、または望ましい特
性(例えば、最適化されていない配列から製造された転写物と比較して、より長い半減期
)を有する組換えRNA転写物を製造するよう、個々の原核生物または真核生物宿主によ
って好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列が調製され得る。
[0080]
合成アブラナ属由来CTP配列を組み込むことによって、任意のポリペプチドが、プラ
スチドを含有する細胞のプラスチドにターゲッティングされ得る。例えば、いくつかの実
施形態では、連結しているポリペプチド−CTP分子が発現される細胞において、ポリペ
プチドをプラスチドに向かわせるために、ポリペプチドが合成アブラナ属由来CTP配列
に連結され得る。特定の実施形態では、合成アブラナ属由来CTP配列の組み込みによっ
てプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドは、例えば、ポリペプチドが天然に
発現される細胞のプラスチドにおいて普通発現されるポリペプチドであり得る。例えば、
限定するものではないが、合成アブラナ属由来CTP配列の組み込みによってプラスチド
にターゲッティングされるポリペプチドは、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体
抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性または真菌抵抗性に関与しているポリペプチドであり得
る。例えば、米国特許第5,569,823号;同5,304,730号;同5,495
,071号;同6,329,504号;および同6,337,431号を参照のこと。合
成アブラナ属由来CTP配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポ
リペプチドは、別法として、例えば、限定するものではないが、草勢または収量に関与す
るポリペプチド(極端な温度、土壌条件、光量レベル、水分レベルおよび化学的環境に対
する耐性に関与しているポリペプチドを含む)または対象とする形質(例えば、選択マー
カー遺伝子産物、種子色に関与しているポリペプチドなど)を含む植物を同定するための
マーカーとして使用され得るポリペプチドであり得る。
[0081]
本発明のいくつかの実施形態において、合成アブラナ属由来CTP配列と連結され得る
、除草剤抵抗性に関与しているポリペプチドの限定されない例として、アセトラクターゼ
シンターゼ(ALS)、突然変異ALSおよびALSの前駆体(例えば、米国特許第5,
013,659号を参照のこと);CP4 EPSPS、クラスIII EPSPSまた
はクラスIV EPSPSなどのEPSPS(例えば、米国特許第4,971,908号
および同6,225,114号を参照のこと);光合成および脂肪酸、アミノ酸、油、ア
ロテノイド(arotenoid)、テルペノイド、デンプンの合成などを含めたプラスチドにお
いて生じる生理学的プロセスを修飾する酵素が挙げられる。特定の実施形態において、合
成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドと連結され得るポリペプチドのその他の限定されな
い例として、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラタ
ーゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、デンプン変性酵素、必須
アミノ酸の合成に関与しているポリペプチド、プロビタミンA、ホルモン、Bt毒素タン
パク質などが挙げられる。前記のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野
で公知であり、このようなヌクレオチド配列は、合成アブラナ属由来CTPと連結してい
る対象とするポリペプチドを含むポリペプチドに発現されるよう、合成アブラナ属由来C
TPをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結され得る。さらに、前記のポリペプ
チドのいずれかをコードするさらなるヌクレオチド配列は、当業者によって同定され得る
(例えば、特定のポリペプチドをコードするその他の遺伝子に対して高い相同性を有する
遺伝子のクローニングによって)。このようなヌクレオチド配列が同定されると、同定さ
れたヌクレオチド配列と作動可能に連結された合成アブラナ属由来CTPをコードする配
列を含むヌクレオチド配列または同等のポリペプチドをコードする配列を設計することが
簡単なプロセスである。
[0082]
V.合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドを含むポリペプチドの発現
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプ
チドまたはその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1種の核酸
分子が、そこでのポリペプチドの発現のために細胞、組織または生物中に導入され得る。
特定の実施形態では、核酸分子は、合成アブラナ属由来CTPをコードするヌクレオチド
配列と作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸分
子は、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPと、対象とするヌクレオチド配列によ
ってコードされる少なくとも1種のさらなるペプチド配列を含むポリペプチドをコードす
るコード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子が、プラスチドを
含有する宿主細胞、組織または生物(例えば、植物細胞、植物組織および植物体)中に導
入され得、その結果、ポリペプチドが、プラスチドを含有する宿主細胞、組織または生物
中の核酸分子から発現され得、発現されたポリペプチドが、少なくとも1種の合成アブラ
ナ属由来CTPおよび対象とするヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも1種
のさらなるペプチド配列を含む。特定の例では、このような発現されたポリペプチドの合
成アブラナ属由来CTPは、少なくともさらなるペプチド配列を含むポリペプチドの一部
を、宿主細胞、組織または生物のプラスチドへのターゲッティングを容易にし得る。
[0083]
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、当業者に公知の方法論のいずれかのう
ち1種によってプラスチドを含有する細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、宿主
細胞、組織または生物は、細胞、組織または生物中に核酸分子を導入するために本発明の
核酸分子と接触され得る。特定の実施形態では、細胞は、核酸分子が細胞中に導入され、
核酸分子が、細胞のゲノム中に安定に組み込まれるように、本発明の核酸分子を用いて形
質転換され得る。いくつかの実施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連
結している合成アブラナ属由来CTPをコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を
含む核酸分子が、細胞、例えば、プラスチドを含有する細胞(例えば、植物細胞)の形質
転換のために使用され得る。発現を開始または増強するために、核酸分子は、1種または
複数の調節配列を含んでもよく、この調節配列は、少なくとも1種の合成アブラナ属由来
CTPを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
[0084]
核酸分子は、例えば、例えば、直鎖または閉じた環状プラスミドを含めたベクター系で
あり得る。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸配
列は、例えば、核酸配列が、1種または複数の調節配列と作動可能に連結されるようベク
ター中に挿入され得る。多数のベクターが、この目的のために利用可能であり、特定のベ
クターの選択は、例えば、ベクター中に挿入される核酸の大きさおよびベクターを用いて
形質転換される個々の宿主細胞に応じて変わり得る。ベクターは、通常、種々の成分を含
有し、その同一性は、ベクターの機能(例えば、DNAの増幅およびDNAの発現)およ
びベクターが適合する個々の宿主細胞(複数可)に応じて変わる。
[0085]
いくつかの実施形態は、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチ
ドをコードする1種または複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結している上記の調節
配列のうち少なくとも1種を含むヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含み得
る。1種または複数のヌクレオチド配列は、ポリペプチドの少なくとも一部を、植物細胞
、組織または生物のプラスチドにターゲッティングする合成アブラナ属由来CTPを含む
ポリペプチドを製造するよう、植物細胞、組織または生物において調節配列(複数可)の
制御下で発現され得る。
[0086]
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列は、核酸分子が増
幅される細菌細胞または核酸分子が発現される植物細胞などの宿主細胞において機能する
プロモーター配列であり得る。本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとし
て、誘導可能、ウイルス性、合成または構成性であるものが挙げられ、そのすべてが、当
技術分野で周知である。本発明の実施形態において有用であり得るプロモーターの限定さ
れない例は、米国特許第6,437,217号(トウモロコシRS81プロモーター);
同5,641,876号(コメアクチンプロモーター);同6,426,446号(トウ
モロコシRS324プロモーター);同6,429,362号(トウモロコシPR−1プ
ロモーター);同6,232,526号(トウモロコシA3プロモーター);同6,17
7,611号(構成的トウモロコシプロモーター);同5,322,938号、同5,3
52,605号、同5,359,142号および同5,530,196号(35Sプロモ
ーター);同6,433,252号(トウモロコシL3オレオシンプロモーター);同6
,429,357号(コメアクチン2プロモーターおよびコメアクチン2イントロン);
同6,294,714号(光誘導性プロモーター);同6,140,078号(塩誘導性
プロモーター);同6,252,138号(病原体誘導性プロモーター);同6,175
,060号(亜リン酸欠乏誘導性プロモーター);同6,388,170号(双方向性プ
ロモーター);同6,635,806号(γ−コイキシン(coixin)プロモーター);お
よび米国特許出願番号第09/757,089号(トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロ
モーター)によって提供される。
[0087]
さらなる例示的プロモーターとして、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター(Eb
ert et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9);オクトピンシンター
ゼ(OCS)プロモーター(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tu
mefaciens)の腫瘍誘導性プラスミドで実施される);カリフラワーモザイクウイルス(
CaMV)19Sプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター(Lawton et al. (198
7), Plant Mol. Biol. 9:315-24);CaMV 35Sプロモーター(Odell et al. (1985
), Nature 313:810-2;ゴマノハグサ(figwort)モザイクウイルス35Sプロモーター(W
alker et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8);スクロースシンタ
ーゼプロモーター(Yang and Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8
);R遺伝子複合体プロモーター(Chandler et al. (1989), Plant Cell 1:1175-83);ク
ロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター;CaMV35S(米国特許第5,
322,938号、同5,352,605号、同5,359,142号および同5,53
0,196号);FMV35S(米国特許第6,051,753号および同5,378,
619号);PC1SVプロモーター(米国特許第5,850,019号);SCP1プ
ロモーター(米国特許第6,677,503号);およびAGRtu.nosプロモータ
ー(GenBank受託番号V00087;Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73;
Bevan et al. (1983), Nature 304:184-7)が挙げられる。
[0088]
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、組織特異的プロモーターを含み得る。組織
特異的プロモーターは、生物のその他の組織と比較して、プロモーターが特異的である組
織において、作動可能に連結しているヌクレオチド配列のより高レベルの転写を指示する
ヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例として、限定するものではないが
、タペータム特異的プロモーター;別の特異的プロモーター;花粉特異的プロモーター(
例えば、米国特許第7,141,424号および国際PCT出願番号WO99/0425
87を参照のこと);胚珠特異的プロモーター;(例えば、米国特許出願第2001/0
47525号 A1を参照のこと);果実特異的プロモーター(例えば、米国特許第4,
943,674号および同5,753,475号参照のこと);および種子特異的プロモ
ーター(例えば、米国特許第5,420,034号および同5,608,152号参照の
こと)が挙げられる。いくつかの実施形態では、発達段階特異的プロモーター(例えば、
発達の後期段階で活性なプロモーター)が、本発明の組成物または方法において使用され
得る。
[0089]
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列と
して、翻訳リーダー配列として機能するプロモーター配列とコード配列の間に位置する5
’UTRが挙げられる。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたmRNA中に存
在し、一次転写物のプロセシングおよび/またはRNA安定性に影響を及ぼし得る。翻訳
リーダー配列の例として、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー
(米国特許第5,362,865号)、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リ
ブロース二リン酸カルボキシラーゼリーダーおよびその他のものが挙げられる。例えば、
Turner and Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。5’UTR
の限定されない例は、GmHsp(米国特許第5,659,122号);PhDnaK(
米国特許第5,362,865号);AtAnt1;TEV(Carrington and Freed (19
90), J. Virol. 64:1590-7);およびAGR腫瘍(GenBank受託番号V00087
;およびBevan et al. (1983), Nature 304:184-7)によって提供されている。
[0090]
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は
また、3’非翻訳配列、3’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらは、
ヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルお
よび/または転写もしくはmRNAプロセシングに影響を及ぼすことができるその他の調
節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物におい
て、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル化(polyadenylate)ヌクレオチドの付
加を引き起こすよう機能する。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子から、またはT
−DNA遺伝子から導かれ得る。3’転写終結領域の限定されない例として、ノパリンシ
ンターゼ3’領域(nos3’;Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80
:4803-7)がある。異なる3’非翻訳領域の使用の例が、Ingelbrecht et al., (1989), P
lant Cell 1:671-80に提供されている。ポリアデニル化シグナルの限定されない例として
、エンドウ(Pisum sativum)RbcS2遺伝子に由来するもの(Ps.RbcS2-E9; Coruzzi
et al. (1984), EMBO J. 3:1671-9)およびAGRtu.nos(GenBank受託番
号E01312)が挙げられる。
[0091]
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞などの形質転換された細胞に選択
可能な表現型を付与する選択マーカーを含み得る。選択マーカーはまた、本発明の組換え
核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するために使用され得る。マーカーは、殺生物
剤抵抗性、抗生物質抵抗性(例えば、カナマイシン、ジェネテシン(G418)、ブレオ
マイシン、ハイグロマイシンなど)または除草剤抵抗性(例えば、グリホサートなど)を
コードし得る。選択マーカーの例として、それだけには限らないが、カナマイシン抵抗性
をコードし、カナマイシン、G418などを使用して選択され得るneo遺伝子;ビアラ
ホス抵抗性をコードするpatまたはbar遺伝子;グリホサート抵抗性をコードする変
異株EPSPシンターゼ遺伝子;ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ
遺伝子;イミダゾリノン(imidazolinone)またはスルホニル尿素抵抗性を付与する変異
株アセト乳酸シンターゼ遺伝子(ALS);メトトレキサート抵抗性DHFR遺伝子が挙
げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハ
イグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシ
ン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよ
びテトラサイクリンなどに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である
。このような選択マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号;同5,6
33,435号;同5,780,708号および同6,118,047号に例示されてい
る。
[0092]
本発明の組換え核酸分子またはベクターはまた、またはあるいは、スクリーニング可能
なマーカーを含み得る。スクリーニング可能なマーカーは、発現をモニタリングするため
に使用され得る。例示的なスクリーニング可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼ
または種々の発色基質が公知である酵素をコードするuidA遺伝子(GUS)(Jeffer
son et al. (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405);植物組織におけるアントシア
ニン色素(赤色)の産生を調節する産物をコードするR遺伝子座遺伝子(Dellaporta et
al. (1988),「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging wi
th Ac.」In 18 th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (Ne
w York: Plenum), pp. 263-82);β−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe et al. (1978), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41);種々の発色基質が公知である酵素をコードす
る遺伝子(例えば、PADAC、発色性セファロスポリン);ルシフェラーゼ遺伝子(Ow
et al. (1986), Science 234:856-9);発色性カテコールを変換できるカテコールジオキ
シゲナーゼをコードするxylE遺伝子(Zukowski et al. (1983), Gene 46(2-3):247-5
5);アミラーゼ遺伝子(Ikatu et al. (1990), Bio/Technol. 8:241-2);チロシンをDO
PAおよびドーパキノンに酸化でき、それが、順に、メラニンに縮合する酵素をコードす
るチロシナーゼ遺伝子(Katz et al. (1983), J. Gen. Microbiol. 129:2703-14);およ
びα−ガラクトシダーゼが挙げられる。
[0093]
宿主細胞の形質転換に適した方法として、例えば、限定するものではないが、プロトプ
ラストの形質転換によって(例えば、米国特許第5,508,184号を参照のこと);
乾燥/阻害媒介性DNA取り込みによって(例えば、Potrykus et al. (1985), Mol. Gen
. Genet. 199:183-8を参照のこと);エレクトロポレーションによって(例えば、米国特
許第5,384,253号を参照のこと);シリコンカーバイドファイバーを用いる撹拌
によって(例えば、米国特許第5,302,523号および同5,464,765号を参
照のこと);アグロバクテリウム媒介性形質転換によって(例えば、米国特許第5,56
3,055号、同5,591,616号、同5,693,512号、同5,824,87
7号、同5,981,840号および同6,384,301号を参照のこと);およびD
NAがコーティングされた粒子の加速によって(例えば、米国特許第5,015,580
号、同5,550,318号、同5,538,880号、同6,160,208号、同6
,399,861号および同6,403,865号を参照のこと)など、DNAが細胞中
に導入され得る任意の方法が挙げられる。これらなどの技術の適用によって、実質的にい
かなる種の細胞も、安定に形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換DNA
は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。多細胞性種の場合には、トランスジェニック細
胞は、トランスジェニック生物に再生され得る。あるいは、トランスジェニック細胞は、
植物体に再生できない場合がある。例えば、トランスジェニック植物のゲノム中に本発明
の1種または複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物を生成するために、これらの
技術のいずれも使用され得る。
[0094]
発現ベクターを植物中に導入するために最も広く利用されている方法は、アグロバクテ
リウムの天然形質転換システムに基づいている。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens
)およびA.リゾゲネス(A. rhizogenes)は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原
性土壌細菌である。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)およびA.リゾゲネス(A. r
hizogenes)のTiおよびRiプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与す
る遺伝子を保持する。Ti(腫瘍誘導性)プラスミドは、形質転換された植物に転移され
るT−DNAとして知られる大きなセグメントを含有する。Tiプラスミドの別のセグメ
ント、vir領域が、T−DNA転移に関与している。T−DNA領域は、末端反復に隣
接している。一部の修飾されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導性遺伝子が欠失されて
おり、T−DNA境界配列に隣接している外来DNAを転移させるために、vir領域の
機能が利用される。T−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞の効率
的な回収のための選択マーカーならびに合成アブラナ属由来CTPをコードする核酸など
の転移のための配列を挿入するための多重クローニング部位を含有し得る。
[0095]
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、A.ツメファシエン
ス(A. tumefaciens)のTiプラスミド(例えば、米国特許第4,536,475号、同
4,693,977号、同4,886,937号および同5,501,967号;および
欧州特許EP0122791を参照のこと)またはA.リゾゲネス(A. rhizogenes)の
Riプラスミドから導くことができる。さらなる植物形質転換ベクターとして、例えば、
限定するものではないが、Herrera-Estrella et al. (1983), Nature 303:209-13;Bevan
et al. (1983), Nature 304:184-7;Klee et al. (1985), Bio/Technol. 3:637-42;によっ
て、および欧州特許EP0120516において記載されたものおよび前記のいずれかか
ら誘導されたものが挙げられる。植物と天然に相互作用する、シノリゾビウム(Sinorhiz
obium)、根粒菌(Rhizobium)およびメソリゾビウム(Mesorhizobium)などのその他の
細菌が、いくつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するよう修飾され得る。これらの植
物と関連する共生細菌は、武装解除されたTiプラスミドおよび適したバイナリーベクタ
ーの両方を獲得することによって遺伝子導入に適任にされ得る。
[0096]
外因性DNAをレシピエント細胞に提供した後、一般に、さらなる培養および植物再生
のために形質転換された細胞が同定される。形質転換された細胞を同定する能力を改善す
るために、形質転換体を生成するために使用されるベクターとともに、先に示されたよう
な選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望ましい場合
がある。選択マーカーが使用される場合には、形質転換された細胞は、細胞を、選択物質
(単数または複数)に曝露することによって、形質転換された可能性のある細胞集団内で
同定される。スクリーニング可能なマーカーが使用される場合には、細胞は、所望のマー
カー遺伝子形質についてスクリーニングされ得る。
[0097]
選択物質に対する曝露を生き延びる細胞またはスクリーニングアッセイにおいて陽性と
スコアされた細胞が、植物の再生を支持する培地で培養され得る。いくつかの実施形態で
は、任意の適した植物組織培養培地(例えば、MSおよびN6培地)は、成長調節物質な
どのさらなる物質を含むことによって修飾され得る。組織は、植物再生の試みを開始する
のに、または手作業での選択の反復ラウンド後に十分な組織が利用可能になるまで、組織
の形態が再生に適するまで(例えば、少なくとも2週間)、成長調節物質を含む基本培地
で維持され、次いで、シュート形成につながる培地に移され得る。培養物は、十分なシュ
ート形成が起こるまで周期的に移される。シュートが形成されると、それらは、根形成に
つながる培地に移される。十分な根が形成されると、植物は、さらなる成長および成熟度
のために土壌に移され得る。
[0098]
再生植物における対象とする核酸分子(例えば、少なくとも1種の合成アブラナ属由来
CTPを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列)の存在を確認するために、様
々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイとして、例えば、サザンおよびノーザ
ンブロッティング、PCRおよび核酸配列決定などの分子生物学的アッセイ;例えば、免
疫学的手段によって(ELISAおよび/またはウエスタンブロット)、または酵素機能
によってタンパク質産物の存在を検出することなどの生化学的アッセイ;葉または根のア
ッセイなどの植物部分アッセイ;および再生した植物体全体の表現型の解析が挙げられる
[0099]
例として、組み込み事象は、例えば、対象とするヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用するPCR増幅によって解析され得る。PCR遺伝子型判定
は、ゲノムに組み込まれた、対象とする核酸分子を含有すると予測される単離された宿主
植物組織に由来するゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅と、それに続く
PCR増幅産物の標準的なクローニングおよび配列解析を含むが、それに限定されないと
理解される。PCR遺伝子型判定の方法は、十分に記載されており(例えば、Rios, G. e
t al. (2002), Plant J. 32:243-53を参照のこと)、任意の植物種(例えば、トウモロコ
シ(Z. mays)またはダイズ(G. max))または細胞培養物を含めた組織種に由来するゲ
ノムDNAに適用され得る。
[0100]
アグロバクテリウム依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は
、通常、1つの染色体に挿入された単一の組換えDNA配列を含有する。単一組換えDN
A配列は、「トランスジェニック事象」または「組み込み事象」と呼ばれる。このような
トランスジェニック植物は、挿入されたDNA配列についてヘテロ接合性である。いくつ
かの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物体は、単一
の外因性遺伝子配列を含有する独立した分離個体のトランスジェニック植物を、自身と性
的に交配すること(自家受粉)によって得られ得る、例えば、F1種子を製造するための
植物。製造されたF 種子の4分の1が、導入遺伝子に関してホモ接合体となる。F
種子を発芽させることが、通常、SNPアッセイまたはヘテロ接合性とホモ接合性間の
区別を可能にする熱増幅アッセイ(すなわち、接合状態アッセイ)を使用してヘテロ接合
性について試験され得る植物をもたらす。
[0101]
特定の実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含む少なくとも1
種のポリペプチドのコピーが、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含む少なく
とも1種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1種の核酸分子
が導入されているプラスチドを含有する細胞において製造される。少なくとも1種の合成
アブラナ属由来CTPを含む各ポリペプチドは、異なる形質転換事象において導入された
複数の核酸配列から、または単一の形質転換事象において導入された単一の核酸配列から
発現され得る。いくつかの実施形態では、複数のこのようなポリペプチドが、単一プロモ
ーターの制御下で発現される。その他の実施形態では、複数のこのようなポリペプチドが
、複数のプロモーターの制御下で発現される。複数のペプチド配列を含み、ペプチド配列
の各々が、プラスチドにターゲッティングされるべき、単一のポリペプチドが、発現され
得る。
[0102]
組換え核酸分子を用いる植物の直接形質転換に加えて、少なくとも1つのトランスジェ
ニック事象を有する第1の植物を、このような事象を欠く第2の植物と交雑させることに
よってトランスジェニック植物が調製され得る。例えば、少なくとも1種の合成アブラナ
属由来CTPを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を
、形質転換を受け入れる第1の植物株に導入して、トランスジェニック植物を製造しても
よく、このトランスジェニック植物を、第2の植物と交雑させて、ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を第2の植物株中に遺伝子移入してもよい。
[0103]
VI.合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチドによって指示されるポリペプチドを含む植
物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞が提供される。特定の実施形態では、
このような植物細胞は、植物体を生成するよう再生できない植物細胞の形質転換によって
製造され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを
含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物が、提供され
る。特定の実施形態では、このような植物は、植物組織または植物細胞の形質転換および
全植物体の再生によって製造され得る。さらなる実施形態では、このような植物は、市販
の供給源から、または少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む核酸の生殖質への遺伝子移入によって得られ得る。特
定の実施形態では、このような植物は、植物体を生成するよう再生できない、少なくとも
1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
む植物細胞を含む。少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物材料も提供される。このような植物
材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
[0104]
少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含むトランスジェニック植物、再生不可能な植物細胞または植物材料は、いく
つかの実施形態では、以下の特徴:植物の細胞におけるポリペプチドの発現;植物の細胞
のプラスチドにおけるポリペプチドの一部の発現;植物の細胞のサイトゾルから細胞のプ
ラスチドへのポリペプチドの輸送;植物の細胞におけるポリペプチドのプラスチド特異的
発現;および/または植物の細胞におけるポリペプチドの局在性のうち1種または複数を
示し得る。このような植物は、コードされるポリペプチドの発現以外の1種または複数の
望ましい形質をさらに有し得る。このような形質は、例えば:昆虫、その他の有害生物お
よび疾患を引き起こす物質に対する抵抗性;除草剤に対する耐性;増強された安定性、収
率または有効期間;環境耐性;薬剤製造;工業製品製造;および栄養強化を含み得る。
[0105]
本発明のトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子を用いて形質転換され得る任意
の植物であり得る。したがって、植物は、双子葉植物または単子葉植物であり得る。本方
法において使用可能な双子葉類植物の限定されない例として、アラビドプシス属、アルフ
ァルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ
、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャ
ガイモ、カボチャ(pumpkin)、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチ
ャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびスイカが挙げられる。
本方法において使用可能な単子葉類植物の限定されない例として、トウモロコシ、アブラ
ナ属、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、
ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサが挙げられる。本発明のトランスジェニック
植物は、任意の方法で使用または栽培され得る。
[0106]
いくつかの実施形態はまた、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペ
プチドをコードする1種または複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物、例えば、
1種または複数のこのようなヌクレオチド配列を含有する組換え植物または種子から製造
される商品生産物を提供する。少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペ
プチドをコードする1種または複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物として、例
えば、限定するものではないが、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリ
ペプチドをコードする1種または複数のヌクレオチド配列を含む、食品、食事、油または
破砕された穀類もしくは全粒または植物の種子が挙げられる。1種または複数の商品また
は商品生産物における少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドを
コードする1種または複数のヌクレオチド配列の検出は、商品または商品生産物が、少な
くとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプチドをコードする1種または複数
のヌクレオチド配列を含む植物から、少なくとも幾分かは製造されたという事実上の証拠
である。特定の実施形態では、本発明の商品生産物は、少なくとも1種の合成アブラナ属
由来CTPを含むポリペプチドをコードする核酸配列の検出可能な量を含む。いくつかの
実施形態では、このような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得ることお
よびそれから食物または餌を調製することによって製造され得る。
[0107]
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の合成アブラナ属由来CTPを含むポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物、再
生不可能な植物細胞または種子はまた、限定するものではないが、iRNA分子;殺虫性
タンパク質(例えば、バチルス・チューリンゲンシス(Bacilus thuringiensis)殺虫性
タンパク質)をコードする遺伝子;除草剤耐性遺伝子(例えば、グリホサートに対する耐
性を提供する遺伝子);およびトランスジェニック植物において望ましい表現型(例えば
、増大した収量、変更された脂肪酸代謝または細胞質雄性不稔の回復)に貢献する遺伝子
が転写されるトランスジェニック事象を含めた、少なくとも1種のその他のトランスジェ
ニック事象を、そのゲノム中に含み得る。
[0108]
VII.プラスチドへの、遺伝子産物の合成アブラナ属由来葉緑体輸送ペプチド媒介性局

