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1. WO2014170031 - METHOD FOR COMBINATORIAL PARTICLE MANIPULATION FOR PRODUCING HIGH-DENSITY MOLECULE ARRAYS, IN PARTICULAR PEPTIDE ARRAYS, AND MOLECULE ARRAYS THAT CAN BE OBTAINED BY MEANS THEREOF

Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters

[ DE ]

VERFAHREN ZUR KOMBINATORISCHEN PARTIKELMANIPULATION ZUR HERSTELLUNG VON HOCHDICHTEN MOLEKÜLARRAYS, INSBESONDERE VON PEPTIDARRAYS, UND DAMIT ERHÄLTLICHE MOLEKÜLARRAYS

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kombinatorischen Partikelmanipulation zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays sowie die daraus erhaltenen hochdichten Molekülarrays. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays, durch kombinatorische Strukturierung von Partikeln, wobei die Strukturierung durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung erreicht wird.

In der Mikroarray-Technologie wird eine Vielzahl an verschiedenen Molekülen in einem vordefinierten Muster auf einer Substratoberfläche in immobilisierter Form angeordnet.

Diese Technologie erlaubt es, Analysen und/oder chemische Reaktionen an einer sehr hohen Anzahl verschiedener Substanzen durchzuführen und wird bevorzugt in der biotechnologischen Forschung und der pharmazeutischen Industrie für Hochdurchsatzscreenings eingesetzt.

Dies ist insbesondere bei der Synthese größerer Moleküle von Vorteil, deren Eigenschaften und insbesondere deren Wechselwirkungen miteinander oftmals so komplex sind, dass diese nur experimentell erforscht werden können. In der kombinatorischen Chemie ermöglichen es solche Molekülarrays, alle darauf synthetisierten Produkte parallel auf gewisse Eigenschaften zu untersuchen. Im Fall von Peptidarrays können dies zum Beispiel Antikörperwechselwirkungen sein. Allerdings mangelt es an Verfahren, um solche Molekülarrays in hoher Qualität und in der nötigen Auflösung herzustellen.

Die Herstellung von in-situ Peptidarrays wurde erstmals in Frank R., Tetrahedron, 48 (1992), 9217-9232, beschrieben, wobei eine Festphasen-gekoppelte Peptidsynthese (Merrifield-Synthese) angewendet wurde. Dazu werden die 20 verschiedenen Aminosäurederivate in einem Lösungsmittel auf definierte Spots eines aminoterminierten Trägers aufgebracht und somit Schicht für Schicht viele Peptide in einer kombinatorischen Synthese nebeneinander aufgebaut. Ein Nachteil dieser "SpotSynthese" ist jedoch, dass damit bisher nur etwa 25 Peptide pro cm2 synthetisiert werden können. Dies liegt darin begründet, dass kleine Flüssigkeitströpfchen sehr schwer zu dosieren sind, so dass die benötigten viskosen Lösungsmittel an der Oberfläche entlang "kriechen", und dass diese Tröpfchen während der Kupplungsreaktion längere Zeit nicht verdunsten dürfen.

Im Stand der Technik wurden zuletzt verschieden Methoden zur Herstellung von Peptidarrays vorgeschlagen. Bestehende Systeme basieren auf der Xerographie zur kombinatorischen Ablagerung von Partikeln. Die verwendeten Partikel enthalten Aminosäurederivate. Dabei ist es möglich, unter Verwendung eines speziellen Laserdruckers für die partikel basierte Synthese Peptidarrays zu produzieren, wie in Stadler, V., et al., "Kombinatorische Synthese von Peptidarrays mit einem Laserdrucker", Angewandte Chemie, 2008, 120 (37), 7241 -7244 beschrieben und wie auch in EP 1 140 977 B1 oder DE 101 56 329 A1 beschrieben, erzeugt dabei das Lichtmuster einer LED-Zeile zunächst ein Ladungsmuster auf einer Fotowalze. Triboelektrisch aufgeladene Partikel setzen sich auf die gegensätzlich geladenen Bereiche der Fotowalze und es entsteht ein Partikelmuster. Dieses Partikelmuster wird von der Fotowalze auf einen Träger übertragen. Anschließend werden die Partikel durch Erhitzen auf dem Träger fixiert. Ein solches Verfahren erlaubt es jedoch nicht, die Partikel direkt zu strukturieren.

