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1. WO2020136361 - FLUIDIC SYSTEM FOR PRODUCING EXTRACELLULAR VESICLES COMPRISING A THERAPEUTIC OR IMAGING AGENT AND ASSOCIATED METHOD

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[ FR ]

SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES COMPRENANT UN AGENT THERAPEUTIQUE OU D’IMAGERIE ET PROCEDE

ASSOCIE

DOMAINE DE L’INVENTION

L’invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires et le chargement d’au moins un agent thérapeutique ou d’imagerie. L’invention se rapporte plus précisément à un système de chargement de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices et d’un agent thérapeutique ou d’imagerie, un procédé de chargement d’agent thérapeutique ou d’imagerie et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d’intérêt comme vecteurs pour la délivrance d’agents thérapeutiques ou d’imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d’un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d’abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également internaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d’imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules.

En particulier, l’utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l’utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires fonctionnalisées (c’est-à-dire chargées d’un composé d’intérêt) en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires. Les propriétés uniques des vésicules extra cellulaires (EVs) et leur tolérance biologique sont maintenant considérées comme des avantages pour délivrer des macromolécules biologiquement actives, tout en les protégeant des enzymes circulant dans les fluides corporels.

Les deux principaux défis pour une utilisation thérapeutique sont (i) la génération des EVs en quantité suffisante pour une utilisation clinique et (ii) l’efficacité de chargement de composés biologiquement actifs d’intérêt.

Aujourd’hui, deux principaux types de techniques de chargement sont décrits, (i) les modifications biologiques des cellules-mères, ou (ii) le chargement des EVs après leur production par des moyens physiques. En ce qui concerne le chargement des cellules-mères, ont été décrit des techniques de chargement spontané ou par transfection. Par exemple, des cellules ont été conçues pour exprimer un peptide RVG sur la partie extracellulaire de la protéine lamp2b surexprimée sur les EVs (Alvarez- Erviti et al., 201 1 ). Cependant, une telle stratégie de transfection des cellules-mères par des plasmides codant le Lamp2b fusionné au peptide d’intérêt prend du temps, pose des défis et peut être difficile à respecter dans un processus évolutif de bonnes pratiques de manipulation (BPF). En parallèle, la méthode d’électroporation est la méthode qui peut être utilisée pour le chargement des EVs après la production. Cette méthode a été utilisée pour charger divers composés dans des EVs tel que l’ARNsi (Shtam et al. , 2013) l’ADN (Lamihhane et al., 2015) et la doxorubicine (Tian et al., 2014). Toutefois, la charge d’ARNsi s’est avérée peu efficace en raison de la formation d’agrégats d’ARNsi. La demande internationale WO 2004/083379 décrit également une méthode de chargement d'un agent exogène dans des vésicules extracellulaires comprenant l'application d'une charge électrique. Une autre méthode pour obtenir des EVs fonctionnalisés (c’est-à-dire des vésicules chargées d’un composé d’intérêt) consiste à détruire les EVs afin de les fonctionnaliser (Haney et al., 2015). Cette méthode est facile à mettre en œuvre, mais ne permet pas de préserver la structure vésicale, ce qui provoque la perte de l’asymétrie de la membrane et des protéines avec un mauvais réarrangement des protéines membranaires. Smyth et al. divulguent une méthode de chargement des EVs par chimie-click. Cette méthode consiste à charger les protéines membranaires des EVs avec un groupe fonctionnel spécifique afin de fixer à ces protéines le composé d’intérêt. Toutefois, cette méthode ne permet pas de charger la lumière des vésicules.

Il est donc nécessaire de fournir une méthode pour obtenir des vésicules extracellulaires fonctionnalisées (EVs) dans lesquelles la topologie et les propriétés originales des vésicules sont préservées et permettant de charger la lumière des vésicules. Il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs avec toutes sortes de composés, avec tout type de volume d’échantillon. Enfin, il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs pour une utilisation clinique compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (B. P. F. ou Good Manufacturing Practices, G.M. P. en anglais), soit facile à mettre en œuvre avec un nombre d’étapes réduites, et permette une obtention d’EVs chargées en grande quantité et contenant une quantité en cargo important, etc.

RESUME DE L’INVENTION

Un but de l’invention est de proposer une solution pour charger des agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires et ainsi fonctionnaliser des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement et plus efficacement qu’avec les méthodes connues, dans des conditions conformes aux normes B. P. F. Un autre but de l’invention est de proposer une solution permettant d’augmenter le rendement du système de chargement d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans des vésicules, c’est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie et le nombre de vésicules non chargées. Un autre but de l’invention est de proposer une solution pour charger, produire et récupérer des vésicules extracellulaires chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie en continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l’invention est de simplifier la structure du système fluidique pour le chargement et la production de vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie et de réduire son coût de fabrication.

Ainsi, l’invention propose une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d’un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie.

En particulier, un objet de l’invention est un système fluidique de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EVs) à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices, un agitateur de milieu liquide adaptés pour la croissance des cellules productrices, caractérisé en ce qu’il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur, l'agitateur, et les dimensions du récipient étant adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) produites simultanément par le système fluidique.

On comprend qu’avec un tel système, il est possible de produire des vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G.M. P. On comprend également qu’un tel système est plus simple et moins coûteux à fabriquer que les systèmes connus pour charger et fonctionnaliser des vésicules extracellulaires, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm.

L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :

la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale 100 pm, et préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm ;

- le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ;

- le système fluidique comprend des microporteurs sur lesquels vont se fixer des cellules productrices adhérentes ;

- l’agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;

- les microporteurs sont des microbilles, le diamètre des microbilles étant compris entre 100 pm et 300 pm ;

- le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, relié fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique pouvant

comprendre un moyen de fermeture en amont du séparateur permettant de fermer ou ouvrir la connectique et ainsi obtenir un système de récupération de vésicules en continu ou discontinu.

Un autre objet de l’invention est un procédé de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant :

• des moyens de commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices, et

• une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.

Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :

- on agite le milieu liquide pendant plus de vingt minutes ;

- on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant, intermittent, d’intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm ;

- un séparateur qui permet d’appauvrir une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et le liquide ainsi appauvri étant réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.

- on réalise une étape d’ultracentrifugation ou de filtration tangentielle après la collecte pour séparer les vésicules, les cellules productrices et les agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans le milieu liquide.

- les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées.

- l’écoulement permet de, simultanément, charger l’agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient.