本発明のいくつかの実施形態は、プラスチド(例えば、葉緑体)への遺伝子産物の発現
および/または局在のための方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子産物は、マー
カー遺伝子産物、例えば、蛍光分子であり得る。合成アブラナ属由来CTPを含むポリペ
プチドの一部としての遺伝子産物の発現は、特定の合成アブラナ属由来CTP配列のプラ
スチド局在能を評価するためのシステムを提供し得る。いくつかの実施形態では、合成ア
ブラナ属由来CTPを含有するポリペプチドの一部としてのマーカー遺伝子産物の発現は
、マーカー遺伝子産物の発現を、ポリペプチドが発現される細胞のプラスチドにターゲッ
ティングするために使用される。特定の実施形態では、このようなマーカー遺伝子産物は
、宿主細胞のプラスチド(複数可)に局在している。例えば、マーカー遺伝子産物は、プ
ラスチド(複数可)において、宿主細胞のサイトゾルまたはその他のオルガネラよりも高
レベルで発現され得るか;マーカー遺伝子産物は、本質的にプラスチド(複数可)のみに
おいて発現され得るか;またはマーカー遺伝子産物は、サイトゾルまたは非プラスチドオ
ルガネラにおける発現が検出され得ないよう、プラスチド(複数可)において完全に発現
され得る。
[0109]
いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子産物と作動可能に連結している、合成アブラ
ナ属由来CTPの機能的変異体を含むポリペプチドは、機能的変異体ペプチドの特徴を評
価するために使用される。例えば、合成アブラナ属由来CTPの配列は、例えば、少なく
とも1つの保存的突然変異を合成アブラナ属由来CTP中に導入することによって変更さ
れ得、得られた変異体ペプチドは、マーカー遺伝子産物に連結され得る。適した宿主細胞
(例えば、発現構築物中の1つまたは複数の調節エレメントが作動可能である細胞)にお
ける発現後、マーカー遺伝子産物の発現が決定され得る。参照合成アブラナ属由来CTP
−マーカー構築物と変異体ペプチド−マーカー構築物間のマーカー遺伝子産物の細胞内局
在性を比較することによって、変異体ペプチドが、例えば、より大きなプラスチド局在性
を提供するか、または実質的に同一のプラスチド局在性を提供するかどうかが決定され得
る。このような変異体は、機能的変異体と考えられ得る。より大きなプラスチド(plasti
c)局在性を提供する合成アブラナ属由来CTPの機能的変異体を同定することによって
、このような変異体における突然変異が、合成アブラナ属由来CTPのさらなる変異体に
組み込まれ得る。この評価プロセスの複数ラウンドを実施すること、続いて、同定された
好都合な突然変異を合成アブラナ属由来CTP配列に組み込むことは、合成アブラナ属由
来CTP配列の最適化のための反復プロセスをもたらし得る。このような最適化された合
成アブラナ属由来CTP配列およびそれをコードするヌクレオチド配列は、このような最
適化された合成アブラナ属由来CTP配列が、さらなる突然変異によってさらに最適化さ
れ得るか否かにかかわらず、本発明の一部と考えられる。
[0110]
本明細書で議論される参考文献は、単に、本願の出願日に先立つその開示のために提供
される。本明細書において、先行発明のために、本発明者らがこのような開示に先行する
権利がないという承認と解釈されるべきものはない。
[0111]
以下の実施例は、特定の個々の特徴および/または態様を例示するために提供される。
これらの実施例は、本開示を、記載される個々の特徴または態様に制限すると解釈されて
はならない。
(実施例)
Example 1
[0112]
キメラ葉緑体輸送ペプチド(TraP)配列の設計および生成
プラスチドは、高等植物種に見出される細胞小器官であり、すべての植物組織中に存在
する。葉緑体は、本質的な生理機能に関与している緑色の光合成組織に見られる特定のタ
イプのプラスチドである。例えば、このような1つの主要な生理機能は、植物に必要とさ
れる芳香族アミノ酸の合成である。核コードされた酵素は、この生合成経路に必要とされ
、細胞質から葉緑体の内部に輸送される。これらの核コードされた酵素は、通常、葉緑体
のストロマへのペプチド輸送を促進するために、葉緑体の膜と相互作用するN末端輸送ペ
プチドを有する。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, functio
n, and evolution. Trends Cell Bio. 10: 440-447。取り込み時に、間質ペプチダーゼは
輸送ペプチドを切断し、葉緑体に取り込まれた成熟機能性タンパク質を残す。Richter S,
Lamppa GK. (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initi
ates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147: 33-43。
葉緑体輸送ペプチドは、長さ、組成および機構において高度に分岐している可変配列であ
る。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolu
tion. Trends Cell Bio. 10: 440-447。葉緑体輸送ペプチドの配列類似性は、異なる植物
種由来の相同タンパク質間で有意に分岐する。異なる植物種から得られた相同タンパク質
は、プロセシングされた成熟機能性タンパク質を比較する場合、典型的に、比較的高レベ
ルの配列類似性を共有することを考慮すると、葉緑体輸送ペプチド間の分岐量は予期され
ない。
[0113]
新規なキメラ葉緑体輸送ペプチド配列を設計し、生成し、in plantaにおいて
試験した。新規なキメラ葉緑体輸送ペプチドは、葉緑体内への農学的に重要なタンパク質
の取り込みのための効果的な移行およびプロセシング特性を有することが示された。最初
に、異なる植物種由来の天然の5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(
EPSPS)タンパク質配列は、http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/にて利用可
能なChloroP(商標)コンピュータプログラムを介して分析され、推定上の葉緑体
輸送ペプチド配列を同定した(Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) Chlor
oP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides an
d their cleavage sites, Protein Science 8; 978-984)。天然の葉緑体輸送ペプチドを
同定した後、第1の葉緑体輸送ペプチド配列を第2の生物由来の第2の葉緑体輸送ペプチ
ド配列と整列させた。図17は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)(NCBI受託番
号:P17688)およびブラシカ・ラパ(Brassica rapa)(NCBI受託番号AAS
80163)のEPSPS葉緑体輸送ペプチド配列のアラインメントを示す。葉緑体輸送
ペプチド配列アラインメントを利用して、新規なキメラ葉緑体輸送ペプチドは、およそ1
:1の比率で、第1の生物由来の葉緑体輸送ペプチド配列の第1の半分と、第2の生物由
来の葉緑体輸送ペプチド配列の第2の半分を組み合わせることによって設計された。新た
に設計されたキメラ葉緑体輸送ペプチドの例示的な配列は、Trap8(配列番号3)お
よびTraP9(配列番号4)である。これらの新規なキメラ葉緑体輸送ペプチド配列は
、セイヨウアブラナ(Brassica napus)[ATCC受託番号:P17688]およびブラ
シカ・ラパ(Brassica rapa)[ATCC受託番号AAS80163]のEPSPSタン
パク質由来である。Trap8(配列番号3)キメラ葉緑体輸送ペプチド配列はセイヨウ
アブラナ(Brassica napus)由来であるN末端を含み、葉緑体輸送ペプチドのC末端はブ
ラシカ・ラパ(Brassica rapa)由来である。TraP9(配列番号4)葉緑体輸送ペプ
チド配列はブラシカ・ラパ(Brassica rapa)由来であるN末端を含み、葉緑体輸送ペプ
チドのC末端はセイヨウアブラナ(Brassica napus)由来である。キメラ葉緑体輸送ペプ
チドは、一過性in planta発現システムを含む複数のアッセイを介して、農学的
に重要な導入遺伝子配列に融合された遺伝子発現エレメントを含む安定な形質転換事象と
して遺伝子導入的に試験された。
Example 2
[0114]
キメラ葉緑体輸送ペプチド(TraP)配列の一過性in planta試験
タバコ一過性アッセイ:
最初に、一過性in plantaアッセイを介して、TraP8およびTraP9の
キメラ葉緑体輸送ペプチド配列を試験した。TraP8(配列番号5)およびTraP9
(配列番号6)のキメラ葉緑体輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を合
成した。リンカー配列(配列番号7)をTraP配列とyfpコード配列間に組み込んだ
。得られた構築物は2つの植物転写単位(PTU)を含有した。第1のPTUは、シロイ
ヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ユビキチン10プロモーター(AtUbi10プロモ
ーター;Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)、TraP−黄色
蛍光タンパク質融合遺伝子(TraP−YFP;米国特許出願公開第2007/0298
412号)、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)ORF23 3’非翻訳領域(AtuORF23 3’UTR;米国特許第5,42
8,147号)で構成された。第2のPTUは、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモ
ーター(CsVMVプロモーター;Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology,
31 : 1 129-1139)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT;Wohlle
ben et al., (1988) Gene, 70: 25-37)、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)ORF1 3’非翻訳領域(AtuORF1 3’UT
R;Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172: 1814-1822)で構成された。構築物pDA
B101977は、TraP8のキメラ葉緑体輸送ペプチドを含有する(図2)。構築物
pDAB101978は、TraP9のキメラ葉緑体輸送ペプチドを含有する。yfp遺
伝子の上流に葉緑体輸送ペプチド配列を含んでいなかった対照プラスミド、101908
は、構築され、研究に含まれていた(図3)。構築物を制限酵素消化および配列決定を介
して確認した。最後に、構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriu
m tumefaciens)に形質転換し、グリセロールストックとして保存した。
[0115]
アグロバクテリウムグリセロールストックから、凍結培養物で満ちたループを14ml
の滅菌チューブ中のYPD(100μg/mlスペクチノマイシン)の2mlに接種した
。接種した培地を200rpmで振とうしながら、28℃にて一晩インキュベートした。
翌日、約100μlの培養物を用いて、125mlの滅菌したトリバッフル付きフラスコ
中に25mlのYPD(100μg/mlスペクチノマイシン)を接種し、200rpm
で振とうしながら一晩28℃にて一晩インキュベートした。翌日、滅菌ddH O(pH
8.0)中でOD 600が0.5になるまで培養物を希釈した。希釈されたアグロバクテ
リウム株は、1:1の比率でP19ヘルパータンパク質を含有する第2のアグロバクテリ
ウム株と混合した。培養物は、Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D., (200
3) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gen
e silencing by the pi 9 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal,
33: 949-956の方法を介して、タバコ葉浸潤に使用された。浸潤されたタバコ植物は、ア
ッセイするまで、少なくとも3日間、24℃にて16時間の光に設定されたConvir
on(商標)に置かれた。
[0116]
顕微鏡の結果:
アグロバクテリウム浸潤したタバコの葉を植物から切断し、脱水を防ぐために水ととも
にペトリ皿に入れた。浸潤したタバコの葉は、YFPレポータータンパク質を首尾よく発
現している葉の損傷がない領域を同定するために、Dark Reader Hand
Lamp(商標)(Clare Chemical Research Co.;Dol
ores、CO)を用いて、適所に保持されたロングパスフィルターガラスを用いた青色
光励起下で観察された。具体的に同定された葉の領域は葉から切断され、共焦点顕微鏡(
Leica TCS−SP5 AOBS(商標);Buffalo Grove、IL)
による画像化のために水中でマウントされた。YFPレポータータンパク質は、マルチラ
インアルゴンイオンレーザーを用いて、514nmのレーザー線で励起した。検出スリッ
トの幅は、バックグラウンドの葉の自己蛍光を排除するために、非発現(暗)対照の葉試
料を用いて調整された。クロロフィルの自己蛍光は、葉緑体の局在を決定するための蛍光
レポータータンパク質シグナルとの直接比較のために第2のチャネルに同時に回収された
[0117]
顕微鏡撮像の結果は、TraP8またはTraP9の葉緑体輸送ペプチドを含むYFP
蛍光タンパク質が、タバコ細胞の細胞質の葉緑体に移行しなかった対照YFP蛍光タンパ
ク質と比較して、タバコ細胞の細胞質に位置した葉緑体内に蓄積したことを示した(図4
および図5)。これらの顕微鏡撮像の結果は、葉緑体へのYFPタンパク質の移行が、T
raP8またはTraP9の葉緑体輸送ペプチドの結果であったことを示唆している。図
5および図6に示すように、YFP蛍光シグナルは、顕微鏡撮像条件下での自己蛍光に起
因して、赤色蛍光も発する葉緑体に局在する。比較的に、図7は、葉緑体輸送ペプチドを
含まない対照構築物pDAB101908で浸潤されたタバコ葉組織の顕微鏡画像を与え
る。この画像内の葉緑体は、顕微鏡撮像条件下で自己蛍光に起因して、赤色蛍光だけを発
し、TraP浸潤されたタバコ細胞において示されるいずれものYFP蛍光シグナルを欠
いている。むしろ、対照タバコ植物細胞におけるYFP蛍光シグナルは、タバコ植物細胞
の細胞質全体に拡散的に発現される。
[0118]
ウエスタンブロットの結果:
浸潤したタバコ植物の試料をウエスタンブロッティングを介してアッセイした。リーフ
パンチを収集し、ビーズミルに供した。約100〜200mgの葉材料は、Kleco(
商標)ビーズミル中で3分間、2BB(鋼球)(Daisy;Rogers、AR)およ
び500mlのPBSTと混合された。次に、試料を14,000×g、4℃にて遠心機
でスピンダウンした。上清を除去し、ウエスタンブロットまたは免疫沈降のいずれかを介
して直接分析した。製造業者のプロトコールに従って、Pierce Direct I
Pキット(商標)(Thermo Scientific;Rockford、IL)を
用いて免疫沈降を行った。およそ50μgの抗YFPを樹脂に結合させた。試料を樹脂と
ともに一晩、4℃にてインキュベートした。次に、試料を洗浄し、翌朝溶出した。等量の
2×8M尿素試料緩衝液を合わせ、その後、試料を5分間煮沸することによって分析用に
準備した。MOPS緩衝液中の4〜12%SDS−Bis Trisゲル上で煮沸試料を
40分間泳動した。次に、製造業者のプロトコールに従って、Invitrogen i
Blot(商標)(Life Technologies;Carlsbad、CA)を
用いてゲルをブロットした。ブロットしたメンブレンをPBS−Tween溶液中の5%
脱脂粉乳を用いて10分間ブロックした。PBS−Tween溶液中の5%脱脂粉乳で1
:1000希釈で使用した一次抗体(ウサギのモノクローナル抗GFP)を用いてメンブ
レンを1時間探査した。次に、すべての未結合の一次抗体を除くために、PBS−Twe
enを用いて5分間3回、メンブレンを濯いだ。1:1000希釈で使用したヤギの二次
モノクローナル抗ウサギ抗体(Life Technologies)を用いてメンブレ
ンを60分間探査した。メンブレンを上記に記載の通りに洗浄し、Themo BCIP
/NBT基質を添加することによって発色させた。比色基質は、5〜10分間発色させ、
続いて、乾燥させる前にブロットを水で濯いだ。
[0119]
ウエスタンブロットの結果は、YFPタンパク質が浸潤したタバコ細胞で発現したこと
を示した。pDAB101977とpDAB101978浸潤したタバコ植物葉組織はと
もに、YFP抗体に反応したタンパク質バンドの存在によって示されるように、YFPタ
ンパク質を発現し、YFP対照構築物で浸潤されたタバコ植物葉組織から得られたYFP
タンパク質バンドと大きさにおいて同等であった。さらに、これらの結果は、TraPキ
メラ葉緑体輸送ペプチドがプロセシングされ、YFPタンパク質から切断されたことを示
した。Trap8−YFPおよびTraP9−YFP構築物は、対照YFPタンパク質よ
りも分子量が大きい事前にプロセシングされたタンパク質バンドを発現する。対照YFP
とサイズにおいて同等であるウエスタンブロット上のバンドの存在は、TraP8とTr
aP9の葉緑体輸送ペプチド配列がプロセシングされ、それによって、YFP対照と同等
である分子量の大きさにYFPの大きさを小さくしたことを示す。
[0120]
トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイ:
TraP8キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(配列番号5
)とリンカーをコードするポリヌクレオチド配列(配列番号7)は、黄色蛍光タンパク質
遺伝子の上流にクローニングされ、トウモロコシプロトプラストの一過性in plan
taアッセイを介した試験のために構築物pDAB106597(図7)に組み込まれた
。得られた構築物は、単一の植物転写単位(PTU)を含有した。PTUは、トウモロコ
シ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター(ZmUbi1プロモーター;Christensen, A
., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, therm
al perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity fol
lowing transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:
675-689)、TraP−黄色蛍光タンパク質融合遺伝子(TraP8−YFP;米国特許
出願公開第2007/0298412号)、およびトウモロコシ(Zea mays)ペルオキシ
ダーゼ5 3’非翻訳領域(ZmPer5 3’UTR;米国特許第6384207号)
で構成された。制限酵素消化および配列決定を介して構築物を確認した。
[0121]
トウモロコシ(Zea mays)変種B104の種子は、2〜3滴のTween 20を含む
50%Clorox(3%次亜塩素酸ナトリウム)中で、約20分間激しく振とうするこ
とによって表面を滅菌した。種子を滅菌蒸留水で十分に濯いだ。無菌種子は、Phyta
trayまたは類似タイプのボックス中で1/2MS培地に播種され、暗所(28℃)に
て12〜20日間成長させた。トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイを用いて、B
104−トウモロコシの葉からのトウモロコシプロトプラストを得てトランスフェクトし
た。このトウモロコシプロトプラストアッセイは、Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen,
J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Tran
sient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2: 1565-1572によって記載されて
いるシステムの変法である。溶液をYooら(2007)によって記載されるように調製したが
、以下の実験に使用したマンニトール濃度を0.6Mに変更したことを除く。
[0122]
100〜500μlのプロトプラスト(1−5×10 )のトランスフェクションは、
室温にて、約40μgのプラスミドDNA(pDAB106597)を含む2mlの微量
遠心管にプロトプラストを添加することによって完了した。DNAの体積は、好ましくは
、プロトプラストの体積の約10%に維持された。プロトプラストおよびDNAは、時々
、5分間のインキュベーション期間中に混合された。等体積のPEG溶液を1回につき2
滴、プロトプラストとDNAにゆっくりと添加し、PEG溶液の液滴の添加間に混合した
。チューブは、時々穏やかに混合しながら約10分間インキュベートした。次に、1ml
のW5+溶液を添加し、チューブを数回反転させることによって混合した。チューブ(複
数可)を4℃の温度にて75×gで5分間遠心分離した。最後に、上清を除去し、ペレッ
トを1mlのWI溶液に再懸濁し、プロトプラストを小さなペトリ皿(35×10mm)
または6ウェルのマルチウェルプレート中に置き、一晩、暗所にて室温でインキュベート
した。YFPの蛍光を、12時間のインキュベーション後に顕微鏡で観察した。前述した
顕微鏡の条件を撮像のために使用した。
[0123]
顕微鏡撮像の結果は、TraP8キメラ葉緑体輸送ペプチドを含むYFP蛍光タンパク
質が、トウモロコシ細胞の細胞質の葉緑体内に移行しない対照YFP蛍光タンパク質と比
較して、トウモロコシ細胞の細胞質に位置する葉緑体に蓄積されたことを示した(図8)
。これらの顕微鏡撮像の結果は、葉緑体へのYFPタンパク質の移行が、TraP8のキ
メラ葉緑体輸送ペプチドの結果であったことを示唆している。
Example 3
[0124]
アラビドプシス属における農学的に重要な導入遺伝子の発現のためのキメラ葉緑体輸送ペ
プチド(TraP)配列
大腸菌(Esherichia coli)の5−エノールピルビルシキミ酸3−リン酸シンターゼ酵
素(EPSPシンターゼ)における1アミノ酸突然変異(G96A)は、グリホサート非
感受性をもたらすことができる(Padgette et al, (1991); Eschenburg et al., (2002);
Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008))。この突然変異はグリホサートに
対する耐性を付与するが、その天然基質であるホスホエノールピルビン酸(PEP)によ
るEPSPシンターゼの結合に悪影響を及ぼすことも知られている。基質結合効率におい
て生じた変化は、グリホサートに対するin plantaにおける耐性を提供するため
に、突然変異した酵素を不適当なものにし得る。
[0125]
EPSPシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌(E.coli)バージョンに導入したG96
A突然変異と類似した位置でアラニンを天然に含有するEPSPシンターゼタンパク質配
列とポリヌクレオチド配列についてインシリコにおいてNCBI Genbankデータ
ベースをスクリーニングした(Padgette et al, (1991); Eschenburg et al, (2002); Pr
iestman et al, (2005); Haghani et al, (2008))。
[0126]
この位置で天然のアラニンを含むことが同定された1つの酵素は、ストレプトマイセス
・スビセウス(Streptomyces sviceus)ATCC29083由来のDGT−28(GEN
BANK受託番号:ZP_06917240.1)であった。さらに、インシリコのデー
タマイニングは、DGT−28;DGT−31(GENBANK受託番号:YP_004
922608.1);DGT−32(GENBANK受託番号:ZP_04696613
);およびDGT−33(GENBANK受託番号:NC_010572)により高い相
同性を有する3つの他の固有のストレプトマイセス酵素を示した。これらの酵素のそれぞ
れは、EPSPシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌(E.coli)バージョンに導入された
G96A突然変異と類似した位置で天然のアラニンを含有する。図1。
[0127]
異なる生物由来のEPSPシンターゼタンパク質は長さが異なるため、EPSPシンタ
ーゼ酵素の大腸菌(E.coli)バージョンの突然変異の番号付けは、他の生物由来のEPS
Pシンターゼ酵素の突然変異の番号付けと必ずしも対応しない。これらの同定されたEP
SPシンターゼ酵素は、グリホサート耐性またはPEP基質親和性に関して従前特徴付け
られていなかった。さらに、これらのEPSPシンターゼ酵素は、EPSPシンターゼ酵
素の新しいクラスを表し、前述のクラスI(米国再発行特許第39247号にさらに記載
されている植物由来の配列)、II(米国再発行特許第39247号にさらに記載されて
いる細菌由来の配列)、およびIII(国際特許出願WO2006/110586にさら
に記載されている細菌由来の配列)のEPSPシンターゼ酵素を特徴付けるために使用さ
れているいずれもの配列モチーフを含まない。
[0128]
新規なDGT−14、DGT−28、DGT−31、DGT−32、およびDGT−3
3酵素は、クラスIのEPSPシンターゼ酵素と比較することによって、グリホサート耐
性およびPEP基質親和性について特徴付けられた。以下のクラスIの酵素;ダイズ(Gl
ycine max)由来のDGT−1、セイヨウアブラナ(Brassica napus)由来のDGT−3
(GENBANK受託番号:P17688)、およびコムギ(Triticum aestivum)由来
のDGT−7(GENBANK受託番号:EU977181)は比較のためのものであっ
た。クラスIのEPSPシンターゼ酵素およびその変異改変体を合成し、評価した。植物
EPSPシンターゼ酵素に導入された突然変異は、酵素の大腸菌(E.coli)バージョン由
来のG96A突然変異と同様の位置で、EPSPシンターゼ酵素内でなされたグリシンか
らアラニンへの突然変異からなっていた。さらに、トレオニンからイソロイシンおよびプ
ロリンからセリンの突然変異は、Funke et al., (2009)において記載されているように、
大腸菌(E.coli)のEPSPシンターゼにおけるアミノ酸97(TからI)とアミノ酸1
01(PからS)の突然変異と類似した位置で、これらのクラスIのEPSPシンターゼ
酵素内に導入された。
[0129]
DGT14:
dgt−14導入遺伝子と融合されたTraP8およびTraP9キメラ葉緑体輸送ペ
プチドを含有するトランスジェニックT アラビドプシス属植物を、Clough and Bent (1
998), Plant J. 16:735−743からのフローラルディップ(floral dip)法を使用して製造
した。トランスジェニックアラビドプシス属植物を入手し、分子確認によって、導入遺伝
子を含有すると確認した。トランスジェニック植物は、異なる比率のグリホサートで噴霧
された。増加した比率を含む様々な濃度のグリホサート比率の分布は、抵抗性の相対レベ
ル(105、420、1,680、または3,360g ae/ha)を決定するために
、この研究において適用された。グリホサートの典型的な1×フィールド使用率は1,1
20g ae/haである。この研究で使用したT アラビドプシス属植物は、dgt−
14導入遺伝子のコピー数において変動した。低コピー数のdgt−14 T アラビド
プシス属植物は、分子確認アッセイを用いて同定され、自家受粉し、使用して、T 植物
を作製した。表1は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子であるdgt−1(米国特許出願
番号12558351に記載されている)を含む対照植物と比較して、dgt−14トラ
ンスジェニック植物に対する抵抗性を示す。
[0130]
アラビドプシス属T 形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して
、非形質転換種子のバックグラウンドから選択された。3フラット、または30,000
個の種子をそれぞれのT 構築物について分析した。選択されたT 植物は分子的に特徴
付けられ、該植物は、その後、個別のポットに移植され、前述のように、様々な比率の市
販のグリホサートで噴霧された。これらの植物の用量反応は、処置から2週間後(WAT
)、視覚的損傷%の観点から提示される。損傷がほとんどないもしくは全くない(<20
%)、中程度の損傷(20〜40%)、または重度の損傷(>40%)を提示する個々の
植物を示すデータが、下記の表に示されている。算術平均および標準偏差は、アラビドプ
シス属形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答に
おける範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。
野生型、非形質転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート感受性対
照として用いた。
[0131]
植物応答のレベルはT アラビドプシス属植物において変化した。この差異は、それぞ
れの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因することができ、したがって、
対象とする遺伝子のコピー数は、植物ごとに変動する。比率による全体的な集団の損傷平
均は表1に示され、様々な比率のグリホサートに対して、TraP8 v2またはTra
P9 v2の葉緑体輸送ペプチド対dgt−1および非形質転換の野生型対照と連結され
たdgt−14構築物のそれぞれによって提供される耐性を実証する。事象は、構築物p
DAB105526(図9)に含まれるTraP8 v2(配列番号8)および構築物p
DAB105527(図10)に含まれるTraP9 v2(配列番号9)と連結された
dgt−14を含有した。T 植物のグリホサート選択からのデータは、dgt−14が
これらの葉緑体輸送ペプチドと連結された場合、高レベルのグリホサートに対する強固な
耐性が提供されたことを実証した。比較的に、非形質転換(または野生型)対照は、類似
した比率のグリホサートで処理したとき、高濃度のグリホサートの処理に対して耐性を提
供しなかった。さらに、dgt−14の3つ以上のコピーを含有することが示された事象
が、増大した比率のグリホサートに対してより感受性である例があった。これらの例は、
表1に示される視覚的な損傷範囲の割合内で実証される。アラビドプシス属植物内での高
いコピー数の導入遺伝子の存在が、dgt−14導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入
遺伝子サイレンシングまたはグリホサートに対する感受性をもたらす他のエピジェネティ
ックな効果をもたらす可能性がある。
[0132]
[Table 1]


