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1. PT2185712 - CNS GENE DELIVERY USING PERIPHERAL ADMINISTRATION OF AAV VECTORS

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DESCRIÇÃO
"ADMINISTRAÇÃO DE GENES AO SNC USANDO A ADMINISTRAÇÃO
PERIFÉRICA DE VACTORES AAV"
A presente invenção refere-se a composições e métodos para a administração de proteínas terapêuticas para o SNC utilizando vectores AAV9 auto-complementares de cadeia dupla recombinantes. Mais especificamente, a invenção refere-se a composições e métodos para a administração de proteínas ao fluido cefalorraquidiano de mamíferos através da administração periférica de vectores AAV9 autocomplementares de cadeia dupla. A invenção pode ser utilizada para tratar vários distúrbios do sistema nervoso central, incluindo doenças degenerativas e doenças dos neurónios motores.
Antecedentes
A produção de longo prazo de proteínas terapêuticas nos ventrículos cerebrais representa uma abordagem reconhecida para a neuroprotecção em doenças do sistema nervoso central. Por exemplo, reportou-se que a administração intra-cerebroventricular (ICV) da proteína recombinante VEGF (factor de crescimento endotelial vascular) retardava a degeneração de neurónios motores num modelo de rato de esclerose lateral amiotrófica (ALS) {Storkebaum, 2005 # 22}. Neste estudo, o VEGF foi administrado aos ventrículos cerebrais por implantação estereotáxica de um cateter ligado a uma minibomba osmótica.
A injecção ICV de vectores de genes recombinantes é um modo conveniente para induzir a produção contínua de proteínas terapêuticas para o fluido cefalorraquidiano (CSF), através da transdução das células do plexo coróide e ependimais {Broekman, 2007 # 37}. Reportou-se que esta abordagem é eficaz para a correcção da neuropatologia em modelos animais de doenças lisossomais, por mediação da administração de genes de enzimas lisossomais para o cérebro. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a injecção ICV neonatal directa de um AAV expressando a βgalactosidase do ácido lisossomal foi capaz de mediar a administração da enzima para o cérebro e restaurar os níveis normais de glicoesfingolípidos {Broekman, 2007 # 48}.
A administração de proteínas no CSF representa, assim, uma abordagem eficaz para o tratamento de patologias do sistema nervoso central (SNC). No entanto, as técnicas existentes para conseguir tal administração exigem a injecção directa de vectores de genes para o cérebro e/ou cirurgia, e os riscos substanciais relacionados com a técnica de injecção (por exemplo, cirurgia intracraniana, infecções ou a inflamação devido à quebra da barreira hemato-encefálica, etc.), evitam as aplicações clínicas dessa estratégia.
O documento WO2005/056807 refere-se à identificação de AAV bovino e propõe a sua utilização para a administração de genes in vivo, incluindo para o tratamento de distúrbios do SNC. Este pedido inclui uma discussão da propriedade de transcitose (isto é, transporte membranar activo) de AAV através da barreira epitelial. Sugere-se a possibilidade de obtenção de administração de genes do SNC, quer através de injecção ou transplante ex vivo de células modificadas por AAV, ou através de injecção directa in vivo dos vectores. No entanto, a aplicação é baseada em experiências in vitro que mostram a infecção por AAV bovino e AAV4 de células endoteliais primárias de bovinos em cultura.
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a novas composições e métodos para a administração de proteínas terapêuticas ao SNC utilizando vectores de AAV recombinantes. Mais especificamente, a invenção refere-se a composições e métodos para a administração de proteínas ao fluido cefalorraquidiano de mamíferos através da administração periférica de vectores de AAV9 auto-complementares de cadeia dupla.
Um objecto da presente invenção refere-se mais especificamente à utilização de um vector AAV que codifica para uma proteína terapêutica para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio do SNC num indivíduo, em que o referido vector AAV é administrado por injecção periférica ao referido indivíduo, permitindo a referida injecção a infecção de células do cérebro secretoras de líquido cefalorraquidiano (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) e secreção subsequente da proteína terapêutica no fluido cefalorraquidiano, em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Um outro objecto da presente invenção refere-se à utilização de um vector de AAV para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem do SNC através da secreção da referida proteína terapêutica no fluido cefalorraquidiano após a injecção periférica do referido vector, em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Um outro objecto da presente invenção refere-se à utilização de um vector de AAV para o fabrico de um medicamento para a secreção de uma proteína no fluido cefalorraquidiano de um indivíduo por injecção periférica do referido vector sob condições que permitem a infecção de células secretoras de fluido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea), em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
A invenção também se relaciona com a utilização de um vector de AAV para o fabrico de um medicamento para a expressão de uma proteína recombinante em células secretoras de fluido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) de um indivíduo, em que o referido vector é administrado ao indivíduo, por injecção periférica, em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Ainda um outro objecto da presente invenção é um método de administração de uma proteína para o fluido cefalorraquidiano de um sujeito, compreendendo o método a administração periférica ao referido indivíduo de um vector AAV que codifica para a referida proteína, permitindo a referida administração periférica a infecção de células secretoras de fluido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) no referido indivíduo e secreção da referida proteína no líquido cefalorraquidiano, em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Um outro objecto da presente invenção é um método para a infecção de células secretoras de fluido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) de um indivíduo, compreendendo a administração periférica ao indivíduo de uma quantidade de um vector AAV eficaz para infectar essas células, e em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Um outro objecto da presente invenção é um método de tratamento de um distúrbio do SNC num indivíduo através da administração de uma proteína terapêutica para o fluido cefalorraquidiano do referido indivíduo, compreendendo o método a administração periférica ao indivíduo de uma quantidade de um vector AAV que codifica para a referida proteína eficaz para permitir a infecção de células secretoras de líquido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) pelos referidos vectores AAV no indivíduo, causando a referida infecção a expressão da proteína terapêutica codificada no fluido cefalorraquidiano e tratamento do referido distúrbio, e em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV autocomplementar de cadeia dupla.
