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1. MXMX/a/2008/010893 - IMMUNOMODULATORY AND ANTI-TUMOUR PEPTIDES

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[ ES ]

PEPTIDOS CON CAPACIDAD ANTI-TUMORAL E INMUNOMODULADORA

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se encuadra dentro del campo de la inmunoterapia del cáncer. En particular con péptidos o combinaciones de ellos, provenientes de la región 32-51 de la proteína Factor anti-LPS de Limulus, los cuales no unen lipopolisacáridos y presentan propiedades anti-tumorales e inmunomoduladoras útiles para el tratamiento del cáncer y metástasis.

TECNICA ANTECEDENTE

Recientemente, se ha publicado el uso de modificadores de la respuesta biológica en el tratamiento para el cáncer principalmente en combinación con las terapias ya existentes buscando aumentar el beneficio del tratamiento (US 2004/0101511 ). Por otra parte, el uso de secuencias CpG las cuales son agonista del Receptor tipo Toll 9 (en inglés Toll-like receptor, abreviado TLR9) se están desarrollando como nuevas drogas para el tratamiento, control y prevención de múltiples indicaciones para cáncer ej: células no pequeñas de cáncer de pulmón, melanoma, carcinoma renal (Klinman D. M., et al, (2004) Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat Rev Immunol. 4:249-258). La activación del sistema inmune por un agonista del TLR7 se encuentra en ensayo clínico fase I con promisorios resultados como nueva droga para el tratamiento de melanoma y otros tumores (Dudek A. Z., et al (2005) ASCO Annual Meeting). Los anteriormente referidos agonistas de los TLR9 y TLR7 están siendo evaluados también en infecciones virales, dado su capacidad de promover una efectiva respuesta inmune en el hospedero. Además, las denominadas Heat shock protein (Hsp), las cuales se unen al TLR4, han sido desarrolladas y comercializadas como un producto de fusión con la oncoproteína E7. Este nuevo enfoque inmunoterapéutico también se conoce como vacunas terapéuticas y tiene amplia perspectiva en la terapia de enfermedades relacionadas con el virus del papilloma humano (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusión protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin Exp Immunol 121 :216-225). Los receptores tipo Toll son receptores que se encuentran en células del sistema inmune y reconocen patrones moleculares asociados a patógenos ejemplo: lipopolisacaridos (en inglés Lipopolysaccharide, abreviado LPS), ácido lipotecoico, secuencias no metiladas CpG, RNA viral de doble y simple cadena. El reconocimiento del patógeno invasor por los TLRs ayuda al sistema inmune a dirigir un tipo de respuesta compartida Th1/Th2 que le permite al organismo erradicar eficientemente la infección. El uso de agonistas de los TLRs como drogas para el cáncer, se basa en la activación del sistema inmune innato y adaptativo. Su principal mecanismo radica en la activación de una respuesta tipo Th1 , dada fundamentalmente por Interferones de tipo I (en inglés Interferon, abreviado IFNa. ) e ¡nterleucina-12 (IL-12). Esto conduce a una respuesta inmune adaptativa altamente específica y mantenida (Switaj T., Jalili A., et al., (2004) CpG Immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clinical Cáncer Research, Vol. 10:4165-4175). Esta dual activación del sistema inmune se diferencia de muchas otras aproximaciones inmuno-terapéuticas, las cuales son generalmente incapaces de crear un efecto mantenido sobre la respuesta inmune adaptativa y por otro lado la activación no especifica del sistema inmune innato conlleva a efectos no deseados (Speiser D. E, et al. (2005) Rapad and strong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. The Journal of Clinical Inv. Vol. 1 15 (3).
Las células dendríticas (en inglés Dendritic Cells, abreviado DC), son células profesionales presentadoras de antigenos, cuyo principal papel es vincular la respuesta inmune innata y adaptativa a través de la interacción directa célula-célula y la producción de citocinas. Las DC pueden ser de origen mieloide o linfoide atendiendo a la expresión de una serie de marcadores de superficie, así como a la expresión de diferentes TLRs. Las DC de origen linfoide conocidas como células dendríticas plasmacitoides son las principales productoras de IFNs de tipo I. En virtud de estas características, las células dendríticas han sido manipuladas como un promisorio adyuvante celular para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra el cáncer e infecciones virales crónicas (Santini S.M., et al (2003) A new type I IFN-mediated pathway for rapid differentiattion of monocytes into highly active dendritic cells. Stem Cells, 21 :357-362). Sin embargo, esta es una técnica altamente costosa y difícil por lo que en la actualidad se esta trabajando en encontrar estrategias alternativas mas practicas y menos costosas (Van Epps H.L. (2005) New hope for tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine, Vol.202:1615).
Originalmente descritos por su actividad antiviral, los Interferones de tipo I (IFNa.p), recientemente han mostrado ejercer importantes efectos sobre el sistema inmune, incluyendo la promoción de respuestas celular y humoral mediada por su efecto adyuvante sobre las células dendríticas (Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr, Opin Immunol. 12:419-424). Trabajos recientes muestran una función crítica para los Interferones de tipo I producidos endógenamente, en los procesos de regresión de un sarcoma murino singéníco altamente inmunogénico y en proteger al hospedero de la formación de tumores primarios carcinogénicos (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A critical function for type I interferons in cáncer immunoediting. Nature Immunology, June 12). Además, el Inferieron alpha juega un papel importante en la iniciación de la respuesta viral de los linfocitos T, vía una activación directa de los linfocitos T CD4+ y CD8+ en infecciones virales como Influenza (Fonteneau J.F, et al. (2003) Activatíon of influenza virus-specific CD+4 and CD+8 T cells: a new role for plasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101 : 3520-3526)
Por su parte, Hoess (WO 95/ 05393) relaciona su invención a sustancias las cuales se unen con gran afinidad al LPS y son de utilidad para la prevención o tratamiento de por ejemplo: sepsis mediadas por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas y para el tratamiento de infecciones bacterianas en general y por hongos. Dichas sustancias son péptidos que unen LPS conteniendo un dominio de unión para la endotóxina (Hoess A., et al, (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A0 resolution. The EMBO J. 12:3351 -3356). Esta revela un lazo o loop en la estructura de la proteína Factor anti-LPS de Limulus (en inglés Limulus anti-LPS factor, abreviado LALF) la cual tiene rasgos similares al polimixin B, por estar cargado positivamente, tener carácter anfipático y contener residuos hidrofóbicos y aromáticos expuestos. Por este mismo principio, argumenta la capacidad de la región comprendida entre los amino ácidos 31-52 de la proteína LALF de unirse y neutralizar los efectos asociados con la heparina, ejemplo: anticoagulacion, angiogénesis y la inhibición de la proliferación de células endoteliales y tumorales. Sin embargo no existe ningún dato experimental que soporte este argumento en la mencionada patente, de hecho las reivindicaciones otorgadas fueron las referentes a un aparato para remover LPS de una solución, dicho aparato comprende los péptidos inmovilizados a un soporte sólido (US 6,384,188).