[0133]
導入遺伝子の挿入物の低コピー数(1〜3コピー)を含むことが同定された、選択され
たT アラビドプシス属植物は、グリホサート耐性のさらなる評価のために自家受粉され
、第2世代を生成した。TraP8とTraP9のキメラ葉緑体輸送ペプチドに融合した
1〜3コピーのdgt−14導入遺伝子を含んだ第2世代のアラビドプシス属植物(T
)は、グリホサート耐性およびグルホシネート耐性についてさらに特徴付けられた(グル
ホシネート抵抗性は、PAT発現カセットが無傷であり、T 植物の自殖の際に再配列を
受けなかったことを示した)。T 世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それ
ぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率の
グリホサートに含まれた。ヘミ接合植物は、遺伝子座で同じ2つの対立遺伝子を含むホモ
接合植物と比較して、遺伝子座で2つの異なる対立遺伝子を含む。T 植物のコピー数と
倍数性レベルは、分子分析プロトコールを用いて確認された。同様に、グリホサートは、
前述のような方法および比率を用いて適用された。植物の用量反応は、処置から2週間後
(WAT)、視覚的損傷%に関して示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全
くない(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)、または重度の損傷(>40%)を
提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシ
ス属形質転換のために使用される各構築物について提示されている。個別の応答における
範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非
形質転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート感受性対照として用
いた。さらに、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子であるdgt−1(米国特許出願番号1
2558351に記載されている)を含む植物を正の対照として含めた。
[0134]
世代では、単一コピーおよび低コピー(2または3コピー)のdgt−14事象の
両方がグリホサート耐性について特徴付けられた。比率による全体的な集団の損傷平均は
表2に示され、様々な比率のグリホサートに対して、葉緑体輸送ペプチド対dgt−1お
よび非形質転換の野生型対照と連結されたdgt−14構築物のそれぞれによって提供さ
れる耐性を実証する。T 世代の事象は、TraP8 v2(pDAB105526)お
よびTraP9 v2(pDAB105527)と連結されたdgt−14を含有した。
これらの事象の両方は、グリホサートに対して非常に抵抗性である。結果は、T アラビ
ドプシス属植物についての損傷範囲が、試験されたグリホサートのすべての濃度について
20%未満であったことを示した。比較的に、非形質転換(または野生型)対照は、類似
した比率のグリホサートで処理したとき、高濃度のグリホサートの処理に対して耐性を提
供しなかった。全体的に、結果は、TraP8とTraP9のキメラ輸送ペプチドタンパ
ク質に融合したDGT−14を含み、発現する植物が、フィールド比率の最大3倍(11
20g ae/ha)のレベルにグリホサートに対する市販レベルの抵抗性をもたらした
ことを示した。
[0135]
[Table 2]


[0136]
導入遺伝子の挿入物の低コピー数(1〜3コピー)を含むことが同定された、無作為に
選択されたT アラビドプシス属植物は、グリホサート耐性のさらなる評価のために自家
受精され、第3世代を生成した。第3世代(T )からのアラビドプシス属種子を植え、
先に記載したのと同じプロトコールを用いてグリホサート耐性について評価した。T
代で試験された事象は、ホモ接合性のそれぞれの系統からの反復を含んでいた(高度な植
物のいずれかが導入遺伝子の分離を示したかどうかを識別するためにグルホシネート抵抗
性スクリーニングを使用することによって決定された)。これらの事象は、植物がDGT
−14タンパク質を発現していることを確認するために、LC−MS−MSによってアッ
セイされた。グリホサートの比率による全体的な集団の損傷平均に関するT 世代の結果
は表3に示され、この表は、様々な比率のグリホサートについて、dgt−14構築物の
それぞれが提供するグリホサートに対する耐性を示している。典型的な抵抗性T 事象は
、TraP8 v2(pDAB105526)およびTraP9 v2(pDAB105
527)と連結されたdgt−14を含んでいた。これらの事象の両方は、グリホサート
に対して非常に抵抗性である。結果は、T アラビドプシス属植物についての損傷範囲が
、試験されたグリホサートのすべての濃度について20%未満であったことを示した。比
較的に、非形質転換(または野生型)対照は、類似した比率のグリホサートで処理したと
き、高濃度のグリホサートの処理に対して耐性を提供しなかった。全体的に、結果は、D
GT−14を含み、これを発現する植物が、フィールド比率の最大3倍(1120g a
e/ha)のレベルにグリホサートに対する市販レベルの抵抗性をもたらしたことを示し
た。
[0137]
[Table 3]


[0138]
データは、グリホサート耐性酵素(例えば、DGT−28)の発現は、融合タンパク質
においてTraP輸送ペプチドによって植物細胞の葉緑体へターゲッティングされる場合
に、グリホサート耐性を植物細胞およびこれらの細胞からなる植物体へ付与できることを
示す。
[0139]
DGT−28、DGT−31、DGT−32、およびDGT−33:
新たに設計された、双子葉植物の最適化されたdgt−28 v5ポリヌクレオチド配
列は配列番号16に列挙されている。新たに設計された、単子葉植物の最適化されたdg
t−28 v6ポリヌクレオチド配列は配列番号17に列挙されている:この配列は、制
限酵素部位を導入するために、第2のアミノ酸位置でアラニンを含むことによって僅かに
改変された。得られたDNA配列は、高度なコドン多様性、所望の塩基組成を有し、戦略
的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または生成物mRNAの翻訳を干
渉し得る配列を欠損している。
[0140]
6個のフレーム終止(コード配列の3’端に追加された全6個のリーディングフレーム
に位置した終止コドン)およびクローニングのための5’制限部位などの追加配列を含有
する配列番号16と配列番号17を含むDNA断片の合成は、商業的供給業者(DAN2
.0、Menlo Park、CA)によって行われた。次に、合成核酸分子は、発現ベ
クターにクローニングされ、以下の実施例に記載されるように、植物または細菌に形質転
換された。
[0141]
同様のコドン最適化戦略を用いて、dgt−1、dgt−3 v2(G173A)、d
gt−3 v3(G173A;P178S)、dgt−3 v4(T174I;P178
S)、dgt−7 v4(T168I;P172S)、dgt−32 v3、dgt−3
3 v3、およびdgt−31 v3を設計した。これらの遺伝子のコドン最適化バージ
ョンは、それぞれ、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番
号22、配列番号23、配列番号24、および配列番号25として列挙されている。
[0142]
植物バイナリーベクター構築。標準的なクローニング法は、インフレーム融合としてd
gt−28に連結した葉緑体輸送ペプチドポリヌクレオチド配列を含有するエントリーベ
クターの構築に使用された。dgt−28に融合した輸送ペプチド(TraP)を含むエ
ントリーベクターは、IN−FUSION(商標)Advantage Technol
ogy(Clontech、Mountain View、CA)を用いて組み立てられ
た。融合の結果として、第1のアミノ酸であるメチオニンをdgt−28から除いた。輸
送ペプチドTraP4 v2(配列番号26)、TraP5 v2(配列番号27)、T
raP8 v2(配列番号28)、TraP9 v2(配列番号29)、TraP12
v2(配列番号30)、およびTraP13 v2(配列番号31)は、それぞれ、DN
A2.0(Menlo Park、CA)によって合成され、最大で固有のAccI制限
エンドヌクレアーゼ認識部位を含むdgt−28の5’端の断片に融合させた。
[0143]
様々なTraPおよびdgt−28発現カセットを含んだバイナリープラスミドをシロ
イヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ユビキチン10プロモーター(AtUbi10 v
2;Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)によって駆動させ、隣
接してアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオープ
ンリーディングフレームの23個の3’非翻訳領域(AtuORF23 3’UTR v
1;米国特許第5,428,147号)を並べた。
[0144]
組み立てられたTraPおよびdgt−28発現カセットは、GATEWAY(登録商
標)技術(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて遺伝子操作され、
アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換を介して植物に形質転換させた。制限エンド
ヌクレアーゼをNew England BioLabs(NEB;Ipswich、M
A)から得て、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen)をDNAライゲーション
のために使用した。選択マーカーカセットキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター
(CsVMV v2;Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol, 31: 1129-1139)−D
SM−2(米国特許出願第2007/086813号)−アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオープンリーディングフレームの1つの3’
非翻訳領域(AtuORFl 3’UTR v6;Huang et al, (1990) J. Bacteriol.
172: 1814-1822)を含む単一のデスティネーションベクターに1つのエントリーベクター
を組み込むことによって、GATEWAY(登録商標)LR CLONASE(登録商標
)酵素ミックス(Invitrogen)を用いてGateway反応を行った。プラス
ミド調製は、供給業者の指示に従って、NUCLEOSPIN(登録商標)プラスミドキ
ット(Macherey−Nagel Inc.、Bethlehem、PA)またはプ
ラスミドMidiキット(Qiagen)を用いて行われた。DNA断片は、アガロース
、Tris−アセテートゲル電気泳動後、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Q
iagen)を用いて単離された。
[0145]
すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、ミニプレップDNAの制限
消化によってスクリーニングされた。選択されたクローンのプラスミドDNAを、市販の
シークエンシングベンダー(Eurofins(商標)MWG Operon、Hunt
sville、AL)によって配列決定された。配列データを組み立て、SEQUENC
HER(商標)ソフトウェア(Gene Codes Corp.、Ann Arbor
、MI)を用いて分析した。
[0146]
以下のバイナリー構築物は、様々なTraP:dgt−28融合遺伝子配列を発現する
:pDAB107527(図18)はTraP4 v2:dgt−28 v5(配列番号
32)を含む;pDAB105530(図19)はTraP5 v2:dgt−28 v
5(配列番号33)を含む;pDAB105531(図20)はTraP8 v2:dg
t−28 v5(配列番号34)を含む;PDAB105532(図21)はTraP9
v2:dgt−28 v5(配列番号35)を含む;pDAB105533(図22)
はTraP12 v2:dgt−28 v5(配列番号36)を含む;pDAB1055
34(図23)はTraP13 v2:dgt−28 v5(配列番号37)を含む。p
DAB105534のdgt−28 v5配列は修飾され、第1のコドン(GCA)を(
GCT)に変更した。
[0147]
追加の植物バイナリーベクター構築。上述したものと類似したクローニング戦略を用い
て、dgt−31、dgt−32、dgt−33、dgt−1、dgt−3、およびdg
t−7を含むバイナリープラスミドを構築した。
[0148]
微生物由来の遺伝子;dgt−31、dgt−32、およびdgt−33は、先に記載
したものとは異なる葉緑体輸送ペプチドと融合させた。以下の葉緑体輸送ペプチドを使用
した;TraP14 v2(配列番号38)、TraP23 v2(配列番号39)、T
raP24 v2(配列番号40)。pDAB107532(図24)は、TraP14
v2(配列番号41)に融合させたdgt−32 v3を含み、pDAB107534
(図25)は、TraP24 v2(配列番号42)と融合させたdgt−33 v3を
含み、pDAB107533(図26)は、TraP23 v2(配列番号43)に融合
させたdgt−31 v3を含む。dgt発現カセットは、シロイヌナズナ(Arabidopsi
s thaliana)ユビキチン10プロモーター(AtUbi10プロモーターv2)によって
駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオ
ープンリーディングフレームの23個の3’非翻訳領域(AtuORF23 3’UTR
v1)を並べた。キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター(CsVMV v2)
−DSM−2−アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
のオープンリーディングフレームの1つの3’非翻訳領域(AtuORF1 3’UTR
v6)を含むDSM−2選択マーカーカセットもバイナリーベクターに存在した。
[0149]
dgt−31 v3、dgt−32 v3、およびdgt−33 v3が先に記載され
た葉緑体輸送ペプチド配列に融合している追加のバイナリーを構築する。例えば、Tra
P8 v2配列は、dgt−31 v3、dgt−32 v3、およびdgt−33 v
3に融合され、上記したバイナリーベクターにクローニングされる。
[0150]
クラスI遺伝子(dgt−1、dgt−3、およびdgt−7)を含むバイナリーベク
ターを構築した。以下のバイナリーベクターを構築し、植物に形質転換した:米国特許出
願公開第2011/0124503号に記載されているdgt−1 v4配列を含むpD
AB4104(図27)を米国特許出願公開第2009/0064376号に記載されて
いるニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)オスモチン配列;pDAB10271
5(図28);pDAB102716(図29);pDAB102717(図30);お
よびpDAB102785(図31)と並べる。dgt−28、dgt−31、dgt−
32、およびdgt−33に融合させた様々なTraP葉緑体輸送ペプチドは、これらの
植物由来の配列は天然の植物葉緑体輸送ペプチドを有するため、クラスI遺伝子に追加さ
れなかった。これらのベクターは、表4においてさらに詳細に記載されている。
[0151]
[Table 4]


[0152]
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の形質転換。アラビドプシス属は、Cloughお
よびBent(1998)のフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記のバイナリープ
ラスミドの1つを含む選択されたアグロバクテリウムコロニーを使用して、スペクチノマ
イシン(100mg/L)およびカナマイシン(50mg/L)を含むYEPブロスの1
つまたは複数の100mLの前培養物を植菌した。培養物を225rpmで一定に撹拌し
ながら一晩28℃にてインキュベートした。細胞を10分間、室温にて約5000×gで
ペレットにし、得られた上清を捨てた。5%(w/v)スクロース、10μg/Lの6−
ベンジルアミノプリン、および0.04%Silwet(商標)L−77を含有する40
0mLの液体培地において穏やかに再懸濁させた。約1カ月齢の植物は、穏やかに撹拌し
ながら5〜10分間、培地中に浸漬させた。植物は、それらの側面を下に置き、2〜3時
間、透明または不透明なプラスチックバッグで覆い、その後、直立に配置された。植物は
、22℃にて16時間の明/8時間の暗の光周期で成長させた。浸漬から約4週間後、種
子を回収した。
[0153]
形質転換植物の選択。新たに回収したT 種子[dgtとDSM−2発現カセットを含
む]を7日間室温にて乾燥させた。T 種子は、26.5×51cmの発芽トレイに播種
され、それぞれは、予め40mLの0.1%アガロース溶液に懸濁され、4℃にて2日間
保存された、層状にしたT 種子の200mgアリコート(約10,000個の種子)を
受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
[0154]
Sunshine Mix LP5は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホー
グランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ4
0mLのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、4〜5
日間、湿気ドームで覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧(同時形質転換され
たDSM−2遺伝子を選択する)を使用した最初の形質転換体選択の1日前に外された。
[0155]
植え付け後(DAP)7日とさらに11DAPに、T 植物は、適用あたり280g
ai/haグルホシネートの有効比率を達成するために、DeVilbiss圧縮空気噴
霧チップを用いて、10mL/トレイ(703L/ha)の噴霧体積で、Liberty
除草剤(200g ai/Lグルホシネート、Bayer Crop Sciences
、Kansas City、MO)の0.2%溶液で噴霧された。生存者(活発に成長し
ている植物)は、最終噴霧から4〜7日後に特定され、ポッティングメディア(Metr
o Mix 360)を用いて調製された3インチ(7.62cm)のポットに個別に移
植された。移植された植物は、3〜4日間、湿気ドームで覆われ、前述のように22℃の
成長チャンバー内に置かれ、または温室に直接移された。その後、ドームを外し、植物を
温室(22±5℃、50±30%RH、14時間の明:10時間の暗、最小500μΕ/
自然+補助照明)で育てた。分子確認分析は、生存T 植物について完了し、グ
リホサート耐性遺伝子が植物のゲノムに安定に組み込まれたことを確認した。
[0156]
分子確認。pDAB107527、pDAB105530、pDAB105531、p
DAB105532、pDAB105533、またはpDAB105534で形質転換さ
れたアラビドプシス属植物のゲノム内でdgt−28およびDSM−2導入遺伝子の存在
が確認された。これらのポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイ、遺
伝子発現カセットPCR(植物転写単位PCR−−PTU PCRとも記載される)、サ
ザンブロット分析、および定量的逆転写PCR分析によって確認された。
[0157]
アラビドプシス属植物は、最初に、TAQMAN(商標)に類似した加水分解プロ
ーブアッセイを介してスクリーニングされ、DSM−2およびdgt−28導入遺伝子の
存在を確認した。事象は、遺伝子発現カセットPCRによりスクリーニングされ、dgt
発現カセットが、再配列することなく、植物ゲノムに完全に組み込まれたかどうかを決定
した。これらの研究から得られたデータを用いて、自家受精およびT 世代への進行に関
して、導入遺伝子のコピー数を決定し、選択アラビドプシス属事象を同定した。また、進
行したT アラビドプシス属植物を加水分解プローブアッセイによりスクリーニングし、
植物染色体内にDSM−2遺伝子とdgt遺伝子の存在を確認し、そのコピー数を推定し
た。最後に、サザンブロットアッセイを用いて、T アラビドプシス属植物のサブセット
上の推定コピー数を確認した。
[0158]
同様のアッセイを用いて、pDAB4101で形質転換された植物由来のdgt−1導
入遺伝子の存在、pDAB107532で形質転換された植物由来のdgt−32導入遺
伝子の存在、pDAB107534で形質転換された植物由来のdgt−33導入遺伝子
の存在、pDAB102715で形質転換された植物由来のdgt−3導入遺伝子の存在
、pDAB102716で形質転換された植物由来のdgt−3導入遺伝子の存在、pD
AB102717で形質転換された植物由来のdgt−3導入遺伝子の存在、およびpD
AB102785で形質転換された植物由来のdgt−7導入遺伝子の存在を確認した。
[0159]
加水分解プローブアッセイ。後述する加水分解プローブアッセイを用いて、T とT
アラビドプシス属植物におけるコピー数を決定した。様々な数の導入遺伝子を有する植物
を同定し、その後のグリホサート耐性研究に進めた。
[0160]
組織試料を96ウェルプレートに回収し、2日間凍結乾燥した。組織浸軟は、KLEC
O(商標)組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された(Environ Me
tal INC.、Sweet Home、Oregon)。組織浸軟後、製造業者が示
唆するプロトコールに従って、Biosprint(商標)96植物キット(Qiage
n(商標)、Germantown、MD)を用いて、ハイスループット形式でゲノムD
NAを単離した。ゲノムDNAをQUANT−IT(商標)PICO GREEN DN
Aアッセイキット(Molecular Probes、Invitrogen、Car
lsbad、CA)によって定量した。定量されたゲノムDNAは、BIOROBOT3
000(商標)自動化液体ハンドラー(Qiagen、Germantown、MD)を
用いて、加水分解プローブアッセイのために約2ng/μLに調整された。加水分解プロ
ーブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、LIGHTCYCLER(登録商標
)480システム(Roche Applied Science、Indianapo
lis、IN)を用いたリアルタイムPCRによって行われた。アッセイは、DSM−2
、dgt−28および内部参照遺伝子、TAFII15(Genbank ID:NC0
03075;Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61)について設計された。
[0161]
増幅のために、LIGHTCYCLER(登録商標)480プローブマスターミックス
(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)は
、DSM−2とdgt−28用のそれぞれ0.1μMのプライマー、TAFII15につ
いてそれぞれ0.4μMのプライマーおよび0.2μMのそれぞれのプローブを含有する
10μL体積の多重反応物において1×最終濃度で調製された。
[0162]
表5.二段階増幅反応は、60℃にて40秒間の伸長を用いて行い、蛍光を得た。すべ
ての試料を実施し、平均サイクル閾値(Ct)をそれぞれの試料の分析に使用した。リア
ルタイムPCRデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いるLightCycle
r(商標)ソフトウェアリリース1.5を使用して行い、ΔΔCt法に基づいている。こ
のために、1コピーの較正物質由来のゲノムDNAの試料と既知の2コピーチェックをそ
れぞれの実行に含めた。加水分解プローブスクリーニングのコピー数の結果は、T およ
びT トランスジェニックアラビドプシス属植物について決定された。
[0163]
[Table 5]