Um outro objecto da presente invenção é uma melhoria aos métodos de tratamento de um distúrbio do SNC num indivíduo através da administração de uma proteína terapêutica ao fluido cefalorraquidiano do referido indivíduo, compreendendo esse aperfeiçoamento a administração da referida proteína terapêutica através de administração periférica ao indivíduo de um vector AAV numa quantidade eficaz para provocar a infecção de células secretoras de fluido cefalorraquidiano do cérebro (por exemplo, as células epiteliais do plexo coróide das e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea), em que o referido vector AAV é um vector AAV9 de serotipo humano, e em que o vector AAV é um vector AAV auto-complementar de cadeia dupla.
Tal como será descrito no presente pedido, a presente invenção representa um meio seguro e conveniente de administrar proteínas terapêuticas para o SNC através da sua secreção para o CSF. A invenção é adequada para a administração de qualquer proteína terapêutica, em qualquer mamífero, incluindo seres humanos, para o tratamento de várias condições do SNC.
Legenda das Figuras
Figura 1. Administração genética generalizada ao sistema nervoso central (SNC) e aos músculos de ratos neonatais após a injecção intramuscular com diferentes serotipos e genomas de vectores AAV. As secções representativas que apresentam coloração histoquímica mSEAP de cada grupo (n = 3 ratos/grupo) (A) Secções transversais dos músculos gastrocnémios injectados com AAV (B) Vistas ampliadas do plexo coróide do terceiro ventrículo de ratos injectados com AAV e um controlo não injectado (C) Visualização ampliada dos vasos sanguíneos no cérebro e da medula espinhal de ratinhos injectados com scAAV9. PN4, pós-natal 4; PN8, pós-natal 8; ss, cadeia simples; sc: auto-complementar. (D) Comparação da eficiência de transdução no cérebro de ratinhos injectados com AVV por via i.p. (3.10e9 vg). Secções de cérebro ilustrativas de ratinhos injectados por via i.p. com os 4 vectores AAV. As secções foram tratadas para histoquímica mSEAP. Foi detectada uma expressão mSEAP muito intensa no plexo coróide de ratinhos injectados com scAAV9. Uma actividade quase similar foi detectada no plexo coróide de ratinhos injectados com ssAAV1, scAAV1 e ssAAV9.
Figura 2. Administração genética generalizada ao SNC e aos músculos de ratos neonatais após a injecção intraperitoneal com vectores sc- e ssAAV9. Secções representativas que mostram a coloração histoquímica mSEAP em (A) músculos, e (B) coróides. As setas e as pontas de setas mostram células epiteliais transduzidas dos coróide e do epêndima, respectivamente, no rato injectado com AAV.
Figura 3. Expressão da GFP no SNC de ratinhos neonatais de sete dias após a injecção intraperitoneal de scAA9-GFP. Fotomicrografias representativas de secções histológicas do cérebro e da espinal medula que mostram imunocoloração por GFP. A expressão do transgene foi detectada no (A, B) plexo coróide, (A, C) no hipocampo (a seta e a ponta de seta indicam células com morfologia glial e neuronal, respectivamente), (D) o córtex entorrinal (as setas indicam células com uma morfologia neuronal típica) e (E) o tracto corticospinal (ao nível da decussação piramidal na medula espinhal cervical).
Figura 4. Fotomicrografias representativas de expressão da GFP no CNS de ratinhos neonatais após injecção intramuscular de vectores de expressão GFP-scAAV9. As secções histológicas do cérebro e da medula espinhal foram tratadas com imunocoloração de GFP sete dias após a injecção. A expressão do transgene foi detectada nas (A) células epiteliais do plexo coróide (seta) e no epêndima (pontas de seta), nas (B) células neuronais no septo (setas) e nas (C) fibras do tracto corticospinal na medula espinhal (setas).
Figura 5. Expressão da GFP no SNC de ratinhos neonatais de sete dias após a injecção intravenosa de vectores scAAV9. Fotomicrografias representativas de secções histológicas do cérebro tratadas para a imunocoloração com GFP. Células positivas para GFP foram detectadas nas (A) células epiteliais do plexo coróide (seta) e do epêndima (pontas de seta), nas (B) células neuronais do córtex entorrinal, nas (C, D) células semelhantes a neurónios e semelhantes a células gliais do hipocampo.
Descrição detalhada da invenção
Descreve-se aqui um novo processo de transferência de genes para a administração de proteínas terapêuticas para o SNC por meio de injecção periférica de vectores de genes AAV. Este método baseia-se na administração de transgenes para células secretoras do fluido cefalorraquidiano do cérebro (ou seja, populações de células ou tipos que, no interior do cérebro, permitem a secreção de um produto para o fluido cefalorraquidiano, tais como as células epiteliais do plexo coróide e/ou do epêndima e/ou uma membrana meníngea) através da administração periférica de vectores de genes de AAV recombinantes, que permite a secreção das proteínas terapêuticas codificadas para o CSF.