Le chargement des vésicules extracellulaires selon le procédé de l’invention peut également s’effectuer indépendamment de leur production. Ainsi un objet de l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie en utilisant directement une suspension de vésicules extracellulaires préalablement produites. Un objet de l’invention est donc un procédé de chargement dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV), comprenant :

- une fourniture de vésicules extracellulaires dans le milieu liquide (5),

- une commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les vésicules afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie.

Un autre objet de l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices, comprenant :

• une commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices, et

• une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires en sortie du récipient.

Ce procédé de chargement de cellules productrices est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :

- on agite le milieu liquide pendant plus de vingt minutes ;

- on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant, intermittent, d’intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm.

Comme le démontrent les expérimentations, le système ou les procédés de l’invention permettent d’obtenir des vésicules et/ou cellules productrices chargées d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à des concentrations particulièrement plus importantes (les augmentations mesurées varient de 39% à 592%) comparées au vésicules et/ou cellules chargées/produites passivement. Ainsi lesdites cellules productrices et vésicules extracellulaires sont d’un intérêt tout particulier et constituent donc un objet de la présente invention. Les vésicules de l’invention sont plus particulièrement d’intérêt comme vecteur d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Ces utilisations constituent également un objet de l’invention.

Plus particulièrement, les vésicules chargées selon les procédés de l’invention présentent des propriétés de pharmacodynamie et thérapeutiques améliorées comparées aux formulations liposomales, comme le montrent les données relatives à la témoporfine. Ainsi un objet particulier de l’invention est le procédé selon l’invention dans l’un quelconque de ses modes de réalisation, une vésicule extracellulaire, cellule productrice obtenue selon ce procédé pour lesquels ledit agent thérapeutique est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine, la cytarabine.

DEFINITIONS

Le terme « vésicule extracellulaire désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire. Il est connu de l’art que les vésicules extracellulaires contiennent les marqueurs membranaires et/ou cytoplasmiques provenant des cellules productrices. Ces marqueurs permettent d’une part d’identifier et caractériser ces vésicules et sont les garant de leur fonctionnalité. Comme le montre la partie expérimentale, les vésicules selon l’invention sont plus efficaces que les liposomes par exemple, et permettent une amélioration de la pharmacocinétique/pharmacodynamie (PK/PD) des molécules qu’elles vectorisent.

Le terme cellule productrice désigne de manière générale indépendamment soit une cellule qui n’est pas adhérente sur un milieu, soit une cellule adhérente sur un milieu et qui peut se diviser et se multiplier. Selon un autre aspect de l’invention, le terme cellules productrices désigne des cellules d’origine humaine, animale ou végétale ou provenant de bactéries ou d’autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Dans le cas des cellules adhérentes, celles-ci peuvent être adhérentes sur des microporteurs eux-mêmes en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l’invention, le terme cellules productrices désigne des agrégats cellulaires. Le terme agrégats cellulaires désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices qui adhèrent solidement entre elles. Un mélange doux créé par l’agitateur permet aux cellules productrices adhérentes ou non de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.

Les termes microporteur et microsupport désignent une matrice sphérique permettant la croissance de cellules productrices adhérentes à sa surface ou à l’intérieur et dont la taille est comprise entre 50 pm et 500 pm, et préférentiellement entre 100 pm et 300 pm. Les microporteurs sont généralement des billes dont la densité est choisie sensiblement proche de celle du milieu liquide de culture des cellules productrices. Ainsi, un mélange doux permet aux billes de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.

Le terme agent thérapeutique ou agent d’imagerie désigne de manière générale tout agent d’intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des molécules thérapeutiques, d’imagerie, des nanoparticules à visée thérapeutique, d’imagerie etc. Comme le montrent les données expérimentales, l’invention est apte à permettre le chargement amélioré d’une grande variété de taille d’agent thérapeutique ou d’imagerie, tels que des petites molécules, des polymères, des protéines, etc... et ce quel que soit le type de cellules productrice. Ainsi, du fait de la diversité possible d’agent thérapeutique incorporable par le procédé selon l’invention et donc vectorisable par les vésicules extracellulaires de l’invention et également du fait de la grande variété des cellules productrices utilisables, les vésicules selon l’invention sont utilisables pour tout genre de thérapie ; par exemple, et de manière non limitative, il peut s’agir de la thérapie de maladies infectieuses, inflammatoires, immunologiques, métaboliques, cancéreuses, génétiques, dégénératives ou secondaires à des chirurgies ou traumas. La vectorisation de molécules de faible biodisponibilité est particulièrement préférée. De la même manière, une grande variété d’agent d’imagerie et/ou traceurs peut être chargée dans les vésicules extracellulaires selon l’invention, par exemple, et de manière non limitative, des agents fluorescents, luminescents, des isotopes radioactifs, des produits de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques. Il peut s’agir également de protéines ou autres molécules biologique ou de synthèse couplées à ces agents y compris des agents de ciblage afin de changer la biodistribution des vésicules.

Le terme agitateur désigne de manière très générale un moyen d’agiter le liquide. Ce peut être une pièce mécanique au moins partiellement en contact avec une partie du liquide et qui permet de mettre ce liquide en mouvement. C’est par exemple le cas avec un agitateur rotatif. L’homme de l’art sait qu’il est possible d’utiliser de nombreuses variantes pour produire un mouvement liquide et un mélange, que ce soit en variant les caractéristiques de forme de l’agitateur rotatif, ou soit en utilisant d’autres types d’actions, que ce soit isolément ou en action conjointe, dans la façon d’induire du mouvement dans le liquide. Ainsi un réacteur de type shake-flask utilise un mouvement de secouage pour induire un mouvement du liquide et son mélange ; un réacteur air-lift utilise l’injection de bulles gazeuses dans le liquide pour produire un mouvement du liquide et son mélange. D’autres configurations de réacteurs existent qui mettent éventuellement à profit l’utilisation d’une enceinte souple pour contenir le liquide, associée à une déformation de l’enceinte souple pour produire un mouvement liquide et un mélange. De même, un mouvement de mélange peut être obtenu au moyen d’une variation cyclique d’inclinaison du réacteur par rapport à la gravité, de façon à créer des vagues dans le liquide, et promouvoir écoulement et mélange. Enfin, des structures statiques présentes dans le réacteur, par exemple des baffles, ou encore des structures formant des barrières partielles au mouvement du liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées.

Le terme « agitateur doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d’un moyen ou d’une combinaison de moyens quelconques permettant de générer la combinaison d’un écoulement, du mélange du milieu, et la génération de turbulence dans un milieux liquide.

PRESENTATION DES FIGURES

D’autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles :

La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension ;

La figure 2 illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices adhérentes et comprenant des microporteurs ;

Les figures 3A, 3B illustrent respectivement la distribution de taille des EVs obtenues par NTA, l’analyse morphologique par cryo-TEM ;

La figure 4 illustre l’analyse par fluorimétrie des vésicules chargées au mTHPC.