[0164]
サザンブロット分析を介したdst−28組み込み確認。サザンブロット分析を用いて
、挿入されたT−鎖DNA断片の組み込みパターンを確立し、dgt−28を含有する事
象を同定した。データを作成し、アラビドプシス属ゲノム内の導入遺伝子挿入物の組み込
みと完全性を実証した。サザンブロットデータは、T−鎖DNAの無傷のコピーの単純な
組み込みを同定するために使用された。詳細なサザンブロット分析は、dgt−28遺伝
子発現カセットに特異的なPCR増幅されたプローブを用いて行われた。特定の制限酵素
で消化されたゲノムDNAとプローブのハイブリダイゼーションは、特定の分子量のゲノ
ムDNA断片を同定した。そのパターンを用いて、次世代への進行のための完全長の単一
挿入物T トランスジェニック事象を同定した。
[0165]
組織試料を2mLのコニカルチューブ(Eppendorf(商標))に回収し、2日
間凍結乾燥した。組織浸軟は、KLECKO(商標)組織粉砕機とタングステンビーズを
用いて実施された。組織浸軟後、CTAB単離手法を用いてゲノムDNAを単離した。Q
iagen(商標)Genomic Tipsキットを用いて、ゲノムDNAをさらに精
製した。ゲノムDNAをQuant−IT(商標)Pico Green DNAアッセ
イキット(Molecular Probes、Invitrogen、Carlsba
d、CA)によって定量した。定量されたゲノムDNAは、一定濃度にするために4μg
に調整された。
[0166]
それぞれの試料について、制限酵素SwaI(New England Biolab
s、Beverley、MA)を用いて、4μgのゲノムDNAを完全に消化し、25℃
で一晩インキュベートし、次に、反応にNsiIを添加し、37℃にて6時間インキュベ
ートした。消化されたDNAは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、Quick
Precipitation Solution(商標)(Edge Biosyst
ems、Gaithersburg、MD)を用いて沈殿させて濃縮された。その後、6
5℃にて1時間、25μLの水にゲノムDNAを再懸濁した。再懸濁した試料は、1×T
AE中で調製された0.8%アガロースゲルに装填され、1×TAE緩衝液中で1.1V
/cmで一晩電気泳動された。連続的に、ゲルは、30分間の変性(0.2MのNaOH
/0.6MのNaCl)、および30分間の中和(0.5MのTris−HCl(pH7
.5)/1.5MのNaCl)に供された。
[0167]
ナイロンメンブレンへのDNA断片の転写は、クロマトグラフィーペーパーの芯や紙タ
オルを使用することによって、処理されたIMMOBILON(商標)NY+転写メンブ
レン(Millipore、Billerica、MA)上にゲルを介して一晩20×S
SC溶液を受動的に吸い上げることによって行われた。転写後、メンブレンは、簡単に、
2×SSCで洗浄し、STRATALINKER(商標)1800(Stratagen
e、LaJolla、CA)を用いて架橋し、80℃にて3時間、真空乾燥させた。
[0168]
モデル400ハイブリダイゼーションインキュベータ(Robbins Scient
ific、Synnyvale、CA)を用いて、ガラスローラーボトル中で1時間65
℃にてプレハイブリダイゼーション溶液(Perfect Hyb plus、Sigm
a、St.Louis、MO)とともにブロットをインキュベートした。プローブは、全
コード配列を含むPCR断片から調製された。PCRアンプリコンは、QIAEX(商標
)IIゲル抽出キットを用いて精製され、Random RT Prime IT(商標
)標識キット(Stratagene、La Jolla、CA)を介して、α 32P−
dCTPで標識された。ブロットは、ブロットあたり約200万カウント/mLまでハイ
ブリダイゼーション緩衝液に直接添加された変性プローブを用いて、一晩65℃にてハイ
ブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、ブロットは、連続して、65℃にて0.
1×SSC/0.1%SDSで40分間洗浄された。最後に、ブロットをストレージリン
光イメージングスクリーンに曝露し、Molecular Dynamics Stor
m 860(商標)イメージングシステムを用いて撮像した。
[0169]
この研究において完成されたサザンブロット分析を用いて、コピー数を決定し、その選
択された事象がアラビドプシス属のゲノム内のdgt−28導入遺伝子を含有しているこ
とを確認した。
[0170]
PCR分析を介したdgt−28遺伝子発現カセットの確認。T の植物事象に含まれ
るdgt−28遺伝子発現カセットの存在は、エンドポイントPCR反応によって検出さ
れた。AtUbi10プロモーターv2とdgt−28遺伝子発現カセットのAtuOR
F23 3’UTR v1領域に特異的なプライマー(表6)を検出のために使用した。
[0171]
[Table 6]


[0172]
PCR反応は、遺伝子発現カセットを増幅するために、標準的な三段階のPCRサイク
リングプロトコールを必要とした。すべてのPCR反応は、以下のPCR条件を使用して
完了された:94℃にて3分間、続いて、94℃にて30秒間、60℃にて30秒間、お
よび72℃にて3分間の35サイクル。製造者の指示に従って、EX−TAQ(商標)P
CRキット(TaKaRa Biotechnology Inc.、Otsu、Shi
ga、Japan)を用いて、反応を完了させた。最終サイクル後、反応を72℃にて1
0分間インキュベートした。TAEアガロースゲル電気泳動を用いて、PCRアンプリコ
ンのサイズを決定した。予想されるサイズのPCRアンプリコンは、全長遺伝子発現カセ
ットの存在がトランスジェニックアラビドプシス属事象のゲノム中に存在することを示し
た。
[0173]
定量的逆転写PCR分析を介したdgt−28相対転写の確認。dgt−28トランス
ジェニック植物の組織試料を96ウェルプレートに回収し、80℃にて凍結した。組織浸
軟は、KLECO(商標)組織粉砕機とタングステンビーズ(Environ Meta
l INC.、Sweet Home、Oregon)を用いて行った。組織浸軟の後、
全RNAは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、カラム上のオプションのDna
seI処置を含めたQiagen(商標)Rneasy 96キット(Qiagen(商
標)、Germantown、MD)を用いたハイスループット形式で単離された。その
後、このステップは、溶出された全RNAの追加のDnaseI(Ambion(商標)
、Austin、TX)処理に続いた。cDNA合成は、製造業者が示唆した手法に従っ
て、オリゴヌクレオチド、TVNを加えて、High Capacity cDNA R
everse Transcription(商標)キット(Applied Bios
ystems、Austin、TX)を用いて、鋳型として全RNAを使用して行われた
。発現の定量は、加水分解プローブアッセイによって完了し、LIGHTCYCLER(
登録商標)480システム(Roche Applied Science、India
napolis、IN)を用いたリアルタイムPCRにより行われた。アッセイは、LI
GHTCYCLER(登録商標)プローブデザインソフトウェア2.0を用いて、dgt
−28および内部参照遺伝子「未知タンパク質」(Genbank受託番号AT4G24
610)について設計された。増幅のために、LIGHTCYCLER(登録商標)48
0プローブマスターミックス(Roche Applied Science、Indi
anapolis、IN)は、0.4μMのそれぞれのプライマー、および0.2μMの
それぞれのプローブを含む10μL体積の一重反応中で1×最終濃度で調製された。表7
[0174]
[Table 7]


[0175]
二段階の増幅反応は、60℃にて40秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべて
の試料は3重にして行い、平均サイクル閾値(Ct)をそれぞれの試料の分析に使用した
。マイナス逆転写反応をそれぞれの試料について行い、gDNA汚染がないことを確認し
た。リアルタイムPCRデータの分析はΔΔCt法に基づいて行った。このアッセイを用
いて、ヘミ接合性およびホモ接合性であることが決定されたトランスジェニックアラビド
プシス属事象におけるdgt−28の相対的発現を決定した。dgt−28 mRNAの
相対的転写レベルは、内部対照より2.5倍から207.5倍高い範囲であった。これら
のデータは、dgt−28トランスジェニック植物が、機能的dgt−28遺伝子発現カ
セットを含有し、植物がdgt−28導入遺伝子を転写することができたことを示してい
る。
[0176]
ウエスタンブロッティング分析。DGT−28は、トランスジェニックシロイヌナズナ
(Arabidopsis thaliana)植物から得られる葉の試料において検出された。dgt−28
トランスジェニック植物由来の植物抽出物とDGT−28タンパク質標準は、DTTを含
有するNUPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液(Invitrogen、Carls
bad、CA)とともに、90℃にて10分間インキュベートされ、アクリルアミドプレ
キャストゲルにおいて電気泳動的に分離された。次に、タンパク質は、製造者のプロトコ
ールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写された。WESTERNB
REEZE(登録商標)ブロッキングミックス(Invitrogen)を用いてブロッ
キング後、DGT−28タンパク質を抗DGT−28抗血清、次にヤギ抗ウサギホスファ
ターゼによって検出した。検出されたタンパク質は、化学発光基質BCIP/NBTウエ
スタン分析試薬(KPL、Gaithersburg、MD)によって可視化された。ウ
エスタンブロットを介した無傷のDGT−28タンパク質の生産は、アッセイされたdg
t−28トランスジェニック植物がDGT−28タンパク質を発現したことを示した。
[0177]
dgt−28導入遺伝子を含むトランスジェニックT アラビドプシス属植物は、異な
る比率のグリホサートで噴霧された。高い比率がこの研究において適用され、抵抗性の相
対的なレベル(105、420、1,680または3,360g ae/ha)を決定し
た。非形質転換アラビドプシス属を制御するグリホサートの通常の1X使用率は、112
0g ae/haである。硫酸アンモニウムが添加されたグリホサート製剤を、187L
/haで較正されたトラック噴霧機を用いてT 植物に適用した。この研究で使用された
アラビドプシス属植物は、様々なコピー数のdgt−28導入遺伝子であった。低コ
ピーのdgt−28 T アラビドプシス属植物を自家受粉し、これを用いてT 植物を
生成させた。表8は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、dgt−1、および野生型対照
を引用したdgt−28トランスジェニック植物の比較を示す。表9は、グリホサート除
草剤抵抗性遺伝子、dgt−1、および野生型対照を引用したdgt−32とdgt−3
3の比較を示す。表10は、新規な微生物EPSPシンターゼ酵素と、クラスIのEPS
Pシンターゼ酵素およびグリホサート比率が1,680g ae/haの対照の比較を示
す。
[0178]
形質転換されたdgt−28アラビドプシス属植物のグリホサート選択の結果。アラビ
ドプシス属T 形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、非形質
転換の種子のバックグラウンドから選択された。3フラットまたは30,000個の種子
は、各T 構築物について分析された。上記で選択されたT 植物は、分子的に特徴付け
られ、その後、様々なコピー数の代表的な植物は、個別のポットに移植され、前述のよう
に様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。これらの植物の応答は、処理から2週
間後(WAT)、視覚的損傷%の観点から提示される。データは表に示され、損傷がほと
んどないもしくは全くない(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)、または重度の
損傷(>40%)を提示する個々の植物を示す。算術平均および標準偏差は、アラビドプ
シス属形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答に
おける範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。
野生型、非形質転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート感受性対
照として用いた。
[0179]
植物応答のレベルは変化した。この差異は、それぞれの植物が独立した形質転換事象を
表すという事実に起因することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は、植
物ごとに変動する。導入遺伝子を含んでいたいくつかの植物はグリホサートに耐性ではな
く;これらの植物が導入遺伝子を発現したかどうかを判断する徹底的な分析が完了しなか
ったことに気付いた。T アラビドプシス属植物内での高いコピー数の導入遺伝子の存在
は、dgt−28導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングをもたら
したかまたはグリホサートに対する感受性をもたらした他のエピジェネティックな効果を
もたらした可能性がある。
[0180]
比率による全体的な集団の損傷平均は、1,680g ae/haでのグリホサートの
比率について表10に示され、dgt−3、dgt−7、dgt−28、dgt−32お
よびdgt−33対dgt−1および野生型対照で形質転換された植物の間に有意な差を
実証する。
[0181]
新規な細菌EPSPシンターゼによって提供される耐性は、特異的酵素に依存して変化
した。DGT−28、DGT−32、およびDGT−33は、予想外にグリホサートに有
意な耐性を示した。dgt遺伝子は、試験したすべての輸送ペプチド全体で個々のT
ラビドプシス属植物に除草剤抵抗性を付与した。このように、追加的な葉緑体輸送ペプチ
ド(すなわち、TraP8−dgt−32またはTraP8−dgt−33)の使用は、
所定の処置内で報告されているのと同様の損傷レベルでグリホサートに対する保護を提供
する。
[0182]
[Table 8-1]


[Table 8-2]


[0183]
[Table 9]


[0184]
[Table 10]


[0185]
選択マーカーとしてのdgt−28。グリホサート選択剤のための選択マーカーとして
のdgt−28の使用は、上記のアラビドプシス属形質転換植物を用いて試験される。約
50個のT 世代アラビドプシス属種子(dgt−28についてホモ接合)は、約5,0
00個の野生型(グリホサートに感受性である)の種子に混ぜられる。種子は発芽され、
苗木はグリホサートの選択用量で噴霧される。グリホサートのいくつかの処理を比較する
:植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム:7DAP(植え付け後の日数)、1
1DAP、または7DAPの後11DAPの1つにおいて、グリホサートの1回または2
回の適用時期のいずれかを受ける。すべての植物はまた、同じ形質転換ベクターにグルホ
シネート抵抗性遺伝子を含んでいるため、グリホサートを用いて選択されたdgt−28
を含む植物は、グルホシネートを用いて選択されたDSM−2またはpatを含む植物と
直接比較することができる。
[0186]
前述のように、グリホサート処置は、DeVilbiss(商標)噴霧チップを用いて
適用される。dgt−28を含有するトランスジェニック植物は、「抵抗性」または「感
受性」17DAPとして同定される。植え付け後(DAP)7日および11日に適用され
た26.25〜1680g ae/haグリホサートの処理は、dgt−28を含むトラ
ンスジェニックアラビドプシス属植物について有効な選択を示す。感受性および抵抗性の
植物をカウントし、グリホサート耐性植物の数は、植え付けられるdgt−28導入遺伝
子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが見出される。これらの結果は
、dgt−28が、形質転換されたアラビドプシス属の集団に対して代替的な選択マーカ
ーとして効果的に使用できることを示す。
[0187]
遺伝可能性。確認されたトランスジェニックT アラビドプシス属事象は、T 種子を
生産するために自家受粉された。これらの種子は、100個の無作為なT 同胞に、グル
ホシネート(200g ae/ha)を含有するIgnite(商標)除草剤を適用する
ことによって後代検定を行われた。それぞれの個々のT 植物は、噴霧適用(187L/
ha適用率でのトラック噴霧器)前に7.5cmの正方形ポットに移植された。T ファ
ミリー(T 植物)は、カイ二乗分析(P>0.05)によって決定したメンデル遺伝を
用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される3抵抗性:1感受性モデルに分離した
。期待されたメンデル遺伝を用いて分離されたT ファミリーの割合は表11に示され、
dgt−28形質はT 世代にメンデル遺伝を介して渡されることを実証する。種子は、
5〜15個のT 個体(T 種子)から回収された。3〜4個の無作為に選択されたT
ファミリーのそれぞれからの25個のT 同胞について前述のように後代検定を行った。
データは分離を示さず、したがって、dgt−28およびdgt−3は、染色体内に安定
に組み込まれ、少なくとも3世代にメンデル様式で遺伝されることを実証した。
[0188]
[Table 11]


[0189]
アラビドプシス属データ。低コピー数のdgt−28導入遺伝子を含んだ選択され
たT アラビドプシス属事象の第2世代植物(T )は、グリホサート耐性についてさら
に特徴付けられた。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から2週
間後(WAT)、視覚的損傷%の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないも
しくは全くない(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)、または重度の損傷(>4
0%)を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラ
ビドプシス属形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の
応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されて
いる。野生型、非形質転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート感
受性対照として用いた。T 世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの
事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホ
サートに含まれた。遺伝子座で同じ2つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、ヘ
ミ接合植物は、遺伝子座で2つの異なる対立遺伝子を含む。グリホサートに対する応答の
変動性は、ホモ接合植物と比較して、ヘミ接合性についての遺伝子量の差の結果として、
世代で期待される。グリホサートへの応答の変動性は、標準偏差と応答の範囲に反映
される。
[0190]
世代において、1コピーとマルチコピーのdgt−28事象の両方はグリホサート
耐性について特徴付けられた。事象内では、1コピーの植物はグリホサートに対して同レ
ベルの耐性を示した。1コピーT 事象について特徴的データを表12に示す。TraP
5 v2と連結されたdgt−28を含む事象は、他のTraP輸送ペプチドを含有した
dgt−28構築物と比較して、グリホサートに対する強固な耐性を提供しなかった。し
かしながら、dgt−28 Trap5構築物は、非形質転換コロンビア対照と比較して
、低レベルのグリホサート耐性を提供した。2以上のコピーのdgt−28を含有するこ
とが示された事象が高比率のグリホサートにより感受性であるという例があった(データ
示さず)。グリホサートに対する感受性のこの増加は、高いコピー数のdgt−28導入
遺伝子も含有したT 植物について先に記載されたデータに類似する。アラビドプシス属
植物内の高いコピー数の導入遺伝子の存在は、dgt−28導入遺伝子の存在にもかかわ
らず、導入遺伝子サイレンシングまたはグリホサートに対する感受性をもたらす他のエピ
ジェネティックな効果をもたらす可能性がある。
[0191]
これらの事象は、TraP5 v2(pDAB105530)、TraP12 v2(
pDAB105533)およびTraP13 v2(pDAB105534)と連結した
dgt−28を含んでいた。
[0192]
dgt−28に加えて、dgt−3で形質転換されたT アラビドプシス属事象を表1
3に示す。表12においてdgt−28事象について記載したように、データ表は、それ
ぞれの構築物についてのグリホサートに対する応答に特徴的である代表的な事象を含む。
dgt−3の特徴付けのために、AtUbi10プロモーターによって駆動されるdgt
−3遺伝子を有する単一PTU(植物形質転換単位)を含む構築物(pDAB10271
6、図29とpDAB102715、図28)は、遺伝子の2PTU(pDAB1027
19、図32;pDAB102718、図33)を含む同遺伝子を有する構築物と比較さ
れた。2PTUを含んだ構築物は、該遺伝子の1コピーを駆動するためにAtUbi10
プロモーターを使用し、他のコピーを駆動するためにCsVMVプロモーターを使用した
。二重PTUの使用は、dgt−3トランスジェニック植物と、2コピーの導入遺伝子を
含有したdgt−28トランスジェニック植物を比較するために組み込まれた。データは
、単一のPTUのみを有する1コピーのT dgt−3事象が、試験された1コピーの
dgt−28事象よりもグリホサートに対して感受性であるが、非形質転換対照より高い
耐性であることを実証した。dgt−3遺伝子の2PTUを含むT ファミリーは、1P
TU構築物と比較して、グリホサートに対して高いレベルの視覚的耐性を提供した。いず
れの場合も、T ファミリーは、dgt−1および野生型対照と比較された。T データ
は、dgt−28が1コピー事象として強固な耐性を提供することを実証している。
[0193]
[Table 12-1]


[Table 12-2]


[0194]
[Table 13]


[0195]
アラビドプシス属データ。低コピー数のdgt−28導入遺伝子を含んだ選択され
たT アラビドプシス属事象の第3世代植物(T )は、グリホサート耐性についてさら
に特徴付けられた。これまでに記載されたように、ラインあたり25個体の植物をグルホ
シネートを用いて選択し、試験されたどの構築物から得られたラインも選択マーカー遺伝
子を分離しなかった。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から2
週間後(WAT)、視覚的損傷%の観点から提示される。データは、損傷がほとんどない
もしくは全くない(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)、または重度の損傷(>
40%)を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、ア
ラビドプシス属形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別
の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示され
ている。野生型、非形質転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート
感受性対照として用いた。
[0196]
[Table 14-1]


[Table 14-2]


[0197]
形質転換植物の選択。新たに回収したT 種子[dgt−31、dgt−32、および
dgt−33 v1遺伝子]を室温にて乾燥させ、試験のためにインディアナポリスに搬
送した。T 種子は、26.5×51cmの発芽トレイ(T.O.Plastics I
nc.、Clearwater、MN)に播種され、それぞれは、予め40mLの0.1
%アガロース溶液に懸濁され、4℃にて2日間保存された、層状にしたT 種子の200
mgアリコート(約10,000個の種子)を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を
確保した。
[0198]
Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture I
nc.、Bellevue、WA)は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグ
ランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ40
mLのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、4〜5日
間、湿度ドーム(KORD(商標)Products、Bramalea、Ontari
o、Canada)で覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧(同時形質転換さ
れたdsm−2遺伝子を選択する)を使用した最初の形質転換体の選択前に植物が発芽し
た時点で外された。
[0199]
植え付け後(DAP)6日とさらに10DAPに、T 植物(それぞれ子葉と2−4−
lf段階)は、適用あたり200g ae/haグルホシネートの有効比率を達成するた
めに、DeVilbiss(商標)圧縮空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ(7
03L/ha)の噴霧体積で、IGNITE(商標)除草剤(280g ai/Lグルホ
シネート、Bayer Crop Sciences、Kansas City、MO)
の0.1%溶液で噴霧された。生存者(活発に成長している植物)は、最終噴霧から4〜
7日後に特定された。生存植物は、ポッティングメディア(Metro Mix 360
(商標))を用いて調製された3インチ(7.62cm)のポットに個別に移植された。
植物は、コピー数分析のための組織サンプリングの少なくとも1日前に温室において生育
された。
[0200]
植物をサンプリングし、dgt−31、dgt−32、およびdgt−33 v1
遺伝子についてのコピー数分析を完了した。次に、コピーの範囲が、それぞれの比率にあ
るように、T 植物を様々な比率のグリホサートに割り当てた。アラビドプシス属につい
て、26.25g ae/haのグリホサートは、感受性の植物と意味のあるレベルの抵
抗性を有する植物を区別するのに有効な用量である。高い比率は、相対的レベルの抵抗性
(105、420、1680、または3360g ae/ha)を決定するために適用さ
れた。表15は、dgt−1を引用した比較を示す。
[0201]
すべてのグリホサート除草剤適用は、187L/haの噴霧体積でトラック噴霧器によ
ってなされた。使用されたグリホサートは、市販のDurangoジメチルアミン塩製剤
(480g ae/L、Dow AgroAciences、LLC)であった。グルホ
シネートまたはグリホサートのいずれかに耐性を示した低コピーのT 植物は、T 世代
においてさらに評価された。
[0202]
最初のアラビドプシス属形質転換は、dgt−31、dgt−32、およびdgt−3
3 v1を用いて行われた。T 形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを
用いて、非形質転換種子のバックグラウンドから選択された。3フラットまたは30,0
00個の種子は、各T 構築物について分析された。形質転換頻度を計算し、T1のdg
t−31、dgt−32、およびdgt−33構築物の結果は表15に列挙する。
[0203]
[Table 15]