Tal como divulgado nos exemplos, foi analisada a distribuição da expressão do transgene após a administração periférica (por exemplo, injecções i.m., i.p., ou i.v.) de vectores AAV de cadeia simples (ss) ou auto-complementar de cadeia dupla (sc) recombinantes em ratinhos C57B1/6 neonatais e adultos. Estes vectores expressaram quer a fosfatase alcalina secretada murina (SEAP) ou a proteína fluorescente verde (GFP), sob o controlo do promotor de CMV. Os resultados apresentados na secção experimental mostram, surpreendentemente, que, após a injecção ou as injecções periféricas em ratinhos neonatais, de AAV9-GFP convencional ou auto-complementar em ratinhos neonatais, se detecta um nível de expressão elevado do transgene no plexo coróide e nas células do epêndima, bem como em membranas meníngicas. Verificou-se que a eficiência de transdução era aumentada após a injecção periférica no rato adulto de cargas altamente concentradas de scAAV9. Após a administração sistémica tanto de AAV9 como AAV1 que expressam mSEAP em ratinhos adultos, verificou-se um aumento significativo na actividade de mSEAP nas amostras de tecido do SNC. A expressão de mSEAP foi também detectada no plexo coróide de ratinhos injectados com ssAAV9 e AAV1 (ss e sc), tal como observado em secções de cérebro tratadas para histoquímica com mSEAP (Figura 1D).
Tal administração periférica de vectores de AAV recombinantes permite o direccionamento e a secreção de longo prazo de proteínas terapêuticas no CSF. A injecção i.v. de um scAAV9 que codifica para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em ratinhos neonatais permitiu a produção da proteína secretada no SNC até 5 meses após a injecção (altura do último exame). Esta estratégia de transferência de genes representa, portanto, um procedimento eficaz e não invasivo para alcançar o SNC, o que permite evitar os riscos associados com o procedimento de cirurgia e contornando o problema da barreira hemato-encefálica. A presente invenção tem, assim, muitas implicações e utilidades no tratamento de perturbações do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas e doenças dos neurónios motores.
Vectores  AAV
No contexto da presente invenção, o termo "vector AAV" designa qualquer vector que compreenda ou derive de componentes de AAV e seja adequado para infectar células de mamífero, de preferência células humanas. O termo vector AAV tipicamente designa uma partícula viral (ou virião) de tipo AAV que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína terapêutica. Como será discutido abaixo, o AAV pode ser derivado a partir de vários serotipos, incluindo combinações dos serotipos (isto é, AAV "pseudotipado") ou a partir de vários genomas (por exemplo, de cadeia simples ou auto-complementar). Além disso, o vector de AAV pode ser deficiente para replicação e/ou dirigido.
Um vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus dependente, com um tamanho de cerca de vinte nanómetros. Como outros parvovírus, o AAV é um vírus de cadeia simples de ADN, sem envelope, com um genoma de aproximadamente 5000 nucleótidos, contendo duas grelhas de leitura abertas. A grelha de leitura aberta da esquerda codifica para as proteínas responsáveis pela replicação (Rep), enquanto que a grelha de leitura aberta da direita codifica para as proteínas estruturais da cápside (Cap). As grelhas de leitura aberta são flanqueadas por duas sequências ITR, que servem como a origem de replicação do genoma viral. Além disso, o genoma contém também uma sequência de empacotamento, permitindo o empacotamento do genoma viral numa cápside de AAV.
O AAV requer funções de coadjuvantes (que podem ser fornecidas por, por exemplo, um adenovírus, ou por células de empacotamento ou plasmídeos auxiliares adequados) para permitir uma infecção produtiva em células em cultura. Na ausência de tais funções adjuvantes, os viriões de AAV essencialmente entram nas células, migram para o núcleo como uma molécula de ADN de cadeia simples, e integram-se no genoma das células. O AAV tem uma ampla gama de hospedeiros que consegue infectar, incluindo células humanas, é ubíquo em humanos, e é totalmente não patogénico.
Os vectores de AAV foram concebidos, produzidos e utilizados para mediar a administração de genes em seres humanos, incluindo para fins terapêuticos. Estão presentemente em curso ensaios clínicos em vários países que utilizam vectores AAV. Tipicamente, os vectores de AAV para utilização na transferência de genes compreendem uma genoma de AAV com replicação defeituosa sem sequências virais codificantes funcionais para Rep e Cap. Tais vectores AAV de replicação defeituosa mais preferentemente não têm a maioria ou nenhuma das sequências de codificação para Rep e Cap, e essencialmente retêm uma ou duas sequências ITR de AAV e uma sequência de empacotamento.
Foram divulgados métodos para a produção de tais vectores AAV na literatura, incluindo a utilização de células de empacotamento, vírus ou plasmídeos auxiliares, e/ou sistemas de baculovírus (Samulski et al, (1989) J. Virology 63, 3822; Xiao et al, (1998) J. Virology 72, 2224; Inoue et al, (1998) J. Virol. 72,7024; WO98/22607; WO2005/072364). Também foram reportados métodos de produção de vectores AAV pseudotipados (por exemplo, WO00/28004), bem como várias modificações ou formulações de vectores AAV, para reduzir a sua imunogenicidade após a administração in vivo (ver, por exemplo, WO01/23001; WO00/73316; WO04/112727; WO05/005610; WO99/06562).
Os vectores AAV podem ser preparados ou derivados de diferentes serotipos de AAV, os quais podem ser ainda misturados entre si ou com outros tipos de vírus para produzir vírus AAV quiméricos (por exemplo pseudotipados).