La figure 5 illustre la biodistribution d’une formulation liposomale du commerce de la mTHPC (foslip®, A et B) et des vésicules avec mTHPC (C et D) étudiée en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.

La figure 6 illustre la biodistribution des vésicules chargées selon l’invention avec mTHPC (A et B) étudiée en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.

La figure 7 illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomale de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.

La figure 8 illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard de croissance tumorale HT29 après traitement avec de la mTHPC libre ; la formulation liposomale de la mTHPC (Liposome mTHPC) et vésicules mTHPC avec activation laser du médicament (thérapie photodynamique), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés).

La figure 9 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en doxorubicine des HUVEC (concentration cellulaire en doxorubicine).

La figure 10 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en doxorubicine des vésicules extracellulaires d’HUVEC (concentration en doxorubicine pour 106 vésicules).

La figure 1 1 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le nombre de vésicules extracellulaires d’HUVEC formées, mesuré en NTA (barres grises) ou en unité arbitraire de luminescence de la luciférase. Un nombre comparable de vésicules est obtenu pour une Lk de 48 pm, que ce soit en l’absence ou en présence du cargo (FITC-dextran 70kDa).

La figure 12 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en FITC-dextran 70kDa des vésicules extracellulaires d’HUVEC mesurée par la fluorescence du FITC (unités arbitraires) contenu dans les vésicules.

La figure 13 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en FITC-dextran 70kDa (fig. 13A) ou en FITC-dextran 10kDa (fig. 13B) en fonction de la taille des vésicules extracellulaires d’HUVEC formées, mesurée par la fluorescence du FITC (unités arbitraires) contenu dans les vésicules. Barres noires, chargement à une Lk=245 pm, barres blanches, chargement à une Lk=48 pm.

DESCRIPTION DETAILLEE

Eléments théoriques

La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d’eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d’un fluide permet de dissiper l’énergie cinétique d’un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur Lk est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941 , January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301 -305) et décrite par la formule (I) suivante :

Lk = n3/4. e- 1/4 (I)

dans laquelle est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et e est le taux moyen de dissipation d’énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d’injection d’énergie dans le fluide).

Zhou ét al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impe tiers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre e moyen et la géométrie d’un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par

agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (II) suivante :

NV.D5.N3

e = — - v (II)

dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l’agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l’agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de e moyen correspondant à la géométrie d’un récipient et d’un agitateur utilisés pour la mise en œuvre de l’invention. Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (III) :


dans laquelle P est la puissance apportée par l’agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (III) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971 , Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1 ), 41 -43) ou Zhou et al. (Zhou, G. , Kresta, S. M. , 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l’écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (IV) suivante :

N.D 2

Re =

V (iv)

Alternativement, l’homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov basée sur un taux moyen de dissipation d’énergie par unité de volume. En tout état, le calcul présenté ci-dessus n’est qu’une façon parmi tant d’autres connues de l’homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov et illustre un mode de réalisation de l'invention sans en limiter la portée. De manière générale, pour un récipient et un agitateur choisis, l’homme du métier saura appliquer le Np fourni par le fournisseur de l’agitateur et ainsi déterminer comment obtenir une Lk souhaitée.

Architecture générale du système fluidique

Les figures 1 et 2 illustrent schématiquement un système fluidique (1 ) pour le chargement de vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique (1 ) de chargement de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) chargées dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients (4) reliés fluidiquement en parallèle ou en série.

Le récipient (4) contient un milieu liquide (5). Le récipient (4) peut notamment être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide (5). Le volume du récipient (4) est l’un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires (EV) en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume du récipient (4) illustré schématiquement dans la figure 1 ou 2 est de 1 L. Dans l’exemple, non limitatif, de mode de réalisation présenté figure 1 , qui permet la séparation en continu des vésicules produites, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient (4) par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19). Une autre pompe (16’) permet d’acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l’entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l’entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l’intermédiaire d’une première pompe (16)). La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19). Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d’une première pompe 16. Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à filtrer les cellules productrices (6) et les débris cellulaires lors de l’extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient (4).

Le récipient (4) comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s’écouler une atmosphère comprenant des concentrations en air, N2, O2 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d’un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d’une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une pompe (17) permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient (4). Le récipient (4) comprend également une sortie (9) susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV). Cette sortie peut être complétée d’un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension permettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient (4). Cette sortie (9) permet d’extraire hors du récipient (4) les vésicules extracellulaires (EV) produites. Le récipient (4) peut également comprendre au moins une entrée (8) adaptée à introduire le milieu liquide (5) dans le récipient (4).

Le milieu liquide (5) peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est soit un milieu liquide de culture avec adjonction de composés permettant la culture des cellules d’intérêt, soit un milieu complémenté en sérum ou lysat plaquettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires soit un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires (EV) produites par le système fluidique 1 par des protéines ou d’autres vésicules provenant d’un sérum. Un milieu liquide (5) de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide (5) est déterminé en partie par le récipient (4). Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) est en partie déterminé par le choix de l’agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5).

Le système fluidique (1 ) peut comprendre, selon un mode de réalisation particulier des microporteurs (3) en suspension dans le milieu liquide (5). Les microporteurs sont particulièrement avantageux lorsque les cellules productrices (6) sont des cellules adhérentes. Les microporteurs (3) peuvent être des microbilles (14), par exemple en Dextran, chaque microbille (14) pouvant être recouverte d’une couche de collagène ou autre matériau nécessaire à la culture de cellules. D’autres matériaux peuvent être utilisés pour la fabrication des microporteurs (3), tels que le verre, le polystyrène, le polyacrylamide, le collagène et/ou l’alginate. De manière générale, l’ensemble des microporteurs (3) adaptés pour la culture cellulaire est adapté à la production de vésicules extracellulaires (EV). La densité des microporteurs (3) peut être par exemple légèrement supérieure à celle du milieu liquide (5). La densité des microbilles (14) en Dextran est par exemple de 1 ,04. Cette densité permet aux microbilles (14) d’être suspendues dans le milieu liquide (5) en agitant faiblement le milieu liquide (5), la traînée de chaque microporteur (3) dans le milieu liquide (5) étant dépendante de la densité du microporteur (3). La taille maximale des

microporteurs (3) peut être comprise entre 50 pm et 500 pm, préférentiellement entre 100 pm et 300 pm, et préférentiellement entre 130 pm et 210 pm.

