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1. WO2008055969 - NOVEL TRIPHENYLAMINE DERIVATIVES FOR USE AS FLUOROPHORES IN BIOLOGY, IN PARTICULAR FOR TWO-PHOTON MICROSCOPY

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[ FR ]

NOUVEAUX DERIVES DE LA TRIPHENYLAMINE UTILES COMME FLUOROPHORES EN BIOLOGIE, NOTAMMENT POUR LA MICROSCOPIE
BIPHOTONIQUE

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés de la triphénylamine utiles comme fluorophores en biologie, notamment pour la microscopie biphotonique.
Elle se rapporte également à des compositions comprenant ces dérivés, à l'utilisation de ces compositions ainsi que des dérivés eux-mêmes pour le marquage de molécules biologiques (ou "biomolécules") du type acides nucléiques, oligo-nucléotides, protéines, polypeptides, plasmides, etc, en vue de leur observation notamment par microscopie biphotonique, et à des biomolécules marquées par lesdits dérivés.
La présente invention trouve application dans tous les domaines d'utilisation des techniques d'imagerie biologique et médicale comme, par exemple, la recherche fondamentale pour l'étude structurelle ou fonctionnelle des systèmes biologiques, la recherche appliquée à visée clinique ou thérapeutique, ou encore le diagnostic et le dépistage médical.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
La microscopie de fluorescence est un outil couramment utilisé par les biologistes en raison de ce qu'elle permet de détecter, de quantifier et de fournir des images aussi bien des composants naturels des systèmes biologiques que d'éléments étrangers à ces systèmes .
Elle repose sur l'aptitude que présentent certains composés d'émettre un rayonnement spécifique lorsqu'ils sont excités par un rayonnement électromagnétique incident d'une longueur d'onde particulière. Ainsi, l'absorption d'un photon incident par le composé lui permet de passer d'un état non excité à un état excité. Le composé retourne ensuite à l'état non excité soit par désexcitation non radiative, auquel cas il n'y a pas de fluorescence, soit par désexcitation radiative avec émission d'un photon fluorescent qui peut être détecté .
Peu de composés naturellement présents chez les êtres vivants ont des propriétés intrinsèques de fluorescence susceptibles d'être exploitées à des fins analytiques car l'intensité du rayonnement émis est généralement trop faible et la coloration trop peu sélective. C'est la raison pour laquelle les biologistes utilisent des colorants particuliers, dotés de propriétés fluorescentes : les fluorophores ou fluorochromes . On parle alors de fluorescence secondaire .
Certains fluorophores ont la particularité de se fixer spécifiquement sur des biomolécules : ainsi, par exemple, le 4, 6-diaminido-2-phénylindole (ou DAPI), qui fluoresce dans le bleu lorsqu'il est excité par une lumière violette, se fixe spécifiquement sur l'ADN. D'autres fluorophores n'ont pas cette aptitude et nécessitent d'être préalablement greffés sur une molécule spécifique de celle que l'on cherche à détecter. C'est le cas, par exemple, de la rhodamine et de la fluorescéine que l'on peut utiliser soit pour détecter un antigène, auquel cas on les greffe sur un anticorps spécifique de cet antigène, soit comme traceurs de lignage cellulaire, auquel cas on les greffe sur une molécule pourvue d'une bonne stabilité dans les milieux biologiques comme le dextran.
En l'espace de quelques décennies, la microscopie de fluorescence s'est considérablement développée grâce à l'arrivée de nouvelles technologies optiques dont la microscopie confocale à balayage laser et, plus récemment, la microscopie de fluorescence par excitation à deux photons, encore appelée microscopie biphotonique .
Actuellement, la microscopie biphotonique est, de toutes les techniques de microscopie de fluorescence, celle qui se développe le plus dans le domaine de la biologie. Son principe consiste à apporter simultanément deux photons d'énergie identique à un composé pour produire une excitation équivalente à celle qu'aurait entraînée un photon unique de haute énergie. Pour que le procédé soit efficace, il est nécessaire que les photons parviennent au composé dans un intervalle de temps très réduit, d'environ 10~15 secondes, ce qui a été rendu possible par l'utilisation de sources de lumière laser produisant des impulsions ultra-brèves et très intenses.
La microscopie biphotonique présente de nombreux avantages. En effet, les processus de photoblanchiment et de phototoxicité, souvent limitants en microscopie monophotonique, sont ici limités au maximum. De plus, les photons d'excitation, qui sont typiquement situés dans l'infrarouge proche

(750-900 nm) , sont moins énergétiques que les photons employés en microscopie monophotonique. Il en résulte que le rayonnement d'excitation est moins destructeur pour des échantillons biologiques et qu'il pénètre plus profondément dans les tissus jusqu'à 0,5 mm environ.

Enfin, la microscopie biphotonique a une résolution spatiale aussi bonne que celle de la microscopie confocale à balayage laser, c'est-à-dire de l'ordre du micromètre .
Il est à noter que le principe d'une excitation à plusieurs photons ne se limite pas à une excitation biphotonique et que des expériences de microscopie triphotonique ont déjà été réalisées avec succès .
Actuellement, les fluorophores utilisés en microscopie biphotonique sont les mêmes que ceux utilisés en microscopie monophotonique. Or, ces fluorophores ont de médiocres propriétés de fluorescence à deux photons, notamment en termes de section efficace d'absorption, ce qui limite l'étendue des applications de la microscopie biphotonique en biologie.
Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de fluorophores mieux adaptés à la fluorescence biphotonique et, en particulier, à une utilisation de cette technique pour l'observation des systèmes biologiques.

Au cours de ces dernières années, les propriétés d' absorption à deux photons des dérivés de la triphénylamine ont fait l'objet d'un certain nombre de travaux et des résultats notables ont été obtenus en milieux organiques pour des applications concernant le domaine des matériaux et l'optoélectronique.
On peut ainsi citer :
" les travaux de Chung et al. (J. Phys . Chem. B 1999, 103, 10741-10745 [I]) portant sur trois dérivés obtenus en fonctionnalisant respectivement un, deux ou les trois groupes phényles de la triphénylamine par un enchaînement de trois cycles aromatiques dont un cycle oxadiazole, via un groupe vinylique ;
" ceux de Porrès et al. (Organic Letters 2004, 6(1), 47-50 [2]) portant sur une série de dérivés issus de la fonctionnalisation des trois groupes phényles de la triphénylamine par un groupe fortement électro-attracteur, via un groupe acétylénique ;
" ceux de Yang et al. (Organic Letters 2004, 6(9), 1389-1392 [3]) portant sur trois dérivés obtenus en fonctionnalisant les trois groupes phényles de la triphénylamine par un ou plusieurs noyaux aromatiques, via un groupe éthylénique ; et enfin
" ceux de Yan et al. (J. of Molecular Structure 2005, 733, 83-87 [4]) portant sur les propriétés spectrales d'un dérivé obtenu par fonctionnalisation des trois groupes phényles de la triphénylamine par des groupes pyridinyles, via un groupe vinylique.
Toutefois, tous ces dérivés présentent un certain nombre de caractéristiques qui s'opposent à leur utilisation comme marqueurs de systèmes biologiques, en particulier une taille élevée de nature à perturber le comportement des biomolécules, une insolubilité dans l'eau et l'absence de fonctionnalités propres à permettre leur greffage sur des biomolécules pour un usage en fluorescence secondaire.
Les Inventeurs se sont donc fixé pour but de développer des fluorophores qui soient parfaitement adaptés à l'utilisation de la fluorescence biphotonique dans le domaine de la biologie.

EXPOSÉ DE L'INVENTION
Ce but et d'autres sont atteints par la présente invention qui propose, en premier lieu, des composés dérivés de la triphénylamine, utiles comme marqueurs soit en fluorescence directe, soit en fluorescence secondaire et qui répondent à la formule générale (I) ci-après :



dans laquelle :
R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe lieurgroupe lieur, auquel cas :
1) si R4 représente un atome d'hydrogène, alors Ri représente un groupe lieur ou un groupe de formule (II) ci-après :



dans laquelle :
* Qi représente :
- un groupe hétérocyclique de formule :D ci-après :


où R5 représente un groupe hydrocarboné ; l'un quelconque de R6 à Rio représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que les autres de R6 à Rio représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; ou
un groupe hétérocyclique de formule (ii) ou (iii) ci-après :


( i j -i ) où R5 représente un groupe hydrocarboné ;
l'un quelconque de Rn à Ri7 représente une
liaison covalente reliant ledit groupe
hétérocyclique à B, tandis que les autres
de Rn à Ri7 représentent, indépendamment les
uns des autres, un atome d'hydrogène ou un
groupe hydrocarboné, R12, R14 et R16 pouvant
aussi former, respectivement avec Rn et/ou
Ri3, R13 et/ou Ri5, et avec Ri5 et/ou Ri7, un

10 groupe pontant ; ou
un groupe hétérocyclique de formule (iv)
ci-après :



où l'un quelconque de Ris à R25 représente

15 une liaison covalente reliant ledit groupe
hétérocyclique à B, tandis que les autres
de Ris à R25 représentent, indépendamment les
uns des autres, un atome d'hydrogène ou un
groupe hydrocarboné, R19, R21, R23 et R25

20 pouvant aussi former, respectivement avec
Ris et/ou R20, R20 et/ou R22, R22 et/ou R24, et
avec R24 et/ou Ris, un groupe pontant ; ou
un groupe hétérocyclique de formule (v)
ci-après :



où R5 représente un groupe hydrocarboné ; W représente un atome d'oxygène ou de soufre ou un groupe -N(R3i)- où R31 est un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, ou un groupe -C(R3i) (R32)- où R31 et R32 sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné ; R30 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B, tandis que

R26 à R29 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R27 pouvant aussi former avec R26 et/ou R28 un groupe pontant, R28 pouvant lui-même former avec R29 un groupe pontant ;
* a vaut 0 (auquel cas A est absent) ou 1 (auquel cas A est présent) ;
* A et B représentent les groupes ci-après :



dans lesquels R33 à R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné, R33 et R36 pouvant aussi former chacun avec R34 et/ou