Numa forma de realização particular, o vector AAV para utilização na presente divulgação é um vector AAV de serotipo humano. Tal AAV humano pode ser derivado a partir de qualquer serotipo conhecido, por exemplo, a partir de qualquer um dos serotipos 1-11, mais preferencialmente de AAV1, AAV2, AAV4, AAV6 e AAV9. Exemplos específicos de tais vectores AAV são vectores compreendendo um genoma derivado de AAV1 (uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma ITR derivada de AAV1 e uma sequência de empacotamento de derivada de AAV1, operativamente ligada a um ácido nucleico que codifica para uma proteína terapêutica, preferência duas ITR derivadas de AAV1 flanqueando uma sequência de empacotamento derivada de AAV1 e um ácido nucleico que codifica para uma proteína terapêutica) numa cápside derivada de AAV1s; e vectores compreendendo genoma de AAV2-derivado numa cápside derivada de AAV2; vectores compreendendo um genoma derivado de AAV4 numa cápside derivada de AAV4; e vectores compreendendo genoma derivado de AAV6 numa cápside derivada de AAV6 ou vectores compreendendo genoma derivado de AAV9 numa cápside derivada de AAV9.
Numa outra forma de realização particular, o vector AAV é um vector AAV pseudotipado, isto é, compreende sequências ou componentes provenientes de pelo menos dois serotipos distintos de AAV. Numa forma de realização particular, o vector AAV pseudotipado compreende um genoma de AAV derivado de um serotipo de AAV, e de uma cápside derivada, pelo menos em parte, de um serotipo de AAV distinto. Exemplos específicos de tais vectores de AAV pseudotipados incluem, sem limitação, vectores compreendendo um genoma derivado de AAV2 numa cápside derivada de AAV1; ou vectores compreendendo um genoma derivado de AAV2 numa cápside derivada de AAV6; ou vectores compreendendo um genoma derivado de AAV2 numa cápside derivada de AAV4 ou vectores compreendendo um genoma derivado de AAV2 numa cápside derivada de AAV9.
Numa outra forma de realização particular, que pode ser combinada com qualquer uma das formas de realização acima, o vector AAV pode compreender um cápside modificada, incluindo proteínas ou péptidos de origem não viral ou estruturalmente modificados, para alterar o tropismo do vector. Como um exemplo particular, a cápside pode incluir um ligando de um receptor particular, ou um receptor de um ligando particular, para dirigir o vector para tipo(s) de células que expressam o referido receptor ou o ligando, respectivamente.
Nos vectores AAV utilizados na presente divulgação, o genoma de AAV pode ser ou um único ácido nucleico em cadeia simples ou um ácido nucleico auto-complementar de cadeia dupla (McCarty et al., Gene Therapy, 2001). Na presente invenção, o genoma AAV do vector AAV é um ácido nucleico auto-complementar de cadeia dupla.
Como discutido acima, o genoma derivado de AAV compreende derivados de um ácido nucleico que codifica para uma proteína terapêutica. Tipicamente, o ácido nucleico compreende igualmente sequências reguladoras permitindo a expressão e, preferentemente, a secreção da proteína codificada, tal como, por exemplo, um promotor, potenciador, sinal de poliadenilação, sítios de entrada de ribossoma internos (IRES), sequências que codificam para domínios de transdução de proteína (PTD), e similares. A este respeito, o ácido nucleico compreende mais preferentemente, uma região promotora, ligada operacionalmente à sequência codificadora, para causar ou melhorar a expressão da proteína terapêutica em células infectadas. Um tal promotor pode ser ubíquo, específico para o tecido, forte, fraco, regulado, quimérico, etc., para permitir a produção eficiente e adequada da proteína no tecido infectado. O promotor pode ser homólogo à proteína codificada, ou heterólogo, incluindo promotores celulares, virais, fúngicos, vegetais ou promotores sintéticos. A maioria dos promotores preferidos para utilização na presente invenção devem ser funcionais nas células humanas, especialmente nas células epiteliais humanas, mais preferencialmente no plexo coróide ou nas células de epêndima. Exemplos de tais promotores regulados incluem, sem limitação, promotores contendo o elemento promotor/repressor Tet, promotores indutíveis pela rapamicina e promotores de metalotioneina. Exemplos de promotores específicos para as células epiteliais do plexo coróide ou células de epêndima incluem aquelas da aquaporina 1 (AQP1) ou do homólogo HNF-3/" fork head" (HPH-4) ou do factor de crescimento II semelhante à insulina. Exemplos de promotores ubíquos incluem promotores virais, em particular o promotor de CMV, o promotor de RSV, o promotor de SV40, etc., e os promotores celulares, tais como o promotor de PGK (fosfoglicerato cinase).
Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico compreende uma sequência de líder que permite a secreção da proteína codificada. A fusão do transgene de interesse com uma sequência que codifica para um péptido de sinal de secreção (geralmente localizado na extremidade N-terminal de polipéptidos secretados) vai permitir que a produção da proteína terapêutica sob uma forma que pode ser secretada a partir da célula transduzida no CSF. Exemplos de tais péptidos de sinal incluem a albumina, a βglucuronidase, a protease alcalina ou os péptidos de sinal de secreção da fibronectina.
De acordo com uma outra forma de realização específica, o transgene é fundido com sequências PTD, tais como as sequências VP22 ou Tat, de modo a causar ou melhorar a secreção da proteína terapêutica das células transduzidas e re-assimilação pelas células vizinhas.
Numa forma de realização particular, o ácido nucleico compreende, um ligante operativo, um promotor e uma sequência líder, para permitir a expressão e secreção da proteína codificada.
Numa outra forma de realização particular, o ácido nucleico compreende, um ligante operativo, um promotor e uma sequência líder e uma sequência PTD, para permitir a expressão e secreção da proteína codificada.