Les microporteurs (3) peuvent par exemple être des microbilles (14) de type Cytodex 1 (marque déposée). On peut réhydrater et stériliser une poudre formée par ces microbilles (14) avant utilisation. On peut utiliser les réhydrater dans du PBS, puis les transférer dans un milieu de culture (par exemple du DMEM) sans sérum, dans lequel les microbilles sont conservées à 4°C avant une utilisation.

Le système fluidique (1 ) comprend également des cellules productrices (6). Les cellules productrices (6) peuvent être selon un mode de réalisation, des cellules adhérentes sur les microporteurs (3) ou selon un autre mode de réalisation des cellules en suspension. Les vésicules extracellulaires EV sont chargées et produites par le système fluidique (1 ) à partir de ces cellules productrices (6) (adhérentes ou en suspension).

Les cellules productrices (6) peuvent être cultivées, avant le chargement et la production de vésicules extracellulaires (EV) chargées par le système fluidique (1 ), sur la surface des microporteurs (3) dans un milieu de culture cellulaire adapté ou en suspension dans un milieu de culture cellulaires adapté pour des cellules en suspension. Ainsi, aucun transfert de cellules n’est nécessaire entre la culture des cellules productrices (6) et le chargement des vésicules extracellulaires (EV), ce qui permet d’éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. Selon un mode de réalisation, la majorité des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), même si une proportion minoritaire de cellules productrices (6) peut être décollée, par exemple par l’agitation du milieu liquide (5). Les autres cellules productrices sont alors et en suspension dans le milieu liquide (5) ou sédimentées au fond du récipient (4). Selon un mode réalisation particulier de l’invention au moins 50% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des

microporteurs (3), de préférence au moins 60% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 70% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 80% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 85% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 90% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 95% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 96% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 97% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 98% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 99% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence 100% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3). Ainsi, moins de 50% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 40% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 30% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 20% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 15% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 10% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 5% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 4% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 3% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 2% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 1 % des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence les cellules productrices (6) ne sont pas en suspension. Préférentiellement, le système fluidique (1 ) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d’homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu

liquide (5) au sein du récipient (4). De manière générale, tout type de cellules productrices (6) peut être utilisé, y compris des cellules productrices non adhérentes. Les cellules productrices en suspension sont alors en suspension dans le milieu liquide (5) ou sédimentées au fond du récipient (4).

Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5). L’agitateur (7) peut être une pale telle qu’une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide (5), et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L’agitateur (7) peut également être un système de perfusion de milieu liquide (5) à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide (5) contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L’agitateur (7) peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles ( shaken flask), agitateur à bascule (wave), bioréacteur avec agitation pneumatique ( air-lift ) ou un agitateur rotatif à pales tel qu’un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d’agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient (4), par exemple des baffles, ou encore des structures formant des barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L’agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). L’homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov Lk adaptée pour chaque type d’agitateur (7) en fonction des dimensions du récipient (4), de la géométrie de l’agitateur (7) et de l’intensité de l’agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds Re est supérieur à 2000. Le nombre

de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (IV). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l’écoulement de milieu liquide (5) est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000.

D’autres agitateurs (7) permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l’homme du métier et susceptibles d’être implantés dans le système selon la présente invention.

L’agitateur (7) utilisé dans les exemples de réalisation de l’invention comprend une pale telle qu’une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques. La vitesse de la pale dans le milieu liquide (5) entraîne un écoulement du milieu liquide (5). L’agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient (4), est turbulent. Dans le cas de l’agitateur (7) illustré en figure 1 ou 2, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide (5), en particulier la viscosité cinématique v du milieu liquide (5), les dimensions du récipient (4) et en particulier le volume V de milieu liquide (5) contenu dans le récipient (4), le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée de la pale, le diamètre D de l’agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L’utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l’écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov Lk, telle que donnée par les équations (I), (II) et (III). En particulier, l’agitateur (7) est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur Lk est inférieure à 100 pm, de préférence inférieure ou égale à 80 pm. De manière encore plus préférée l’agitateur 7 est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur Lk est inférieure ou égale à 70 pm et très préférentiellement à inférieure ou égale 60 pm. De manière

particulièrement préférée, l’écoulement a une Lk inférieure ou égale à 55 pm, de manière également préférée inférieure ou égale à 50 pm.

Dans un exemple de réalisation du système fluidique (1 ), la vitesse de rotation de l’agitateur (7) est susceptible d’être commandée à 100 rpm (rotations par minute), le diamètre d’une pale telle que, par exemple, une roue à aube est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient (4) est de 400 mL. Le nombre de puissance N P mesuré de la pale dans le milieu liquide 5, par la formule (III), est sensiblement égal à 3,2. L’énergie dissipée par unité de masse e, calculée, par la formule (II), est égale à 5,44.10 1 J. kg-1. La longueur de Kolmogorov Lk calculée par la formule (I) est ainsi égale à 41 ,8 pm.

Préparation des microporteurs et des cellules productrices

Le récipient (4) peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide (5), de microporteurs (3), de cellules productrices (6) et de l’agent thérapeutique ou agent d’imagerie. Les microporteurs (3), en l’occurrence des microbilles (14), sont également stérilisés. Les microbilles (14) sont incubées dans le milieu de culture des cellules productrices (6), comprenant du sérum, dans le récipient (4). Cette incubation permet d’oxygéner le milieu de culture et de recouvrir la surface des microbilles (14) d’une couche, au moins partielle, de protéines, favorisant l’adhésion des cellules productrices (6) à la surface des microbilles (14).

Les cellules productrices (6), avant d’être introduites dans le système fluidique (1 ), sont mises en suspension au moyen d’un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 § pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d’un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices (6) sont ensuite introduites dans le récipient (4), comprenant du milieu de culture et les microbilles (14), dans une quantité correspondant sensiblement à 5 à 20 cellules productrices (6) par microbille (14). Les cellules productrices (6) et les microbilles (14) sont ensuite agitées puis sédimentées, de manière à mettre en contact les microbilles (14) et les cellules productrices (6), et favoriser l’adhésion des cellules productrices (6) sur la surface des microbilles (14). L’agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l’homogénéité de l’adhésion des cellules productrices (6) à la surface des microbilles (14), par exemple toutes les 45 minutes pendant 5 à 24 heures. La culture des cellules productrices est ensuite réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d’une pale telle qu’une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu’un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% du milieu de culture chaque jour).