R35 un groupe pontant ;
lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R2 représente également un groupe de formule (II) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R2 représente un groupe de formule (III) ci-après :



dans laquelle :
* Q2 représente :
- un groupe hétérocyclique répondant à l'une quelconque des formules (i) à (v) ci-avant ; ou
- un groupe hétérocyclique de formule (vi) ci-après :



où R6 à Rio ont la même signification que dans la formule (i) ci-avant ; ou
un groupe hétérocyclique de formule (vii) ou (viii) ci-après :


où Rn à Ri7 ont la même signification que dans les formules (ii) et (iii) ci-avant ;
ou
un groupe hétérocyclique de formule (ix) ci-après :



où W, R26 à R30 ont la même signification que dans la formule (v) ci-avant ;
* a, A et B ont la même signification que précédemment ;
• lorsque Ri représente un groupe lieur, alors R3 représente un groupe de formule (III) ci-avant tandis que, lorsque Ri représente un groupe de formule (II) ci-avant, alors R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (II) ci-avant ; 2) si R4 représente un groupe lieur, alors Ri et R2 représentent un groupe de formule (III) ci-avant tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné ou un groupe de formule (III) ci-avant ;
dans laquelle le groupe lieur est un groupe fonctionnel apte à permettre le greffage par réaction chimique du composé sur une biomolécule, ou un groupe hydrocarboné comprenant un tel groupe fonctionnel, et dans laquelle chacun des groupes hydrocarbonés sus-mentionnés peut être substitué par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, et comprendre un ou plusieurs hétéroatomes .
L'invention a aussi pour objet les isomères de ces composés ainsi que les sels d'addition de ces composés et de leurs isomères.
L'expression "l'un quelconque de Re à R1O représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" utilisée ci-avant signifie que le groupe hétérocyclique en question est relié directement à B par une liaison covalente impliquant l'un quelconque des atomes de carbone du cycle qui le constitue .
De manière similaire, les expressions "1 'un quelconque de R11 à R17 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" et "1 'un quelconque de R1S à R25 représente une liaison covalente reliant ledit groupe hétérocyclique à B" utilisées ci-avant signifient que les groupes hétérocycliques concernés sont reliés directement à B par une liaison covalente impliquant l'un quelconque des atomes de carbone des cycles qui les constituent.
Conformément à l'invention, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 dans les groupes de formules (II) et (III) ci-avant ainsi que pour R3 peuvent être des groupes saturés, mono- ou polyinsaturés, aliphatiques (c'est-à-dire linéaires ou ramifiés), mono- ou polycycliques .
Comme précédemment mentionné, ces groupes peuvent, d'une part, être substitués par un ou plusieurs substituants, identiques entre eux ou différents les uns des autres, et, d'autre part, comprendre un ou plusieurs hétéroatomes, auquel cas ce ou ces hétéroatomes peuvent aussi bien former pont dans lesdits groupes hydrocarbonés qu'être portés par eux sous la forme de substituants.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "hétéroatome" , tout atome autre que de carbone ou d'hydrogène comme, par exemple, un atome d'oxygène, d'azote, de soufre, d'halogène, de phosphore, de bore ou encore de silicium, les atomes d'oxygène, d'azote, de soufre et d'halogène (fluor, iode, chlore, brome) étant les préférés.
Ainsi, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 et pour R3 peuvent notamment être :
• des groupes alkyle, linéaires ou ramifiés, comme, par exemple, des groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle ou hexyle ;
• des groupes alcényle ou alcynyle, linéaires ou ramifiés, comme, par exemple, des groupes éthényle ou éthynyle, propényle ou propynyle, isopropényle ou isopropynyle, butényle ou butynyle, isobutényle ou isobutynyle, sec-butényle ou sec-butynyle, tert-butényle ou tert-butynyle, pentényle ou pentynyle, isopentényle ou isopentynyle ;
• des groupes cycloalkyle comme, par exemple, des groupes cyclopentyle ou cyclohexyle ;
• des groupes cycloalcényle ou cyclo-alcynyle comme, par exemple, des groupes cyclopentényle ou cyclopentynyle, un groupe cyclohexényle ou cyclo-hexynyle ;
• des groupes aromatiques à un ou plusieurs cycles fusionnés comme, par exemple, des groupes cyclopentadiényle, phényle, naphtyle, pyrényle ou anthracényle ;
• des groupes hétéroaromatiques à un ou plusieurs cycles fusionnés comme, par exemple, des groupes furanyle, pyrrolyle, thiophényle, oxazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, imidazolyle, triazolyle, pyridinyle, pyranyle, quinolinyle, isoquinolinyle, pyrazinyle ou pyrimidinyle ; ou encore
• des groupes dérivés des groupes susmentionnés par une ou plusieurs substitutions, cette ou ces substitutions correspondant, de préférence, à des atomes d'halogène ou à des groupes aliphatiques comprenant au moins un hétéroatome comme, par exemple, un groupe -COOR", -CHO, -OR", -SR", -SCOR", -SO2R", -NR"R"', -CONR"R"', -C(HaI)3, -OC(HaI)3, -C(O)HaI ou -CN dans lesquels R" et R"' représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, tandis que HaI représente un atome d'halogène, de préférence de fluor, de chlore ou de brome.
Pour éviter que les composés ne souffrent d'un encombrement stérique, on préfère que les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 ne comportent pas plus de 10 atomes de carbone

(substituant (s) inclus) et soient, si possible, des groupes en Ci à Ce et, mieux encore, des groupes en Ci à C4, dans le cas de groupes aliphatiques, ou bien des groupes à un seul cycle à 5 ou 6 membres dans le cas de groupes cycliques.
De manière particulièrement préférée, les groupes hydrocarbonés susceptibles d'être utilisés pour R5 à R36 sont des groupes alkyle en Ci à C4, en particulier méthyle ou éthyle.
Conformément à l'invention, les groupes pontants susceptibles d'être formés par :
• R12, R14 et R16, respectivement avec Rn et/ou R13, R13 et/ou Ri5, et avec Ri5 et/ou Ri7, dans les groupes de formules (ii) , (iii) , (vii) et (viii) ;
• Ri9, R2i, R23 et R25 pouvant aussi former, respectivement avec Ris et/ou R20, R20 et/ou R22, R22 et/ou R24, et avec R24 et/ou Ris, dans les groupes de formule (iv) ;
• R27 avec R26 et/ou R28 et par R2s avec R29 dans les groupes de formules (v) et (ix) ; et par
• R33 et R36 avec R34 et/ou R35 dans les groupes A et B ;
sont des groupes divalents formés par l'enchaînement de n atomes choisis parmi les atomes de carbone, d'azote, d'oxygène et/ou de soufre et dans lesquels n est avantageusement choisi de sorte que la formation de ces groupes pontants se traduise par la formation de cycles ou d' hétérocycles à 5 ou 6 membres.
Ainsi :
• les groupes pontants susceptibles d'être formés par Ri3 avec Ri4 dans les groupes de formules (ii) et (vii) , par R12 avec Ri3 et par Ri6 avec Ri7 dans les groupes de formules (iii) et (viii) , par Ri8 avec R25 et par R2i avec R22 dans le groupe de formule (iv) , par R33 et R36 avec R34 et/ou R35 dans les groupes A et B sont, de préférence, des groupes formés par l'enchaînement de 2 ou 3 atomes ; tandis que
* tous les autres groupes pontants susceptibles d'être formés dans les groupes de formules (ii) à (ix) , sont, de préférence, des groupes formés par l'enchaînement de 3 ou 4 atomes.
Par ailleurs, ces groupes pontants sont, de préférence, des groupes insaturés dont les insatu-rations correspondent typiquement à des doubles liaisons. De préférence, ces doubles liaisons forment, entre elles et/ou avec les autres doubles liaisons présentes dans les composés, un système de doubles liaisons conjuguées.
Au surplus, les groupes pontants peuvent être substitués par un ou plusieurs substituants, identiques ou différents, dès lors que l'enchaînement d'atomes qui les forme comprend un ou plusieurs atomes de carbone et/ou d'azote. Ce ou ces substituants correspondent, de préférence, à des atomes d'halogène, à des groupes aliphatiques comprenant au moins un hétéroatome comme, par exemple, des groupes -COOR", -CHO, -OR", -SR", -SCOR", -SO2R", -NR"R"', -CONR"R"', -C(HaI)3, -OC(HaI)3, -C(O)HaI ou -CN dans lesquels R", R"' et HaI ont la même signification que précédemment, ou encore à des groupes neutres comme des groupes alkyle, par exemple méthyle ou éthyle.
Pour une utilisation en fluorescence directe, les composés selon l'invention répondent typiquement à la formule générale (I) dans laquelle R4 représente un atome d'hydrogène, Ri représente un groupe de formule (II) telle que précédemment définie, R2 représente un groupe de formule (II) identique à Ri, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné tel que précédemment défini ou encore un groupe de formule (II) identique à Ri et R2.
De tels composés comportent au moins deux atomes d'azote chargés positivement dont les charges sont contrebalancées par des anions. Ces anions peuvent notamment être des ions halogénures comme I~, Cl", Br", F", des ions nitrates, des ions phosphates comme PO43" ou PF6", des ions carbonates, des ions carboxylates comme CH3COO", des ions sulfites comme SO32" ou HSO3", des ions sulfates comme SO42" ou HSO4", des ions sulfonates comme CF3SO3" ou alkyle-SO3", ou encore des ions BF4".
Pour que ces composés aient une bonne solubilité dans l'eau, le groupe de formule (II) constituant Ri et R2, et éventuellement R3, est, de préférence, un groupe dans lequel a vaut 0, ce qui signifie que A est absent, tandis que R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, avantageusement méthyle ou éthyle.
Bien que, dans ce groupe de formule (II), Qi puisse représenter l'un quelconque des groupes hétérocycliques de formules (i) à (v) ci-avant, on préfère toutefois qu'il représente soit un groupe de formule (i) telle que précédemment définie, soit un groupe de formule (v) telle que précédemment définie.

Des groupes de formule ( I I ) répondant à ces critères sont typiquement :
( a ) des groupes de formule ( I I - l ) ci -après :


)
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6 à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; (b) des groupes de formule (II-2) ci-après :



dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6 à R8, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ;

( c) des groupes de formule ( I I -3 ) ci-après


)
dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R6, R7, R9, R10, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et
(d) des groupes de formule (II-4) ci-après :



dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, tandis que R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
Dans le cadre de leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que les composés de formule générale (I) dans laquelle au moins Ri et R2 représentent un groupe de formule (II-5) ci-après :

dans laquelle R5 représente un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle, et qui correspond à la formule (II-3) ci-avant où R6 = R7 = R9 = Rio = R35 = R36 = H, présentent un ensemble de propriétés rarement réunies par les fluorophores classiquement utilisés en biologie, à savoir :
" une bonne solubilité dans l'eau et, donc, dans les milieux biologiques ;
" une excellente résistance aux effets des irradiations lumineuses (ni photoblanchiment, ni photodégradation) ;
" une fluorescence dans le rouge qui, d'une part, ne risque pas d'interférer avec les signaux émis dans le vert par les composants cellulaires qui fluorescent naturellement et, d'autre part, est moins nocive pour les cellules que des fluorescences dans le bleu et le vert ;
" une grande section efficace d'absorption à deux photons ; et surtout,
" une affinité particulièrement élevée pour l'ADN dans des conditions analogues aux conditions physiologiques, se manifestant par une forte exaltation de leur fluorescence en présence de cette biomolécule et conférant à ces composés un intérêt tout particulier pour le marquage de l'ADN.
Aussi, ces composés sont-ils particulièrement préférés pour une utilisation en fluorescence directe .