Numa forma de realização mais preferida, o promotor é específico para as células epiteliais do plexo coróide ou do epêndima, isto é, permite a expressão preferencial do transgene nas referidas células.
Como discutido acima, os vectores AAV podem ser produzidos por técnicas conhecidas per se na técnica, como mais ilustrado nos exemplos.
Administração  periférica
A invenção baseia-se na demonstração de que a expressão eficaz e a longo prazo de proteínas no CSF pode ser conseguida com técnicas não-invasivas, através de administração periférica de vectores AAV. Tal administração periférica inclui, sem limitação, qualquer via de administração que não implique a injecção directa no cérebro. Mais particularmente, a administração periférica compreende injecções sistémicas, tais como intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intraarterial, subcutânea ou transdérmica. A administração periférica também inclui a administração oral de vectores AAV (WO96/40954), utilizando implantes de administração (WO01/91803), ou a administração por instilação através do sistema respiratório, por exemplo, utilizando pulverizadores, aerossóis ou quaisquer outras formulações adequadas.
A administração periférica mais preferida inclui a injecção periférica, em particular injecção sistémica, mais preferencialmente injecção i.m., i.p. ou i.v. injecção.
As doses de vectores AAV podem ser facilmente adaptadas pelo perito na técnica, por exemplo, dependendo da condição da doença, do indivíduo, do esquema de tratamento, etc. Tipicamente, são administrados por dose desde 10 5 a 10 14 genomas virais (unidades de transdução), tipicamente de 10 5 a 10 12, de 10 6 a 10 11, de 10 7 a 10 11, de 10 8 a 10 11. Exemplos de doses para alcançar efeitos terapêuticos são títulos de vírus de pelo menos cerca de 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, 10 10 ou 10 11 unidades de transdução ou mais, preferivelmente cerca de 10 10 e 10 13. Uma dose eficaz preferida mo contexto desta invenção é uma dose que permite a infecção de células do plexo coróide ou do epêndima.
O vector de AAV pode ser administrada em qualquer forma adequada, seja como uma solução ou suspensão líquida, tal como uma forma sólida adequada para solução ou suspensão em líquido antes da injecção, tal como um gel ou como uma emulsão. Os vectores AAV são tipicamente formulados com qualquer excipiente, veículo, adjuvante, diluente, etc apropriado e farmaceuticamente aceitável. Para injecção, o excipiente pode ser um líquido, solução isotónica, tampão, tais como água estéril e isenta de pirogénios ou numa solução salina tamponada com fosfato estéril e isenta de pirogénios. Para inalação, o excipiente pode ser na forma de partículas.
Os vectores AAV são tipicamente administrados numa quantidade "terapeuticamente eficaz", ou seja, numa quantidade que é suficiente para aliviar (por exemplo, diminuir, reduzir) pelo menos um dos sintomas associados com o estado de doença, ou para proporcionar uma melhoria na condição do indivíduo. Deve salientar-se que podem ser realizadas administrações repetidas, se necessário, utilizando quer a mesma ou diferentes vias de administração periférica e/ou o mesmo ou diferentes serotipos de AAV.
Distúrbio  do SNC
A invenção pode ser usada para tratar uma variedade de distúrbios através da administração de um produto terapêutico para o CSF. O produto terapêutico pode ser qualquer proteína, péptido ou ARN que possa aliviar ou reduzir os sintomas que resultam de uma ausência ou deficiência numa proteína numa célula ou num indivíduo ou que de outro modo confere um benefício a um indivíduo. Exemplos de proteínas terapêuticas incluem factores de crescimento, citocinas, hormonas, neurotransmissores, enzimas, factores anti-apoptóticos, factores angiogénicos, bem como qualquer proteína que se saiba ser mutada em distúrbios patológicos tais como a proteína de "sobrevivência do neurónio motor" (SMN).
Dependendo do produto terapêutico, a invenção pode ser utilizada para tratar várias doenças, incluindo qualquer doença que possa ser tratada ou prevenida pela expressão de proteínas terapêuticas no tecido nervoso. Tais doenças incluem doenças do SNC, de um modo preferido seleccionadas de doenças neurodegenerativas, doenças neuromusculares, doenças lisossomais, trauma, lesões da medula óssea, cancros do sistema nervoso, doenças desmielinizantes, doenças auto-imunes do sistema nervoso, síndromes neurotóxicas, distúrbios do sono.
Exemplos específicos de doenças incluem a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, doença de Sly, doença de Hunter, demência, paranóia, distúrbio obsessivo compulsivo, dificuldades de aprendizagem, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Kennedy, glioblastoma, neuroblastoma, autismo, doença de Gaucher, doença de Hurler, doença de Krabbe e comportamentos alterados (por exemplo, distúrbios no sono, percepção ou cognição).
A invenção pode ser utilizada em qualquer mamífero, particularmente em seres humanos, incluindo adultos, para o tratamento preventivo ou curativo.
Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão revelados na seguinte secção experimental, que deve ser considerada apenas como ilustrativo, e não limitativa do âmbito do presente pedido.