[0204]
その後、上記で選択されたT 植物は、個別のポットに移植され、様々な比率の市販の
グリホサートで噴霧された。表16は、アラビドプシス属T 形質転換体にグリホサート
抵抗性を付与するdgt−31、dgt−32およびdgt−33 v1ならびに対照遺
伝子の応答を比較する。応答は、2WATで視覚的損傷%の観点から提示される。データ
は、損傷がほとんどないもしくは全くない(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)
、または重度の損傷(>40%)を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平
均および標準偏差は、それぞれの処理について提示される。個別の応答における範囲もま
た、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質
転換アラビドプシス属(栽培品種コロンビア)は、グリホサート感受性対照として用いた
。輸送ペプチドTraP23を有するDGT−31(v1)遺伝子は、陰性対照と比較し
て、わずかな除草剤耐性を個々のT アラビドプシス属植物に付与したが、遺伝子は輸送
ペプチドTraP8を有する場合には改善された耐性を示した。DGT−32とDGT−
33はともに、TraP8およびそれぞれの様々な葉緑体輸送ペプチド(それぞれTra
P14とTraP24)を用いて試験された比率でグリホサートに対して強固な耐性を実
証した。所与の処理中で、植物応答のレベルは非常に変化した。これは、それぞれの植物
が独立した形質転換事象を表すという事実に帰することができ、したがって、対象とする
遺伝子のコピー数は植物ごとに変動する。重要にも注目すべきことに、試験したそれぞれ
のグリホサート比率で、他よりも耐性である個体があった。比率による全集団の損傷平均
は表16に示され、dgt−31、dgt−32、およびdgt−33 v1対dgt−
1 v1または野生型対照で形質転換された植物間で有意な相違を実証する。
[0205]
[Table 16-1]


[Table 16-2]


[0206]
トウモロコシ形質転換。標準的なクローニング方法は、上述した通りであり、アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を媒介したトウモロコシ
の形質転換において使用するためのバイナリーベクターの構築に用いた。表17は、トウ
モロコシ形質転換のために構築されたベクターを列挙する。以下の遺伝子エレメントはd
gt−28を含んだベクターにおいて使用された;トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン
1プロモーター(ZmUbi1;米国特許第5,510,474号)を用いて、トウモロ
コシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域(ZmLip 3’UTR;米国特許第717
9902号)に並べられたdgt−28コード配列を駆動し、選択マーカーカセットは、
トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域に並べられたaad−1コード配列(
米国特許第7,838,733号)を駆動するために使用されたトウモロコシ(Zea mays
)ユビキチン1プロモーターからなる。aad−1コード配列は、例えば、2,4−ジク
ロロフェノキシ酢酸(2,4−D)およびアリールオキシフェノキシプロピオネート(A
OPP)除草剤などのフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する。
[0207]
dgt−28構築物は、標準的なバイナリーベクターおよびアグロバクテリウムスーパ
ーバイナリーシステムベクター(Japan Tobacco、Tokyo、JP)とし
て構築された。標準的なバイナリーベクターとしては、pDAB107663、pDAB
107664、pDAB107665、およびpDAB107665が挙げられる。アグ
ロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクターには、pDAB108384、pD
AB108385、pDAB108386、およびpDAB108387が含まれる。
[0208]
黄色蛍光タンパク質(yfp;米国特許出願公開第2007/0298412号)レポ
ーター遺伝子を含有しているさらなる構築物を完成した。pDAB109812は、トウ
モロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーターによって駆動され、トウモロコシ(Zea
mays)per5 3’非翻訳領域(Zm per5 3’UTR;米国特許第71799
02号)に並べられたyfpレポーター遺伝子カセットを含み、選択マーカーカセットは
、aad−1発現を駆動するために使用され、トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非
翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター(SCBV;米国特許第5
,994,123号)からなる。pDAB101556は、トウモロコシ(Zea mays)ユ
ビキチン1プロモーターによって駆動され、トウモロコシ(Zea mays)per5 3’非
翻訳領域に並べられたyfpカセットを含み、選択マーカーカセットは、aad−1発現
を駆動するために使用され、トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域に並べら
れたトウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーターからなる。pDAB10769
8は、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーターによって駆動され、トウモロ
コシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域に並べられたdgt−28カセットを含み、y
fpカセットは、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーターによって駆動され
、トウモロコシ(Zea mays)per5 3’非翻訳領域に並べられ、選択マーカーカセッ
トは、aad−1発現を駆動するために使用され、トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3
’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターからなる。これらの構
築物の3つすべてが標準的なバイナリーベクターである。
[0209]
[Table 17]


[0210]
穂の滅菌および胚の単離。トウモロコシ未熟胚を得るために、トウモロコシ(Zea mays
)の同系交配株B104の植物を温室で生育させ、自家受粉または同胞受粉し、穂を生成
した。受粉後の約9〜12日目に穂を回収した。実験日に、穂は、次亜塩素酸ナトリウム
(5%)の20%溶液に浸漬することによって表面を滅菌し、20〜30分間振とうし、
次に、滅菌水で3回濯いだ。滅菌後、未熟接合胚(1.5〜2.4mm)は、それぞれの
穂から無菌的に切除し、液体感染培地(LS基礎培地、4.43g/L;N6ビタミン溶
液[1000×]、1.00mL/L;L−プロリン、700.0mg/L;スクロース
、68.5g/L;D(+)グルコース、36.0g/L;10mg/mlの2,4−D
、150μL/L)を含む微量遠心管に無作為に分配した。所与の実験セットについて、
3つの穂からプールされた胚をそれぞれの形質転換に使用した。
[0211]
アグロバクテリウム培養開始:
上記のバイナリー形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムのグリセロールストック
は、適切な抗生物質を含むAB最小培地プレート上に筋状にし、20℃にて3〜4日間で
増殖させた。単一のコロニーを採取し、同じ抗生物質を含むYEPプレート上に筋状にし
、28℃にて1〜2日間インキュベートした。
[0212]
アグロバクテリウム培養および共培養。アグロバクテリウムコロニーをYEPプレート
から採取し、50mL使い捨てチューブ中の10mL感染培地に懸濁した。細胞密度は、
分光光度計を用いてOD 600nmが0.2〜0.4になるように調整した。アグロバク
テリウム培養物を125rpm、室温にてロータリーシェーカー上に置き、胚切除を行っ
た。サイズが1.5〜2.4mm間の未熟接合胚は、滅菌トウモロコシ穀粒から単離し、
1mLの感染培地に入れ、同じ培地で1回洗浄した。アグロバクテリウム懸濁液(2mL
)をそれぞれのチューブに加え、チューブを10〜15分間振とうプラットフォーム上に
置いた。胚を共培養培地(MS塩、4.33g/L;L−プロリン、700.0mg/L
;ミオ−イノシトール、100.0mg/L;カゼイン酵素加水分解物 100.0mg
/L;30mMジカンバ−KOH、3.3mg/L;スクロース、30.0g/L;Ge
lzan(商標)、3.00g/L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.0
0ml/L;8.5mg/mlのAgNo 、15.0mg/L;DMSO、100μΜ
)に移し、胚盤を上に向けて配向し、50μmole m −2sec −1光強度の24時
間光の下で25℃にて3日間インキュベートした。
[0213]
カルス選択および推定事象の再生。共培養期間後、胚を残りの培地(MS塩、4.33
g/L;L−プロリン、700.0mg/L;1,2,3,5/4,6−ヘキサヒドロキ
シシクロヘキサン、100mg/L;MES[(2−(n−モルホリノ)−エタンスルホ
ン酸)、遊離酸]0.500g/L;カゼイン酵素加水分解物 100.0mg/L;3
0mM ジカンバ−KOH、3.3mg/L;スクロース、30.0g/L;Gelza
n 2.30g/L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.00ml/L;8
.5mg/ml AgNo3、15.0mg/L;カルベニシリン、250.0mg/L
)(選択剤を含まない)に移し、50μmole m −2sec −1光強度の24時間光
の下で25℃にて3日間インキュベートした。
[0214]
増殖阻害用量応答実験により、0.25mM以上のグリホサート濃度が非形質転換B1
04トウモロコシ株において細胞増殖を阻害するのに十分であることが示唆された。胚は
、0.5mMグリホサートを含む選択1培地(MS塩、4.33g/L;L−プロリン、
700.0mg/L;ミオイノシトール、100.0mg/L;MES[(2−(n−モ
ルホリノ)−エタンスルホン酸)、遊離酸]0.500g/L;カゼイン酵素加水分解物
100.0mg/L;30mM ジカンバ−KOH、3.3mg/L;スクロース、3
0.0g/L;Gelzan(商標)2.30g/L;改変されたMS−ビタミン[10
00×]、1.00ml/L;8.5mg/ml AgNo3、15.0mg/L;カル
ベニシリン、250.0mg/L)に移され、暗所および/または50μmole m
sec −1光強度の24時間光の下で28℃にて7〜14日間インキュベートされた。
[0215]
増殖中の胚発生カルスは、1.0mMグリホサートを含有する選択2培地(MS塩、4
.33g/L;1,2,3,5/4,6−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、100mg
/L;L−プロリン、700.0mg/L;MES[(2−(n−モルホリノ)−エタン
スルホン酸)、遊離酸]0.500g/L;カゼイン酵素加水分解物 100.0mg/
L;30mM ジカンバ−KOH、3.3mg/L;スクロース、30.0g/L;Ge
lzan(商標)2.30g/L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.00
ml/L;8.5mg/mL AgNo3、15.0mg/L;カルベニシリン、250
.0mg/L;R−ハロキシホップ酸0.1810mg/L)に移し、暗所および/また
は50μmole m −2sec −1光強度の24時間光の下で28℃にて14日間イン
キュベートされた。この選択工程は、トランスジェニックカルスをさらに増殖および分化
させた。カルス選択期間を3〜4週間継続した。
[0216]
増殖中の胚発生カルスは、0.5mMグリホサート含有PreReg培地(MS塩、4
.33g/L;1,2,3,5/4,6−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、100mg
/L;L−プロリン、350.0mg/L;MES[(2−(n−モルホリノ)−エタン
スルホン酸)、遊離酸]0.250g/L;カゼイン酵素加水分解物 50.0mg/L
;NAA−NaOH 0.500mg/L;ABA−EtOH 2.50mg/L;BA
1.00mg/L;スクロース、45.0g/L;Gelzan(商標)2.50g/
L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.00ml/L;8.5mg/ml
AgNo3、1.00mg/L;カルベニシリン、250.0mg/L)に移し、50μ
mole m −2sec −1光強度の24時間光の下で28℃にて7日間培養された。
[0217]
シュート様芽を有する胚発生カルスは、0.5mMグリホサート含有再生培地(MS塩
、4.33g/L;1,2,3,5/4,6−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、100
.0mg/L;スクロース、60.0g/L;Gellan Gum G434(商標)
3.00g/L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.00ml/L;カルベ
ニシリン、125.0mg/L)に移し、50μmole m −2sec −1光強度の2
4時間光の下で7日間培養された。
[0218]
一次根を有する小さなシュートは、Phytotray中の発根培地(MS塩、4.3
3g/L;改変されたMS−ビタミン[1000×]、1.00ml/L;1,2,3,
5/4,6−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、100mg/L;スクロース、60.0
g/L;Gellan Gum G434(商標)3.00g/L;カルベニシリン、2
50.0mg/L)に移し、140〜190μmole m −2sec −1光強度の16
/8時間の明/暗で27℃にて7日間インキュベートされた。推定されるトランスジェニ
ック苗木は、上述のプロトコールを用いて、導入遺伝子のコピー数について分析され、土
壌に移された。
[0219]
トウモロコシ植物内のdgt−28およびaad−1導入遺伝子の存在の分子確認。d
gt−28およびaad−1のポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセ
イによって確認された。単離されたT トウモロコシ植物は、最初に、aad−1とdg
t−28導入遺伝子の存在を確認するために、TAQMAN(商標)に類似した加水分解
プローブアッセイを介してスクリーニングされた。これらの研究から生じたデータは、導
入遺伝子のコピー数を決定するために使用され、T 世代へ戻し交配および進行のための
トランスジェニックトウモロコシ事象を選択するために使用された。
[0220]
組織試料を96ウェルプレートに回収し、組織浸軟は、Qiagen(商標)RLT緩
衝液中でKLECO(商標)組織粉砕機およびステンレス製ビーズ(Hoover Pr
ecision Products、Cumming、GA)を用いて行った。組織浸軟
後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、ゲノムDNAは、Biosprint
96(商標)Plantキット(Qiagen、Germantown、MD)を用いて
、ハイスループット形式で単離された。ゲノムDNAは、Quant−IT(商標)Pi
co Green DNAアッセイキット(Molecular Probes、Inv
itrogen、Carlsbad、CA)によって定量した。定量されたゲノムDNA
は、BIOROBOT3000(商標)自動化液体ハンドラー(Qiagen、Germ
antown、MD)を用いて、加水分解プローブアッセイのために約2ng/μLに調
整された。TAQMAN(登録商標)アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによ
る導入遺伝子のコピー数の決定は、LIGHTCYCLER(登録商標)480システム
(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を
用いたリアルタイムPCRによって行われた。アッセイは、LIGHTCYCLER(登
録商標)Probe Design Software 2.0を用いて、aad−1、
dgt−28および内部参照遺伝子インベルターゼ(Genbank受託番号:U161
23.1)について設計された。増幅のために、LIGHTCYCLER(登録商標)4
80プローブマスターミックス(Roche Applied Science、Ind
ianapolis、IN)は、aad−1とdgt−28についての0.4μMの各プ
ライマーおよび0.2μMの各プローブを含有する10μL体積の多重反応において1×
最終濃度にて調製された(表18)。
[0221]
二段階の増幅反応は、60℃にて40秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべて
の試料を行い、平均サイクル閾値(Ct)をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタ
イムPCRデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いたLightCycler(
登録商標)ソフトウェアリリース1.5を使用して行われ、ΔΔCt法に基づいている。
対照は、それぞれの実行に含まれた単一コピー較正因子と既知の2つのコピーチェックか
らのゲノムDNAの試料を含んだ。表19は、加水分解プローブアッセイの結果を列挙す
る。
[0222]
[Table 18]


[0223]
[Table 19]


[0224]
dgt−28形質転換されたトウモロコシにおける除草剤耐性。トウモロコシ(Zea ma
ys)dgt−28形質転換事象(T )は、温室で順化させ、植物が、組織培養から温室
生育条件(すなわち、2〜4の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現していた)に移
行するまで成長させた。植物を温室で、27℃にて16時間の光:8時間の暗所の条件で
生育した。次に、植物を2%w/vの硫酸アンモニウムの添加とともに、DURANGO
DMA(商標)(除草剤グリホサートを含む)の市販製剤で処理した。除草剤適用は、
187L/haの噴霧量、50cmの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。T
物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる280〜4480g
ae/haのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系B1
04に対して>95%損傷を引き起こす比率として定義される。
[0225]
dgt−28トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大44
80g ae/haまでの比率で達成されたことを実証した。特定の媒体タイプをT
代に使用した。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植
物成長は、TraP5、TraP8、およびTraP23葉緑体輸送ペプチドに連結され
たとき、dgt−28がグリホサートに対する強固な耐性を提供することを実証した。
[0226]
選択されたT 植物は、次世代におけるさらなる特徴付けのために自家受粉され、また
は戻し交配される。T 植物を含む100個の選ばれたdgt−28株は、140〜11
20g ae/haのグルホシネートまたは105〜1680g ae/haのグリホサ
ートで噴霧される。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド
上に構築される。したがって、1つの除草剤耐性遺伝子が除草剤で噴霧することによって
選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。14DATで、抵抗性および感
受性植物は、カイ二乗分析によって決定された単一遺伝子座の優性メンデル形質(3R:
1S)として分離された株の割合を決定するためにカウントされる。これらのデータは、
dgt−28が、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝され
得ることを実証する。グリホサート比率の増加は、dgt−28遺伝子によって提供され
る耐性および保護をさらに特徴付けるために、T またはF 生存者に適用される。
[0227]
dgt−28で形質転換されたT トウモロコシにおける発芽後の除草剤耐性。Tra
P4、TraP5、TraP8およびTraP23と連結されたdgt−28のT 事象
は、アグロバクテリウム形質転換によって生成され、2〜4枚の新しく、通常に見える葉
が渦巻きから出現するまで、制御された成長チャンバー条件下で順化させた。植物は、個
々の識別番号が割り当てられ、dgt−28とaad−1の両方のコピー数分析のために
サンプリングされた。コピー数分析に基づいて、タンパク質発現分析のための植物を選択
した。植物を新しい成長培地とともに大きなポットに移植し、温室で27℃にて16時間
の光:8時間暗所の条件で生育した。次に、タンパク質発現のためにサンプリングされな
かった残りの植物を2%w/vの硫酸アンモニウムの添加とともにDURANGO DM
A(商標)(グリホサート)の市販製剤で処理した。植物のそれぞれのグループがコピー
数を変化させるT 事象を含むように処置を分配させた。除草剤適用は、187L/ha
の噴霧量、50cmの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。T 植物は、非形質転
換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる280〜4480g ae/haの
グリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系B104に対して>
95%損傷を引き起こす比率として定義される。B104は、形質転換体の遺伝的バック
グラウンドであった。
[0228]
dgt−28トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大44
80g ae/haまで達成されたことを実証する。表20。非形質転換対照と比較した
、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、TraP5、TraP8、およ
びTraP23に連結されたとき、dgt−28がグリホサートに対する強固な保護を与
えることを実証した。
[0229]
[Table 20]


[0230]
標準的なELISAによるタンパク質発現分析は、試験された構築物全体で12.6〜
22.5ng/cm のDGT−28タンパク質の平均範囲を実証した。
[0231]
温室条件下でのF 世代におけるグリホサート耐性の確認。噴霧されなかった1コピー
のT 植物は、次世代においてさらなる特徴付けのために、非形質転換のバックグラウン
ドB104に戻し交配された。T 世代において、グリホサート耐性は、dgt−28遺
伝子の遺伝を確認するために評価された。T 植物について、除草剤ASSURE II
(商標)(35g ae/haのキザロホップ−メチル)は、AAD−1タンパク質を選
択するためのV1成長段階で適用された。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両
方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、1つの遺伝子が選択される場合、両
方の遺伝子が存在すると考えられる。7DAT後、抵抗性および感受性植物をカウントし
、ヌル植物を集団から除去した。これらのデータは、dgt−28(v1)は、単子葉植
物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝することができることを実証す
る。標準的なELISAおよびRNA転写レベルによるDGT−28タンパク質の特徴付
けのために植物をサンプリングした。抵抗性植物は、前述のように、560〜4480g
ae/haのグリホサートで噴霧された。データは、4480g ae/haのグリホ
サートまで、葉緑体輸送ペプチドTraP4、TraP5、TraP8およびTraP2
3と連結されたdgt−28の強固な耐性を実証する。
[0232]
[Table 21]


[0233]
タンパク質発現データは、T 世代のタンパク質発現を確立する、T 事象および試験
された構築物全体で、42.2〜88.2ng/cm のある範囲の平均DGT−28タ
ンパク質を実証する。
[0234]
野外条件下のdgt−28トウモロコシの特徴付け。1コピーのT 事象は、さらなる
特徴付けのために、ハイブリッドヘミ接合種子と近交系ホモ接合種子の両方を作製するた
めに野外場所に搬送された。ハイブリッド種子は、トウモロコシ形質転換株B104にお
けるT 事象を、事象について1:1(ヘミ接合:ヌル)を分離するハイブリッド集団を
生成する近交株4XP811に交配させることによって作製された。得られた種子は、2
つの別々の場所に搬送された。構築物あたり5つの1コピー事象の合計は、3重の無作為
化された完全ブロック設計のそれぞれの場所で植え付けられた。野外は、V4成長段階で
生じさせるためのグリホサート適用、およびV8成長段階で適用される植物の別のグルー
プについて設計された。4XP811/B104の従来のハイブリッドを陰性対照として
使用した。
[0235]
実験行は、ヌル分離体を排除するために、184g ae/haのASSURE II
(商標)(106g ai/Lのキザロホップ−メチル)で処理された。すべての実験エ
ントリーは、ASSURE II(商標)適用に関して1:1(感受性:抵抗性)(p=
0.05)を分離した。選択された抵抗性植物は、標準的なELISAによってDGT−
28タンパク質の定量化のためにそれぞれの事象からサンプリングされた。
[0236]
キザロホップメチル抵抗性植物は、V4またはV8成長段階のいずれかで2.5%w/
v硫酸アンモニウムの添加とともに、市販の除草剤DURANGO DMA(商標)(4
80g ae/Lのグリホサート)で処理された。除草剤適用は、187L/haの体積
、50cmの噴霧高を送達するように較正されたブーム噴霧器を用いて行われた。植物は
、非形質転換トウモロコシ株に対して重大な損傷を与えることができる1120〜448
0g ae/haのグリホサートのある範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、4
XP811近交系に対して>95%損傷を引き起こす比率として定義される。視覚的損傷
評価は、7、14および21DAT(処置後の日数)での視覚的な白化の割合、壊死の割
合、成長阻害の割合および全視覚的損傷について行われた。評価は、それぞれの株および
陰性対照について、未処理チェックと比較された。
[0237]
すべての評価時期の視覚的損傷データは、場所と適用時期の両方で、最大4480g
ae/haまでのDURANGO DMA(商標)に対する強固な耐性を実証した。V4
適用に関する代表的な事象は1つの場所から示され、他の事象、適用時期および場所と一
致している。表22。TraP23(pDAB107665)と連結されたdgt−28
を含む構築物からの1つの事象は、AAD−1タンパク質についてASSURE II(
商標)選択に対して耐性であったが、適用されたすべての比率のグリホサートに感受性で
あった。
[0238]
[Table 22]


[0239]
追加の評価は、4480g ae/haのグリホサート比率について、再生成長段階中
に行われた。房、受粉時期および穂の膨らみの視覚的評価は、すべての構築物、適用時期
および場所について、それぞれの株の未処理チェックと同様であった。DGT−28タン
パク質の定量結果は、186.4〜303.0ng/cm のある範囲の平均タンパク質
発現を実証した。データは、最大4480g ae/haのグリホサートまで再生成長段
階を通じて、野外条件下でdgt−28形質転換されたトウモロコシの強固な耐性を実証
する。また、データは、噴霧耐性結果に基づいて、DGT−28タンパク質の検出および
機能を実証した。
[0240]
ホモ接合状態におけるdgt−28トウモロコシの遺伝可能性および耐性の確認。T
S2から種子は、前述のように、温室条件下で植え付けられた。野外条件下で特徴付けた
同じ5つの1コピー株は均一な状態で特徴付けた。植物は、V3成長段階まで成長させ、
1120〜4480g ae/haのグリホサート(DURANGO DMA(商標))
の範囲の3つの比率のグリホサートおよび処理あたり4つの複製に分離された。適用は、
前述のようにトラック噴霧器で行われ、2.0%w/vの硫酸アンモニウムにおいて製剤
化された。硫酸アンモニウムの適用は、それぞれの株に対して未処理のチェックとして用
いた。前述のように、視覚的評価は処置から7日後および14日後に行われた。データは
、試験されたすべての事象について、最大4480g ae/haのグリホサートまで強
固な耐性を実証した。表23。
[0241]
[Table 23]