Obwohl sich die vorstehend beschriebenen Laserdrucker für die partikelbasierte Synthese und Produktion von Peptidarrays bereits kommerziell bewährt haben, können mit diesen Druckern zudem nur Partikelmuster mit einem Rastermaß, d.h. einen Mittelpunkt-zu-Mittelpunkt-Abstand der Spots, von 350 μm erzielt werden. Des Weiteren ist die Anzahl der für eine Synthese einsetzbaren Monomere durch

die Anzahl der Druckwerke im Laserdrucker begrenzt. Da die Druckwerke exakt zueinander justiert sein müssen, nimmt mit jedem Druckwerk die Störanfälligkeit zu. Da mit jedem weiteren Druckwerk auch die Komplexität des Druckers zunimmt, ist der Bau eines Druckers mit 20 Druckwerken oder mehr bei gleich bleibender Druckgenauigkeit sehr teuer.

Ein anderes Verfahren basiert auf der Verwendung eines Halbleiterchips, wie beispielsweise in Beyer, M., et al., "Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a microchip", Science, 2007, 318 (5858), 1888, beschrieben. Dabei handelt es sich um einen speziellen Hochspannungs-CMOS-Chip, dessen Oberfläche in verschiedene Elektroden unterteilt ist. Durch Programmierung des Chips können bestimmte Elektroden eingeschaltet werden. Durch die entstehenden elektrischen Felder werden geladene Partikel selektiv auf den eingeschalteten Elektroden abgelagert. Die Synthese des Molekülarrays kann entweder direkt auf der Chipoberfläche durchgeführt werden, oder das gesamte Partikelmuster auf dem Chip wird mittels eines elektrischen Feldes auf einen Zielträger, wie beispielsweise einen Glasobjektträger, übertragen, wo auch die Synthese stattfindet.

Beim Hochspannungs-CMOS-Chips ist die nutzbare Fläche des Chips bedingt durch den Herstellungsprozess sehr klein, bei aktuellen Modellen 12 mm x 12 mm. Dies bedeutet, dass die Anzahl an unterschiedlichen Molekülen durch die zur Verfügung stehende Fläche sehr begrenzt ist.

Beim chipbasierten Verfahren findet die selektive Ablagerung von Partikeln aus einem Aerosol statt. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, müssen sehr hohe Anforderungen an die Aerosolparameter gestellt werden, wie beispielsweise Aerosoldichte, Partikelgeschwindigkeit und Partikelladung. Dies ist in der Praxis jedoch nur schwer durchführbar und führt zu Problemen und Verzögerungen, da sehr viele Einflussgrößen beachtet werden müssen, wie beispielsweise Aerosolführung, Strömungsdynamik, Partikelgrößenverteilung, Luftfeuchtigkeit, etc.

Daneben sind lithographische Verfahren zur Herstellung von Peptidarrays bekannt, die auf photolabilen Schutzgruppen basieren, die durch die Bestrahlung mit Licht abgespalten werden, wie beispielsweise in Fodor, S.P.A., et al., "Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis", Science, 1991 , 251 (4995), 767-773 beschrieben.

Bekannte lithographische Methoden weisen einen prinzipiellen Nachteil auf. Für jedes der unterschiedlichen Monomere muss gesondert der Kopplungszyklus durchlaufen werden, d.h. jede Art von Monomer wird aufgebracht, gekoppelt und überschüssige Monomere werden weggewaschen, gefolgt von der nächsten Art von Monomer, so dass beispielsweise bei der kombinatorischen Peptidsynthese Schicht für Schicht jeweils 20 Kopplungszyklen durchlaufen werden müssen. Dies führt zu Qualitätsproblemen der resultierenden Molekülbibliotheken, da bei jedem Kopplungszyklus zu erwartende Nebenprodukte bzw. Artefakte entstehen können. Daher werden lithographische Verfahren bisher fast nur für die Synthese von Oligonukleotidarrays verwendet, da hierbei nur vier verschiedene Monomere an den Träger gekoppelt werden müssen.