Por otra parte, Vallespí (US 6,191 ,114) relaciona su invención al péptido que comprende los aminoácidos 31 -52 de la proteína LALF, el cual ejerce un efecto antiviral sobre células tipo Hep-2 y DBK en virtud de la inducción de IFN-α y γ; así como relaciona su invención al uso de dicho péptido para el tratamiento de infecciones virales y desordenes relacionados a inmunosupresion. Además, el mismo autor ha demostrado el efecto antiinfectivo de este péptido en modelos animales de sepsis, (Vallespí M.G. , et all (2003) A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acute infection in mice. International Immunopharmacology, 3:247-256).
Existe un número de terapias dirigidas al tratamiento del cáncer las que incluyen quimioterapia, radiaciones y terapia génica. Una desventaja de estas terapias es la toxicidad asociada a la mayoría de los tratamientos. Además, grandes dosis tienen que ser administradas por un largo periodo de tiempo antes de obtener un beneficio terapéutico. Por lo tanto, aun persiste la necesidad del desarrollo de nuevas drogas para acometer tratamientos más efectivos.
Sobre la base del papel crucial que juega el sistema inmune en detectar y dirigir una respuesta eficiente contra el tumor, el diseño de drogas que actúen sobre los mecanismos de defensa del hospedero tanto innato como adaptativo puede convertirse en poderosas herramientas para la terapéutica del cáncer.