II s'agit notamment de ceux dans lesquels Ri et R2 sont tous deux un groupe de formule (II-5) où R5 représente un groupe méthyle, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (II-5) identique à Ri et R2.
A titre d'exemples de tels composés, on peut citer les halogénures et, en particulier, les iodures de bis- [4- (2-N-méthyl-pyridinium-4-yl-vinyl) -phényl] phénylamine et de tris- [4- (2-N-méthylpyridinium-4-yl-vinyl) phényl ] aminé .
Pour une fluorescence secondaire, les composés selon 1 ' invention répondent typiquement à la formule générale (I) dans laquelle :
• soit R4 représente un atome d'hydrogène, auquel cas Ri représente un groupe lieur, R2 représente un groupe de formule (III) telle que précédemment définie et R3 représente un groupe de formule (III) identique à R2 ;
• soit R4 représente un groupe lieur, auquel cas Ri représente un groupe de formule (III) telle que précédemment définie, R2 représente un groupe de formule (III) identique à Ri, tandis que R3 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe hydrocarboné tel que précédemment défini ou encore un groupe de formule (III) identique à Ri et R2.
Les Inventeurs ayant constaté que la nature du groupe lieur n'a pas ou que très peu d'incidence sur les propriétés de fluorescence des composés selon l'invention, le groupe lieur ou le groupe fonctionnel que comporte le groupe lieur lorsque ce dernier est un groupe hydrocarboné peut être choisi parmi de très nombreux groupes fonctionnels, pour autant qu'ils soient capables de réagir chimiquement avec un groupe fonctionnel appartenant à la ou aux biomolécules qu'il entend marquer par ces composés.
Une liste exhaustive des groupes lieurs susceptibles d'être utilisés ne peut donc être donnée, mais un homme du métier saura parfaitement choisir un groupe lieur approprié.
Ainsi, par exemple, il saura que, pour favoriser la solubilité dans l'eau des composés, le groupe lieur devra, de préférence, être un groupe très hydrophile comme un polyalcool, un polyol, un polyéthylène glycol ou une polyamine.
Il saura également que, pour greffer les composés sur un acide nucléique, un groupe lieur de type polyéthylène glycol conviendra particulièrement bien comme décrit par Mac Laughin et al. (J. Org. Chem. 1997 , 62 (3) , 523-529 [5] ) .
De la même manière il saura que l'utilisation d'un polyol comme un saccharide (galactose par exemple), outre d'augmenter la solubilité, minimise aussi l'agrégation en milieu aqueux (Zongren et al., Org. Lett. 2004, 6, 2067-2070 [6]) .
II saura encore que, pour greffer les composés sur une protéine ou un polypeptide et, notamment, sur un anticorps ou un antigène, par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel d'un acide aminé, un groupe lieur constitué par ou comportant un groupe acide carboxylique, un groupe dérivé d'acide carboxylique (par exemple, un halogénure d'acide ou un anhydride d'acide), un ester activé (par exemple, un ester de N-hydroxysuccinimidyle, de pentafluorophényle ou de para-nitrophényle) , un groupe aminé primaire ou encore un groupe partant du type halogénure, tosylate, mésylate, maléimide, etc, pourra être utilisé.
Conformément à l'invention, lorsque R4 représente le groupe lieur, alors celui-ci se trouve, de préférence, en α du groupe Ri.
Par ailleurs, lorsque, dans le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 quand R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri, R2, et éventuellement R3, quand R4 est un groupe espaceur, Q2 est un groupe hétérocyclique répondant à l'une quelconque des formules (i) à (v) , alors les composés comportent au moins deux atomes d'azote chargés positivement dont les charges sont, là également, contrebalancées par des anions tels que ceux précédemment cités.
Le groupe de formule (III) constituant R2 et R3 quand R4 est un atome d'hydrogène, ou Ri, R2, et éventuellement R3, quand R4 est un groupe espaceur, est, de préférence, un groupe dans lequel a vaut 0, tandis que R35 et R36 de B représentent des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en Ci à C4, avantageusement méthyle ou éthyle.
Par ailleurs, dans ce groupe de formule

(III), Q2 représente, de préférence, soit un groupe de formule (vi) telle que précédemment définie, soit un groupe de formule (ix) telle que précédemment définie.

Des groupes de formule (III) répondant à ces critères sont typiquement :
(a) des groupes de formule (III-l) ci-après :



dans laquelle Re à Rg, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ;
(b) des groupes de formule (III-2) ci-après :



dans laquelle Re à Rs Rio , R35 et R36 repré sentent , indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ;
(c) des groupes de formule (III-3) ci-après :


:in-3) dans laquelle R6, R7, Rg, Rio, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle ; et
(d) des groupes de formule (III-4) ci-après :



dans laquelle R26 à R29, R35 et R36 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle.
Pour une utilisation en fluorescence secondaire, on préfère plus particulièrement les composés de formule générale (I) dans laquelle R4 est un groupe lieur, tandis que Ri, R2 et R3 représentent tous :
* soit un groupe de formule (III-5) ci-après :



(qui correspond à un groupe de formule ( I I I -3 ) ci-avant où R6 = R7 = R9 = Rio = R35 = R36 = H) ;
* soit un groupe de formule ( I I I- 6 ) ci-après :


; i I I - 6 ) (qui correspond à un groupe de formule (III-4) ci-avant dans laquelle R26 = R27 = R28 = R29 = R35 = R36 = H) .
Des exemples de tels composés sont notamment :
- le 4-{5- [bis (A- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol- 2-yl) -vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- ( 1 , 3-benzothiazol-2-yl) -vinyl] phénoxyjbutanoate d'éthyle ;
- l'acide 4- { 5- [Ms (4- [ (E) -2- (1, 3-benzo-thiazol-2-yl) vinyl ] phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzo-thiazol-2-yl) vinyl] phénoxyjbutanoïque ;
- le 4-{5- [Ms (4- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol-2-yl) vinyl]phényl) amino] -2- [ (E) -2- (1, 3-benzothiazol-2-yl) vinyl] phénoxyjbutanoate de succinimidyle ;
- la (3- (8-bromooctyloxy) -{4- [ (E) -2-(benzo-thiazol-2-yl) vinyl] }-N,N-Ms-{4- [ (E) -2- (benzo-thiazol-2-yl) vinyl ] phényl } aniline ;
- la (3- (8- (2, 5-dioxo-l-aza) cyclopent-3-ényl)-octyloxy)-{4-[ (£')-2-(benzothiazol-2-yl)vinyl] } -N,N-Ms-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl }-aniline ;
- la (3- (9-bromononyloxy) -4-{4- [ (E) -2-(pyridin-4-yl) vinyl] phényl } -N,N-bis- {4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) -vinyl ] phényl } aniline ;
- la tris-méthiodure de 3- (9-bromononyl-oxy) -4, 4% 4"- tris (2- ( (E) -pyridin-4-yl) vinyl) triphényl-amine ;
- le 4- (N,N-bis- (4- (2- (pyridin-4-yl) -vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle ; et
- le 4- (N,N-Ms- (4- (2- (benzothiazol-2-yl) -vinyl) ) phényl) aminobenzoate de méthyle.

Les composés selon 1 ' invention peuvent être préparés par des voies de synthèse à la portée de l'homme du métier, de nombreux procédés permettant de dérivatiser la triphénylamine ayant, en effet, été décrits dans la littérature comme, par exemple, dans les références [1] à [4] précitées.
Le composé de départ est généralement une triphénylamine mono-, di- ou trisubstituée par un atome d'halogène, par exemple de brome ou d'iode, ou un aldéhyde que l'on soumet à une ou plusieurs réactions successives de couplage pour greffer sur les noyaux phényles les groupes constituant respectivement Ri, R2, R3 et/ou R4 dans les composés de formule générale (I) .
Ces réactions de couplage comme, par exemple, la réaction de Heck ou de Wittig-Hôrner qui permet de greffer des composés vinylés sur des noyaux phényle, sont des réactions couramment utilisées en synthèse organique.
Le couplage peut conduire parfois à des produits comportant un à plusieurs substituants qu'il est possible de séparer par purification. L'utilisation d'une chromatographie sur gel de silice est alors recommandée .
Selon l'objectif de l'utilisateur, il est possible de procéder en plusieurs étapes. Si Ri à R3 sont identiques alors, à partir d'un composé de départ comportant par exemple des fonctions -Br, -I ou -CHO, il suffit de faire réagir un composé comportant une fonction de type alcène, phosphonate ou phosphonium en proportions au moins stoechiométriques . Dans le cas où R3 est différent de Ri et R2 ou bien dans le cas où Ri est différent de R2 et R3, il est possible de procéder de la même manière à condition que R3 dans le premier cas ou Ri dans le second cas ne réagisse pas lors du couplage. Bien entendu, il est également possible de recourir à l'utilisation de groupes protecteurs pour protéger une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir afin d'orienter les réactions de couplage et de favoriser ces réactions dans un sens particulier.
L'invention a, aussi, pour objet une composition qui comprend au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, en solution dans un solvant.
Elle a, également, pour objet l'utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, ou d'une composition comprenant un tel composé pour le marquage de biomolécules.
Compte tenu des propriétés de fluorescence à deux photons présentées par les composés selon l'invention, ce marquage sera, de préférence, réalisé en vue de l'observation desdites biomolécules par microscopie biphotonique . Ceci étant, il est également possible d'utiliser les composés selon l'invention comme marqueurs de biomolécules comme des protéines dans d'autres applications comme, par exemple, en microscopie par épifluorescence ou en microscopie confocale .
L'invention a, encore, pour objet une biomolécule marquée par au moins un composé répondant à la formule générale (I) telle que précédemment définie, cette biomolécule étant, de préférence, un acide nucléique ou un fragment d'un acide nucléique (oligonucléotide par exemple) , une protéine, un polypeptide ou un fragment d'une protéine ou d'un polypeptide .
L'invention sera mieux comprise à la lumière du complément de description, qui se réfère à des exemples de réalisation de composés selon l'invention et de démonstration de leurs propriétés.
Bien entendu, ces exemples ne sont donnés qu'à titre d'illustrations de l'invention et n'en constituent en aucun cas une limitation.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 illustre le schéma de synthèse d'un premier composé selon l'invention (TP-2Py) .
La figure 2 illustre le schéma de synthèse d'un autre composé selon l'invention (TP-3Py) .
La figure 3 illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'absorption (densité optique (DO) en fonction de la longueur d'onde (λ) ) d'un composé selon l'invention (TP-2Py) en solution (5 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) ; sont représentés sur cette figure, le spectre d'absorption du composé tel qu'obtenu en l'absence d'ADN (m) et ses spectres d'absorption tels qu'obtenus en présence de 0,5 équivalent (Δ) , 1 équivalent (0), 2 équivalents (X) et 5 équivalents (O) d'ADN.
La figure 4, qui est une figure analogue à la figure 3, illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'absorption (densité optique (DO) en fonction de la longueur d'onde (λ) ) , d'un autre composé selon l'invention (TP-3Py) , également en solution (5 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) ; là également, sont représentés sur cette figure, le spectre d'absorption du composé tel qu'obtenu en l'absence d'ADN (m) et ses spectres d'absorption tels qu'obtenus en présence de 0,5 équivalent (Δ) , 1 équivalent (0), 2 équivalents (X) et 5 équivalents (O) d ' ADN .
La figure 5 illustre l'influence de la présence d'ADN sur le spectre d'émission (intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en coups par seconde (cps) , en fonction de la longueur d'onde λ) , d'un composé selon l'invention (TP-3Py) en solution (3 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) et pour une excitation à 474 nm ; sont représentés sur cette figure, le spectre d'émission du composé en l'absence d'ADN (courbe A) et celui obtenu en présence d'1 équivalent d'ADN (courbe B).
La figure 6 illustre l'influence de la présence d'ADN sur l'intensité de la fluorescence émise par deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et