Exemplos
1.  Materiais e métodos
1.1.  Produção dos vectores AAV recombinantes {Riviere, 2006 #39}
Geraram-se vectores ssAAV de serotipo 1 e 9 convencionais de cadeia simples (ss) e auto-complementar de cadeia dupla (sc) por empacotamento de genomas AAV2 em cápsides AAV1 e 9. Resumidamente, os vectores foram produzidos utilizando uma transfecção de três plasmídeo sem vírus auxiliar com (1) o plasmídeo de adenovírus auxiliar (2) o plasmídeo de empacotamento de AAV que codifica para os genes rep e cap (3) o plasmídeo vector AAV2 contendo mSEAP ou GFP (sob controlo do promotor de citomegalovírus) como genoma ss ou sc. Este último plasmídeo foi construído através da deleção das sequências "D" e do local de resolução (TRS) na extremidade 5' do genoma {Veron, 2007 #40}.
Os vectores recombinantes foram purificados por dupla ultracentrifugação em CsCl seguida de diálise contra solução salina de tampão fosfato. As partículas físicas foram quantificadas por Taqman e os títulos dos vectores foram expressos como genoma viral (vg) por mL.
1.2.  Animais
Ratinhos C57B1/6 prenhes foram adquiridos a Charles River Laboratories (Les Oncins, França) e recémnascidos foram injectados no dia do nascimento (PN1). Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as orientações Europeias para o cuidado humano e para a utilização de animais experimentais.
1.3.  Injecções in vivo dos vectores AAV
-  Injecções intramusculares:
Soluções de vector AAV (ssAAV1 (n = 2), ssAAV9 (n = 2), scAAV1 (n = 2) ou scAAV9 (n = 3) que codificam para mSEAP ou GFP foram injectadas em ambos os tricípites e músculos gastrocnémios em ratinhos C57B16 com um dia de idade (1 local de injecção por músculo, 5 microlitros por injecção, 8.10 +9 para 2.10 +10 de genoma viral por ratinho).
-  Injecções intraperitoneais:
As soluções virais (ssAAV1, n = 2, ssAAV9, n = 1 scAAV1, n = 1 e scAAV9, n = 2) que codificam para mSEAP ou GFP foram injectadas na cavidade peritoneal de ratinhos C57B16 com um dia de idade (100 µl, 3.10 +10 a 10 +11 de genoma viral por ratinho).
-  Injecções intravenosas:
As soluções virais (scAAV9-GFP, n = 3) foram injectadas na veia temporal dos ratos C57B16 com um dia de idade (50 µL, 1,5.10 +10 de genoma viral por ratinho).
1.4.  Avaliação da expressão do transgene
Histoquímica  mSEAP:
Músculos, cérebros e medulas espinhais foram removidas a um (PN2), três (PN4) ou sete (PN8) dias pósinjecção, congelados em isopentano frio (-50ºC), e mantidos a -80ºC para utilização extemporânea.
Secções de tecido com uma espessura de 16μm para o cérebro e a medula espinhal, e uma espessura de 8 µm para os músculos foram preparadas num criostato e subsequentemente processadas para a expressão do transgene. As secções foram lavadas com PBS e inactivou-se pelo calor a fosfatase alcalina endógena durante 30 min a 65ºC. As secções foram então incubadas durante a noite a 37ºC em 0,165 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo e 0,33 mg/mL de azul de nitrotetrazólio em 100 mM de Tris-HCl, NaCl a 100 mM e MgCl 2 a 50 mM, contrastadas com hematoxilina-eosina, e montadas com Eukit.
I muno-histoquímica   GFP:
Músculos, cérebros e medulas espinhais foram removidos a um, três ou sete dias após a injecção e fixados durante 4 h com paraformaldeído a 4% em PBS. Os tecidos foram então crioprotegidos durante a noite a 4ºC em 15% de sacarose para cérebros e músculos, e 30% de sacarose para a espinal medula e, em seguida, congelados em isopentano frio (-50ºC). Cortaram-se secções em série num criostato e armazenaram-se a -80ºC para análise posterior.
As secções foram lavadas em PBS e incubadas durante 30 minutos numa solução de peróxido de hidrogénio (solução Peroxydase-Bolcking, Dako) para inibição das peroxidases endógenas. Após lavagem em PBS, as secções foram bloqueadas durante uma hora à temperatura ambiente em PBS com 10% de soro de cabra (Dako) e 0,4% de Triton e, em seguida, incubadas durante a noite com um anticorpo policlonal de coelho anti-GFP (Abcam; 1/3000). Usou-se um anticorpo secundário conjugado com biotina (Vectastain 1:200) e o kit Vectastain Elite ABC, e a coloração DAB foi revelada com o kit de substrato DAB para peroxidase de Vector Laboratories. As secções foram desidratadas em álcool e xileno, e montadas com Eukit.
1.5.  Ensaio de quantificação de mSEAP
Os tecidos congelados foram lisados em 700 µL de tampão de lise de núcleos incluídos no kit de extracção de ADN genómico Wizard (Promega Corporation, Madison, WI) contendo um cocktail de inibidores de protéase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Os tecidos foram primeiro homogeneizados durante 30 s com um Ultra-Turrax e depois foram submetidos a três homogeneizações sucessivas para se conseguir a lise completa. As membranas os detritos celulares foram sedimentados por centrifugação durante 2 minutos a 10000 g a 4ºC. A actividade de mSEAP foi medida no sobrenadante usando um ensaio quimioluminescente. Brevemente, as fosfatases alcalinas endógenas foram inactivadas pelo calor durante 5 min a 65ºC e a mSEAP resistente ao calor foi medida através da adição do tampão de reacção e do substrato quimioluminescente CPSD, de acordo com as instruções do fabricante (Tropix, Applied Biosystems, Forster City, EUA). A quimioluminescência foi quantificada usando um luminómetro (Perkin Elmer, Walthan, MA, EUA). Os níveis de expressão foram expressos como ng de mSEAP por lisado de acordo com uma curva de calibração de fosfatase alcalina de placenta humana purificada e são normalizados por µg de proteína usando um ensaio de quantificação de proteína nano-laranja® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
1.6.  Análise de VEGF por ELISA
A análise quantitativa dos níveis de VEGF foi realizada usando um kit de imunoensaio de VEGF de ratinho (Quantikine, R&D systems). 5 meses após a injecção de scAAV-VEGF, os animais foram profundamente anestesiados com pentobarbital e sacrificados por decapitação. Removeram-se amostras de tecidos e congelaram-se a -80ºC. Os tecidos foram homogeneizados em tampão TSAI (50 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,1% de NP40, 5 mM de DTT, 10 mM de NaF) contendo um cocktail de inibidores de protéase (Complete mini, Roche) usando um pistilo motorizado do sedimento para o cérebro e a medula espinhal, e um Ultra-Turrax para coração e fígado. Os lisados foram então centrifugados 20 min a 4ºC, os sobrenadantes foram recolhidos e realizou-se um ELISA usando o protocolo do fabricante. A concentração de proteína foi avaliada usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce).