Hasta el momento no se ha descrito sustituciones de amino ácidos específicos en la secuencia HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW de la proteína LALF, que permita eliminar la capacidad de unión al LPS y potenciar el efecto inmunomodulador, además de conferirle efecto anti-tumoral in vivo contra diferentes tumores.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención resuelve el problema antes mencionado, al proporcionar péptidos provenientes de la secuencia HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 13) que corresponde a la región 32-51 de la proteína LALF, en la cual se han introducido sustituciones de amino ácidos que garantizan eliminar la capacidad de unión al LPS y potencian el efecto antitumoral e inmunomodulador.
Los péptidos análogos derivados de dichas sustituciones las cuales no unen LPS ni heparina y muestran un mayor efecto anti-tumoral e inmunomodulador que el péptido parental presentan las siguientes secuencias:
HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1 )
HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 2)
HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 3)
HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 4) La capacidad de unión a LPS de los péptidos descritos por Hoess y Vallespí tienen como desventaja que su administración en presencia de LPS desvía el patrón de citocinas de un perfil compartido Th1/Th2 a uno predominante Th2, lo cual seria contraindicado en pacientes con cáncer. Estos pacientes generalmente presentan infecciones concomitantes producto de su estado inmunodeprimido, por lo cual no se descarta la presencia de partículas de LPS en sangre. La administración de un péptido que pueda inducir un tipo de respuesta predominante Th2 en presencia de la endotoxina seria un efecto no deseado que deterioraría aun mas el estado inmunológico del paciente, empeorando la respuesta del hospedero contra el tumor. Además, la unión al LPS, por parte del péptido reportado por Vallespí, podría minimizar el efecto inmunomodulador descrito para este péptido. Por otro lado, la no unión a heparina de los péptidos descritos en esta invención tiene ventajas sobre los descritos anteriormente por Hoess y Vallespí. En pacientes críticos como por ejemplo: cardiopatía isquémica, enfermedad cerebrovascular, enfermedad tromboembólica venosa (trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar), isquemia de miembros inferiores, el uso de heparina esta indicado como tratamiento (D. Cabestrero Alonso, et al (2001 ) Heparinas de bajo peso molecular en pacientes críticos: usos, indicaciones y tipos. Medicina Intensiva, Vol.95:18-26), por lo que la administración de un péptido que tenga la propiedad de unirse a heparina podría estar contraindicado por bloquear el efecto de dicha droga en ese contexto. La asociación entre cáncer y enfermedades relacionadas a trombo-embolismos es un fenómeno bien conocido y puede contribuir significativamente a la morbilidad y mortalidad del paciente con cáncer, como por ejemplo la trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar. Por las razones antes expuestas es ventajoso disponer de péptidos que no unan heparina y tengan efecto antitumoral e inmunomodulador en el tratamiento del paciente con cáncer, el cual en un gran porciento son sometidos a cirugía y presentan otros trastornos como hipercoagulabilidad, (Castelli R., et al (2004) The heparins and cáncer: Review of clinical triáis and biological properties. Vascular Medicine, Vol.9:1-9).
La invención también incluye péptidos, donde dos o más residuos aminoacidicos son sustituidos por alanina y comprenden las secuencias de amino ácidos:
HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)
HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)
HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)
HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1 1 )
HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)
y cualquier variante homologa o mimética de los péptidos anteriores, que haya sido obtenida por vía sintética o recombinante, así como cualquier péptido de fusión que los contenga. Se entiende por variante homologa a cualquier péptido que no tenga capacidad de unión al LPS o heparina y mantenga un efecto anti-tumoral e inmunomodulador. Igualmente se entiende por variante mimética a cualquier molécula de origen químico (no proteico) cuya estructura no tenga capacidad de unión al LPS o heparina y mantenga un efecto anti-tumoral e inmunomodulador.
En una modalidad preferida de la invención, la composición farmacéutica contiene uno o más de los péptidos y compuestos químicos o sus sales farmacéuticamente aceptables, así como excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica contiene adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno bacteriano, viral y de cáncer.
Igualmente los péptidos de la invención pueden emplearse combinados con los tratamientos convencionales contra el cáncer, como por ejemplo quimioterapia, cirugía, radiación, etc.
También es parte de la presente invención el uso de los péptidos y los compuestos químicos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de desordenes ¡nmunológicos, en los cuales se necesite desarrollar una efectiva respuesta inmune tipo Th1 ; tratamiento y/o prevención del cáncer, así como para desarrollar una efectiva respuesta inmune ante infecciones de origen bacteriano y viral.
Los péptidos descritos se definieron por su capacidad de no unir el LPS, ya que la secuencia original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW está previamente descrita como dominio consenso óptimo para la unión al LPS (Hoess et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Asimismo, los péptidos descritos en esta invención potencian el efecto inmunomodulador dado por la expresión de IFN-α, comparado al péptido de la proteína LALF que comprende los amino ácidos 31-52, el cual Vallespí en su invención (US 6,191 ,114) refiere como un péptido anti-viral e inmunomodulador.
Igualmente, los péptidos descritos en esta invención pueden ser administrados a pacientes que están inmunosuprimidos y necesitan una activación de la capacidad de respuesta del sistema inmune ej; pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), pacientes sometidos a cirugías complejas.
De igual forma los datos experimentales in vivo demuestran la efectividad de los péptidos análogos en tumores ya implantados en ratones, provenientes de células murinas de melanoma B16; células epiteliales de pulmón malignizadas derivadas de ratones C57BL/6 y células 3LL-D122 provenientes de cáncer de pulmón de ratón.
En otra materialización la administración de los péptidos puede ser usada para reducir eventos de metástasis.
Otros resultados de la presente invención indican que los péptidos descritos tienen efecto antiproliferativo sobre líneas tumorales de diferentes orígenes histológico, demostrando un efecto citotóxico directo sobre las células cancerígena.