Bislang ist bei den lithographischen Techniken zur Peptidarrayherstellung die Peptidausbeute auf Grund der komplexen Chemie folglich nicht hoch genug, um diese Technik zu etablieren.

Neben den vorstehend erwähnten Methoden wurde die Ablagerung von Mikropartikeln in den Vertiefungen eines strukturierten Trägers in Yin, Y., et al., "Template-assisted self-assembly: a practical route to complex aggregates of monodispersed colloids with well-defined sizes, shapes, and structures", Journal of the American Chemical Society, 2001 , 123 (36) 8718-8729 und in Kim, Y.H., et al., "Selective assembly of colloidal particles on a nanostructured template coated with polyelectrolyte multilayers", Advanced Materials, 2007, 19 (24) 4426-4430 vorgeschlagen.

Ausgehend hiervon liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays, insbesondere von Peptidarrays, bereitzustellen, welches die bekannten Nachteile und Einschränkungen des Stands der Technik überwindet.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände gelöst.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays mit einem Rastermaß von ≤ 300 μm bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(i) das Bereitstellen eines Zielträgers mit einer Vielzahl an diskreten Spots,

(ii) das Konditionieren ausgewählter Spots durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, und

(iii) das Umsetzen mindestens eines Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel direkt beeinflusst und somit strukturiert werden:

- entweder indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten fixiert und/oder zu definierten Orten transferiert werden, oder

- indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten entfernt werden, um somit den Zugang zu diesen Orten zu ermöglichen.

Beide Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens zur kombinatorischen Strukturierung von Partikeln ("combinatorial particle patterning") vereinen die technischen Vorteile der lithographischen und der partikelbasierten Strukturierungsmethoden und vermeiden gleichzeitig deren Nachteile, wie im Folgenden im Detail beschrieben wird.

Unter dem Begriff "Molekülarray" wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine auf einem Träger gebundene Molekülbibliothek verstanden, wobei letztere die Gesamtheit von vielen unterschiedlichen, an definierten Orten des Trägers (sog. Spots) gebundene Moleküle einschließt. Dieser Träger, auf welchem die Moleküle gebunden sind, wird auch als Zielträger bezeichnet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich einen hochdichten Molekülarray mit einem Rastermaß von≤ 300 μm herzustellen. Dies bedeutet, dass der Abstand der einzelnen Spots, auch Pitch genannt, gemessen jeweils vom Mittelpunkt,≤ 300 μm beträgt. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt das Rastermaß des Molekülarrays vorzugsweise≤ 200 μm, mehr bevorzugt≤ 150 μm und besonders bevorzugt≤ 100 μm.

Im Folgenden werden unter dem Begriff "Array" sowohl Träger, bei denen unterschiedliche Moleküle im Wesentlichen in nur zwei Dimensionen angeordnet sind, als auch poröse Träger oder Träger mit einer strukturierten Oberfläche verstanden, bei denen die unterschiedlichen Moleküle in einer zusätzlichen dritten Dimension vorliegen.

Ferner wird unter dem Begriff "diskreter Spot" ein Bereich eines (Ziel)-Trägers verstanden, der räumlich von benachbarten Spots getrennt ist. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung die Spots sowohl aufgrund einer geometrischen Formgebung als auch aufgrund unterschiedlicher Oberflächeneigenschaften von den benachbarten Spots getrennt vorliegen. Beispielsweise können diese in Form dünner Trennwände oder mittels Stegstrukturen voneinander getrennt sein oder in Form von Vertiefungen vorliegen. Außerdem ist es möglich, dass die Spots beispielsweise aufgrund unterschiedlicher Benetzungseigenschaften der Oberfläche des Trägers als diskrete Bereiche vorliegen.

Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten fixiert und/oder zu definierten Orten transferiert werden.