[0242]
野外条件下で耐性でないpDAB107665からの株はグリホサートに対して耐性を
示さず、したがって、野外観察と一致する(データ示さず)。前述の1つの株を除いて、
株からグリホサートで処理したすべての複製物は、グリホサートに対して感受性でなかっ
た。したがって、データは、メンデル様式でdgt−28トウモロコシの均質な集団に対
する遺伝可能性を実証する。標準的なELISAによるDGT−28タンパク質の発現は
、グリホサートに耐性であった1コピー事象全体で27.5〜65.8ng/cm のあ
る範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、機能的タンパク質、および世代全体
でDGT−28タンパク質の安定性を実証する。
[0243]
選択マーカーとしてのグリホサートの発芽後の除草剤耐性使用。前述したように、T
形質転換植物を組織培養から移動させ、温室内で順化させた。試験された事象は、Tra
p5、TraP8、およびTraP23葉緑体輸送ペプチドに連結されたdgt−28を
含有した。これらのT 植物は最大4480g ae/haまでのグリホサートに強固な
耐性を提供し、非形質転換植物は、280g ae/ha程度に低い濃度のグリホサート
で制御されたことが実証された。これらのデータは、dgt−28が、280〜4480
g ae/haの範囲のグリホサートの濃度を用いる選択マーカーとして利用され得るこ
とを実証する。
[0244]
dgt−28導入遺伝子を含むトウモロコシの固定された株からの多数の種子が、多数
の非形質転換トウモロコシ種子に混ぜられた。種子を植え付け、V1〜V3発育段階まで
生育させ、その時点で、苗木は、280〜4480g ae/haの範囲でグリホサート
の選択用量を用いて噴霧される。7〜10日後に、感受性および抵抗性植物をカウントし
、グリホサート耐性植物の量は、植え付けられるdgt−28導入遺伝子を含むトランス
ジェニック種子の元の数と相関する。
[0245]
dgt−28トウモロコシのスタッキング。AAD−1タンパク質は、研究目的のため
にdgt−28形質転換されたトウモロコシにおいて選択マーカーとして使用される。ま
た、aad−1遺伝子は、作物における最大V8適用までに強固な2,4−D耐性を提供
するために、トウモロコシにおける除草剤耐性の形質として利用することができる。構築
物pDAB107663(TraP4::dgt−28)、pDAB107664(Tr
aP8::dgt−28)およびpDAB107666(TraP5::dgt−28)
からの4つの事象は、グリホサートおよび2,4−Dのタンク混合適用の耐性について特
徴付けられた。特徴付け研究は、温室条件下でF 種子を用いて完了された。適用は、前
述されるように、以下の比率:1120〜2240g ae/haのグリホサート(dg
t−28遺伝子について選択的である)、1120〜2240g ae/haの2,4−
D(aad−1遺伝子について選択的である)、または記載される比率での2つの除草剤
のタンク混合物でトラック噴霧器において行われた。植物は7および14DATで等級付
けされた。2240g ae/haの除草剤の適用についての噴霧結果を表24に示す。
[0246]
[Table 24]


[0247]
結果は、dgt−28がaad−1と首尾よく積層できることを確認し、したがって、
対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤(dgt−28およびaad−1につい
てそれぞれグリホサート+フェノキシ酢酸)を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗
性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護
の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、トウモロ
コシおよび他の植物におけるdgt−28遺伝子を用いて積層することができる。
[0248]
ダイズ形質転換。安定に組み込まれたdgt−28導入遺伝子を含むトランスジェニッ
クダイズ(Glycine max)は、アグロバクテリウムを媒介したダイズ子葉節外植片の形質
転換を介して生成された。機能的dgt−28を含有するバイナリーベクターを担持する
安全化されたアグロバクテリウム株は、形質転換を開始するために使用された。
[0249]
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Zengら(Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z
., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482)の修正された半子葉節手
法を用いて行われた。簡単に説明すると、ダイズ種子(品種マーベリック)が基本培地で
発芽され、子葉節が単離され、アグロバクテリウムで感染させた。シュート開始、シュー
ト伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チ
メンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤を介した選択は、非形質転換シュー
トの生育を阻害するために使用された。選択されたシュートは、根の発育のために発根培
地に移され、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移される。
[0250]
選択された苗木の末端の小葉は、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草
剤(葉塗装技術)で局所的に処理された。スクリーニングされた苗木は、温室に移され、
順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認した。これらの推定の形質転換され
たT 植物をサンプリングし、分子分析を用いて、除草剤選択マーカーおよびdgt−2
8導入遺伝子の存在を確認した。T 植物を温室で自家受粉させ、T 種子を作製した。
[0251]
第2のダイズ形質転換法を用いて、追加のトランスジェニックダイズ植物を作製するこ
とができる。機能的dgt−28を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグ
ロバクテリウム株を使用して、形質転換を開始する。
[0252]
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Paz et al.(Paz M., Martinez J., Kalvi
g A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213)の修正された
半種子手法を用いて実施された。簡単に説明すると、成熟ダイズ種子は、塩素ガスで一晩
滅菌され、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換の20時間前に滅菌H Oを吸収
させた。種子は、種子を分離し、種皮を除去するために、へそに沿って長手方向の切り込
みによって半分に切断される。胚軸は切除され、いずれもの軸方向のシュート/芽は子葉
節から除去された。得られた半種子の外植片をアグロバクテリウムで感染させた。シュー
ト開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフ
ォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足された。除草剤選択は、非形質転換
シュートの生育を阻害するために使用された。選択されたシュートは、根の発育のために
発根培地に移され、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移された。
[0253]
推定の形質転換されたT 植物をサンプリングし、分子分析を用いて、選択マーカーお
よびdgt−28導入遺伝子の存在を確認した。いくつかの事象は、導入遺伝子を含むも
のとして同定された。これらのT 植物は、さらなる分析に進められ、温室で自家受粉さ
れ、T 種子を生じさせた。
[0254]
T1世代へのdgt−28の遺伝可能性の確認。T 世代へのDGT−28タンパク質
の遺伝可能性は、2つの方法のうちの1つにおいて評価された。第1の方法は、メトロミ
ックス培地にT 種子を植え付け、第1の三つ葉成長段階で発芽した植物に411g a
e/haのIGNITE(商標)280SLを適用することを含んだ。第2の方法は、ボ
ールベアリングとジェノグラインダーを用いて、全8回の反復について種子を均質化する
ことからなっていた。次に、PATタンパク質を検出するためのELISAストリップ試
験は、選択マーカーがdgt−28と同じプラスミド上にあるため、遺伝可能な事象を検
出するために使用された。単一の植物がグルホシネートに耐性であった場合、またはPA
T ELISAストリップ試験で検出された場合のいずれの方法について、事象は、T
世代への遺伝可能性を実証した。
[0255]
全5つの構築物は、前述のように、遺伝可能性についてスクリーニングされた。プラス
ミドは、TraP4、TraP8およびTraP23と連結されたdgt−28を含んだ
。構築物全体の事象は、T 世代へのPAT::DGT−28タンパク質の遺伝可能性が
68%であることを実証した。
[0256]
dgt−28形質転換T ダイズにおける発芽後の除草剤耐性。前述のスクリーニング
法によって、遺伝可能性であることが決定されたT 事象由来の種子は、温室条件下でメ
トロミックス培地に植え付けられた。第1の三つ葉が完全に展開されるまで植物を生育さ
せ、前述のように、pat遺伝子の選択のために411g ae/haのIGNITE(
商標)280SLで処理した。それぞれの事象由来の抵抗性植物は、固有の識別子が与え
られ、dgt−28遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、
十分な植物が存在する場合に処理あたり全4つの複製物について可能にする、適用された
それぞれの比率のグリホサートに、2つのヘミ接合複製物と2つのホモ接合複製物を割り
当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナタバコと比較された。す
べての植物は、187L/haで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、56
0〜4480g ae/haの範囲のDURANGO(商標)ジメチルアミン塩(DMA
)から噴霧された。すべての適用は、2%w/vの硫酸アンモニウム(AMS)の添加と
ともに水中で製剤化された。植物は、処理の7日および14日後に評価された。植物は、
全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。T
世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
[0257]
[Table 25]


[0258]
世代における高いグリホサート率に対するdgt−28保護。45個の植物の後代
検定は、構築物あたりdgt−28の2〜5個のT 株に対して行われた。ホモ接合体株
は、前の世代に完成した接合性分析に基づいて選択された。前述のように種子を植え付け
た。次に、植物は、前述のようなpat選択マーカーの選択のために、411g ae/
haのIGNITE 280SLで噴霧された。3DAT後、抵抗性および感受性植物を
カウントした。
[0259]
dgt−28と連結されたTraP4を含む構築物(pDAB107543およびpD
AB107548)について、試験された12個の株のうち9個は分離せず、それによっ
て、T 世代において均一な株を確認した。dgt−28と連結されたTraP8を含む
株(pDAB107545)は、4つの株のうち2つは分離がないことを実証し、ダイズ
におけるdgt−28の少なくとも2つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。組織試
料は、抵抗性植物から採取され、DGT−28タンパク質は、標準的なELISA法によ
って定量された。データは、試験された非分離のT 株について、32.8〜107.5
ng/cm のある範囲の平均DGT−28タンパク質を実証した。構築物pDAB10
7553(TraP23::dgt−28)由来の株は、グルホシネートで以前に選択さ
れなかった。グリホサートの用量反応は、均質性と高い比率のグリホサートに対する耐性
を試験するために利用された。構築物pDAB107553由来の株からの複製物は、5
60〜4480g ae/haのグリホサートの範囲の比率に耐性であり、したがって、
少なくとも2つの世代で均質な集団であり、遺伝可能性であることが確認された。
[0260]
560〜4480g ae/haのグリホサートの範囲のDURANGO DMAの比
率は、前述のように2〜3個の三つ葉のダイズに適用された。14DATの視覚的損傷デ
ータは、T 世代において実証された耐性結果を確認した。
[0261]
[Table 26]


[0262]
dgt−28を用いたイネの形質転換。安定に組み込まれたdgt−28導入遺伝子を
含むトランスジェニックイネ(コメ(Oryza sativa))は、滅菌したイネ種子のアグロバ
クテリウムを媒介した形質転換を介して生成される。機能的dgt−28を含むバイナリ
ーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株は、形質転換を開始するために
使用される。
[0263]
培養培地は、1MのKOHでpH5.8に調整され、2.5g/lのPhytagel
(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)で固化される。胚発生カルス
は、30mlの半固形培地を含む100×20mmのペトリ皿中で培養される。イネ苗木
は、MAGENTAボックス中の50mlの培地上で生育される。細胞懸濁液は、35m
Lの液体培地を含む125mlのコニカルフラスコ中で維持され、125rpmで回転さ
せる。胚発生培養の誘導および維持は、25〜26℃にて暗所で発生させ、植物再生およ
び全植物体培養は、16時間の光周期(Zhangら、1996)を用いて照明の部屋で
発生させる。
[0264]
胚発生カルスの誘導および維持は、前述されるような改変されたNB基礎培地(Liら
、1993)上で行われ、ここで、培地は、500mg/Lのグルタミンを含むように適
合される。懸濁培養物は、マルトースの代わりに30g/Lのスクロースを含む、SZ液
体培地(Zhangら、1998)中で開始され、維持される。浸透培地(NBO)は、
それぞれ0.256Mのマンニトールとソルビトールの添加を伴うNB培地からなる。除
草剤抵抗性カルスは、3〜4週間、適切な除草剤選択剤が補足されたNB培地上で選択さ
れる。プレ再生は、1週間、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、1mg/
lのα−ナフタレン酢酸(NAA)、5mg/lのアブシジン酸(ABA)と選択的除草
剤を含むNB培地からなる培地(PRH50)上で行われる。苗木の再生は、推定上、ト
ランスジェニックシュートが再生されるまで、2,4−D、0.5mg/lのNAAおよ
び選択的除草剤を含有するNB培地を含む再生培地(RNH50)上での培養に続く。シ
ュートは、1%スクロースと選択的除草剤が補足された、半強度のMurashigeお
よびSkoog基本塩とGamborgのB5ビタミンを含む発根培地に移される。
[0265]
コメ(Oryza sativa)L.ジャポニカ品種Taipei309の成熟乾燥種子は、Zh
angら、1996に記載されるように滅菌される。胚発生組織は、暗所においてNB培
地上で滅菌成熟イネ種子を培養することによって誘導される。約1mm径の一次カルスは
、胚盤から取り出され、SZ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用される。次に、
懸濁液は、Zhang、1996に記載されるように維持される。懸濁誘導された胚発生組織は、
先の継代培養から3〜5日後、液体培地から取り出され、NBO浸透培地上に配置され、
ペトリ皿全体において約2.5cmの円を形成し、照射前4時間、培養される。照射の1
6〜20時間後、組織をNBO培地からNBH50選択培地に移し、照射表面が上を向い
ていることを確認し、暗所にて14〜17日間インキュベートされる。次に、新たに形成
されたカルスは、元の照射された外植片から分離され、同じ培地上で、近くに配置される
。さらに8〜12日後、比較的にコンパクトであり、不透明なカルスは、視覚的に識別さ
れ、暗所での7日間、PRH50プレ再生培地に移される。次に、よりコンパクトで不透
明になる成長中のカルスは、16時間の光周期の下で14〜21日間、RNH50再生培
地上で継代培養される。再生中のシュートは、1/2のMSH50培地を含むMAGEN
TAボックスに移される。単一の外植片から再生された複数の植物は、同胞種であると考
えられ、1つの独立した植物株として処理される。植物は、厚く、白い根を生成し、1/
2のMSH50培地上で積極的に成長している場合、dgt−28遺伝子について陽性と
して採点される。苗木がMAGENTAボックスの最上部に達すると、100%湿度で1
週間、6cmポット中の土壌に移され、次に、30℃にて14時間の光周期の成長チャン
バーに移動させ、温室において13cmポットに移植される前に、21℃にて2〜3週間
、暗所に配置される。種子を回収し、4℃で保存する前に1週間、37℃で乾燥させる。
[0266]
dgt−28イネのT 分析。アグロバクテリウム形質転換方法を介して得られた植え
付けられたイネ形質転換体を培地に移植し、温室条件に順化させた。すべての植物は、d
gt−28のPCR検出のためにサンプリングされ、結果は、pDAB110827(T
raP8::dgt−28)について22個のPCR陽性事象と、pDAB110828
(TraP23::dgt−28)について16個のPCR陽性事象の最小を実証する。
PCR陽性事象のdgt−28についてのサザン分析は、両方の構築物について単一(1
〜2コピー)事象を実証した。選択されたT 事象のタンパク質発現は、DGT−28タ
ンパク質の発現が、検出レベル未満から130ng/cm の範囲であることを実証した
。構築物pDAB110828からの選択されたT 事象は、前述されるように2240
g ae/haのDURANGO DMA(商標)で処理され、処置の7および14日後
に評価された。データは、適用されたグリホサートの比率に強固な耐性を実証した。すべ
てのPCR陽性植物は、さらなる特徴付けのためにT 種子を生成させた。
[0267]
イネにおけるdgt−28遺伝可能性。100個の植物後代検定は、葉緑体輸送ペプチ
ドTraP8を含む構築物pDAB110827からのdgt−28の4つのT 株にお
いて行われた。種子は、培地で満たされたポットに植えられた。次に、すべての植物は、
前述されるように、dgt−28遺伝子の選択について、560g ae/haのDUR
ANGO DMA(商標)で噴霧された。7DAT後、抵抗性および感受性の植物をカウ
ントした。それぞれの構築物について試験された4つの株のうちの2つは、カイ二乗分析
によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質(3R:1S)として分
離された。dgt−28は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である
[0268]
dgt−28形質転換されたT イネにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において
使用されるそれぞれの事象からのT 抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、dgt−
28遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全4
つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、2つのヘ
ミ接合複製物と2つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、
野生型のキタアケイネと比較された。すべての植物は、187L/haで設定されたトラ
ック噴霧器で噴霧された。植物は、560〜2240g ae/haの範囲のDURAN
GO DMA(商標)から噴霧された。すべての適用は、2%w/vの硫酸アンモニウム
(AMS)の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の7日および14日後に評
価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割
り当てられた。T 世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いによ
り期待される。
[0269]
噴霧結果は、7DAT(処置後の日数)で、高い比率のグリホサートに対する最小植物
損傷が検出されたことを実証する(データ示さず)。
[0270]
[Table 27]


[0271]
DGT−28のタンパク質検出は、pDAB110827から試験された4つすべての
株からの複製物について評価された。データは、DGT−28平均タンパク質が、ヘ
ミ接合複製物とホモ接合複製物について、それぞれ20〜82ng/cm と21〜20
9ng/cm の範囲であることを実証した。これらの結果は、T 世代に対する安定な
タンパク質発現と、選択のために使用された560g ae/haのグリホサート適用後
の最大2240g ae/haのグリホサートまでのdgt−28イネの耐性を実証した
[0272]
dgt−28を用いたタバコの形質転換。タバコ(cv. Petit Havana)の葉片は、dg
t−28導入遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tume
faciens)を用いて形質転換された。dgt−28導入遺伝子を含むプラスミドを含有す
る単一コロニーは、スペクチノマイシン(50μg/mL)とストレプトマイシン(12
5μg/mL)を含有する4mLのYEP培地に植菌され、190rpmの振とう機上で
一晩28℃にてインキュベートされた。その後、4mLの種子培養物を用いて、125m
Lのバッフルされた三角フラスコ中で同じ培地の25mLの培養物を植菌した。この培養
物は、OD 600が約1.2に達するまで190rpmで振とうしながら28℃にてイン
キュベートされた。次に、10mLのアグロバクテリウム懸濁液は、滅菌した60×20
mmのペトリ(商標)皿に配置された。
[0273]
PhytaTrays(商標)(Sigma、St.Louis、MO)における30
g/Lのスクロースを含むMS培地(Phytotechnology Labs、Sh
awnee Mission、KS)上で無菌で成長させた植物の新鮮なカットされた葉
片(0.5cm )は、アグロバクテリウムの10mLの一晩培養物に数分間浸漬させ、
滅菌ろ紙上にブロット乾燥させ、次に、1mg/Lインドール酢酸および1mg/Lの6
−ベンジルアミノプリンの添加を伴う同じ培地上に配置された。3日後、dgt−28導
入遺伝子を保有するアグロバクテリウムと共培養された葉片は、5mg/LのBasta
(商標)および250mg/Lのセフォタキシムを含む同じ培地に移された。
[0274]
3週間後、個々のT 苗木は、土壌に移植され、温室に移される前にさらに3週間、1
0mg/LのBasta(商標)および250mg/Lのセフォタキシムを含むMS培地
に移された。選択されたT 植物(上述の分子分析プロトコールを用いて同定される)は
、自家受粉され、完全に乾燥したとき、種子をカプセルから回収した。T 実生は、接合
性およびレポーター遺伝子発現(後述)についてスクリーニングされ、dgt−28導入
遺伝子を含む選択された植物を同定した。
[0275]
植物は、根から寒天を洗浄し、13.75cmの正方形ポット中の土壌に移植し、ポッ
トをZiploc(登録商標)バッグ(SC Johonson & Son,In.)
に置き、バッグの底に水道水を入れ、間接光中の30℃の温室に1週間置くことによって
温室に移動された。3〜7日後、バッグを開封した;植物を受精し、植物が温室で順化さ
れるまで開封したバッグで成長させた。その時点でバッグを除去した。植物は、通常の暖
かい温室条件(日中27℃、夜間24℃、日中16時間、最小の自然光+補足光=120
0μΕ/m )下で成長させた。
[0276]
繁殖前に、T 植物をDNA分析のためにサンプリングし、リアルタイムPCRによっ
てインサートdgt−28のコピー数を決定した。新鮮な組織をチューブに入れ、4℃に
て2日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ(Valenit
e)をチューブ中に配置し、試料をKelcoビーズミルを用いた1分間の乾式粉砕に供
した。次に、標準のDNeasy(商標)DNA単離手法を続けた(Qiagen、DN
easy 69019)。抽出したDNAのアリコートをピコグリーン(Molecul
ar Probes P7589)で染色し、既知の標準とともに蛍光光度計(BioT
ek(商標))において読み出し、濃度(ng/μl)を得た。総DNAの全100ng
を鋳型として使用した。PCR反応は、9700Geneamp(商標)サーモサイクラ
ー(Applied Biosystems)において実施され、試料を94℃で3分間
と、94℃で30秒間、64℃にて30秒間および72℃で1分45秒の35サイクル、
ならびに72℃で10分間に供した。PCR産物をEtBrで染色した1%アガロースゲ
ル上の電気泳動によって分析し、サザンブロットによって確認した。
[0277]
異なる葉緑体輸送ペプチド配列を含む3つの構築物(TraP4、TraP8とTra
P23)からのdgt−28遺伝子の1〜3コピーを有する5〜9個のPCR陽性事象を
再生し、温室に移した。
[0278]
すべてのPCR陽性植物は、標準的なELISAによってDGT−28タンパク質の定
量のためにサンプリングされた。DGT−28タンパク質は、すべてのPCR陽性植物に
おいて検出され、タンパク質濃度が増加する傾向は、dgt−28のコピー数の増加とと
もに注目された。
[0279]
タバコにおけるaad−12(v1)遺伝可能性。100個の植物の後代検定は、構築
物あたりdgt−28の5つのT 株について行われた。構築物は、以下の葉緑体輸送ペ
プチド配列:TraP4、TraP8またはTraP23の1つを含んだ。種子は、大部
分、上記で例示されたアラビドプシス属手法のように、層状にし、播種され、植え付けら
れたが、ヌル植物は、植え付け前に初期の選択によって除かれなかったことを除く。次に
、すべての植物は、前述されるように、pat選択マーカーの選択のために、280g
ae/haのIGNITE 280SLで噴霧された。3DAT後、抵抗性および感受性
植物をカウントした。
[0280]
それぞれの構築物について試験された5つの株のうちの4つは、カイ二乗分析によって
決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質(3R:1S)として分離された
。dgt−28は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
[0281]
dgt−28形質転換されたT タバコにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定におい
て使用されるそれぞれの事象からのT 抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、dgt
−28遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全
4つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、2つの
ヘミ接合複製物と2つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は
、野生型のプチハバナ(Petite havana)タバコと比較された。すべての植物は、187
L/haで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、560〜4480g ae
/haの範囲のDURANGO DMA(商標)から噴霧された。すべての適用は、2%
w/vの硫酸アンモニウム(AMS)の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理
の7日および14日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および
壊死に関して損傷評価が割り当てられた。T 世代は分離されているので、いくつかの変
数応答は接合性の違いにより期待される。
[0282]
噴霧結果は、7DAT(処置後の日数)で、高い比率のグリホサートに対する最小植物
損傷が検出されたことを実証する(データ示さず)。14DAT後、視覚的損傷データは
、構築物TraP8とTraP23からの単一コピーの事象と比較して、TraP4を含
む構築物の単一コピー事象を用いて損傷の増加を実証する。表28。
[0283]
[Table 28]


[0284]
これらの結果は、最大4480g ae/haのグリホサートまでのdgt−28の耐
性、ならびにdgt−28遺伝子に連結された葉緑体輸送ペプチド配列によって与えられ
る耐性における相違を実証した。
[0285]
世代における高いグリホサート比率に対するdgt−28保護。25個の植物の後
代検定は、構築物あたりdgt−28の2〜3個のT 株について行われた。ホモ接合体
株は、前の世代において完成された接合性分析に基づいて選択された。前述のように、種
子を層状にし、播種し、および移植した。次に、すべての植物は、前述のように、pat
選択マーカーの選択のために、280g ae/haのIgnite 280SLで噴霧
された。3DAT後、抵抗性と感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について
試験されたすべての株は分離せず、それによって、T 世代において均一な株を確認し、
タバコにおけるdgt−28の少なくとも2つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。
[0286]
420〜3360g ae/haのグリホサートの範囲のDURANGO DMA(商
標)の比率は、前述したように、2〜3枚の葉タバコに適用された。視覚的損傷データ1
4DATは、T1世代において実証された耐性の結果を確認した。TraP4を含む構築
物由来の2コピー株からの葉面結果が単一コピーのTraP8とTraP23株と同様の
耐性を示した(データは示さず)。
[0287]
[Table 29]