En principio, los péptidos descritos pueden ser utilizados solos o en combinación con las terapias actuales para el tratamiento del cáncer, como ejemplo: cirugía, radiación, quimioterapia.
Igualmente, los péptidos descritos en esta invención administrados profilácticamente conlleva a una rápida respuesta inmune innata contra el tumor, con un subsiguiente desarrollo de una respuesta inmune adaptativa antigeno especifica, enfatizando su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra cáncer.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1A: Efecto de los péptidos sobre la capacidad de unir lipopolisacárido bacteriano (LPS). Estos experimentos se realizaron por triplicado, se muestran las curvas de inhibición de un experimento.

Figura 1 B: Porcientos de inhibición con la media de tres experimentos independientes.
Figura 2: Efecto de los péptidos sobre la capacidad de unir el compuesto aniónico heparina. Se muestra la media de tres experimentos independientes.
Figuras 3A y 3B: Efecto de los péptidos sobre la producción de IFNa.y e IL-12 en células mononucleares humanas. Se realizaron tres experimentos con donantes diferentes. Se muestran los resultados de un donante.
Figuras 4A y 4B: Efecto antitumoral de los péptidos en el modelo de tumor TC-1 .
Figuras 5A y 5B: Efecto antitumoral del péptido L-2 en el modelo melanoma.
Figuras 6A y 6B: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de administración profiláctico en el modelo de tumor TC-1.
Figuras 7A y 7B: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en un esquema de doble reto con las células tumorales TC-1 .
Figura 8: Capacidad anti-metástasis del péptido análogo L-2.
Figura 9: Efecto del péptido análogo L-2 sobre la proliferación de células TC-1 , H-125 y L929.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Síntesis de péptidos

Los péptidos de la invención son sintetizados usando un procedimiento en fase sólida. El péptido crudo es extraído con una solución de ácido acético al 30%, liofolizado y posteriormente purificado por RP-HPLC. La masa molecular de los péptidos purificados son verificadas usando un espectómetro de masa JEOL JMS-HX1 10HF con un FAB gun. La preparación resultante es no antigénica, no pirogénica y farmacéuticamente aceptable para su administración en animales y humanos. Las sustituciones se realizaron puntualmente introduciendo el amino ácido alanina en cada una de las posiciones de la secuencia original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW.

EJEMPLO 2
Selección de péptidos análogos que no presentan capacidad de unión al
lipopolisacárido (LPS)