Insbesondere umfasst diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die vorstehend definierten Schritte (i) des Bereitstellens eines Zielträgers mit einer Vielzahl an diskreten Spots, (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, und des Umsetzens mindestens

eines Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden, wobei mindestens ein Ausgangsträger mit einer Materialschicht in Form einer Partikelschicht oder Filmschicht bereitgestellt wird, in der das mindestens eine Monomer enthalten ist, und wobei der Schritt (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots das selektive Übertragen von Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger und das ortsgenaue Fixieren dieses Materials auf dem Zielträger umfasst, wobei das Übertragen und/oder Fixieren mittels elektromagnetischer Strahlung erfolgt.

Bei diesem Verfahren wird ein Ausgangsträger verwendet, der gleichmäßig mit einer Partikelschicht als Materialschicht belegt ist. Diese Partikelschicht enthält Monomere, beispielweise in Form von Monomerpartikeln, für die kombinatorische Synthese von Molekülarrays. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff Monomerpartikel solche Partikel verstanden, die Monomere oder andere chemische Bausteine für die Herstellung von Molekülarrays enthalten. Diese Monomerpartikel bestehen dabei im Wesentlichen aus einer Polymermatrix, in die geeignete chemische Bausteine bzw. Monomere für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder von Oligonukleotidarrays, eingebettet sind. Diese Monomere können zum Beispiel Aminosäurederivate zur Synthese von Peptidarrays sein.

Als Polymermatrix können gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise Polymere wie Polystyrol-n-Butylacrylat-Copolymere, Styrol-Acrylat-Copolymere, Polydimethylacrylamid, Polyester- und Epoxyharze verwendet werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Des Weiteren können den Monomerpartikeln weitere Stoffe zugesetzt werden, mit der Einschränkung, dass diese die kombinatorische Kupplungsreaktion nicht stören dürfen. Für die Peptidsynthese dürfen diese Bestandteile insbesondere keine NH2oder SH-Gruppen enthalten, für die Oligonukleotidsynthese sollten sie zusätzlich auch keine OH-Gruppen enthalten. Beispielsweise können den Monomerpartikeln Eisenkomplexe zugesetzt werden, um die elektrische Aufladung der Monomerpartikel einzustellen oder Stoffe, die das Absorptionsverhalten beeinflussen. Diese Auf gabe kann durch eine Vielzahl von chemisch inerten und gleichzeitig Licht absorbierenden Substanzen übernommen werden, wie beispielsweise Graphitnanopartikeln, Rußpartikeln, Fullerenen oder Bromphenolblau.

Alternativ zu einem Ausgangsträger mit einer Schicht aus Monomerpartikeln, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Ausgangsträger verwendet werden, der mit einem gleichmäßigen Monomerfilm belegt ist, der wie die Monomerpartikel aus einer Polymermatrix besteht und in welchen Monomere sowie gegebenenfalls weitere Stoffe wie Absorbermaterialien eingebettet sind. Bei ausreichender mechanischer Stabilität der Polymermatrix kann auch eine selbst tragende Folie oder ein Block aus den genannten Materialien eingesetzt werden.

Entsprechend wird unter dem Begriff Monomerfilm eine Materialschicht verstanden, die Monomere oder andere chemische Bausteine für die Herstellung von Molekülarrays enthält.

Wie bereits vorstehend beschrieben kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Materialschicht auf dem Ausgangsträger in Form einer Partikelschicht oder Filmschicht vorliegen. In dieser Ausführungsform wird das Material mit den darin eingebetteten Monomeren selektiv vom Ausgangsträger auf den Zielträger übertragen, wo dieses ortsgenau fixiert wird. Das Übertragen des Materials, d.h. der in der Polymermatrix eingebetteten Monomere, ist gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf eine Partikelform beschränkt. Im Rahmen dieser Ausführungsform umfasst das Übertragen des Materials sowohl das Übertragen von Partikeln als auch das Übertragen des Materials in flüssiger oder gasförmiger Form.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Material mit den darin eingebetteten Monomeren von einem entsprechend präparierten Ausgangsträger mit Hilfe von elektromagnetischer Strahlung auf einen Zielträger übertragen und dort selektiv und ortsgenau fixiert. Erfindungsgemäß wird dieser Vorgang vorteilhaft mit unterschiedlichen Ausgangsträgern aber gleichem Zielträger wiederholt. Somit können auf einem Zielträger unterschiedliche Monomere an frei wählbaren Orten kombinatorisch ortsgenau fixiert werden. Diese Monomere gehen in einem weiteren Prozessschritt parallel eine chemische Reaktion mit auf dem Zielträger aufgebrachten funktionellen Gruppen ein. Dies sind insbesondere NH2-Gruppen für die Synthese von Peptidarrays oder OH-Gruppen für die Synthese von Oligonukleotidarrays. Die Kupplungsreaktion kann dadurch gestartet werden, dass die ortsgenau fixierten Materialien erhitzt werden oder durch eine Chemikalie gelöst werden, sodass die eingebetteten Monomere mobilisiert werden und zur Oberfläche des Trägers diffundieren können, wo sie mit den funktionellen Gruppen der dort immobilisierten Reaktanden abreagieren. Besonders vorteilhaft ist dieses Verfahren, wenn dabei die Diffusion der erwähnten Monomere eingeschränkt bleibt, indem die aufgebrachten Materialien eine ölige oder wachsähnliche Konsistenz einnehmen.