TP-3Py (4) ) en solution (1 μM) dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,0) et respectivement pour une excitation à 474 nm et 478 nm ; sont représentées sur cette figure, les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du nombre d'équivalents d'ADN.
La figure 7 représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du temps, exprimé en secondes, telles que mesurées pour un composé selon l'invention (TP-3Py (4)) et pour le TO-PRO-3 (Δ) ) , au cours d'une irradiation par une lampe xénon-mercure de 150 W.
La figure 8 représente les variations de la section efficace d'absorption à deux photons δ, exprimée en Gôppert-Mayer, en fonction de la longueur d'onde (nm) telles que mesurées pour deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et TP-3Py (4)), pour un composé qui leur est structurellement très proche, la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] aminé (•) , et pour la fluorescéine (Δ) , la fluorescéine étant en solution dans l'eau (pH > 10), TP-2Py et TP-3Py étant en solution dans le glycérol et la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] aminé étant en solution dans le dichlorométhane .
La figure 9 représente les résultats d'un test analogue à celui dont les résultats sont présentés sur la figure 8, mais qui a été réalisé en utilisant les deux composés selon l'invention (TP-2Py (m) et TP-3Py (4) ) en solution dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,3) additionné de 5 équivalents d'ADN de testicule de hareng.
Les figures 1OA et 1OB correspondent à des images, prises en microscopie d' épifluorescence, de cellules CHO Kl traitées avec un mélange d'un composé selon l'invention (TP-3Py 2 μM) et de DAPI (3 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon 1 ' invention dans le cas de la figure 1OA et au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure 1OB. La figure 10C correspond à la superposition (overlapping) , effectuée par un traitement informatique, des figures 1OA et 10B qui montre la colocalisation des marqueurs dans le noyau.
Les figures HA et HB correspondent à des images, prises en microscopie d' épifluorescence, de cellules CHO Kl traitées avec un mélange d'un autre composé selon l'invention (TP-2Py 2 μM) , et de DAPI

(3 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon l'invention dans le cas de la figure HA et au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure HB. La figure HC correspond à la superposition (over-lapping) , effectuée par un traitement informatique, des figures HA et HB qui montre la colocalisation des marqueurs dans le noyau.
Les figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E et 12F correspondent à des images, prises en microscopie à contraste de phase (figures 12A et 12D) et en microscopie confocale (figures 12B et 12E) et en couplant ces deux méthodes (figures 12C et 12F) , de cellules CHO Kl se trouvant à deux stades de mitose différents, ces cellules ayant été préalablement traitées par un composé selon l'invention (TP-3Py 2 μM) ; ces images ont été prises au maximum d'émission de fluorescence du composé selon l'invention.
Les figures 13 à 15 illustrent les schémas de synthèse d'autres composés selon l'invention.

EXPOSE DETAILLE D'EXEMPLES DE REALISATION
Exemple 1 : Composés utiles en fluorescence directe

1.1. Iodure de bis- [4- (2-N-méthylpyridinium-4-yl-vinyl) phényl] phénylamine
Le composé titre ou composé TP-2Py, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = R3 = H, Ri = R2 = groupe de formule (II-5) où R5 = -CH3, est synthétisé en partant de la 4, 4 ' -diiododiphénylamine ou composé 1, selon le schéma montré sur la figure 1.
La 4 , 4 ' -diiodophénylamine a préalablement été obtenue comme décrit par Kajigaeshi dans Bull. Chem. Soc. Jpn . 1998, 61(2), 600-602 [7].

Synthèse de la 4, 4 ' -diiodotriphénylamine ou composé 2
Dans de 1 ' acétonitrile sec (6 mL) , on dissout de la 4, 4 ' -diiododiphénylamine (406 mg, 1 éq.) et du 2- (triméthylsilyl) benzène trifluorométhane-sulfonate (244 μL, 602 mg, 1,04 éq.). Après 1 minute d'agitation, du CsF finement broyé est ajouté (295 mg, 2,01 éq.) et la suspension résultante est agitée pendant 3 jours à l'abri de la lumière. Puis la solution est évaporée, reprise dans le n-hexane et filtrée sur silice. Après évaporation des eaux-mères, on isole le composé 2 sous la forme d'une fine poudre blanche (Rdt : 86%) .

Synthèse de la 4, 4 ' -Ms (2- ( (E) -pyridin-4-yl) vinyl) -triphénylamine ou composé 3
Le composé 2 (108 mg, 220 μmol) , de l'acétate de palladium (6 mg, 12%) et de la tris- (o-tolyl) phosphine (15 mg, 22%) sont introduits dans un réacteur sec qui est ensuite purgé avec de l'azote. Puis 70 μl de 4-vinylpyridine (660 μmol) et 3 mL d'un mélange triéthylamine/diméthylformamide (TEA/DMF : 2/1, v/v) dégazé sont ajoutés successivement. Le mélange est agité à 85-900C, sous azote pendant 3 heures. Puis, sa température est ramenée à la température ambiante et les solvants sont évaporés sous vide poussé. Le résidu huileux est dilué avec du dichlorométhane et lavé avec de l'eau plusieurs fois. Puis la phase organique est séchée et concentrée. Le résidu huileux est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution : dichlorométhane/méthanol 100/0 à 95/5, v/v) . On obtient ainsi 79 mg (200 mmol) du composé 3 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 80%) .

Synthèse de TP-2Py
Le composé 3 (37 mg, 82 μmol) est dissous dans 3 mL d'un mélange d' iodométhane/méthanol (2/1, v/v) et la solution ainsi obtenue est chauffée à reflux pendant 24 heures. Puis le brut est concentré, repris à l'éther et filtré. Le solide rouge obtenu est lavé plusieurs fois à l'éther et au pentane pour donner 52 mg (71 μmol) de TP-2Py sous la forme d'une poudre rouge foncé (Rdt : 87%) .

RMN 1H (DMSO-de, 300 MHz) δ : 8,80 (d, 6, 6 Hz, 4H) ;

8,17 (d, 6, 6 Hz, 4H) ; 7, 97 (d, 16,2 Hz, 2H) ; 7,70 (d,

8,7 Hz, 4H) ; 7,35-7,46 (m, 4H) ; 7,08-7,28 (m, 7H) ; 4,23 (s, 6H) .
RMN 13C (DMSO-de, 75 MHz) δ : 153,1 ; 148,8 ; 146,2 ;

145.4 ; 140, 6 ; 130, 6 ; 130,2 ; 126, 6 ; 125,8 ; 123, 6 ;

123.5 ; 122,0 ; 47,2.

1.2. Iodure de tris- [4- (2-N-méthylpyridinium-4-yl-vinyl) phényl] aminé
Le composé titre ou composé TP-3Py, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (II-5) où R5 = -CH3, est synthétisé en partant de la tris- (4-bromophényl) aminé ou composé 4, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 2.

Synthèse de la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] -aminé ou composé 5
Le composé 4 (1 g, 2,07 mmol, 1 éq.), de l'acétate de palladium (23 mg, 0,104 mmol, 0,05 éq.) et de la tris-o-tolylphosphine (95 mg, 0,311 mmol, 0,15 éq.) sont introduits dans un réacteur sec qui est ensuite purgé avec de l'azote. Un mL de 4-vinylpyridine

(0,98 g, 9,32 mmol, 4,5 éq.) et 5,4 mL d'un mélange

TEA/DMF (2/1, v/v) sont ajoutés successivement. Le mélange est agité à 85-900C, sous azote pendant

25 heures. Puis, sa température est ramenée à la température ambiante et les solvants sont éliminés sous vide poussé. Le produit est dilué avec 120 mL de dichlorométhane, lavé avec 3 x 30 mL d'une solution de carbonate de sodium saturée puis séché. Le volume de dichlorométhane est réduit et le produit est précipité par addition d'hexane et refroidissement à 4°C.
On obtient ainsi 0,943 g du composé 5 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 85,5%) .

Synthèse de TP-3Py
De 1 ' iodométhane en large excès (1,5 mL) est ajouté à une suspension du composé 5 (64 mg, 0,115 mmol) dans 1,5 mL de méthanol. On laisse le mélange, qui prend immédiatement une couleur rouge profond, toute une nuit sous agitation. Le produit est ensuite précipité par addition d'éther diéthylique et filtré.
On obtient ainsi 0,103 g de TP-3Py sous la forme d'un solide rouge (Rdt : 91%) .