2.  Injecções intramusculares de AAV expressando mSEAP
Os ssAAV1 ssAAV9, scAAV1 ou scAAV9 que codificam para mSEAP foram injectados em ambos os músculos tricípites e gastrocnémio em ratinhos C57B16 com um dia de idade (8.10 +9 a 2.10 +10 de genoma viral por ratinho). Os músculos, cérebros e medulas espinais injectadas foram removidas um, três ou sete dias após a injecção, e a expressão mSEAP foi determinada através de histoquímica (ver materiais e métodos).
A expressão de mSEAP foi detectada nos músculos a partir de 3 dias após a injecção de cada um dos serotipos de AAV, quer convencional ou auto-complementar (excepto com ssAAV9), com um aumento substancial do nível de expressão com o tempo (Figura 1 A).
A expressão do transgene foi também detectado no SNC após administração i.m. injecção de scAAV9 e, de forma interessante, a expressão foi especificamente detectada nas células do plexo coróide e ependimais (Figura 1 B), que são um epitélio altamente especializado na secreção e na eliminação de muitas proteínas e toxinas no CSF {Redzic, 2005 # 38 }. A expressão de mSEAP no SNC foi observada logo 3 dias após a injecção quando se usou scAAV9, e os níveis de expressão de novo aumentaram com o tempo. Uma expressão fraca foi observada com AAV1sc, mas poderia ser devido a coloração não específica da mSEAP endógena.
Uma fraca expressão do transgene foi também detectada na medula espinal após a injecção i.m. do vector scAAV9. Neste caso, a coloração mSEAP foi quase visível e à volta de vasos sanguíneos do parênquima espinal (Figura 1 C).
3-  Injecções intraperitoneais de AAV expressando mSEAP
ssAAV1 ssAAV9, scAAV1 e scAAV9 foram injectados por via intraperitoneal em ratinhos C57B16 de um dia de idade (100 µL, 3,10 +10 a 1,10 +11 de genoma viral por ratinho) e a expressão do transgene foi avaliada no músculo ou tecido do SNC a 1, 3 ou 7 dias após a injecção.
Foi observada expressão mSEAP tanto nas fibras musculares e nas células do plexo coróide e do epêndima tão cedo como 3 dias após a injecção de scAAV9, o que aumentou consideravelmente a 7 dias após a injecção (Figura 2). A expressão do transgene foi também observada no interior dos vasos sanguíneos, tanto no cérebro como ao longo da medula espinal.
4-  Expressão do transgene no SNC depois da injecção periférica de AAV-GFP
Para determinar se a expressão mSEAP observada no plexo coróide (após injecção i.p. e i.m. de scAAV9 recombinante) resultou da difusão de proteínas ou da expressão do transgene nas células do plexo coróide, analisou-se o padrão de expressão da proteína fluorescente verde (GFP), uma proteína não secretada, 7 dias após a injecção periférica do vector de AAV correspondente em ratinhos neonatais.
Após injecção i.p. (100 µl, 3,10 +10 vg) e i.m. (5 µl por músculo, 8,10 +9 vg) de scAAV9-GFP, células GFP-imunorreactivas foram observadas tanto nas células do plexo coróide como nas células do epêndima (Fig. 3A, B e Fig. 4A). De forma importante, observou-se uma forte expressão de GFP em muitas células do cérebro, por exemplo, localizadas no hipocampo (Fig. 3A, C), no córtex entorrinal (Fig. 3D) ou no septo (Fig. 4B). Observou-se um maior número de células GFP-imunopositivas após injecção i.p. do que após injecção i.m., mas isto pode ser devido ao maior título de vector utilizado no procedimento i.p.. São necessários dados adicionais para confirmar esta observação.
Uma expressão de GFP particularmente elevada foi encontrado no hipocampo, provavelmente devido à sua localização perto dos ventrículos cerebrais e à difusão preferencial dos vectores através da barreira hematoencefálica ao nível do plexo coróide. Interessantemente, células neuronais altamente transduzidas foram também observadas no córtex entorrinal, provavelmente resultante do transporte axonal retrógrado dos vectores AAV a partir do hipocampo. A presença de células neuronais transduzidas no septo também pode resultar de mecanismos de transporte axonal semelhantes.
A expressão de GFP foi ainda detectada nos vasos sanguíneos por todo o cérebro e na medula espinhal.