Die Vorbereitung der Ausgangsträger, das bedeutet die Erzeugung einer homogenen Schicht aus Monomerpartikeln oder eines Monomerfilms, kann auf verschiedene Arten erfolgen. Die Monomerpartikel können zum Beispiel aus einem Aerosol oder einer Suspension auf dem Ausgangsträger abgelagert werden. Die Monomerpartikel können von der Oberfläche einer Flüssigkeit abgehoben oder abgeschöpft werden oder mit einer Rakel oder einer Walze auf den Ausgangsträger aufgetragen werden. Sofern die Monomerpartikel elektrisch geladen sind, können elektrische Felder zur Ablagerung eingesetzt werden.

Die Beschichtung mit einem homogenen Film auf einem Träger kann zum Beispiel mit Hilfe von Rotationsbeschichtung, durch Tauchbeschichtung oder den Einsatz einer Rakel oder Walze geschehen. Der Monomerfilm kann jedoch auch in einem separaten Prozess hergestellt werden und beispielsweise auf den Ausgangsträger aufgeklebt werden. Zudem kann der Monomerfilm in einem Druckverfahren, wie beispielsweise Tintenstrahldruck, auf den Ausgangsträger aufgebracht werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Material des Ausgangsträgers nicht beschränkt und kann je nach Zielmolekül ausgewählt werden. Diese Materialien sind dem Fachmann bekannt und müssen daher nicht im Detail beschrieben werden. Als nichtbeschränkende Beispiele seien polymere, keramische oder metallische Materialien genannt. Beispielsweise können insbesondere Träger aus Polydimethylsiloxan vorteilhaft verwendet werden. Für den Zielträger wird auf die nachstehenden Ausführungen verwiesen.

Der Ausgangträger als auch der Zielträger können mit einer Strukturierung versehen sein, zum Beispiel mit Vertiefungen im Mikrometermaßstab. Diese Strukturierung kann den gezielten Materialtransfer ermöglichen oder verbessern. Weist der Ausgangsträger eine Strukturierung auf, so kann es sinnvoll sein, diesen nicht homogen mit einer Beschichtung zu überziehen, sondern die Beschichtung entsprechend der Strukturierung anzupassen, also zum Beispiel nur die Vertiefungen im Ausgangsträger mit Monomerpartikeln zu füllen. Durch das Auffüllen von Strukturen auf dem Ausgangsträger kann das zu übertragende Material portioniert werden, bis hin zu einzelnen Mikropartikeln pro Vertiefung.

Durch Strukturierung des Zielträgers kann eine örtliche Begrenzung des Übertrags stattfinden, sodass beim Übertrag beispielsweise nur einzelne oder eine bestimmte Anzahl von Strukturen auf dem Zielträger mit Material des Ausgangsträgers gefüllt oder bedeckt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommen mindestens eine oder mehrere Zwischenschicht(en) zum Einsatz, welche zwischen dem Ausgangsträger und dem Zielträger angeordnet ist bzw. sind. Vorzugsweise befindet sich die mindestens eine Zwischenschicht zwischen dem Ausgangsträger und der Materialschicht, d.h. der Schicht aus Monomerpartikeln bzw. dem Monomerfilm.