Formule brute : C42H39N43+, 31" M : 980,5
RMN 1H (DMF d7) δ (ppm) : 4,50 (s, 9H, Me) , 7,28 (d,

J = 8,4Hz, 6H) ; 7, 64 (d, J = 16,2Hz, 3H) ; 7, 90 (d, J = 8,7Hz, 6H) ; 8,20 (d, J = 16,2Hz, 3H) 8,40 (d, J = 6, 6Hz, 6H) ; 9,06 (d, J = 6, 6Hz, 6H) .
RMN 13C (DMF d7) δ (ppm) : 47,0 ; 122,3 123,7 r 124, 6 ; 130,1 ; 131,3 ; 140,5 ; 145,3 ; 148,3 153,4 MS (ESI+) : 363,11 ( [C42H39N4I ] 2+/2, 10%) 199, ,75 ( [C42H39N4] 3+/3, 100%) .

Exemple 2 : Propriétés de TP-2Py et de TP-3Py

2.1. Solubilité dans l'eau
TP-2Py et TP-3Py présentent une solubilité dans l'eau élevée puisque des solutions aqueuses de ces composés 0,5 à 1 mM ont pu être obtenues sans que ne se forme un quelconque précipité. Cette solubilité aqueuse est un réel avantage, notamment pour des applications biologiques, puisqu'elle permet de travailler en milieu aqueux et de ne pas utiliser de solvant organique comme le DMSO qui, bien que classiquement employé dans ce domaine, est délétère pour les membranes cellulaires.
De plus, contrairement aux marqueurs couramment utilisés en biologie comme les dérivés des cyanines (thiazole orange par exemple) qui forment des agrégats en milieu aqueux, les solutions aqueuses de TP-2Py et TP-3Py suivent la loi de Beer-Lambert, au moins jusqu'à une concentration de 50 μM. A titre comparatif, le thiazole orange se trouve, dans les conditions où il est classiquement employé, c'est-à-dire à une concentration de 36 μM et à une température de 200C, sous forme de dimères (Kubista et al., Biopolymers 1998, 46_, 39-51 [8]).

2.2. Propriétés d'absorption monophotonique et d' émission
L'étude des propriétés d'absorption monophotonique de TP-2Py et TP-3Py a mis en évidence que ces deux composés présentent une forte absorption dans le domaine visible et que leurs coefficients d'extinction molaire (ε) sont, dans le glycérol, de 37400 L/mol.cm (à 474 nm) pour la TP-2Py et de 66000 L/mol.cm (à 474 nm) pour la TP-3Py.
Les longueurs d'onde maximales d'absorption de ces deux composés se situent dans la gamme de 450-500 nm et sont donc parfaitement compatibles avec l'utilisation des lasers Titane : Saphir que l'on emploie en microscopie biphotonique et qui sont généralement accordables dans la gamme spectrale de 750-900 nm.
Par ailleurs, des mesures de fluorescence réalisées sur TP-2Py et TP-3Py en solution dans un milieu aqueux (cacodylate de sodium 10 mM, pH 7,0) ont montré que la présence d'ADN dans ce milieu se traduit par un fort hypochromisme, d'environ 20%, de TP-2Py et de TP-3Py et par un déplacement vers le rouge de leurs spectres d'absorption, ce déplacement étant d'autant plus prononcé que la concentration en ADN des milieux est plus élevée.
Ces résultats, qui sont illustrés sur les figures 3 et 4, lesquelles représentent les spectres d'absorption, respectivement de TP-2Py et de TP-3Py, obtenus à partir de solutions 5 μM de ces composés, avant et après que ne leur soit ajouté un ADN duplex de 26 paires de bases de séquence autocomplémentaire (ci-après "ds26"), à des teneurs allant de 0,5 à 5 équivalents, indiquent une forte affinité de TP-2Py et TP-3Py pour l'ADN dans des conditions analogues aux conditions physiologiques.
La présence d'ADN dans un milieu aqueux contenant TP-2Py et TP-3Py s'est révélée avoir aussi pour effet d'exalter fortement les propriétés de fluorescence de ces composés à leur maximum d'émission de fluorescence, c'est-à-dire vers 660-680 nm.
Cet effet d'exaltation est illustré sur la figure 5 qui représente les spectres d'émission obtenus à partir d'une solution 3 μM de TP-3Py, avant et après que ne lui soit ajouté 1 équivalent de ds26, pour une excitation à 474 nm, ainsi que sur la figure 6 qui représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo) obtenues à partir de solutions 3 μM de TP-IPy (A), TP-2Py (U) et TP-3Py (4), également pour une excitation à 474 nm, en fonction du nombre d'équivalents de ds26 ajouté.
Cette dernière figure montre que l'intensité de la fluorescence émise par ces composés peut augmenter jusqu'à 20 fois en fonction du nombre d'équivalents d'ADN.
Des études de fluorescence analogues mais réalisées dans du glycérol, ont montré une exaltation encore plus prononcée des propriétés de fluorescence de TP-2Py et de TP-3Py, de l'ordre de 100 fois.
Il est à noter qu'une telle affinité vis-à-vis de l'ADN est rare chez les marqueurs classiquement utilisés en biologie, ce qui confère un grand intérêt à des composés tels que TP-2Py et TP-3Py, cette affinité garantissant a priori un niveau élevé de luminescence moléculaire dans un contexte cellulaire.
L'affinité de TP-2Py et de TP-3Py pour l'ADN a été déterminée par titration fluorométrique dans des conditions stringentes (tampon cacodylate de sodium cacodylate de sodium 10 mM, pH 7,0 additionné de NaCl 100 mM) et en utilisant ds26 comme ADN. Pour les deux composés, une constante de dissociation Kd de l'ordre du micromolaire a été obtenue, confirmant leur très forte affinité pour l'ADN.

2.3. Photostabilité
L'aptitude de TP-3Py à résister aux effets d'une irradiation a été testée et comparée à celle d'un fluorophore classiquement utilisé comme marqueur de l'ADN en microscopies à épifluorescence et confocale, à savoir le TO-PRO-3 (iodure de 1- (N, N, N-triméthylamino-propyl) -4- { 2- [3-méthyl-2, 3-dihydro- (benzo-1, 3-thiazole) -2-éthylidène] -vinyl } -quinolinium) .
Comme illustré par la figure 7, qui représente les variations de l'intensité de fluorescence (Ifiuo), exprimée en unités arbitraires, en fonction du temps, exprimé en secondes, telles que mesurées pour le TP-3Py et le TO-PRO-3 au cours d'une irradiation par une lampe xénon-mercure de 150 W d'une trentaine de minutes, l'émission de fluorescence de TP-3Py est peu modifiée par l'irradiation, alors que celle du TO-PRO-3 chute de plus de 40%.

2.4. Propriétés d'absorption biphotonique
Les propriétés d'absorption biphotonique des composés selon l'invention ont été appréciées en utilisant la technique de fluorescence induite par deux photons (TPIF pour "Two-Photon-Induced Fluorescence) et au moyen d'une source laser femtoseconde Titane : Saphir à impulsions de 90 fs à 76 MHz pouvant être accordée à 750-840 nm.

Les intensités TPIF relatives des composés selon 1 ' invention ont été mesurées relativement à un marqueur classique de référence, la fluorescéine, ainsi qu'à un composé structurellement très proche de TP-2Py et TP-3Py, la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] -aminé .
Dans un premier temps, les mesures ont été effectuées en utilisant TP-2Py et TP-3Py dans du glycérol, la fluorescéine et la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl ] aminé étant, elles, respectivement dans de l'eau (pH > 10) et dans du dichlorométhane .
Comme le montre la figure 8, qui représente les variations de la section efficace d'absorption à deux photons δ, exprimée en Gδppert-Mayer, en fonction de la longueur d'onde (nm) telles qu'obtenues pour TP-2Py (H), TP-3Py (4), la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl ] aminé (•) et la fluorescéine (Δ) , on observe un maximum relatif aux alentours de 820 nm pour TP-2Py et TP-3Py. Le maximum d'absorption à 2 photons se situe donc à une longueur d'onde inférieure à deux fois la longueur d'onde d'absorption à 1 photon (2 x 474 nm = 950 nm) ce qui indique que d'autres états excités, plus hauts en énergie participent au processus d'absorption à deux photons.
Puis, les mesures ont été effectuées en utilisant TP-2Py et TP-3Py dans un tampon cacodylate de sodium (10 mM, pH 7,3) additionné de 5 équivalents d'ADN de testicule de hareng. Comme le montre la figure 9, les spectres obtenus pour TP-2Py et TP-3Py en présence d'ADN sont identiques à ceux précédemment observés dans le glycérol et ce, pour toutes les longueurs d'onde d'excitation.
Les propriétés optiques de TP-2Py et TP-3Py sont résumées dans le tableau I ci-après, dans lequel ε correspond au coefficient d'extinction molaire, exprimé en L/mol.cm, ΦF correspond au rendement quantique de fluorescence et δ correspond à la section efficace d'absorption à deux photons, exprimée en Gδppert-Mayer (GM) .

TABLEAU I

II apparaît que TP-3Py présente une importante section efficace d'absorption à deux photons puisque celle-ci atteint une valeur de 700 GM dans le glycérol et de 700 GM et en présence d'ADN. Cette valeur est très nettement supérieure à celles obtenues pour le DAPI (0,16 GM), pour la fluorescéine (38 GM) et pour la rhodamine 6G (100 GM) qui est pourtant considérée comme l'un des meilleurs fluorophores pour la microscopie bi-photonique .
Il y a lieu de noter que la tris- [4- (2-pyridin-4-yl-vinyl) phényl] aminé, qui est structurel-lement très proche de TP-3Py, présente comme cette dernière un maximum d'excitation vers 820 nm mais la valeur de sa section efficace d'absorption à deux photons n'est que de 58 GM selon la littérature et de 90 GM selon les mesures effectuées par les Inventeurs.