Aspect chargement d’agent thérapeutique ou d’imagerie

Le système fluidique (1 ) pour le chargement et production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques et /ou d’imagerie dans les vésicules extracellulaires (EV) produites selon l’invention. Ainsi, les cellules productrices (6) et l’agent thérapeutique ou d’imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide (5) et mélangés dans le récipient (4). Alternativement, les cellules productrices (6) peuvent être ajoutées séquentiellement dans le milieu liquide (5), c’est-à-dire avant ou après l’ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans ledit milieu liquide (5). De manière générale, tout type d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie peut être utilisé, les agents thérapeutiques pouvant notamment être des molécules ou particules pour traiter des maladies infectieuses, des maladies inflammatoires, des maladies métaboliques, des maladies dégénératives, des maladies traumatiques, des maladies post-chirurgicales, des maladies génétiques, des tumeurs malignes, des maladies orphelines,

des maladies du système vasculaire, des maladies du système lymphatique, des maladies du système locomoteur, des maladies du système digestif, des maladies du système nerveux, des maladies du système reproducteur, des maladies du système excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d’imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) tel que décrit précédemment et permettant d’agiter le milieu liquide (5) comprenant les cellules productrices en suspension (6) et l’agent thérapeutique ou d’imagerie. Préférentiellement, le système fluidique (1 ) est adapté de manière à générer une agitation suffisamment douce pour homogénéiser le milieu sans abîmer les cellules productrices mais suffisante pour induire des contraintes de cisaillement permettant dans le milieu liquide (5) au sein du récipient

(4) et ce afin de charger efficacement les agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans les cellules productrices (6) et dans les vésicules extracellulaires.

Selon un autre objet, l’invention est également un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices (6), comprenant :

· la commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement et la production d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide 5 comprenant des cellules productrices (6), et

• une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV), par exemple en sortie (9) du récipient (4). La collecte peut se faire alternativement par transvasement de l’ensemble du liquide

(5) contenu dans le récipient dans un autre récipient. Eventuellement, une centrifugation dont la vitesse est adaptée pour séparer les vésicules extracellulaires d’une part et les cellules productrices et/ou les cellules productrices adhérentes sur les microporteurs d’autre part est appliquée.

Dans un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale à 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Dans un mode particulièrement préféré ladite la longueur de Kolmogorov est inférieure ou égale à 55 pm. Dans un mode également préféré ladite la longueur de Kolmogorov est inférieure ou égale à 50 pm.

Selon un objet de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Bien entendu, cette étape peut également être mise en œuvre avant l’étape de production de vésicules extracellulaires. Dans ce mode de réalisation particulier, les cellules productrices de vésicules sont donc chargées dans leur membrane et/ou leur cytoplasme en agent thérapeutique et/ou d’imagerie d’intérêt préalablement à la mise en œuvre du procédé de production de vésicules extracellulaires. Le chargement s’opère soit par des méthodes connues de l’art, comme par exemple chargement passif, soit, de manière préférée, selon le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6), comprenant :

une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices (6), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et

une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4), et

- optionnellement, une collecte des cellules productrices chargées.

Selon un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une caractéristique encore plus particulière, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une autre caractéristique particulière, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.

Alternativement, dans un autre mode de réalisation, l’étape de chargement peut être mise en œuvre après l’étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d’intérêt dans le cas où l’on souhaite obtenir une 1 ère production de vésicules non chargées suivie d’une 2ème production de vésicules extracellulaire chargées dudit agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d’un système fluidique avec une collecte du milieu liquide (5) en continu. Dans ce mode de réalisation, une fois produites, et ce de manière indépendante de leur production, les vésicules sont chargées en étant soumises à des contraintes de cisaillement en commandant de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans le récipient (4) dans lequel sont les vésicules extracellulaires afin de réaliser le chargement, dans la lumière ou la membrane des vésicules extracellulaires (EV), d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie contenu également dans le milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm dans un récipient (4). Selon une caractéristique particulière, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une caractéristique particulièrement préférée, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une caractéristique également préférée, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.

De manière surprenante, comme démontré dans la partie expérimentale, l’écoulement qui permet aux cellules productrices (6) de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l’agent thérapeutique ou d’imagerie dans les cellules productrices (6) et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4) chargé de l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Ainsi, alternativement, et selon un autre de réalisation, l’étape de chargement dudit agent thérapeutique et/ou d’imagerie est simultanée à l’étape de production de vésicules extracellulaires. Un objet de l’invention est donc également le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane et/ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6) et/ou dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires desdites cellules, comprenant :

une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) et les vésicules extracellulaires afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices (6) et la lumière et/ou la membrane des vésicules desdites cellules, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et

une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).

Selon un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une

caractéristique encore plus particulière, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une autre caractéristique également particulière, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.

Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4) comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie.

Exemple de production des vésicules extracellulaires EV avec chargement d’agent thérapeutique ou agent d’imagerie

Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites dans un récipient (4) contenant un milieu liquide (5), par exemple sans sérum, des cellules productrices (6). Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices (6) comprenant du sérum et des agents thérapeutiques et/ou d’imagerie, on lave trois à quatre fois le récipient (4) avec du milieu liquide 5 DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d’environ 400 mL. On commande ensuite l’agitation du milieu liquide (5) par l’agitateur (7) de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient (4). L’agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur de Kolmogorov Lk est inférieure à 100 pm et préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm. L’agitation du milieu liquide (5) est commandée au moins pendant 20 minutes, préférentiellement pendant plus d’une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures. Selon un aspect particulier, l’agitation dure deux heures. Le chargement et la production de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être mesuré(s) pendant la production. A cet effet, l’agitation peut être momentanément interrompue. On laisse sédimenter et/ou on centrifuge les cellules productrices 6 au fond du récipient (4), puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires (EV). On réalise une centrifugation de l’échantillon à 2000 g pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires (EV) et d’en déduire la concentration en vésicules extracellulaires (EV) des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires (EV) au début de l’agitation est proche de zéro ou négligeable.

Les vésicules extracellulaires (EV) produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 pL de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l’éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires (EV) est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires (EV) sont observées à une température de l’ordre de -170° C.

Séparation des vésicules extracellulaires

Les vésicules extracellulaires (EV) chargées et produites dans le récipient 4 sont susceptibles d’être extraites du récipient (4) par la sortie (9) du récipient (4), suspendues dans du milieu liquide (5). Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à filtrer les cellules productrices 6 et les débris cellulaires lors de l’extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient (4). Une connectique (13) est fluidiquement reliée à la sortie (9), permettant le transport du milieu liquide (5) comprenant les vésicules extracellulaires (EV) produites.