Este ensayo consiste en un sistema de competencia de tipo

ELISA (Hardy E. , et al (1994) Enhanced ELISA sensitivity using TCA for efficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J. Immunol. Meth. Vol.176:1 1 1 -1 16). Placas de poliestireno (Costar.USA) se recubrieron con LPS de E.coli 01 1 1 :B4 (1 μg/mL) con el empleo de ácido tricloroacético (TCA) al 0.2%. Las placas se incubaron toda la noche a 37°C y luego se lavaron 10 veces con tampón fosfato salino (PBS 1 X) con tween-20 al 0.1 % (solución de lavado). La unión de los péptidos análogos al LPS fijado en la superficie sólida se evaluó por competencia directa con el péptido LALF32.51 marcado con biotina (LALF32-5i-biot¡na) a una concentración de 0.2 μΜ, para la que se obtenía un 90% de la unión máxima al LPS. Para estimar las curvas de inhibición, se utilizaron diferentes concentraciones de los péptidos análogos desde 10 μΜ hasta 0.01 μΜ y como control del experimento se realizo la curva del LALF32-51. El LALFa^s biotina, en presencia de los péptidos análogos, se incubo durante 2 h a 37°C y luego las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado. El LALF32,5 -biotina unido al LPS se detecto por incubación durante 45 min a 37°C con estreptavidina conjugada a peroxidasa (estreptavidina-peroxidasa) en dilución 1 :2000. Las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado y se añadió entonces la solución de sustrato (tampón citrato-fosfato 0.05 M pH 5.5, 1 tableta de 3,3 ,5,5 -tetrametilbenzidine, peróxido de hidrogeno al 0.025%). Se incubo por 15 minutos adicionales y se detuvo la reacción por adición de ácido sulfúrico 2 M. La absorbancia a 450 nm se cuantifico utilizando un lector de placas (Sensident Sean). Existe una correlación entre los valores de densidad óptica y la capacidad de unión al LPS de los péptidos análogos. Péptidos análogos con mayor capacidad de unión al LPS presentan curvas de inhibición con valores de D.O menor respecto a la curva de inhibición del LALF32-51.
Péptidos análogos con menor capacidad de unión al LPS presentan curvas de inhibición con valores de D.O mayor respecto a la curva de inhibición del LALF32-5i . Los resultados de este ejemplo plasmados en la figura 1A, demostraron que los péptidos denominados L-2, L-8, L-12 y L-20 pierden la capacidad de unión al LPS, sin embargo los péptidos L-9 y L-19 evidencian una capacidad de unión al LPS similar al LALF32-5i . Por su parte el análogo L-3 muestra una mayor capacidad de unión al LPS.
En la figura 1 B se presentan los porcientos de inhibición de los péptidos análogos, a una concentración fija de 0.5 μΜ, en cuanto a la capacidad de desplazar la unión del LALF32-5rbiotina (0.2 μΜ) al LPS fijado a superficie sólida.
% de inhibición = { 1- (( [D.O] muestra - [D.O] min ) / ( [D.O] max - [D.O] min ))} χ100
[D.O] muestra: Valor de densidad óptica en presencia de una concentración fija de los péptidos análogos;

[D.O] min: fondo del ELISA;
[D.O] max: Valor de densidad óptica en ausencia de los péptidos análogos.
CUADRO 1
Secuencia de los péptidos utilizados en los ejemplos



Como resultado de estos análisis realizamos mutaciones dobles, triples y en cuatro amino ácidos, partiendo de los péptidos que no unen LPS:
HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)
HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)
HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)
HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1 1 )
HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)

EJEMPLO 3
Evaluación de la unión a heparina de los péptidos análogos L-2,
L-8, L-12 y L-20

Este ensayo consiste en un sistema de competencia de tipo

ELISA, similar al descrito anteriormente. El péptido LALF32-5i-biotina en PBS 1X se fijo a placas de poliestireno (Costar.USA) y se incubo toda la noche a 4°C. Los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 a una molaridad de 2 μΜ se mezclaron con 250 unidades de heparina (Heparina sódica, 5000 U/mL, Liorad) en PBS+0. % de albúmina bovina (BSA). Posteriormente, fueron añadidos a la placa de ELISA conteniendo 0.02 μΜ del péptido LALF32-5-i-biotina unido a superficie sólida. Pasado 1 h de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado, y el péptido LALF32-5i-biotina fijado a superficie sólida se detecto por incubación durante 45 min. a 37°C con estreptavidina conjugada a peroxidasa (estreptavidina-peroxidasa) en dilución 1 :2000. Seguidamente, las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado y se añadió entonces la solución de sustrato. Se incubo por 5 min. adicionales y se detuvo la reacción por adición de ácido sulfúrico 2 M. La no unión a heparina de los péptidos análogos correlaciona con la disminución de la densidad óptica, ya que estos no son capaces de desplazar la unión del péptido LALF32-5i-biotina fijado a superficie sólida a la heparina. Paralelamente se incluye como control en el ensayo el LALF32-5i no marcado en un exceso molar de 100X. La unión a heparina del péptido LALF32-51 no marcado se demuestra por el aumento de los valores de densidad óptica, ya que el exceso de péptido frío compite por la unión a la heparina. Como se puede observar en la figura 2, los resultados indican que los péptidos L-2, L-8, L- 2 y L-20 descritos en esta invención no se unen a la heparina.