2.5. Etude en microscopie
Afin de mettre en évidence les potentialités des composés selon l'invention pour l'imagerie de l'ADN, des cellules CHO Kl (Chinese Ovarian Hamster Kl) ont été traitées respectivement par TP-2Py, TP-3Py, du DAPI et des mélanges TP-2Py/DAPI et TP-3Py/DAPI, puis observées en microscopie par épi-fluorescence et en microscopie confocale laser.
Les cellules CHO-Kl, préalablement cultivées dans des puits, sur des supports de verre recouverts de polyornithine, renfermant un milieu de culture standard disponible commercialement, ont été fixées en utilisant une solution de formaldéhyde (4%) dans le PBS.
Les cellules ont ensuite été incubées, à température ambiante et pendant 20 minutes, en présence des marqueurs ou mélanges de marqueurs à tester (en solution aqueuse) , puis lavées au tampon PBS (NaCl 13mM, KCl 0,27 mM, KH2PO4 0,15 mM, Na2HPO4 0,8 mM, pH 7,4) pour éliminer l'excès de marqueur. Les concentrations de TP-2py et de TP-3Py ont été fixées à 2 μM, tandis que celle du DAPI a été fixée à 3 μM. Les cellules ont ensuite été préparées de façon conventionnelle pour les observations microscopiques.
Les observations par microscopie par épifluorescence ont été réalisées avec un microscope Nikon, Eclipse E 800, muni d'un objectif 6Ox (1.4) et d'un appareil numérique Nikon, DXM 1200, tandis que celles par microscopie confocale ont été réalisées avec un microscope Leica DM6000 comportant une unité SP2 équipée d'un objectif 63x (1.4) et d'un laser HeNe pour l'excitation des marqueurs.
Comme le montrent les figures 1OA, 10B et

10C, qui correspondent à des images de cellules ayant été traitées par un mélange de TP-3Py et de DAPI, prises en microscopie d' épifluorescence au maximum d'émission de fluorescence du TP-3Py dans le cas de la figure 10A, au maximum d'émission de fluorescence du DAPI dans le cas de la figure 10B et en superposant ces images par un traitement informatique dans le cas de la figure 10C, on observe une intense fluorescence (dans le rouge) due au traitement au TP-3Py et cette fluorescence est localisée exclusivement au niveau du noyau, ce qui démontre encore une fois l'affinité remarquable que présente ce composé vis-à-vis de l'ADN. S 'agissant du cytoplasme, un très grand contraste est obtenu et aucun bruit de fond n'a été détecté. Par ailleurs, considérant l'intensité lumineuse au point focal de l'objectif du microscope, il ressort de l'observation que TP-3Py est très stable.
Des résultats analogues ont été obtenus pour les cellules traitées avec un mélange TP-2Py/DAPI comme en témoignent les figures HA, HB et HC.
D'autre part, comme le montrent les figures 12A à 12F, qui correspondent à des images de cellules ayant été traitées par TP-3Py, prises en microscopie à contraste de phase (figures 12A et 12D) , en microscopie confocale (figures 12B et 12E) et en superposant ces deux méthodes (figures 12C et 12F), au maximum d'émission de fluorescence de TP-3Py, ce dernier a permis d'obtenir, par couplage des microscopies à contraste de phase et confocale, des images de chromosomes en anaphase d'une très grande netteté et de haute résolution, avec une définition très claire des limites de la cellule.
Ainsi, en dépit du fait que les rendements quantiques obtenus in vitro pour TP-2Py et TP-3Py soient relativement moyens, il s'avère que, grâce à leur grande section efficace d'absorption à deux photons et leur faible rendement quantique à l'état libre, ces composés offrent un contraste important.
Ces composés émettent dans le rouge, ce qui est un net avantage sur les fluorophores émettant dans le bleu ou le vert car, non seulement l'utilisation de ces derniers s'accompagne d'interférences dues aux composants cellulaires qui fluorescent naturellement dans le vert, mais de surcroît la lumière bleu-vert est susceptible de causer des dommages aux cellules. Pour ces raisons, une meilleure détection peut être obtenue car la diffusion dans le milieu est plus limitée.

Exemple 3 : Composés utiles en fluorescence secondaire

3.1. 4- {5- [Jbis(4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) -vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) -vinyl] phénoxy}butanoate d' éthyle
Le composé titre ou composé 12, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -0(CH2)SC(O)OC2H5, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), est synthétisé à partir du 2-méthoxy-4-aminobenzoate de méthyle ou composé 6, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 13.

Synthèse du 2-méthoxy-4- (N,N-bis (4-méthoxycarbonyl-phényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 7
Dans 30 mL de toluène sec et dégazé, on introduit de l'acétate de palladium (186 mg, 828 μmol, 5%) de la tris- tert-butylphosphine (7,7 mL, 2,48 mmol, 15% ; solution à 10% dans l'hexane (m/m)) . Après 15 minutes d'agitation, on ajoute du 4-bromobenzoate de méthyle (10,7 g, 49,7 mmol, 3 éq.), le composé 6 (3,0 g, 16,6 mmol, 1 éq.) et du carbonate de césium (13,5 g, 41,4 mmol, 2,5 éq.). La solution est chauffée à reflux pendant 17 heures, puis refroidie et diluée avec du dichlorométhane (100 mL) . La solution est filtrée sur Celite, évaporée et purifiée par chromatographie (élution avec un gradient de n-hexane/dichlorométhane 2/1, v/v, à dichlorométhane) pour donner 6,35 g du composé 7 sous la forme d'une poudre jaune clair (Rdt : 89%) .

Synthèse du (4- {bis [4- (hydroxyméthyl) phényl] amino } -2-méthoxyphényl) méthanol ou composé 8
A une suspension d'hydrure d'aluminium et de lithium (LiAlH4, 1,7 g, 45 mmol, 15 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF) sec (30 mL) à -78°C, on ajoute au goutte-à-goutte une solution du composé 7 (1,35 g, 3 mmol) dans 20 mL de THF. On laisse la température du milieu revenir à température ambiante puis la réaction est chauffée au reflux sous agitation. Après 1 heure, la solution est refroidie à -78°C et diluée par du dichlorométhane, puis on verse lentement de l'eau (10 mL) . Le solide obtenu est filtré et lavé au dichlorométhane. Les eaux-mères sont lavées à l'eau et à la saumure puis séchées et concentrées pour donner 1,05 g (2,88 mmol) d'un composé pâteux (Rdt : 97%).

Synthèse du 4- [bis (4-formylphényl) amino] -2-méthoxybenz-aldéhyde ou composé 9
A une solution du composé 8 (27 mg, 74 μmol) dans du dichlorométhane (2 mL) , on ajoute du Mnθ2 (40 mg, 444 μmol) . La suspension obtenue est agitée pendant 48 heures à température ambiante puis elle est filtrée. Le solide obtenu est lavé au dichlorométhane. Les eaux-mères sont ensuite concentrées pour donner 25 mg du composé 9 sous la forme d'un solide jaune (Rdt : 91%) Synthèse du 4- [bis (4-formylphényl) amino] -2-hydroxybenz-aldéhyde ou composé 10
A une suspension de chlorure d'aluminium (AICI3, 575 mg, 4,31 mmol, 5 éq.) dans du dichlorométhane (10 mL) à -100C, on ajoute au goutte-à-goutte une solution du composé 9 (310 mg, 860 μmol) dans du dichlorométhane (5 mL) . Le mélange est agité à reflux pendant 24 heures. Il est ensuite versé dans un mélange d'eau et de glace, puis il est vigoureusement agité 10 minutes. Il est extrait au dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau et à la saumure, séchée et concentrée pour donner un solide que l'on triture dans de l'hexane pour donner 260 mg (754 μmol) du composé 10 sous la forme d'une poudre jaune (Rdt : 87%) .

Synthèse du 4- { 5- [bis (4-formylphényl) amino] -2-formyl-phénoxyjbutanoate d'éthyle ou composé 11
A une solution du composé 10 (280 mg, 810 μmol) dans du DMF sec (12 mL) , on ajoute du K2CO3

(1,1 g, 8,0 mmol, 10 éq.) . La réaction est agitée pendant 15 minutes et du bromobutanoate d'éthyle

(175 μL, 1,22 mmol, 1,5 éq.) est lentement ajouté. Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante puis concentré. Le résidu est repris dans du dichlorométhane et de l'eau. Le mélange biphasique est décanté, et la phase organique est lavée plusieurs fois à l'eau. Après séchage et concentration, on obtient un solide qu'on purifie par chromatographie (élution avec un gradient de méthanol de 0 à 1% dans du dichlorométhane) pour donner 275 mg (530 μmol) du composé 11 sous la forme d'une poudre orange (Rdt

Synthèse du composé 12
A une suspension d'hydrure de sodium

(dispersion à 60%, 51 mg, 1,26 mmol, 3,60 éq.) et de (2-méthylbenzothiazole) phosphonate de diéthyle (328 mg, 1,15 mmol, 3,3 éq.) dans du THF sec (10 mL) , on ajoute au goutte-à-goutte le composé 11 (160 mg, 348 μmol) en solution dans du THF (12 mL) . Le mélange est agité à température ambiante pendant 3 jours, puis il est dilué par du dichlorométhane, lavé à l'eau et à la saumure. La phase organique est séchée et concentrée. Le résidu obtenu est trituré dans le pentane pour donner 220 mg (257 μmol) du composé 12 (Rdt : 74%) .

RMN IH (CDC13, 300 MHz) δ : 1,27 (t, 6,9, 3H) ; 2,24

(quint, 6,9 Hz, 2H) ; 2,60 (t, 6,9 Hz, 2H) ; 4,00 (t,

6,9 Hz, 2H) ; 4,19 (q, 6,9 Hz, 2H) ; 6,72 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,79 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz,

4H) ; 7,33-7,65 (mult, 16H) ; 7,83 (d, 16,2 Hz, IH) ;

7,89 (mult, 3H) ; 8,01 (d, 8,4 Hz, IH) ; 8,03 (d,

8, 4 Hz, 2H) .
RMN 13C (CDC13, 75 MHz) δ : 14,2 ; 24,5 ; 30,8 ; 60,6 ; 67,5 ; 108,0 ; 117,1 ; 120,3 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ;

122,5 ; 122,7 ; 122,8 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ;

126,3 ; 128,7 ; 130,8 ; 132,4 ; 134,3 ; 136,8 ; 147,6 ;

148,8 ; 154,0 ; 154,1 ; 157,8 ; 167,1 ; 168,2 ; 173,0.

3.2. Acide 4- {5- [bis (4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl)vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 , 3-benzothiazol-2-yl) vinyl] phénoxy}butanoïque
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 13, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 3COOH, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 12 tel qu'obtenu au point 3.1. ci-dessus.
Pour ce faire, le composé 12 (60 mg,

0,070 mmol) est dissous dans du THF (2 mL) . On y ajoute 2 mL d'une solution aqueuse saturée en LiOH, et le mélange biphasique obtenu est vigoureusement agité pendant 24 heures. Puis le mélange est acidifié jusqu'à pH 2 et dilué par du dichlorométhane . Après décantation, la phase organique est séparée, lavée à l'eau puis à la saumure, séchée et concentrée pour donner un résidu qu'on triture dans l'éther et le pentane. On obtient ainsi 53 mg (63 μmol) du composé 13 (Rdt : 90%) .