[0288]
データは、非形質転換対照と比較して、2つの世代を通じて最大3360g ae/h
aのグリホサートまでdgt−28タバコの強固な耐性を実証する。
[0289]
それぞれの事象から選択された植物は、標準的なDGT−28 ELISAによって、
DGT−28タンパク質の分析のために、グリホサート適用前にサンプリングされた。デ
ータは、72.8〜114.5ng/cm の範囲の構築物全体で単一(1〜2コピー)
株のDGT−28平均タンパク質発現を実証した。データは、形質転換されたタバコのT
世代において、dgt−28がタンパク質を発現していることを実証し、耐性データは
、機能的なDGT−28タンパク質を確認する。
[0290]
タバコ(cv. Petit Havana)中の除草スペクトルを増加させるためのdgt−28のス
タッキング。ホモ接合dgt−28(pDAB107543とpDAB107545)お
よびaad−12 v1(pDAB3278)植物(後者についてPCT/US2006
/042133参照)はともに相互交雑され、F 種子を回収した。それぞれの遺伝子の
2つの相互交雑からのF 種子は層状にされ、それぞれの交雑の処理された6個の代表は
、1120g ae/haのグリホサート(dgt−28遺伝子について選択的である)
、1120g ae/haの2,4−D(aad−12遺伝子について選択的である)、
または記載される比率での2つの除草剤のタンク混合物で処理された。植物は、14DA
Tで等級付けされた。噴霧結果を表30に示す。
[0291]
[Table 30]


[0292]
結果は、dgt−28がaad−12(v1)と首尾よく積層され得ることを確認し、
したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤(dgt−28およびaa
d−12についてそれぞれグリホサート+フェノキシ酢酸)を増やす。防除が難しい広葉
雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象と
する作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性は
また、dgt−28遺伝子を用いて積層することができる。
[0293]
コムギにおけるグリホサートに対する抵抗性。DGT−28をコードするバイナリーベ
クターの製造。DGT−28発現およびPAT選択カセットを含むバイナリーベクターを
設計し、当該技術分野において一般的に知られている技法および技術を用いて組み立てた
。それぞれのDGT−28発現カセットは、プロモーター、トウモロコシ(Zea mays)由
来のユビキチン(Ubi)遺伝子からの5’非翻訳領域とイントロン(Toki et al., Pla
nt Physiology 1992, 100 1503-07)、続く5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸
シンターゼ遺伝子(DGT−28)の合成バージョンの5’端に融合された4つの輸送ペ
プチドのうちの1つ(TraP4、TraP8、TraP23またはTraP5)からな
るコード配列を含み、植物における発現にコドン最適化されている。DGT−28発現カ
セットは、トウモロコシ(Z. mays)由来のリパーゼ遺伝子(Vp1)の転写ターミネー
ターとポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域(UTR)(Paek et al., Mol. Cells
1998 30;8(3) 336-42)を用いて終了させた。PAT選択カセットは、プロモーター、コ
メ(Oryza sativa)由来のアクチン(Act1)遺伝子からの5’非翻訳領域とイントロ
ン(McElroy et al., The Plant Cell 1990 2( 2) 163-171)、続くストレプトマイセス
・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)から単離されたホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子の合成バージョンから構成され、植
物における発現にコドン最適化されている。PAT遺伝子は、ホフィノトリシン、グルホ
シネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与す
るタンパク質をコードする(Wohlleben et al., Gene 1988, 70(1), 25-37)。選択カセ
ットは、転写ターミネーターとカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝
子(Chenault et al., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396)からのポリアデニ
ル化部位を含む3’UTRで終了された。
[0294]
選択カセットは、市販の遺伝子合成販売会社(GeneArt、Life Techn
ologies)によって合成され、およびゲートウェイ対応のバイナリーベクターにク
ローニングされた。DGT−28発現カセットをpDONR221にサブクローニングし
た。得られたエントリークローンは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(
PAT)発現カセットをコードするゲートウェイ対応のバイナリーベクターを用いて、L
RクロナーゼII(Invitrogen、Life Technologies)反応
に使用された。すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、New En
gland BioLabs(NEB;Ipswish、MA)とPromega(Pr
omega Corporation、WI)から得られた制限エンドヌクレアーゼを用
いて、精製されたDNAの制限消化によってスクリーニングされた。プラスミドDNA調
製物は、供給業者の指示に従って、QIAprep Spin Miniprepキット
(Qiagen、Hilden)またはPure Yield Plasmid Max
iprepシステム(Promega Corporation、WI)を用いて実施さ
れた。選択されたクローンのプラスミドDNAは、ABI Sanger Sequen
cingとBig Dye Terminator v3.1サイクル配列決定プロトコ
ール(Applied Biosystems、Life Technologies)
を用いて配列決定された。配列データを集め、SEQUENCHER(商標)ソフトウェ
ア(Gene Codes Corporation、Ann Arbor、MI)を用
いて分析した。
[0295]
得られた4つのバイナリー発現クローン:pDAS000122(TraP4−DGT
28)、pDAS000123(TraP8−DGT28)、pDAS000124(T
raP23−DGT28)およびpDAS000125(TraP5−DGT28)はそ
れぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株EH
A105に形質転換された。
[0296]
dgt−28発現構築物を用いたトランスジェニックコムギ事象の生成。4つのDGT
−28発現構築物のうちの1つを発現するトランスジェニックコムギ植物は、Wuら、Tran
sgenic Research 2008、17:425-436に類似したプロトコールに従って、ドナーコムギ株B
obwhite MPB26RHを使用して、アグロバクテリウムを媒介した形質転換に
よって生成された。推定されるT0トランスジェニック事象は、ホスフィノトリシン(P
PT)耐性について選択され、表現型はPAT選択マーカーによって付与され、土壌に移
された。T0植物を温室の閉じ込められた条件下で成長させ、T1種子を作製した。全体
として、約45個の独立したT0事象が、それぞれのDGT−28発現構築物について生
成された。
[0297]
コムギdgt−28コムギ事象におけるグリホサート抵抗性。T 事象を温室で順
化させ、2〜4枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで成長させた(すな
わち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行された)。植物は、成熟するまで温室で
12時間の補足照明下で、25℃にて成長させた。グリホサート耐性とTaqman分析
の初期スクリーニングは、前述したように、同じ条件下で成長させたT 植物について完
了された。データは、さらに特徴付けられる遺伝可能なT 事象の決定を可能にした。6
つの低コピー(1〜2コピー)と2つのマルチコピーT 事象は、温室条件下で植え替え
られ、3葉期まで成長させた。T 植物は、非形質転換のコムギ株に重大な損傷を与える
ことができる420〜3360g ae/haの範囲のグリホサートの市販製剤(Dur
ango DMA(商標))で噴霧された。2%w/vの硫酸アンモニウムの添加は適用
に含まれた。致死量は、Bob White MPB26RH非形質転換対照に対して>
75%損傷を引き起こす比率として定義される。除草剤を適用した。
[0298]
この実施例では、グリホサート適用は、T 世代におけるdgt−28遺伝子の分離を
決定すること、ならびにグリホサートの増加レベルに対する耐性を実証することについて
利用された。植物の応答は、処理から21日後(DAT)の視覚的損傷の規模に関して提
示される。データは、25%未満の視覚損傷(4)、25%〜50%の視覚損傷(3)、
50%〜75%の視覚損傷(2)、および75%を超える損傷(1)を提示する個体のヒ
ストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、コムギ形質転換のために使用さ
れる各構築物について提示されている。個別の応答におけるスコア範囲もまた、それぞれ
の比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非形質転換コムギ(栽培
品種Bob White MPB26RH)は、グリホサート感受性対照として用いた。
世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利
用可能であり、したがって、試験されたグリホサートのそれぞれの比率について含まれた
。ヘミ接合植物は、ホモ接合植物としての遺伝子の用量の半分を含み、したがって、グリ
ホサートに対する応答の変動性は、T 世代で予想され得る。
[0299]
のdgt−28コムギ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が、葉緑体輸送ペ
プチドTraP4、TraP5、TraP8およびTraP23を用いて、最大3360
g ae/haの比率で達成されることを実証した。表31。データは、低コピーのT
事象のものであるが、それぞれの構築物について、集団の代表的なものである。
[0300]
[Table 31]


[0301]
21DATで、抵抗性および感受性植物をカウントし、カイ二乗分析によって決定され
るように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質(3R:1S)として分離された株の割合
を決定する。表32。これらのデータは、dgt−28が単子葉植物種において強固なグ
リホサート抵抗性遺伝子として遺伝可能であることを実証する。
[0302]
[Table 32]


Example 4
[0303]
トウモロコシにおける農学的に重要な導入遺伝子を発現させるためのキメラ葉緑体輸送ペ
プチド(TraP)配列
Cry2Aa:
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のCry2Aaタンパ
ク質は、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)(CEW)およびヨーロッパアワノメイ
ガ(Ostrinia nubilalis)(ECB)に対して活性を実証した。cry2Aa遺伝子(配
列番号10)の単一バージョンは、トウモロコシのための偏ったコドンであり、トウモロ
コシにおいて試験された。この実験では、Cry2Aaは、単独で、およびトウモロコシ
におけるTraP8キメラ葉緑体輸送ペプチドと組み合わせて評価され、昆虫耐性活性を
決定し、TraP8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチド配列がトウモロコシにおけるCry
2Aaタンパク質の発現に及ぼす効果を評価した。
[0304]
TraP8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチド配列(配列番号8)を含むpDAB109
807構築物およびGCAコドンリンカーは、cry2Aa遺伝子の上流にクローニング
され、トウモロコシ植物における昆虫耐性試験のために構築物pDAB109807に組
み込まれた(図11)。得られた構築物は2つの植物転写単位(PTU)を含有した。第
1のPTUは、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター(ZmUbi1プロ
モーター;Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin
genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, a
nd promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant
Molecular Biology, 18:675-689)、TraP8−cry2Aa融合遺伝子(TraP8
Cry2Aa)、およびトウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域(ZmLi
p 3’UTR;米国特許第7,179,902号)を含んでいた。制限酵素消化および
配列決定によって、構築物を確認した。第2のPTUは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロ
モーター(SCBVプロモーター;米国特許第6,489,462号)、MSVリーダー
とアルコールデヒドロゲナーゼ1イントロン6を含有するaad−1除草剤耐性遺伝子(
AAD−1;米国特許第7,838,733号、およびMSVリーダー配列;Genba
nk受託番号FJ882146.1、およびアルコールデヒドロゲナーゼイントロン;G
enbank受託番号EF539368.1)、およびトウモロコシ(Zea mays)リパー
ゼ3’非翻訳領域(ZmLip 3’UTR)を含んでいた。cry2Aa遺伝子の上流
に葉緑体輸送ペプチド配列を含まない対照プラスミドであるpDAB107687を構築
し、研究に含めた(図12)。プラスミドは、植物形質転換用のアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入された。
[0305]
トウモロコシ(Zea mays)の栽培品種B104由来の穂を受粉から10〜12日後に回
収した。回収された穂は脱穀され、市販の漂白剤(Ultra Clorox(登録商標
)殺菌漂白剤、6.15%次亜塩素酸)とTween 20の2滴の20%溶液中で20
分間浸漬させることによって表面殺菌し、層流フード内で滅菌した脱イオン水中で3回濯
いた。未熟接合胚(1.8〜2.2mmの長さ)は、それぞれの穂から無菌的に切り出さ
れ、2μlの10%Break−Thru(登録商標)S233界面活性剤を添加した2
.0mlのアグロバクテリウム懸濁液を含む1つまたは複数の微量遠心管に分配された。
[0306]
胚単離活動が完了すると、胚のチューブを閉じ、5分間ロッカープラットフォーム上に
置いた。チューブの内容物は、共培養培地のプレートに注ぎ出し、液体アグロバクテリウ
ム懸濁液は、無菌の使い捨てトランスファーピペットを用いて取り出された。胚を含む共
培養プレートは、30分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に配置させた;その時間後
、胚は、顕微鏡を用いて、胚盤が上を向くように配向させた。次に、胚との共培養プレー
トは、さらに15分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に戻された。その後、プレート
を閉じ、3Mマイクロポアテープで密封し、約60μmolのm−2s−1の光強度で2
4時間/日の光を用いて、25℃にてインキュベーターに置かれた。
[0307]
共培養期間後、胚を休息培地に移した。36個以下の胚をそれぞれのプレートに移した
。プレートを3Mマイクロポアテープでラップし、7〜10日間、約50μmolのm−
2s−1の光強度で24時間/日の光を用いて、27℃にてインキュベートした。次に、
カルス胚を選択I培地に移した。18個以下のカルス胚を選択Iのそれぞれのプレートに
移した。プレートを3Mマイクロポアテープでラップし、7日間、約50μmolのm−
2s−1の光強度で24時間/日の光を用いて、27℃にてインキュベートした。次に、
カルス胚を選択II培地に移した。12個以下のカルス胚を選択IIのそれぞれのプレー
トに移した。プレートを3Mマイクロポアテープでラップし、14日間、約50μmol
のm−2s−1の光強度で24時間/日の光を用いて、27℃にてインキュベートした。
[0308]
この段階で、抵抗性カルスをプレ再生培地に移した。9個以下のカルスをプレ再生のそ
れぞれのプレートに移した。プレートを3Mマイクロポアテープでラップし、7日間、約
50μmolのm−2s−1の光強度で24時間/日の光を用いて、27℃にてインキュ
ベートした。次に、再生中のカルスをPhytatray(商標)中の再生培地に移し、
7〜14日間またはシュートが発生するまで、約150μmolのm−2s−1の光強度
で、1日あたり16時間光/8時間暗所で28℃にてインキュベートした。5個以下のカ
ルスをそれぞれのPhytatray(商標)に置いた。次に、一次根を有する小さなシ
ュートを単離し、シュート/根培地に移した。約6cm以上の高さの根ざした苗木を土壌
に移植し、ハードニングのために成長チャンバーに移動させた。
[0309]
トランスジェニック植物は、全体で固有の識別子が割り当てられ、温室に定期的に移さ
れた。植物は、成長培地(Premier Tech Horticulture、Pr
oMix BX、0581P)で充填された小さなポット(T.O.Plastics、
3.5インチ(8.89cm)SVD、700022C)に、Phytatray(商標
)から移植され、加湿ドームで覆われ、植物を順化させた。植物は、V3〜V4段階に達
するまで、Conviron(商標)成長チャンバー(28℃/24℃、16時間の光周
期、50〜70%RH、200μmolの光強度)内に配置された。これは、土壌および
厳しい温度に植物を順化させることに役立った。次に、植物を温室(光曝露タイプ:光ま
たは同化;光の上限:1200PAR;16時間の日の長さ;日中27℃/夜間24℃)
に移動させ、小さなポットから5.5インチ(13.97cm)ポットに移植した。大き
なポットに移植してから約1〜2週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングし
た。事象あたり1つの植物をバイオアッセイした。
[0310]
選択事象は、遺伝子のコピー数に基づく次世代への進行、ウエスタンブロットによるタ
ンパク質検出、およびバイオアッセイ昆虫に対する活性について同定された。スペクチノ
マイシン抵抗性遺伝子を含む事象が注目されたが、必ずしも進行から省略されなかった。
進行のために選択された事象は、5ガロン(19L)のポットに移植された。観察は、い
ずれかの異常な表現型を追跡するために定期的に行われた。浮遊花粉による交雑汚染を防
止するために、シュート袋を毛(silk)の出現前にシュート上に置いた。覆いの前に
毛を生成しているいずれものシュートを注目し、シュートを除去した。次に、第2のシュ
ートを覆い、受粉のために使用した。異常シュートを生成した植物またはシュートが全く
ない植物をデータベースに記録した。受粉の前日に毛を刈り込み、花粉を受け入れるよう
に均一なブラシを与え、植物を自家受粉させた。
[0311]
選択のための植物は、播種の7日後に噴霧された。それらは、フラットあたり15
ポットで、Metro 360の鉢植え用土の4インチ(10.16cm)ポットにおい
て成長させた。実生の成長段階は、V1〜V1.5であった。発芽が乏しいまたは非常に
小さな植物(渦巻きがまだ閉じている)を含むポットに印を付け、それらを選択評価に含
めなかった。次に、植物の全フラットは、トラック噴霧器適用用の二次キャリアトレイに
入れられた。トレイは、Mandelトラック噴霧器において一度に2つ配置され、80
02Eフラットファンノズル(Tee Jet)を使用して標的領域に体積187L/h
aを送達するように較正された。35g ae/haのAssure II(キザロホッ
プ)+1%COC(穀物油濃縮物)の溶液は適用のために製剤化された。15ml/噴霧
の体積を用いて、必要とされる総噴霧溶液を算出した。計算;(35g ae/ha)×
(1ha/187L)×(1L/97.7g ae Assure II)=0.192
%溶液または28.74μl/15ml H2O+1%v/v)。次に、適用後、植物を
温室に戻す前に、噴霧室で1時間乾燥させた。大きなポットに移植してから約1〜2週間
後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。事象あたり1つの植物はバイオア
ッセイした。
[0312]
分子解析スクリーニングを通過したT 事象のすべては、Cry2Aaタンパク質発現
レベルについて分析された。TraPを含まないCry2Aaを含む対照構築物であるp
DAB107687からの事象は、TraP8を含むpDAB109807(5.0ng
/cm )からの事象と比較して、Cry2Aaの有意に高い平均発現レベル(15.0
ng/cm )を有していた。pDAB109807事象の発現レベルの低下にもかかわ
らず、これらの事象はなおもCry2Aaタンパク質を発現した。
[0313]
また、T1事象はCry2Aaタンパク質発現レベルについて分析された。TraPを
含まないCry2Aaを含む対照構築物であるpDAB107687からの事象は、Tr
aP8を含むpDAB109807(約20〜40ng/cm )からの事象と比較して
、Cry2Aaの有意に高い平均発現レベル(55および60ng/cm )を有した。
pDAB109807事象の発現レベルの低下にもかかわらず、これらの事象はなおもC
ry2Aaタンパク質を発現した。
[0314]
単一のBt遺伝子を含むトランスジェニック植物は、該トランスジェニック植物からの
葉の上に新生児鱗翅類の幼虫を用いて行われたバイオアッセイにおける殺虫活性について
試験された。アッセイされた鱗翅目種は、ヨーロピアンコーンボーラー、ヨーロッパアワ
ノメイガ(Ostrinia nubilalis)(Hubner)(ECB)、およびトウモロコシイヤ
ーワーム、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)(CEW)であった。
[0315]
32ウェルトレイ(C−D International、Pitman、NJ)は、
2%寒天溶液で部分的に満たされ、寒天を固化させた。約1 in の葉のセクションは
、それぞれの植物から採取され、32ウェルトレイのウェルに単独で入れられた。1枚の
葉片をそれぞれのウェルに入れ、2つの葉片を植物あたりおよび昆虫あたり試験した。昆
虫は、ペイントブラシを用いて大量に群棲させ、それぞれのウェルに10匹の新生児幼虫
を入れた。トレイは、試験中に換気を可能にする有孔粘着性の蓋で密封された。トレイは
、28℃にて、40%RH、16時間光:8時間暗所で3日間置かれた。試験期間後、単
純な損傷割合スコアをそれぞれの葉片について得た。それぞれの試験についての損傷スコ
アを平均し、相関分析を行うために、タンパク質発現解析と一緒に使用した。
[0316]
とT のバイオアッセイの結果は、TraP8キメラ葉緑体輸送ペプチド配列が機
能的であり、pDAB109807事象が試験された昆虫に対して保護を与えたことを示
した。T1事象では、TraPを含まないCry2Aaタンパク質(pDAB10768
7)を発現する植物は、試験されたすべての昆虫種全体でTraP8を有するCry2A
aタンパク質(pDAB109807)を発現する植物と有意に異ならない平均の葉損傷
を有した。TraP(pDAB107687)を有さないCry2Aaタンパク質を発現
する植物が、TraP8(pDAB109807)を有するCry2Aa タンパク質を
発現する植物と比較して、より高いレベルのタンパク質を発現したということを考えると
、これらの結果は驚くべきものであった。
[0317]
VIP3Ab1:
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のVip3Ab1タン
パク質は、アメリカタバコガ(Helicoverpa zea)(CEW)およびツマジロクサヨトウ
(FAW)および抵抗性ツマジロクサヨトウ(rFAW)に対する活性を実証した。vi
p3Ab1 v6(配列番号11)およびvip3Ab1 v7(配列番号12)遺伝子
を発現させ、トウモロコシにおける昆虫耐性について試験した。この実験では、vip3
Ab1 v6とvip3Ab1 v7は、単独で、およびトウモロコシにおけるTraP
8キメラ葉緑体輸送ペプチドと組み合わせて評価され、昆虫耐性活性を決定し、TraP
8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチド配列がトウモロコシにおけるVip3Ab1 v6と
Vip3Ab1 v7タンパク質の発現に及ぼす影響を評価した。
[0318]
Trap8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(配列
番号8)およびGCAコドンリンカーを含むpDAB111481(図13)構築物は、
トウモロコシ植物における昆虫耐性のためにvip3Ab1v6遺伝子の上流にクローニ
ングされ試験された。得られた構築物は2つの植物転写単位(PTU)を含有した。第1
のPTUは、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター(ZmUbi1プロモ
ーター;Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin g
enes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and
promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant M
olecular Biology, 18:675-689)、TraP8−vip3Ab1v6融合遺伝子(Tra
P8−Vip3Ab1v6)、およびトウモロコシ(Zea mays)ペルオキシダーゼ5 3
’非翻訳領域(ZmPer5 3’UTR)を含んでいた。構築物は、制限酵素消化と配
列決定を介して確認された。第2のPTUは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター(
SCBVプロモーター;米国特許第6,489,462号)、MSVリーダーとアルコー
ルデヒドロゲナーゼ1イントロン6を含有するaad−1除草剤耐性遺伝子(AAD−1
;米国特許第7,838,733号、およびMSVリーダー配列;Genbank受託番
号FJ882146.1、およびアルコールデヒドロゲナーゼイントロン;Genban
k受託番号EF539368.1)、およびトウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻
訳領域(ZmLip 3’UTR)を含んでいた。vip3Ab1v6遺伝子の上流に葉
緑体輸送ペプチド配列を含まない対照プラスミドであるpDAB111479を構築し、
研究に含めた(図14)。プラスミドは、植物形質転換用のアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入された。
[0319]
Trap8 v2キメラ葉緑体輸送ペプチド配列(配列番号8)およびGCAコドンリ
ンカーを含むpDAB111338(図15)構築物は、トウモロコシ植物における昆虫
耐性試験のためにvip3Ab1v7遺伝子の上流にクローニングされ、試験された。得
られた構築物は2つの植物転写単位(PTU)を含有した。第1のPTUは、トウモロコ
シ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター(ZmUbi1プロモーター;Christensen, A
., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, therm
al perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity fol
lowing transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:6
75-689)、TraP8−Vip3Ab1v7融合遺伝子(TraP8−vip3Ab1v
7)、およびトウモロコシ(Zea mays)ペルオキシダーゼ5 3’非翻訳領域(ZmPe
r5 3’UTR)で構成された。構築物は、制限酵素消化と配列決定を介して確認され
た。第2のPTUは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター(SCBVプロモーター;
米国特許第6,489,462号)、MSVリーダーとアルコールデヒドロゲナーゼ1イ
ントロン6を含有するaad−1除草剤耐性遺伝子(AAD−1;米国特許第7,838
,733号、およびMSVリーダー配列;Genbank受託番号FJ882146.1
、およびアルコールデヒドロゲナーゼイントロン;Genbank受託番号EF5393
68.1)、およびトウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’非翻訳領域(ZmLip 3
’UTR)で構成された。Vip3Ab1v7遺伝子の上流に葉緑体輸送ペプチド配列を
含まない対照プラスミドであるpDAB112710を構築し、研究に含めた(図16)
。プラスミドは、植物形質転換用のアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacter
ium tumefaciens)にクローニングされた。
[0320]
トウモロコシ形質転換、タンパク質発現および昆虫バイオアッセイは、前述されるプロ
トコールに従って完了し、結果を表33に示す。昆虫バイオアッセイの結果は、TraP
8キメラ葉緑体輸送ペプチド配列が機能的であり、pDAB111338とpDAB11
1481事象が、バイオアッセイにおいて試験された昆虫に対して保護を与えたことを示
した。試験された事象では、TraPを含まないVip3Ab1タンパク質を発現する植
物(pDAB112710およびpDAB111479)は、CEWとFAW昆虫種の両
方について、TraP8を含むVip3Ab1タンパク質を発現する植物(pDAB11
1338およびpDAB111481)と有意に異ならない平均の葉損傷レベルを有した
。結論として、ウエスタンブロットおよびバイオアッセイは、試験された事象のすべてが
Vip3Ab1タンパク質を発現したことを示した。
[0321]
[Table 33]