EJEMPLO 4
Efecto de los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 sobre la expresión de IFN-a, IFN-γ e IL-12 en células mononucleares humanas

Para este ensayo se realizó el aislamiento de células mononucleares humanas por gradiente de Ficoll-Hypaque a partir de un concentrado leucocitario "Buffy Coat" de un donante. Un total de 5x106 células se sembraron en placas de 24 pozos en medio RPMI 1640+10% de suero fetal bovino. Luego se añadió cada péptido a una concentración de 40 μg/mL en un volumen de 0.1 mL en medio RPMI y el cultivo celular se mantuvo durante 18 horas a 37°C y 5% de C02. La extracción de RNA total se realizo por el método de TriReagent. Posteriormente la expresión de los genes para IFN-a, IFN-γ e IL-12 se determino por la técnica de reacción de trascripción reversa y amplificación por PCR (Kit de RT-PCR Perkin Elmer). Los resultados son mostrados como niveles relativos de RNA mensajero normalizados con el gen de la β-actina. Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que los péptidos L-2, L-8, L-12 y L-20 descritos en esta invención son capaces de inducir la expresión de los genes para IFN-γ e IL-12, figura 3A. Los péptidos análogos L-2, L-8 y L-12 son particularmente mas efectivos en la inducción del gen para IFN-α que el péptido LALF32-5i , figura 3B. Este ejemplo demuestra que sustituciones de amino ácidos en la secuencia original 32-51 de la proteína LALF elimina la capacidad de unión al LPS y potencia el efecto inmunomodulador.

EJEMPLO 5
Efecto antitumoral de los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 en el
modelo de tumor TC-1

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantación del tumor en este modelo, se usaron las células TC-1 derivadas de células epiteliales de pulmón de C57BL/6 malignizadas, las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Una cantidad de 50,000 células en un volumen de 200 μί fue inoculada a los ratones por vía subcutánea en la pata posterior derecha. La 1ra administración de los péptidos se realizo subcutánea en el flanco derecho una vez que los tumores alcanzaron 100 mm3 de volumen, la 2da inyección se realizo 0 días después. En este ensayo se evaluó una dosis de 4 mg de péptido por Kg de peso (80
Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral de los péptidos de interés fue la sobrevida de los animales y la masa tumoral, como se puede observar en las figura 4A y figura 4B. Los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 fueron efectivos en cuanto a la capacidad de inhibir la progresión del tumor y aumentar la sobrevida de los ratones, respectivamente. Estos resultados evidencian la eficacia antitumoral de los péptidos análogos en un modelo de tumor sólido. El análisis estadístico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizo por el método de Log Rank. Los resultados evidencian que los péptidos análogos L-2, L-8, L-1 2 y L-20 aumentan significativamente (*p< 0.05) la sobrevida de los animales en comparación al péptido LALF32-51. Estos resultados demuestran que sustituciones de amino ácidos en la secuencia original 32-51 de la proteína LALF pueden aumentar significativamente la capacidad antí-tumoral.

EJEMPLO 6
Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en el modelo de melanoma

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantación del tumor en este modelo, se usaron las células MB16-F10 las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Una cantidad de 15 000 células en un volumen de 200 μL· fue inoculada a los ratones por vía subcutánea en la pata posterior derecha. Pasado 4 días de la inoculación de las células tumorales se administro el péptido L-2, la segunda inyección se realizo 7 días después de la 1 ra inyección y 14 días posteriores se realizo la tercera inyección. En este ensayo se evaluó una dosis de 4 mg de péptido por Kg de peso. Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral del péptido de interés fue el tiempo de prendimiento del tumor y la sobrevida de los animales. Como se puede observar en la figura 5A, el péptido análogo L-2 retardó significativamente el prendimiento del tumor ( p< 0.05, método de Log Rank). El análisis de sobrevida realizado por el método de Log Rank, demostró que el péptido L-2 aumentó significativamente (*p< 0.05) la sobrevida de los animales, siendo más efectivo que el péptido LALF32-51 figura 5B. Estos resultados evidencian la eficacia antitumoral del péptido L-2 no solo para células epiteliales de pulmón sino también para células tumorales de otras localizaciones y tipos histológicos como la de melanoma.