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 2,32 (br, 2H) ; 2,59 (br,

2H) ; 4,01 (t, 6.0 Hz, 2H) ; 6,67 (d, 1.8 Hz, IH) ;

6,75 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,21 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,30-7,65 (mult, 16H) ; 7,86-7,91 (mult, 3H)

8,01-8,04 (mult, 3H) ; 8,14 (d, 15.0 Hz, IH).
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 25,0 ; 32,0 ; 68,6 ; 107,5 ;

116,9 ; 119,4 ; 120,1 ; 121,0 ; 121,5 ; 122,2 ; 122,8 ;

124,6 ; 125,0 ; 125,2 ; 126,5 ; 128,5 ; 128,7 ; 130,9 ; 132,8 ; 134,1 ; 134,3 ; 137,0 ; 147,5 ; 149,0 ; 153,1 ;

153,9 ; 158,1 ; 167,2 ; 168,7.

3.3. 4-{5- [Jbis(4- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) vinyl]phényl)amino] -2- [ (E) -2- (1 ,3-benzothiazol-2-yl) vinyl] phénoxy}butanoate de succinimidyle
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 14, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 3C (0) O-succinimidyle, Ri = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 13 tel qu'obtenu au point 3.2. ci-dessus.
Pour ce faire, le composé 13 (40 mg, 50 μmol) , du N-hydroxysuccinimide (9 mg, 78 μmol) et du DCC (11 mg) sont dissous dans du dichlorométhane (1 mL) et le mélange est agité pendant 24 heures. Puis le milieu est évaporé, repris dans un minimum de dichlorométhane. La suspension laiteuse est filtrée, l'opération est répétée plusieurs fois. Les eaux-mères sont évaporées à sec pour donner le composé 14 sous la forme d'une poudre jaune orangée.

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 2,34 (quint, 6,3 Hz, 2H) ; 2,83 (s, 4H) ; 2,93 (t, 6,3Hz, 2H) ; 4,06 (t, 6,0 Hz, 2H) ; 6,73 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,80 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,35-7,65 (mult, 16H) ; 7,83 (d, 16,5 Hz, IH) ; 7,90 (mult, 3H) ; 8,00 (d, 8,4 Hz, 2H) ; 8, 02 (d, 8,4 Hz, IH) .
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 22,7 ; 25,6 (3C) ; 66,8 ; 108,0 ; 117,3 ; 120,2 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,7 ;

122.8 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ; 126,4 ; 128,5 ; 128,7 ; 130,8 ; 132,3 ; 134,3 ; 138,9 ; 147,6 ; 148,8 ;

153.9 ; 154,0 ; 157,4 ; 167,2 ; 168,2 ; 168,3 ; 169,0.

3.4. (3- (8-bromooctyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzo-thiazol-2-yl)vinyl] } -N,N-bis-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl}aniline
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 16, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe espaceur -0 (CH2) 8Br, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 10 tel qu'obtenu au point 3.1. ci-dessus.

Synthèse du 2- (8-bromooctyloxy) , 4- [N,N-bis (4-formyl-phényl) ] aminobenzaldéhyde ou composé 15
Dans de l'acétone sèche (10 mL) , on dissout le composé 10 (100 mg, 290 μmol) , du 1, 8-dibromooctane

(800 μL, 1,18 g, 4,34 mmol, 15 éq.) et du carbonate de potassium (100 mg, 723 μmol, 2,5 éq.). La suspension blanche est agitée à 45°C pendant 24 heures. Puis, on ajoute de l'éther et le mélange est filtré et lavé à l'éther. Après réunion et concentration des eaux-mères, le résidu est purifié par chromatographie sur colonne

(élution : dichlorométhane/n-hexane 1/1 à 4/1, v/v, puis dichlorométhane et dichlorométhane/méthanol

99,5/0,5, v/v) . Le composé 15 est obtenu sous forme d'un solide jaune (Rdt : 84%) .

Synthèse du composé 16
Du diéthyl (2-méthylbenzothiazole) phospho-nate (186 mg, 652 μmol, 3,5 éq.) est dissous dans du THF sec (5 mL) . On ajoute de l'hydrure de sodium

(dispersion à 60%, 25 mg, 625 μmol, 3,3 éq.) . Après environ 15 minutes, le composé 15 (100 mg, 186 μmol) en solution dans du THF sec (5 mL) est ajouté au goutte-à-goutte. Après 24 heures d'agitation à température ambiante, le milieu est évaporé à sec et le résidu purifié par chromatographie (élution avec un gradient de méthanol de 0 à 0,5% dans le dichlorométhane) pour donner, après évaporation, 98 mg (106 μmol) du composé 16 sous la forme d'une poudre orangée (Rdt : 57%) .

RMN 1H (CDCl3, 300 HMz) δ : 1,30-1,60 (br, 8H) ; 1,88 (br, 4H) ; 3,41 (t, 6,9 Hz, 2H) ; 3,94 (t, 6,3 Hz, 2H) ; 6,72 (br, IH) ; 6,77 (d, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,35-7,58 (mult, 16 H) ; 7,84 (d, 16,5 Hz, IH) ; 7,90 (mult, 3H) ; 8,01 (d, 7,6 Hz, IH) ; 8,03 (d, 7, 6 Hz, 2H) .
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 26,1 ; 28,1 ; 28,7 ; 29,0 ; 29,2 ; 32,8 ; 33,9 ; 68,6 ; 108,1 ; 116,9 ; 120,3 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,8 ; 122,9 ; 124,6 ; 125,1 ; 125,3 ; 126,2 ; 126,4 ; 128,6 ; 129,0 ; 130,8 ; 132,8 ; 134,3 ; 134,4 ; 138,8 ; 147,7 ; 148,8 ; 154,0 ; 154,1 ; 158,2 ; 167,1 ; 168,3.

3.5. (3- (8- (2,5-dioxo-l-aza)cyclopent-3-ényl) -octyloxy) -{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] }-N,N-bis-{4- [ (E) -2- (benzothiazol-2-yl) vinyl] phényl}aniline
Comme visible sur la figure 13, le composé titre ou composé 17, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur - (CH2) 8-succinimidyle, Ri = R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 16 tel qu'obtenu au point 3.4. ci-dessus.

Dans 50 μL de DMF sec, on dissout le composé 16 (24 mg, 25.8 μmol) , du rac-7-oxabicyclo- [2.2.1 ] -heptène-2, 3-dicarboxylic imide (5 mg, 28,4 μmol, 1,1 éq.) et du K2CO3 (18 mg, 129 μmol, 5 éq.) . La suspension blanche obtenue est agitée à 55°C pendant 24 heures. L'avancement de la réaction est suivie par CCM. Une fois la disparition du produit de départ constatée, le mélange est dilué par du dichlorométhane et lavé plusieurs fois à l'eau. La phase organique est séchée et concentrée. Le résidu est remis en solution par 5 mL d'anisole et chauffé à reflux pendant 2 heures. Puis l'anisole est chassé sous vide et le résidu est purifié par CCM préparative. On obtient ainsi 11 mg (12 μmol) du composé 17 sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 47%) .

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ : 1,30-1,60 (br, 10H) ; 1,85

(quint, 2H) ; 3,52 (t, 7,2 Hz, 2H) ; 3,93 (t, 6,3 Hz,

2H) ; 6,67 (s, 4H) ; 6,72 (d, 1,8 Hz, IH) ; 6,77 (dd, 1,8 Hz, 8,4 Hz, IH) ; 7,22 (d, 8,4 Hz, 4H) ; 7,33-7,60

(mult, 16 H) ; 7,84 (d, 16,2 Hz, IH) ; 7,90 (mult,

3H) ; 8,01 (d, 7,6 Hz, IH) ; 8,03 (d, 7,6 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ : 26,1 ; 26,6 ; 28,5 ; 29,0 ;

29,1 ; 29,2 ; 37,9 ; 68,6 ; 108,0 ; 116,9 ; 120,4 ; 121,0 ; 121,4 ; 121,5 ; 122,7 ; 122,9 ; 124,4 ; 125,0 ;

125,2 ; 126,3 ; 126,4 ; 128,7 ; 128,9 ; 130,6 ; 132,7 ;

134,0 ; 134,4 (2C) ; 136,8 ; 147,6 ; 148,9 ; 153,9 ;

154,0 ; 158,1 ; 167,3 ; 168,6 ; 171,0.

3.6. (3- (9-bromononyloxy) -4-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl)vinyl]phényl}-N,N-.bis-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) -vinyl] phényl}aniline
Le composé titre ou composé 22, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -0(CH2) 9Br, Ri = R2 = R3 = groupe de formule

(III-5), est synthétisé à partir de la

3-méthoxytriphénylamine ou composé 18, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 14.

Synthèse de l'acétate de 3- (N, N-diphénylamino) phényle ou composé 19
A une solution de composé 18 (1,012 g, 3,67 mmol) dans du dichlorométhane sec (10 mL) refroidi à -78°C, on ajoute goutte-à-goutte une solution molaire de BBr3 (5,5 mL, 5,5 mmol, 1,5 éq.) sur 45 minutes. La suspension ambrée résultante est agitée pendant 1 heure à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé, redissous dans un mélange pyridine/anhydride acétique (6/4,5, v/v) et chauffé à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement à température ambiante, le mélange est dilué par du dichlorométhane et lavé par de l'acide chlorhydrique 10 mM jusqu'à acidification de la phase aqueuse, Na2CO3 2% (m/v) et de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4, réduite à 5 mL et filtrée sur un peu de silice. Après séchage, on obtient 1,046 g (3,45 mmol) du composé 19 sous la forme d'une huile incolore (Rdt : 94%) .