Example 5
[0322]
キメラ葉緑体輸送ペプチド(TraP)配列の植物体内切断
TraP8とTraP9キメラ葉緑体輸送ペプチドの切断部位は、MALDI分析法お
よびN末端エドマン分解配列決定により決定された。植物材料は、TraP8−dgt1
4、TraP8−dgt28、TraP9−dgt14、およびTraP9−dgt28
融合遺伝子を含むトランスジェニック植物から得られ、葉緑体内の転位中に生じたキメラ
葉緑体輸送ペプチドの切断位置を決定するためにアッセイされた。
[0323]
MALDI結果:
植物試料からの半精製タンパク質をSDS−PAGEにより分離した。YFPの分子量
に相当するサイズのタンパク質バンドをゲルから切り出し、脱染色し、乾燥させた。次に
、乾燥させたタンパク質バンドは、25mM重炭酸アンモニウム中のトリプシン(Pro
mega;Madison、WI)で、一晩、37℃にてゲル内消化された。ペプチドは
、C18 ZipTip(商標)(Millipore、Bedford、MA)によっ
て精製され、50%アセトニトリル/0.1%TFAを用いて溶出された。試料は、マト
リックスα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸と1:1の比率で混合され、混合物は、MA
LDI試料プレートに示され、空気乾燥された。
[0324]
ペプチドのマススペクトルは、Voyager DE−PRO MALDI−TOF質
量分析器(商標)(Applied Biosystems;Framingham、M
A)を用いて生じさせた。外部較正は、Calibration Mixture2(商
標)(Applied Biosystems)を用いることによって行われた。内部較
正は、m/z842.508、1045.564および2211.108でトリプシン自
己分解ピークを用いて行われた。すべてのマススペクトルは陽イオン反射モデルに回収さ
れた。ペプチドのマスフィンガープリント(PMF)分析は、試料が標的タンパク質であ
るかどうかを検証するために、試料のPMFを標的タンパク質の理論上のPMFと照合す
ることによって、Proteometrics LLCからのPAWS(商標)(タンパ
ク質分析ワークシート)フリーウェアを用いて行われた。タンパク質同定は、NCBI
NRタンパク質データベースに対するMASCOT(MatrixScience、Lo
ndon、UK)を用いたデータベース検索によって行われた。
[0325]
エドマン化学分解を介したN末端配列決定:
N末端配列決定は、Applied Biosystems(Foster City
、CA)からのProcise Protein Sequencer(モデル494)
で実施された。タンパク質試料は、最初にSDS−PAGEによって分離され、次にPV
DF膜上でブロットされた。タンパク質バンドを膜から切り出し、Procise Se
quencerに装填した。8サイクルのエドマン化学分解は、N末端で5個のAA残基
を得るために、それぞれの試料について実施された。20個のPTH−アミノ酸の標準混
合物(Applied Biosystems)は、それぞれの試料を用いて行われた。
それぞれのエドマン分解からのアミノ酸残基は、標準に対するC18カラムからのそれら
の保持時間に基づいて決定された。
[0326]
MALDI配列決定の結果は、DGT−28およびDGT14タンパク質が発現し、T
raPキメラ葉緑体輸送ペプチド配列がプロセシングされたことを示した。表34は、N
末端エドマン分解およびMALDI配列決定を用いることによって得られたプロセシング
された配列を列挙する。
[0327]
[Table 34]


Claims

[1]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドの連続するアミノ酸配列を含み、第2の葉緑体輸
送ペプチドの連続するアミノ酸配列をさらに含むペプチドをコードする合成アブラナ属由
来ヌクレオチド配列
を含む、単離された核酸分子。
[2]
合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、対象とするヌクレオ
チド配列をさらに含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[3]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドが、セイヨウアブラナ(Brassica napus)または
ブラシカ・ラパ(Brassica rapa)由来である、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[4]
第2の葉緑体輸送ペプチドが、第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチド以外のアブラナ属
種に由来する、請求項3に記載の単離された核酸分子。
[5]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドが、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸
シンセターゼ遺伝子に由来する、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[6]
第2の葉緑体輸送ペプチドが、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセター
ゼ遺伝子に由来する、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[7]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対し
て少なくとも80%同一である、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[8]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対し
て少なくとも85%同一である、請求項7に記載の単離された核酸分子。
[9]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対し
て少なくとも90%同一である、請求項8に記載の単離された核酸分子。
[10]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対し
て少なくとも95%同一である、請求項9に記載の単離された核酸分子。
[11]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対し
て少なくとも98%同一である、請求項10に記載の単離された核酸分子。
[12]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される、請求項11に記載の単離
された核酸分子。
[13]
対象とするヌクレオチドコード配列が、配列番号1または配列番号2のペプチドをコー
ドしない、請求項1に記載の単離された核酸分子。
[14]
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号5、6、8および9からなる群か
ら選択されるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズ可能である、請求項1に記載の
単離された核酸分子。
[15]
各々、葉緑体輸送ペプチドをコードする、少なくとも1種のさらなるヌクレオチド配列
をさらに含み、さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に
連結している、請求項2に記載の単離された核酸分子。
[16]
少なくとも1種のさらなるヌクレオチド配列が、原核生物、下等光合成真核生物および
緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、請求項15に記載の単離された核酸
分子。
[17]
合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列および対象とするヌクレオチド配列が、1種また
は複数の調節配列に作動可能に連結している、請求項2に記載の単離された核酸分子。
[18]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドおよび合成アブラナ属由来
ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする
、請求項2に記載の単離された核酸分子。
[19]
請求項18に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
[20]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチド含有細胞中
のプラスチドにターゲッティングされる、請求項19に記載のキメラポリペプチド。
[21]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッ
ティングされると除去される葉緑体輸送ペプチドを含む、請求項20に記載のキメラポリ
ペプチド。
[22]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプ
チドである、請求項19に記載のキメラポリペプチド。
[23]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、蛍光ペプチドである、
請求項19に記載のキメラポリペプチド。
[24]
生物学的に活性なペプチドが、酵素である、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
[25]
生物学的に活性なペプチドが、細胞のプラスチドにおいて正常に発現され、ペプチドが
天然に発現される、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
[26]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆
虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光
量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプ
ン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arotenoid)
の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択さ
れるプロセスに関与している、請求項22に記載のキメラポリペプチド。
[27]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナ
ーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロ
ビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定にお
いて有用なマーカーからなる群から選択される、請求項22に記載のキメラポリペプチド
[28]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、請求項26に記載のキメ
ラポリペプチド。
[29]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異AL
S、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPS
PS)、CP4 EPSPS、クラスIII EPSPS、およびクラスIV EPSP
Sからなる群から選択される、請求項24に記載のキメラポリペプチド。
[30]
請求項2に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
[31]
請求項2に記載の核酸分子を含む植物材料。
[32]
植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体から
なる群から選択される、請求項31に記載の植物材料。
[33]
ペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、請求項31に記載の植物材料。
[34]
対象とするヌクレオチド配列が、植物材料の細胞中のプラスチドにターゲッティングさ
れるポリペプチドの一部をコードする、請求項33に記載の植物材料。
[35]
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項31に記載
の植物材料。
[36]
全植物体である、請求項31に記載の植物材料。
[37]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、請求項31に記載の植物材料。
[38]
アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニ
ンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エ
ンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナ
タネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ
、トマト、スイカ、トウモロコシ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ
、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から
選択される植物に由来する、請求項31に記載の植物材料。
[39]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
請求項2に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
[40]
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および
全植物体からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
[41]
植物材料が、全植物体ではない、請求項39に記載の方法。
[42]
請求項39に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
[43]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、請求項42に記載のトランスジェ
ニック植物材料。
[44]
請求項42に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植
物。
[45]
請求項42に記載の植物材料から製造されたトランスジェニック植物商品生産物。
[46]
対象とするヌクレオチド配列が、生物学的に活性なペプチドをコードする、請求項42
に記載のトランスジェニック植物材料。
[47]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆
虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、植物の勢い、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性
、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子の色
、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arot
enoid)の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群か
ら選択されるプロセスに関与している、請求項46に記載のトランスジェニック植物材料
[48]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナ
ーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロ
ビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定にお
いて有用なマーカーからなる群から選択される、請求項46に記載のトランスジェニック
植物材料。
[49]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、請求項47に記載のトラ
ンスジェニック植物材料。
[50]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異AL
S、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPS
PS)、CP4 EPSPSおよびクラスIII EPSPSからなる群から選択される
、請求項46に記載のトランスジェニック植物材料。
[51]
同種の野生型植物材料と比較した場合に、増大した除草剤抵抗性または除草剤耐性を示
す、請求項49に記載のトランスジェニック植物材料。
[52]
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのアブラナ属由来の手段を含む単離
された核酸分子。
[53]
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのアブラナ属由来の手段に作動可能
に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項52に記載の単離され
た核酸分子。
[54]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチド
をコードする、請求項53に記載の単離された核酸分子。
[55]
請求項54に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
[56]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドを含有する
細胞中のプラスチドにターゲッティングされる、請求項55に記載のキメラポリペプチド
[57]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッ
ティングされると除去される葉緑体輸送ペプチドを含む、請求項56に記載のキメラポリ
ペプチド。
[58]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプ
チドである、請求項55に記載のキメラポリペプチド。
[59]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆
虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光
量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプ
ン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arotenoid)
の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択さ
れるプロセスに関与している、請求項58に記載のポリペプチド。
[60]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナ
ーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロ
ビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定にお
いて有用なマーカーからなる群から選択される、請求項58に記載のポリペプチド。
[61]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異AL
S、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPS
PS)、CP4 EPSPSおよびクラスIII EPSPSからなる群から選択される
、請求項58に記載のポリペプチド。
[62]
請求項53に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
[63]
請求項53に記載の核酸分子を含む植物材料。
[64]
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項63に記載
の植物材料。
[65]
全植物体である、請求項63に記載の植物材料。
[66]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、請求項63に記載の植物材料。
[67]
アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニ
ンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エ
ンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナ
タネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ
、トマト、スイカ、トウモロコシ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ
、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から
選択される植物に由来する、請求項63に記載の植物材料。
[68]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
請求項53に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
[69]
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および
全植物体からなる群から選択される、請求項68に記載の方法。
[70]
植物材料が、全植物体ではない、請求項68に記載の方法。
[71]
請求項68に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
[72]
請求項68に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植
物。
[73]
トランスジェニック植物材料が、全植物体である、請求項71に記載の植物材料。
[74]
トランスジェニック植物材料が、植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、
請求項71に記載の植物材料。
[75]
請求項71に記載のトランスジェニック植物材料から製造されたトランスジェニック植
物商品生産物。
[76]
対象とするヌクレオチド配列が、生物学的に活性なペプチドをコードする、請求項71
に記載のトランスジェニック植物材料。

Drawings

[ Fig. 1]

[ Fig. 2]

[ Fig. 3]

[ Fig. 4]

[ Fig. 5]

[ Fig. 6]

[ Fig. 7]

[ Fig. 8]

[ Fig. 9]

[ Fig. 10]

[ Fig. 11]

[ Fig. 12]

[ Fig. 13]

[ Fig. 14]

[ Fig. 15]

[ Fig. 16]

[ Fig. 17]

[ Fig. 18]

[ Fig. 19]

[ Fig. 20]

[ Fig. 21]

[ Fig. 22]

[ Fig. 23]

[ Fig. 24]

[ Fig. 25]

[ Fig. 26]

[ Fig. 27]

[ Fig. 28]

[ Fig. 29]

[ Fig. 30]

[ Fig. 31]

[ Fig. 32]

[ Fig. 33]

[ Fig. 34]

[ Fig. 35]

[ Fig. 36]

[ Fig. 37]

[ Fig. 38]

[ Fig. 39]

[ Fig. 40]

[ Fig. 41]

[ Fig. 42]

[ Fig. 43]

[ Fig. 44]

配列表

20191004A16333全文3

Claims

[1]
単離された核酸分子であって、
プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドによって特徴付けられ、前記ポリヌクレオチドが、
配列番号3または配列番号4と少なくとも90%同一である葉緑体輸送ペプチド(CTP)と、
対象とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、キメラタンパク質をコードし
前記ポリヌクレオチドが前記CTPおよび3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPSPS)をコードする、単離された核酸分子。
[2]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと少なくとも90%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[3]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと少なくとも90%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[4]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと少なくとも95%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[5]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと少なくとも95%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[6]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[7]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[8]
前記CTPが、配列番号3または配列番号4と少なくとも95%同一である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。
[9]
前記CTPが、配列番号3または配列番号4と同一である、請求項8に記載の核酸分子。
[10]
前記プロモーターが植物細胞において機能的である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸分子。
[11]
前記分子が植物発現ベクターまたは植物形質転換ベクターである、請求項10に記載の核酸分子。
[12]
請求項10に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物材料であって、
前記植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物および植物の一部からなる群から選択される、植物材料。
[13]
前記植物材料が、アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される植物に由来する、請求項12に記載のトランスジェニック植物材料。
[14]
前記植物材料がトウモロコシに由来する、請求項12に記載のトランスジェニック植物材料。
[15]
請求項10に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物または種子。
[16]
前記植物または種子が、アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される、請求項15に記載のトランスジェニック植物または種子。
[17]
前記植物または種子がトウモロコシである、請求項12に記載のトランスジェニック植物または種子。
[18]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
植物材料を、請求項11に記載の核酸分子を用いて形質転換すること
によって特徴付けられる、方法。
[19]
請求項15〜17のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または種子の、野外に播種する、第2の植物と交雑させる、および/またはトランスジェニック植物を再生するための、使用。
[20]
請求項10に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物商品生産物。
[21]
前記植物または種子が植物である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または種子。
[22]
トランスジェニック植物の後代を製造する方法であって、請求項21に記載の第1のトランスジェニック植物を第2の植物と交雑することによって特徴付けられる方法。

A1633003273
[0327]
[Table 34]



本発明は、以下の態様を含む。
[1]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドの連続するアミノ酸配列を含み、第2の葉緑体輸送ペプチドの連続するアミノ酸配列をさらに含むペプチドをコードする合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
[2]
合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、[1]に記載の単離された核酸分子。
[3]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドが、セイヨウアブラナ(Brassica napus)またはブラシカ・ラパ(Brassica rapa)由来である、[1]に記載の単離された核酸分子。
[4]
第2の葉緑体輸送ペプチドが、第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチド以外のアブラナ属種に由来する、[3]に記載の単離された核酸分子。
[5]
第1のアブラナ属葉緑体輸送ペプチドが、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ遺伝子に由来する、[1]に記載の単離された核酸分子。
[6]
第2の葉緑体輸送ペプチドが、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ遺伝子に由来する、[1]に記載の単離された核酸分子。
[7]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対して少なくとも80%同一である、[1]に記載の単離された核酸分子。
[8]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対して少なくとも85%同一である、[7]に記載の単離された核酸分子。
[9]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対して少なくとも90%同一である、[8]に記載の単離された核酸分子。
[10]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対して少なくとも95%同一である、[9]に記載の単離された核酸分子。
[11]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される葉緑体輸送ペプチドに対して少なくとも98%同一である、[10]に記載の単離された核酸分子。
[12]
ペプチドが、配列番号3および4からなる群から選択される、[11]に記載の単離された核酸分子。
[13]
対象とするヌクレオチドコード配列が、配列番号1または配列番号2のペプチドをコードしない、[1]に記載の単離された核酸分子。
[14]
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号5、6、8および9からなる群から選択されるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズ可能である、[1]に記載の単離された核酸分子。
[15]
各々、葉緑体輸送ペプチドをコードする、少なくとも1種のさらなるヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、[2]に記載の単離された核酸分子。
[16]
少なくとも1種のさらなるヌクレオチド配列が、原核生物、下等光合成真核生物および緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、[15]に記載の単離された核酸分子。
[17]
合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列および対象とするヌクレオチド配列が、1種または複数の調節配列に作動可能に連結している、[2]に記載の単離された核酸分子。
[18]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドおよび合成アブラナ属由来ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、[2]に記載の単離された核酸分子。
[19]
[18]に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
[20]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチド含有細胞中のプラスチドにターゲッティングされる、[19]に記載のキメラポリペプチド。
[21]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッティングされると除去される葉緑体輸送ペプチドを含む、[20]に記載のキメラポリペプチド。
[22]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプチドである、[19]に記載のキメラポリペプチド。
[23]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、蛍光ペプチドである、[19]に記載のキメラポリペプチド。
[24]
生物学的に活性なペプチドが、酵素である、[22]に記載のキメラポリペプチド。
[25]
生物学的に活性なペプチドが、細胞のプラスチドにおいて正常に発現され、ペプチドが天然に発現される、[22]に記載のキメラポリペプチド。
[26]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arotenoid)の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択されるプロセスに関与している、[22]に記載のキメラポリペプチド。
[27]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定において有用なマーカーからなる群から選択される、[22]に記載のキメラポリペプチド。
[28]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、[26]に記載のキメラポリペプチド。
[29]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異ALS、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPSPS)、CP4 EPSPS、クラスIII EPSPS、およびクラスIV EPSPSからなる群から選択される、[24]に記載のキメラポリペプチド。
[30]
[2]に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
[31]
[2]に記載の核酸分子を含む植物材料。
[32]
植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、[31]に記載の植物材料。
[33]
ペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、[31]に記載の植物材料。
[34]
対象とするヌクレオチド配列が、植物材料の細胞中のプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドの一部をコードする、[33]に記載の植物材料。
[35]
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、[31]に記載の植物材料。
[36]
全植物体である、[31]に記載の植物材料。
[37]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、[31]に記載の植物材料。
[38]
アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、トウモロコシ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される植物に由来する、[31]に記載の植物材料。
[39]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
[2]に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
[40]
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、[39]に記載の方法。
[41]
植物材料が、全植物体ではない、[39]に記載の方法。
[42]
[39]に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
[43]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、[42]に記載のトランスジェニック植物材料。
[44]
[42]に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植物。
[45]
[42]に記載の植物材料から製造されたトランスジェニック植物商品生産物。
[46]
対象とするヌクレオチド配列が、生物学的に活性なペプチドをコードする、[42]に記載のトランスジェニック植物材料。
[47]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、植物の勢い、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子の色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arotenoid)の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択されるプロセスに関与している、[46]に記載のトランスジェニック植物材料。
[48]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定において有用なマーカーからなる群から選択される、[46]に記載のトランスジェニック植物材料。
[49]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、[47]に記載のトランスジェニック植物材料。
[50]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異ALS、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPSPS)、CP4 EPSPSおよびクラスIII EPSPSからなる群から選択される、[46]に記載のトランスジェニック植物材料。
[51]
同種の野生型植物材料と比較した場合に、増大した除草剤抵抗性または除草剤耐性を示す、[49]に記載のトランスジェニック植物材料。
[52]
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのアブラナ属由来の手段を含む単離された核酸分子。
[53]
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのアブラナ属由来の手段に作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、[52]に記載の単離された核酸分子。
[54]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、[53]に記載の単離された核酸分子。
[55]
[54]に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
[56]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドを含有する細胞中のプラスチドにターゲッティングされる、[55]に記載のキメラポリペプチド。
[57]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッティングされると除去される葉緑体輸送ペプチドを含む、[56]に記載のキメラポリペプチド。
[58]
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプチドである、[55]に記載のキメラポリペプチド。
[59]
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド(arotenoid)の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択されるプロセスに関与している、[58]に記載のポリペプチド。
[60]
生物学的に活性なペプチドが、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、プロビタミンA、ホルモン、Bt毒素タンパク質および対象とする形質を含む植物の同定において有用なマーカーからなる群から選択される、[58]に記載のポリペプチド。
[61]
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、突然変異ALS、ALSの前駆体、3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPSPS)、CP4 EPSPSおよびクラスIII EPSPSからなる群から選択される、[58]に記載のポリペプチド。
[62]
[53]に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
[63]
[53]に記載の核酸分子を含む植物材料。
[64]
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、[63]に記載の植物材料。
[65]
全植物体である、[63]に記載の植物材料。
[66]
植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、[63]に記載の植物材料。
[67]
アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、トウモロコシ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される植物に由来する、[63]に記載の植物材料。
[68]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
[53]に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
[69]
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、[68]に記載の方法。
[70]
植物材料が、全植物体ではない、[68]に記載の方法。
[71]
[68]に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
[72]
[68]に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植物。
[73]
トランスジェニック植物材料が、全植物体である、[71]に記載の植物材料。
[74]
トランスジェニック植物材料が、植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、[71]に記載の植物材料。
[75]
[71]に記載のトランスジェニック植物材料から製造されたトランスジェニック植物商品生産物。
[76]
対象とするヌクレオチド配列が、生物学的に活性なペプチドをコードする、[71]に記載のトランスジェニック植物材料。
20191031A16333全文3

Claims

[1]
単離された核酸分子であって、
プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドによって特徴付けられ、前記ポリヌクレオチドが キメラタンパク質をコードするものでありかつ、
配列番号3または配列番号4と少なくとも90%同一である葉緑体輸送ペプチド(CTP) をコードするヌクレオチド配列と、
対象とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含 み、
前記ポリヌクレオチドが前記CTPおよび3−エノールピルビルシキミ酸−5−リン酸シンセターゼ(EPSPS)を 含むキメラタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
[2]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと少なくとも90%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[3]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと少なくとも90%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[4]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと少なくとも95%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[5]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと少なくとも95%同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[6]
前記EPSPSが、配列番号23によってコードされるEPSPS、配列番号24によってコードされるEPSPS、または配列番号25によってコードされるEPSPSと同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[7]
前記EPSPSが、配列番号16および配列番号17によってコードされるEPSPSと同一である、請求項1に記載の核酸分子。
[8]
前記CTPが、配列番号3または配列番号4と少なくとも95%同一である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。
[9]
前記CTPが、配列番号3または配列番号4と同一である、請求項8に記載の核酸分子。
[10]
前記プロモーターが植物細胞において機能的である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸分子。
[11]
前記分子が植物発現ベクターまたは植物形質転換ベクターである、請求項10に記載の核酸分子。
[12]
請求項10に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物材料であって、
前記植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物および植物の一部からなる群から選択される、植物材料。
[13]
前記植物材料が、アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される植物に由来する、請求項12に記載のトランスジェニック植物材料。
[14]
前記植物材料がトウモロコシに由来する、請求項12に記載のトランスジェニック植物材料。
[15]
請求項10に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物または種子。
[16]
前記植物または種子が、アラビドプシス属、アルファルファ、アブラナ属、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、スイカ、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサからなる群から選択される、請求項15に記載のトランスジェニック植物または種子。
[17]
前記植物または種子がトウモロコシである、請求項 15に記載のトランスジェニック植物または種子。
[18]
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
植物材料を、請求項11に記載の核酸分子を用いて形質転換すること
によって特徴付けられる、方法。
[19]
請求項15〜17のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または種子の、野外に播種する、第2の植物と交雑させる、および/またはトランスジェニック植物を再生するための、使用。
[20]
請求項10に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物商品生産物。
[21]
前記植物または種子が植物である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または種子。
[22]
トランスジェニック植物の後代を製造する方法であって、請求項21に記載の第1のトランスジェニック植物を第2の植物と交雑することによって特徴付けられる方法。