Le système fluidique (1 ) peut en outre comprendre un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV). Le séparateur (15) comprend une entrée du séparateur (10), dans laquelle le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) issu du récipient (4) peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur (15) peut également comprendre une première sortie (11 ) du séparateur, par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus petite qu’en entrée (10) du séparateur (15), voire sensiblement nulle. Le séparateur (15) peut également comprendre une deuxième sortie (12) du séparateur (15), par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus élevée qu’en entrée (10) du séparateur (15).

De manière générale, le séparateur (15) de vésicules extracellulaires EV peut être relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide (5) appauvri en vésicules EV dans le récipient (4), par exemple par l’entrée (8) du récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide (5) sensiblement constant dans le récipient (4). Selon un mode de réalisation alternatif, le système fluidique ne comprend pas de séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) ou le système fluidique comprend un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l’intermédiaire d’un moyen de fermeture dudit séparateur (15), au récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou continu en fonction de l’ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur (15).

Dans l’exemple de réalisation d’un système fluidique (1 ) illustré dans la figure 1 ou 2, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient 4 par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19). Une autre pompe (16’) permet d’acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l’entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La

première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l’entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l’intermédiaire d’une première pompe (16)). La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5), et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur (15) au débit d’une première pompe (16).

Influence de l’agitation sur le chargement des vésicules extracellulaires EV La figure 3 illustre la distribution de taille des EVs obtenues par NTA (Nanoparticle Tracking Analysis, NS300, Malvern) (A) et l’analyse morphologique par cryo-TEM ( Cryogénie Transmission Electron Microscopy (B). La répartition de la taille des EVs déclenchés par la turbulence provenant des HUVEC a été analysée par NTA et cryo-TEM (Figure 3) montrant la forme des vésicules et la plage de taille type des EVs polydispersés (C). Les résultats montrent que les EVs obtenues à une longueur de Kolmogorov de 35 pm affichaient une plage de taille classique (100 à 400 nm). La taille moyenne des EVs étaient respectivement de 236 nm et de 200 nm. La présence de mTHPC ( meta -tetra(hydroxyphenyl)chlorine, INN : temoporfin, témoporfine en Français) dans la fraction des EVs isolées est démontrée par fluorométrie avec un pic d’émission vers 650 nm caractéristique de cette molécule (suite à excitation vers 400-410 nm) (Figure 4).

La quantification de mTHPC a été effectuée pour les échantillons d’EVs produits par des cellules productrices incubées avec 100 mM mTHPC sous agitation. Des expériences de chargement ont été effectuées à une longueur de Kolmogorov de 100 et 35 pm afin de déterminer l’effet de la turbulence sur l’internalisation des agents d’intérêt sur les cellules productrices et par la suite sur les EVs libérées. Afin d’établir une comparaison à une quantité équivalente d’EVs, l’étape de chargement à 100 pm a été suivie d’un lavage et d’une vésiculation à 35 pm de longueur Kolmogorov, selon le protocole expérimental du tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : protocole de chargement de vésicules d’HUVEC au mTHPC


Les échantillons d’EVs purifiés (EV) obtenus suite à une charge des cellules à une longueur de Kolmogorov de 100 et 35 pm contenaient une concentration mTHPC de 1 ,3 mM et 7,8 mM, respectivement, ce qui signifie une augmentation de plus de 5 fois de la charge d’EVs avec le mTHPC. Par ailleurs, lorsqu’on compare la quantité d’EV obtenue à 35 pm à 100 pm, on obtient une augmentation de 10 fois, attestant l’effet et de l’importance de la longueur de Kolmogorov pour, d’une part, déclencher et augmenter la libération des EVs et, d’autre part également augmenter leur chargement en molécule cargo d’intérêt.

La même expérience a été réalisée en utilisant des HUVEC (ATCC, figures 9 et 10) et de Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) murines (C3HT1 /2, ATCC) en utilisant des Lk différentes. Brièvement, les cellules ont été cultivées dans du DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PenStrep, Gibco) à 37° C (5% de CO2). Elles ont été ensemencées sur des microporteurs Cytodex 1 (GE Healthcare) à 12g de billes/ L en micro-carrier spinner flask (Bellco) de 100 mL, à raison de 13300 cellules/cm2, puis cultivées à 6g de billes/ L avec une agitation de 34 rpm jusqu’à confluence. Avant le chargement en doxorubine, les microporteurs comportant les cellules confluentes ont été lavés 3 fois avec du DMEM afin d’éliminer toute trace de sérum. Après équilibration dans du DMEM sans sérum, la doxorubicine a été ajoutée à une concentration finale de 5mM. Le chargement et la vésiculation ont été effectués à 37° C (5% CO2) suivant le protocole du tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : protocole de chargement de vésicules d’HUVEC ou CSM murines à la doxorubicine


En fin de culture, les cellules ont été isolées des billes par trypsine

10 min à 37°C (5% CO2), et séparée des billes par passage sur tamis cellulaire 70 pm, puis lavées en PBS pour éliminer la doxorubicine libre. Après une première étape de centrifugation à 2000 g durant 10 minutes, les vésicules ont été isolées et concentrées par ultracentrifugation (Beckman Optima MAX XP, 150 000 g pendant 1 h30). La concentration en cellules a été déterminée avec le compteur de cellules NC200 (Chemometec) et la concentration et distribution en taille des vésicules ont été calculées par NTA. Les marqueurs présents dans les vésicules ou leur membrane ont été

analysés par cytométrie en flux utilisant le kit MACSPlex (Miltenyi Biotec). Vésicules et cellules ont été ensuite lysées chimiquement (Triton 0,3%) puis analysées au spectrophotomètre à fluorescence (Hitachi F7000). La doxorubicine a été quantifiée en utilisant ses longueurs d’ondes d’excitation à 485 nm et d’émission à 560 nm.

La figure 9 confirme l’importance de la Lk dans le chargement des HUVEC d’une part : le chargement des cellules HUVEC est 2,4 fois plus important (+140 %) en utilisant une Lk de 55 pm qu’à une Lk de 283 pm, et d’autre part dans le chargement des vésicules (figure 10): une augmentation de 39% de la concentration en doxorubicine des vésicules est observée quand une Lk de 55 pm est utilisée, par rapport à une Lk de 283 pm, qui correspond à un chargement passif des cellules ou vésicules (figure 10).

Des résultats similaires sont obtenus pour les CSM murines (non montré) avec notamment une augmentation de 485% de la concentration des vésicules en doxorubicine quand une Lk de 55 pm est utilisée, par rapport à un chargement passif à une Lk de 283 pm. Le chargement des cellules est également augmenté de 592%.