Synthèse de l'acétate de 2-iodo-5- (N, N-bis- (4-iodo-phényl) amino) phényle ou composé 20
A une solution de composé 19 (77 mg,

254 μmol) dans du dichlorométhane, on ajoute de l'iode (449 mg, 1,77 mmol, 7 éq.) puis de l'oxyde de mercure rouge (384 mg, 1,77 mmol, 7 éq.), et la suspension obtenue est agitée à température ambiante pendant

3 jours. Puis la suspension est filtrée sur Celite et les eaux-mères lavées par une solution de Na2S2Û3 et de l'eau. Les eaux-mères sont filtrées une seconde fois sur silice puis évaporées à sec pour donner 153 mg du composé 20 sous la forme d'une poudre blanche (Rdt :

Synthèse de la 3-hydroxy-4- { 4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) -vinyl]phényl}-I\f,N-Ms-{4- [ (E) -2- (pyridin-4-yl) vinyl] -phényl } aniline ou composé 21
Dans 3 mL d'un mélange TEA/DMF sec (2/1, v/v) , on dissous de l'acétate de palladium (5 mg, 22 μmol) et de la tris o-tolylphosphine (20 mg, 66 μmol) . Après 10 minutes d'agitation, on ajoute de la 4-vinylpyridine (150 μl, 1,39 mmol, 5 éq.) et le composé 20 (278 μmol, 1 éq.) et le mélange est chauffé pendant 3 heures à 85°C sous atmosphère inerte. Puis le milieu est évaporé à sec, et l'huile rouge obtenue est lavée au pentane puis à l'éther. Le résidu pâteux rouge résiduel est purifié sur colonne de silice (élution avec un gradient dichlorométhane à dichlorométhane/ méthanol 97/3, v/v) pour donner une poudre ocre correspondant au composé 21 (Rdt : 61%) .

Synthèse du composé 22
Le composé 21 (103 mg, 1 éq.), du

1, 9-dibromononane (730 μl, 20 éq.) et du carbonate de potassium (125 mg, 5 éq.) sont agités pendant 3 heures à température ambiante dans du DMF (1 mL) . Puis, le brut réactionnel est versé dans un grand volume d'éther

(100 mL) et filtré sur silice. La silice est abondamment lavée à l'éther. Puis elle est lavée par un mélange dichlorométhane/méthanol (95/5, v/v) et les eaux-mères sont concentrées et purifiées sur colonne de silice (élution avec un gradient dichlorométhane à dichlorométhane/méthanol 97/3, v/v) pour donner, après évaporation, environ 30 mg du composé 22 sous la forme d'une poudre rouge.

3.7. Tris-méthiodure de 3- (9
4 , 4' , 4"-tris (2- { (E) -pyridin-4-yl) vinyl) triphénylamine
Comme visible sur la figure 14, le composé titre ou composé 23, qui répond à la formule générale (I) dans laquelle R4 = groupe lieur -O(CH2)9Br, R1 = R2 = R3 = groupe de formule (II-5) où R5 est -CH3, peut être synthétisé à partir du composé 22 tel qu'obtenu au point 3.6. ci-dessus.
Pour ce faire, le composé 22 (30 mq) est dissous dans 5 mL d'un mélange iréthanoi /iodomethane

(1/1, v/v) et le tout est chauffé à reflux pendant

18 heures. Le brut est ensuite évaporé et repris dans un minimum de méthane1. Une grande quantité d'éther est ajouté. Le précipité résultant est filtré et lavé à l'éther puis au pentane pour donner le composé 23 sous la forme d'une poudre rouge (Fdt: 82%).

3.8. 4- (N,N-b±s- (4- (2- (pyridin-4-yl) vinyl) ) -phényl) aminobenzoate de méthyle
Le composé titre ou composé 27, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, Ri = groupe espaceur -COOCH3, R2 = R3 = groupe de formule (III-5), est synthétisé à partir du 4-aminobenzoate de méthyle ou composé 24, qui est disponible commercialement, selon le schéma montré sur la figure 15.

Synthèse du 4- (N^N-diphénylamino) benzoate de méthyle ou composé 25
A une solution de composé 24 (500 mg, 3,31 mmol) dans du toluène sec (20 mL) , du carbonate de césium (1,6 g, 4,91 mmol), de l'acétate de palladium

(50 mg, 0,22 mmol), de la tris- tert-butylphosphine

(300 μl, à 10% dans de l'hexane, 0,15 mmol) et du bromobenzène (440 μl, 657,4 mg, 4,91 mmol) sont ajoutés sous azote. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 18 heures, puis les mêmes quantités de réactifs

(carbonate de césium, palladium et phosphine) sont de nouveau ajoutées et le mélange est à nouveau chauffé pendant 18 heures. A la fin de la réaction, le brut est filtré sur Celite et dilué à l'acétate d'éthyle. Les eaux-mères sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 85/15, v/v) . On obtient ainsi le composé 25 sous la forme d'une huile jaune qui cristallise après refroidissement à -4°C (Rdt : 91%).

Synthèse du 4- (N,N-bis- (4-bromophényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 26
A une solution de composé 25 (550 mg, 1,81 mmol) dans le chloroforme, du W-bromosuccinimide est ajouté (708 mg, 3,98 mmol) . La réaction est chauffée pendant 2 heures puis refroidie à température ambiante. Le brut réactionnel est alors lavé à l'eau puis à la saumure et séché sur sulfate de magnésium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice

(élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 85/15, v/v) . On isole le composé 26 sous la forme d'une poudre jaune

(Rdt : 98%) .

Synthèse du composé 27
A une solution de composé 26 (138 mg, 0,30 mmol) dans 15 mL d'un mélange TEA/DMF (2/1) sec et dégazé, on ajoute de la 4-vinylpyridine (94,6 mg, 0,90 mmol), de l'acétate de palladium (10 mg, 0,04 mmol) et de la tris o-tolylphosphine (40,7 mg, 0,13 mmol) sous azote. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 18 heures. A la fin de la réaction, le brut est filtré sur Celite et dilué à l'acétate d'éthyle. Les eaux-mères sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange dichlorométhane/ méthanol 95/5, v/v) . Le composé 27 est obtenu sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 59%) .

3.9. 4- (N,N-bis- (4- (2- (benzothiazol-2-yl) vinyl) ) -phényl) aminobenzoate de méthyle
Comme visible sur la figure 15, le composé titre ou composé 29, qui correspond au composé de formule générale (I) dans laquelle R4 = H, Ri = groupe espaceur -COOCH3, R2 = R3 = groupe de formule (III-6), peut être synthétisé à partir du composé 25 tel qu'obtenu au point 3.7. ci-dessus.

Synthèse du 4- (N,N-bis- (4-formylphényl) amino) benzoate de méthyle ou composé 28
Du DMF (2,9 ml, 37,5 mmol) est refroidi à 00C et du trichlorure de phosphoryle (POCl3, 3,7 ml, 40 mmol) est ajouté goutte-à-goutte sous atmosphère d'azote. Le mélange est agité pendant 1 heure à 00C. A ce mélange, on ajoute le composé 25 (500 mg, 1,6 mmol) lentement et le mélange est agité vigoureusement à 95°C pendant 4 heures. Après refroidissement, le mélange réactionnel est versé dans de la glace et neutralisé par addition de soude concentrée. Le mélange obtenu est extrait plusieurs fois au dichlorométhane . La phase organique est lavée à la saumure puis à l'eau et enfin séchée sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange n-hexane/AcOEt 75/25) . Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une poudre orange (Rdt : 35%) .

Synthèse du composé 29
Dans du THF sec (10 ml), on dissout du (benzothiazol-2-yl) méthyl) ] phosphonate de diéthyle (comme décrit dans J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7192-7198 [9] ; 175 mg, 0,61 mmol) , du NaH (50 mg, 1,25 mmol, dispersion à 60%) et une goutte d'éther-couronne 18-C-6. La solution rouge résultante est refroidie à 00C et une solution de composé 28 (100 mg, 0,28 mmol) dans du THF sec (5 ml) est ajoutée au goutte-à-goutte. Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. Puis, la réaction est arrêtée par ajout d'eau (2 mL) et diluée par du dichloro-méthane. Les phases organiques sont lavées à la saumure puis à l'eau et enfin séchées sur sulfate de sodium. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (élution avec un mélange AcOEt/AcOH, 99/1). Le composé 29 est obtenu sous la forme d'une poudre jaune (Rdt : 41%) .

Exemple 4 : Fonctionnalisation d'oligonucléotides

4.1. Fonctionnalisation par le composé 16 :
Un oligonucléotide présentant une fonction terminale, en position 3' ou 5 ' , de type thiophosphate et comportant des contre-ions de type ammonium (NH4+) est dissous dans une solution d' éther-couronne 18-C-6 dans le méthanol (préalablement traité par une résine chélatante) à hauteur approximativement de 20 DO par mL . Le composé 16 (environ 2 mg) est ajouté, et le mélange est vortexé puis agité à 35°C pendant 6 heures.
Le mélange est ensuite soumis à une procédure de purification en suivant le mode opératoire ci-après : le mélange est tout d'abord évaporé, repris par de l'eau (1 mL) et extrait plusieurs fois au dichlorométhane puis à l'acétate d'éthyle jusqu'à ce que les phases organiques restent incolores. Le solvant non-aqueux résiduel est chassé sous vide, et la solution aqueuse est diluée par NaCl IM dans un mL mélange eau/acétonitrile 5/1 (v/v) . Cette solution est purifiée sur colonne d'exclusion stérique (exclusion < 1000 Da) et la première fraction éluante colorée est récupérée. Si nécessaire, la fraction obtenue est purifiée par HPLC selon les procédures habituelles. Classiquement, la purification se fait en employant une colonne de type phase inverse (RP-18) et un système d'élution eau/acétonitrile ou eau/méthanol, de pH proche de 7 et comprenant un sel dissous (environ 0,1M) de type acétate de (trialkyl) ammonium. Les fractions isolées sont lyophilisées trois fois au minimum.

4.2. Fonctionnalisation par le composé 14 :
Un oligonucléotide comportant une fonction aminé primaire est dissous dans un tampon NaHCC>3 à 0,5% à pH 9.5 à hauteur de 10 DO pour 500 μL . Le composé 14 (environ 1 à 2 mg) en solution dans du DMF (environ 300 μL, préalablement purifié des impuretés aminées) est ajouté. Le mélange est agité pendant 24 heures à 35°C.
Le mélange est ensuite soumis à une procédure de purification identique à celle décrite au point 4.1. ci-dessus.

DOCUMENTS CITES

[1] Chung et al., J. Phys . Chem. B 1999, 103, 10741-10745
[2] Porrès et al., Organic Letters 2004, 6(1), 47-50
[3] Yang et al., Organic Letters 2004, 6(9), 1389-1392 [4] Yan et al., J. of Molecular Structure 2005, 733,

83-87
[5] Mac Laughin et al., J. Org. Chem. 1997, 62(3),

523-529
[6] Zongren et al., Org. Lett. 2004, 6, 2067-2070
[7] Kajigaeshi, Bull. Chem. Soc. Jpn . 1998, 61(2),

600-602
[8] Kubista et al., Biopolymers 1998, 46, 39-51
[9] J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7192-7198