Muitas fibras positivas para GFP foram também observadas nas células neuronais que enervam a matéria cinzenta espinhal (que foram identificadas usando imunocoloração GFP/NeuN). Estas fibras provavelmente são originárias do gânglio da raiz dorsal que também se revelou fortemente positivo (Fig. 3E e 4C).
5-  Injecções intravenosas de AAV expressando GFP em ratinhos neonatos:
Um vector scAAV9 que expressa GFP foi injectado por via intravenosa na veia temporal dos ratinhos C57B16 com um dia de idade (50 µL, 1,5.10 +10 genoma viral por ratinho) e a expressão do transgene foi analisada 7 dias pós-injecção usando imuno-histoquímica contra GFP.
A análise imuno-histoquímica de secções de tecido do cérebro revelou uma forte expressão de GFP em ambas as células do plexo coróide e do epêndima (Fig. 5A), e nos vasos sanguíneos do cérebro. De novo, observou-se a expressão da GFP nas células do cérebro, tanto como fenótipo semelhante a neurónio e um fenótipo semelhante a glia, situado por exemplo no hipocampo ou do córtex entorrinal (Fig.5B-D) .
Resultados semelhantes foram obtidos quando os vectores ssAAV9-GFP foram injectados intravenosamente em ratinhos neonatais com um dia de idade. Neste caso, a análise da expressão foi realizada às 3 semanas após as injecções de AAV, o que é o tempo necessário para a conversão do genoma em ADN de cadeia dupla.
6-   Actividade mSEAP em tecidos de ratinhos adultos injectados com AAV por via i.v.
A formação da BHE é incompleta em ratinhos neonatais. Deste modo, investigou-se se a transferência de genes do SNC em ratinhos recém nascidos era preservada em adultos. Injectaram-se diferentes serotipos (AAV1 e AAV9) de AAV que expressam mSEAP na veia da cauda de ratinhos adultos com doses crescentes de vector (3x10 11 a 2x10 12 vg em 500µL por ratinho) e a dose de 1x10 12 vg de scAAV-mSEAP resultou na transdução eficiente de vasos do cérebro e de células epiteliais do plexo coróide. A eficiência da transdução das células foi de novo superior para vectores de cadeia dupla (sc) do que para vectores ssAAV9 convencionais. Para confirmar a eficiência deste método para a transferência sistémica de genes no SNC de ratinhos adultos, injectou-se vectores AAV1 e AAV9 ss- e sc que codificam para mSEAP na veia da cauda de ratinhos adultos (3x10 11 ou 1x10 12 vg por ratinho) e a actividade mSEAP foi analisada 4 semanas depois por análise bioquímica. Observou-se uma grande tendência para uma administração de gene sistémica superior em todos os tecidos de ratinhos injectados por via i.v. com o vector scAAV9 (incluindo órgãos não nervosos tais como o coração, músculo esquelético, o fígado e rins) apesar de também se ter verificado um aumento da actividade de mSEAP no SNC em relação ao que tinha sido observado entre ratinhos injectados com AAV1. Em comparação com outros serotipos, verificou-se um aumento de 4 a 9 vezes na actividade mSEAP média no cérebro, e um aumento de 2 a 17 vezes na corda espinhal. Verificou-se que a actividade mSEAP foi também 33 vezes, 70 vezes, 9 vezes e 7 vezes superior no coração, nos tricípites, no fígado e nos rins de animais injectados com scAAV9 em comparação com aqueles injectados com os outros vectores (Tabela 1). Inesperadamente, a actividade de mSEAP foi mais elevada na corda espinhal de ratinhos injectados com ssAAV1 em comparação com ratinhos injectados com ssAAV9 (e possivelmente do que nos ratinhos injectados com scAAV1, mas não estatisticamente significativo).
Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a administração i.v. de vectores scAAV9 pode mediar a transferência de genes no SNC de ratinhos adultos, nos quais a BHE está completamente formada. Isto sugere a eficácia da administração periférica de AAV9 e AAV1 para mediar a produção de uma proteína terapêutica no SNC.
7  - Expressão a longo prazo da administração de VEGF mediada por AAV no SNC
Além da administração de transgenes repórteres, também se testou a eficiência e a duração da transferência sistémica mediada por scAAV9 de um gene terapêutico, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Vários estudos com o objectivo de administrar VEGF aos MNs mostraram efectivamente uma melhoria no fenótipo ALS em modelos animais 15,19. Ratinhos com um dia de idade foram injectados na veia temporal com 5x10 9 vg de um vector scAAV9 que codifica para VEGF sob o controlo do promotor ubíquo da fosfoglicerato cinase (scAAV9-VEGF). Uma análise de ELISA foi realizada aos 5 meses após a injecção i.v. do vector para quantificar os níveis de proteína VEGF no SNC e em amostras de tecido não nervoso de ratinhos scAAV9-VEGF e controlo não injectados. A análise revelou um aumento global dos níveis de VEGF em muitos tecidos dos ratinhos injectados com scAAV-VEGF incluindo a corda espinhal (Fig. 6). Estes resultados sugerem uma expressão eficiente e de longo prazo do transgene VEGF em todos os tecidos de ratinho, incluindo SNC, após a transferência do gene de VEGF mediada por ssAAV9 sistémica em ratinhos.
Do nosso conhecimento, estes resultados demonstram, pela primeira vez, que a expressão eficiente do transgene pode ser obtida em células do plexo coróide ou do epêndima, após a administração periférica de um vector de transferência de gene. Estes resultados também representam a primeira demonstração de que proteínas recombinantes podem ser secretadas para o fluido cefalorraquidiano através da administração periférica de um vector de transferência de gene.
Lisboa,  3  de agosto  de 2016