Concernant les caractéristiques des vésicules produites, les données de NTA montrent une distribution en taille similaire entre les conditions de chargement (passif et pour une Lk = 55 pm), respectivement 106,9 nm et 109,7 nm pour les vésicules des HUVEC, qui correspondent à une taille classique de vésicules extracellulaires (non montré). L’analyse par cytométrie en flux montre que les vésicules obtenues selon les deux conditions présentent des marqueurs classiques des vésicules extracellulaires notamment CD9, CD63 et CD81 (non montré). Ainsi la vésiculation à une Lk inférieure à 40 pm n’a pas d’impact sur la présence des marqueurs classiques des vésicules ; on peut donc attendre une fonctionnalité de vectorisation au moins aussi performante que les vésicules produites passivement.

Les résultats montrent l’influence de Lk dans la production et le chargement de vésicules sur différents types de cellules utilisées. Le mTHPC et la doxorubicine sont des agents thérapeutiques de petite taille (respectivement 680,7 et 543,5 kDa). Les conditions identifiées par les inventeurs sont plus efficaces que la condition de chargement passif sans agitation ou à très faible agitation à 283 pm par exemple. L’effet de la variation de Lk pour la production de vésicules extracellulaires pour des agents de taille plus importante a également été testé (Figures 1 1 , 12, 13). Les sondes dextran-FITC de 10 kDa et 70 kDa ont été utilisées. Elles peuvent être considérées comme des modèle d’agents d’imagerie et comme également des modèles pour des agents thérapeutiques qui seraient de poids moléculaire plus important, tel que, par exemple des polymères, des siRNAs qui ont un poids moléculaire de l’ordre de 13 kDa (Whitehead et al., 2009) ou des « petites >> protéines thérapeutiques dont le poids moléculaire est proche de 70 kDa (Strohl, 2015). Des résultats similaires sont obtenus que ce soit pour les sondes dextran-FITC de 70 kDa ou 10 kDa.

Brièvement, des cellules HeLa (ATCC), modifiées génétiquement pour exprimer la luciférase liée à la protéine HSP70 (HSP70 est un marqueur des vésicules extracellulaires, Théry et al. 2018), ont été cultivées avec du DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PenStrep, Gibco) à 37° C (5% de CO2). Ces cellules ont été ensemencées sur des microporteurs Cytodex 1 (GE Healthcare) à 6g de billes/L en spinner flask (Bellco) de 100 mL à raison de 6700 cellules/cm2, puis cultivées à 3g de billes/L avec une agitation de 34 rpm jusqu’à confluence. Avant le chargement, les microporteurs comportant les cellules confluentes ont été lavés 3 fois avec du DMEM sans sérum pour éliminer des traces de sérum, puis incubés avec des sondes de FITC-dextran de 10 ou 70 kDa (références FD10S et 90718 respectivement, Sigma) à 1 ,43 mM pendant 2 heures à des Lk de 245 ou 48 pm (tableau 3).

Tableau 3 : protocole de production et chargement de vésicules de cellules HeLa avec du dextran 10 ou 70 kDa couplé au FITC.


Après une première centrifugation pour éliminer les débris cellulaires (2000 g durant 10 minutes), et une ultracentrifugation (Beckman Optima MAX XP, 1 10 000 g pendant 1 h). La concentration cellulaire a été déterminée avec le compteur de cellules NC200 (Chemometec), et la concentration et distribution en taille des vésicules a été calculée par NTA) (NS300, Malvern). Le signal luminescent des vésicules a été analysé par un lecteur de plaques (EnSpire, PerkinElmer). Vésicules et cellules ont été ensuite lysées chimiquement (Triton 0,3%) et la quantité en FITC déterminée au spectrophotomètre à fluorescence (Hitachi F7000), en utilisant les longueurs d’ondes d’excitation à 495 nm, et d’émission à 520 nm du FITC. Les vésicules extracellulaires obtenues ont été également analysées en imagerie par cytométrie en flux (Amnis® ImageStream®) en utilisant des anticorps anti-CD 63 PE et anti-CD 81 APC (Biolegend). Au total, 100000 événements ont été analysés. Les événements positifs au marquage FITC ont été ensuite classés dans les « gates correspondantes aux corps apoptotiques (AB pour apoptotic bodies), grandes vésicules (lEVs) et petites vésicules (sEV) en fonction de leur granularité ou complexité interne relative (« side scatter en anglais).

Le signal luminescent (luciférase) et fluorescent (FITC) pour les vésicules obtenues à une Lk de 245 pm et 48 pm en utilisant la sonde de FITC-dextran de 70 kDa a été évalué. Le signal luminescent est indicateur du nombre de vésicules produites par les cellules HeLa, il correspond à la luciférase liée à la protéine HSP70, qui est un marqueur cytosolique des vésicules, et produite par les cellules-mères. La fluorescence du FITC reflète la quantité de FITC-dextran internalisé dans les vésicules et donc la charge des vésicules en FITC-dextran.

Concernant la production de vésicules avec le FITC-dextran de 70 kDa (figure 1 1 ), une augmentation de la production de vésicules d’un facteur 2 en utilisant une Lk de 48 pm par rapport aux cellules chargées à une Lk de 245 pm est observée, que ce soit en NTA ou en signal luminescent (qui est trouvé proportionnel au nombre de vésicules compté en NTA). Une condition contrôle a été préparée à une LK de 48 pm mais en l’absence de la sonde de FITC-dextran de 70 kDa. La même augmentation du nombre de vésicules est observée en l’absence du cargo de 70kDa. En outre, l’analyse du signal fluorescent, indicatif de la présence de la sonde de FITC-dextran de 70 kDa, indique, à nombre égal de vésicules, une augmentation de 27% du signal fluorescent (figure 12), signant ainsi un chargement des vésicules plus important quand Lk=48 pm, par rapport aux conditions où Lk=245 pm.

L’augmentation de l’efficacité de chargement est observée quelle que soit la taille de la vésicule extracellulaire produite par les cellules (petites vésicules, grosses vésicule, corps apoptotique). Les différents types de vésicules et leur marquage ont été visualisés par imagerie en cytométrie en flux (ImageStream®, non montré) indiquant la présence des marqueurs fluorescents CD81 et CD63 et permettant de confirmer que les données de NTA correspondent bien à des vésicules extracellulaires et non pas des agrégats de débris cellulaires. L’analyse de cytométrie en flux (en plotant l’intensité du side scatter et l’intensité de marquage FITC) est indicative de leur chargement par les sondes FITC-dextran (figure 13 A et B). Les résultats chiffrés d’augmentation du chargement des vésicules extracellulaires quand une Lk inférieure à 100 mM est utilisée sont reportés dans le tableau 4 ci-dessous :

Tableau 4

Augmentation du chargement en cargo Taille de vésicule (Lk=48 miti vs Lk= 245 mm)

FITC-dextran 10 kDa FITC-dextran 70kDa

Petites vésicules +75,0% +46,3%

Grosses vésicules +263, 1% +460,0%

Corps apoptotiques +52,6% +92,0

Globalement, l’analyse de cytométrie en flux pour le marquage avec les anticorps anti-CD 63 PE et anti-CD 81 APC montre un nombre sensiblement également de vésicules extracellulaires marquées par l’un ou l’autre des anticorps (non montré). Ainsi l’augmentation de production de vésicules extracellulaires ne se fait pas au détriment de la qualité vésicules en termes de présence des marqueurs classiques des vésicules extracellulaires.