Die mindestens eine Zwischenschicht ist nicht speziell eingeschränkt und kann beispielsweise aus Mikro- oder Nanopartikeln, einem festen Film oder einer Flüssigkeit bestehen. Diese Zwischenschicht kann die Funktion haben, die Monomere auf dem Ausgangsträger oder den Zielträger und die darauf befindlichen Reaktanden vor den Einwirkungen der elektromagnetischen Strahlung zu schützen. Dies gilt auch für indirekte Einwirkungen wie zum Beispiel Hitze, Dämpfe, Gase oder Plasma, die durch die elektromagnetische Strahlung erzeugt werden oder chemische Reaktionen, die durch die elektromagnetische Strahlung ausgelöst werden. Die mindestens eine Zwischenschicht kann ferner die Funktion haben, die Haftung weiterer Zwischenschichten oder die Haftung der Materialschicht auf dem Ausgangsträger einzustellen, beispielsweise in Form von Klebeschichten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die mindestens eine Zwischenschicht den Übertrag von Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger unterstützen. Kommen eine oder mehrere derartiger Zwischenschichten zum Einsatz, so können die Monomerpartikel oder der Monomerfilm etwa durch Erwärmen dieser Zwischenschicht(en), welche beispielsweise aus Kohlenstoff oder einem Metall besteht bzw. bestehen, indirekt erwärmt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können metallische oder elementare Zwischenschichten eingesetzt werden, wie z. B. aus Titan, Chrom, Gold, Kupfer, Wolfram, Palladium, Silber, Kohlenstoff, oxidische Zwischenschichten, wie z. B. aus In2O3, V2O5, TiO2, Photopolymere, wie z. B. Azide, Triazene oder Polymere mit integrierten Triazengruppen, oder andere Verbindungen oder Mischungen, wie z. B. Polyimid oder Polysiloxan. Dabei können mehrere Zwischenschichten aus gleichem oder verschiedenem Material in Kombination verwendet werden, um die vorstehend erwähnten Effekte zu verstärken bzw. zu kombinieren.

Für den Übertrag von Material sind verschiedene Mechanismen möglich, die im Folgenden im Detail beschrieben werden. Die verwendeten Materialen, die Wellenlänge und die Einstrahlrichtung der elektromagnetischen Strahlung werden jeweils in geeigneter Weise gewählt. Die Einstrahlrichtung kann insbesondere vom Ausgangsträger in Richtung Zielträger erfolgen oder vom Zielträger in Richtung Ausgangsträger.

Erfindungsgemäß kann das Übertragen und Fixieren des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger durch das Inkontaktbringen des Ausgangsträgers mit dem Zielträger und das direkte oder indirekte Erwärmen der Partikel- oder Filmschicht durch die selektive und direkte Einwirkung der elektromagnetischen Strahlung erfolgen, wobei sich die Materialschicht zwischen den Trägern befindet.

Dabei wird ein fester Ausgangsträger, belegt mit einer Schicht aus Monomerpartikeln oder einem Monomerfilm, in Kontakt mit einem festen Zielträger gebracht, sodass sich die Beschichtung zwischen den beiden Trägern befindet. Mit elektromagnetischer Strahlung wird selektiv an bestimmen Orten Energie eingebracht. Das Matrixmaterial mitsamt den darin enthaltenen Substanzen wird auf dem Zielträger fixiert.

Durch geeignete Wahl der Einstrahlrichtung, der Materialien und der Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung wird die Materialschicht, insbesondere in Form der Monomerpartikel oder des Monomerfilms, entweder direkt erwärmt oder sie wird indirekt erwärmt, indem eine oder mehrere wie vorstehend erwähnte Zwischenschichten (z.B. aus Kohlenstoff oder Metall) oder einer bzw. beide Träger durch die Strahlung erwärmt werden. Ein indirektes Erwärmen der Partikel oder des Films kann auch erreicht werden, indem dieser mit einem Zusatz, wie zum Beispiel Gra-phitnanopartikeln, vermischt wird, der als Absorber dient. Das fixierte Material verbleibt nach der Trennung der beiden Träger am Zielträger.