EJEMPLO 7
Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de tratamiento
profiláctico en el modelo de tumor TC-1

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantación del tumor en este modelo, se usaron las células TC-1 , las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Los ratones recibieron una primera inyección del péptido L-2 (4 mg de péptido por Kg de peso), pasado 7 días recibieron una segunda inyección utilizando la misma dosis; pasado 14 días de la primera inyección de péptido, los animales se inocularon con 50,000 células TC-1 en un volumen de 200 μΙ_ de PBS por via subcutánea en la pata posterior derecha. Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral del péptido de interés fue el tiempo de prendimiento del tumor, figura 6A y la sobrevida de los animales, figura 6B. Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que el péptido L-2 de esta invención es efectivo en cuanto a prevenir el desarrollo del tumor y aumentar la sobrevida de los animales. Estos resultados evidencian que el péptido de esta invención tiene un efecto profiláctico, previniendo la aparición del tumor.

EJEMPLO 8
Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de doble reto

Para este ensayo los animales que no tuvieron prendimiento del tumor en el esquema anterior (n=6 animales), se retaron por segunda vez con 50,000 células TC-1 en un volumen de 200 μί de PBS por vía subcutánea en la pata posterior izquierda (día 49 a partir del primer reto). Como control de este experimento se inocularon la misma cantidad de células tumorales en ratones "naive" del mismo lote (para garantizar homogeneidad de los ratones y edad) mantenidos en iguales condiciones pero que nunca recibieron el péptido, (n=10 animales). Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral del péptido L-2 fue el tiempo de prendimiento del tumor y la sobrevida de los animales. Los resultados obtenidos en este ensayo demuestran que el péptido L-2 es capaz de proteger a los ratones de un segundo reto con las células tumorales, en cuanto al retardo en la aparición del tumor (figura 7A) y en el aumento de la sobrevida, figura 7B. Este resultado evidencia que el péptido de esta invención es capaz de proporcionar una mantenida respuesta anti-tumoral a un segundo golpe con las células tumorales, lo que evidencia el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa antigeno especifica.

EJEMPLO 9
Efecto antitumoral del péptido análogo L-2, en el modelo de metastásis
de Carcinoma de Lewis

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=8 animales/grupo experimental). En los animales se inocularon en la almohadilla plantar posterior derecha 250,000 células 3LLD122 de cáncer de pulmón de ratón. Pasado 7 días se inyecto por vía subcutánea una dosis de péptido L-2 de 4 mg por Kg de peso. Cuando los tumores alcanzaron 8 mm de diámetro se elimino el tumor primario mediante escisión quirúrgica de la pata portadora. Los ratones se sacrificaron 21 días después de este procedimiento. Los pulmones se pesaron como parámetro indicador de la cantidad de metastásis presentes en los mismos. Los resultados mostrados en la figura 8 indican que el péptido análogo L-2 de esta invención es capaz de reducir los eventos de metastásis.

EJEMPLO 10
Efecto del péptido análogo L-2 sobre el crecimiento de células tumorales

Para este ensayo las células TC-1 , H-125 (células no pequeñas de cáncer de pulmón humano) y L929 (fibroblastos murino), se sembraron en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 2 x 104 células/ml en medio Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, los péptidos fueron adicionados al medio de cultivo en un rango de dosis entre 9 μΜ y 300 μΜ. La incubación fue realizada por espacio de 72 horas en presencia de CO2 al 5% y al termino de la misma se revelo con violeta cristal. Las placas se lavaron extensamente con agua corriente y finalmente se realizo la lectura de la placa a una absorbancia de 562 nm. Los resultados son mostrados en la figura 9. Para este ensayo se empleó como control positivo un péptido proapotótico con un demostrado efecto antiproliferativo in vitro (Perea, S., et al (2004) Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs the Phosphorylation by the Protein Kinase 2 Cáncer Research 64: 7127-7129). Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que el péptido L-2 produce un efecto antiproliferación, de manera dependiente de la dosis, sobre las células TC-1 y H-125. Sin embargo ningún efecto se observó con el péptido de esta invención en la línea celular L929 de fibroblastos murino. Este resultado demuestra que el péptido de esta

invención tiene efecto citotóxico selectivo sobre células tumorales in vitro.