Ces résultats montrent que le choix d’une longueur de Kolmogorov(Lk) selon l’invention permet d’augmenter le rendement de production de vésicule de cellule HeLa, que le cargo n’a pas d’influence sur ce rendement et également un effet important de la Lk dans le chargement des vésicules. Il permet donc la production en plus grand nombre de vésicules mieux chargées, cela de manière indépendante quant au type de cellules (cultures primaire ou cellules immortelles cancéreuses, cellules souches, endothéliales, épithéliales, humaines ou animales) et sur un large intervalle de taille de cargo.

II découle de l’ensemble des résultats que le choix d’une longueur de

Kolmogorov adaptée, inférieure à 100 pm, permet d’optimiser significativement la production et le chargement de vésicules extracellulaires quelle que soit la taille du cargo envisagé et le type de cellules. Ainsi les vésicules extracellulaires produites selon l’invention ont une concentration en agent d’imagerie et/ou en agent thérapeutique plus importante que les vésicules extracellulaires produites selon les méthodes actuellement connues, telles que le chargement passif (sans ou à très faible agitation). En outre, la méthode selon l’invention ne comprend pas l’application d’un stress électrique sur les cellules via l’application d’une différence de potentiel comme la méthode d’électroporation.

Les figures 5 et 6 illustrent la biodistribution d’une formulation liposomale de la mTHPC (figure 5) et de mTHPC-EV (figure 6) en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Le devenir des EVs mTHPC à une longueur de Kolmogorov de 35 pm a été étudié dans un modèle tumoral de souris. La biodistribution à la suite d’une administration intraveineuse a été comparée à une formulation liposomale de la mTHPC (une formulation liposomique mTHPC) en tirant parti des propriétés d’imagerie du médicament. Les données sur la biodistribution (Figures 5 et 6) indiquent que les EVs mTHPC ont atteint une concentration maximale dans la tumeur plus rapidement (entre 6 et 15 h après l’injection) que la formulation liposomale de la mTHPC (entre 24 et 48 h après l’injection). L’absorption pulmonaire était plus élevée pour les EVs mTHPC que pour la formulation liposomale de la mTHPC. On a observé une absorption dans le foie aussi élevée pour les EVs mTHPC et la formulation liposomale de la mTHPC.

La figure 7 illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomale de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Une étude pharmacocinétique a révélé une diminution de la mTHPC dans la circulation après l’injection de la formulation liposomale de la mTHPC après un pic de 30 minutes après l’injection (Figure 7). À l’inverse, les concentrations sanguines de mTHPC ont augmenté étonnamment avec un pic à 6 h après l’injection. La diminution des concentrations plasmatiques de mTHPC à près de 0,2 ng/ml a atteint 6 h et 24 h après l’injection de la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC, respectivement.

La figure 8 illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard de croissance tumorale HT29 après traitement avec de la mTHPC libre ; la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC-EVs avec activation laser du médicament (thérapie photodynamique, thérapies tridimensionnelles), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés). Les inventeurs ont comparé l’effet thérapeutique des EVs mTHPC, de la formulation liposomale de la mTHPC et de mTHPC libre en termes de croissance de la tumeur, 90 jours après le traitement. Les diagrammes de Kaplan-Meier montrent que, sans activation médicamenteuse induite par laser, le mTHPC EV, la formulation liposomale de la mTHPC et le mTHPC libre avaient le même effet thérapeutique. Toutefois, la thérapie photodynamique pour les EVs mTHPC suivie de l’activation laser a permis d’obtenir un effet thérapeutique amélioré par rapport à la formulation liposomale de la mTHPC activée par laser et au mTHPC libre. Les résultats montrent que 0 % des tumeurs témoins ou du groupe traité par la thérapie photodynamique avec formulation liposomale de la mTHPC, ainsi que 20 % des tumeurs traitées par la thérapie photodynamique à la mTHPC, affichaient une croissance 10 fois plus élevée, tandis que cette valeur était de 33 % pour le groupe traité par le TDP de EV mTHPC au jour 90 (Figure 8).

Ainsi, comparées aux liposomes, les vésicules chargées d’agents actifs obtenues selon les procédés de la présente invention peuvent constituer une alternative très avantageuse tant du point de vue des propriétés de pharmacodynamie que de l’efficacité du traitement réalisé. Les liposomes sont connus pour la vectorisation de diverses biomolécules telles que des enzymes, hormones, oligonucléotides antisens, ribozymes, protéines ou

peptides ADN, molécules anticancéreuses (Farjadian et al. 2018). De telles molécules peuvent donc avantageusement être vectorisées par les vésicules chargées selon le procédé de l’invention à l’instar de la mTHPC. En effet, des agents actifs dans des formulations lipidiques font l’objet d’autorisation de mise sur le marché par les autorités de santé, par exemple :

- l’amphotéricine B (AmBisome®, autorisé dans le traitement des infections fongiques),

- la daunorubicine (Daunoxome®, autorisé dans le traitement du sarcome de Kaposi cutanéomuqueux extensif ou viscéral),

- l’irinotécan (Onivyde® autorisé dans le traitement des adénocarcinomes),

- la vincristine (Marqibo® autorisé dans le traitement leucémie aigüe lymphoblastique Phi négatif ou du lymphome lymphoblastique),

- la cytarabine (DepoCyte®, autorisé dans le traitement de la méningite lymphomateuse).

Un objet particulier de l’invention est donc un procédé de production de vésicules extracellulaires chargées par l’une de ces molécules et tel que décrit dans la présente demande dans l’un quelconque de ses modes de réalisation. Les vésicules ou cellules avantageusement chargées par ces agents par ledit procédé constituent également des objets de la présente invention. Un objet particulier est un procédé de chargement selon l’invention, une vésicule extracellulaire ou une cellule chargée selon ce procédé, caractérisé en ce que l’agent thérapeutique utilisé dans ce procédé et chargé dans les vésicules et/ou cellules productrices, est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine et la cytarabine.

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