Vorzugsweise kann der/können die Träger auch aus einem flexiblen Material gefertigt sein, um einen besseren Kontakt zu gewährleisten. Durch die chemische Modifikation und/oder Nano- und/oder Mikrostrukturierung der Trägeroberflächen kann erreicht werden, dass die erwärmten Partikel bzw. das Material des Films vorzugsweise am Zielträger haftet.

Um die Kontaktfläche des Zielträgers mit der Beschichtung des Ausgangsträgers zu vergrößern können der Zielträger und/oder der Ausgangsträger Vibrationen ausgesetzt werden oder zu mechanischen Schwingungen angeregt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Übertragen und Fixieren des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch ohne direkten Kontakt der Träger erfolgen. Insbesondere kann das Übertragen des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger durch Ablationsmechanismen erfolgen. Zum Beispiel indem durch elektromagnetische Strahlung ein Teil der Monomerpartikel, des Monomerfilms, des Ausgangsträgers, der optionalen mindestens einen Zwischenschicht oder eines speziellen Zusatzes verdampft wird, sodass durch die Volumenausdehnung Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger befördert wird. Wie bereits beschrieben, ist in diesem Fall ein direkter Kontakt zwischen dem Ausgangsträger und dem Zielträger nicht zwangsweise notwendig, jedoch nicht ausgeschlossen.

Die Volumenausdehnung kann beispielsweise durch thermische Ausdehnung, Plasmabildung, Verdampfen oder die Zersetzung eines Stoffes hervorgerufen werden. Die Zersetzung eines Stoffes kann zum Beispiel durch photolytische Zersetzung, beispielsweise durch Verwendung von Photopolymeren, oder thermische Zersetzung erfolgen. Weiterhin kann die elektromagnetische Strahlung oder eine Temperaturerhöhung erzeugt durch die elektromagnetische Strahlung eine chemische Reaktion hervorrufen, die entweder direkt eine Volumenausdehnung zur Folge hat oder die zu einem Temperaturanstieg führt und somit über thermische Effekte eine Volumenausdehnung zur Folge hat. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung einer Zwischenschicht erfolgen, welche Verbindungen aus der Gruppe von Schwermetallazid-Salzen, Trinitrotoluol oder anderen aromatische Verbindungen mit Nitrogruppen und ihren Salzen, Verbindungen und Polymeren in die aromatische Verbindungen mit Nitrogruppen integriert sind, Polymeren mit Nitrogruppen, wie z.B. Nitroglycerin, Nitropenta, Cellulosenitrat, Nitroguanidin, Nitraminen, Hexanitrostilben, Nitrotriazolon, Acetylid-Salzen, Mischungen einzelner oder verschiedener Sprengstoffe mit stabilisierenden Stoffen, Plastiksprengstoff, organische Aziden, Ethylenglycol, Dinitraten, Schwarzpulver, binären Sprengstoffen, Ammoniumnitrat, Nitromethan, und Mischsprengstoffen mit Nitratsalzen enthält.

Eine weitere Ausführungsform besteht darin, dass sich durch die vorstehend beschriebene Volumenausdehnung bei geeigneter Wahl der mindestens einen Zwischenschicht, wie z. B. Polyimid, und der Materialschicht eine Blase bildet, die das zu übertragende Material in Richtung auf den Zielträger befördert.

Auf dem Zielträger wird das übertragene Material fixiert, indem durch elektromagnetische Strahlung lokal begrenzt Energie eingebracht wird. Wie bereits beschrieben, findet eine direkte oder indirekte Erwärmung des Materials statt. Hierfür können die Parameter der Strahlenquelle wie Wellenlänge, Energie, Pulsdauer, Fokusgröße und Fokusebene geändert werden oder es wird eine geeignete zweite Strahlenquelle verwendet.

Alternativ wird eine Fixierung des Materials auf dem Zielträger allein durch geeignete Wahl des Polymermatrixmaterials und/oder des Zielträgermaterials erreicht, sodass diese bei Kontakt aneinander haften oder kleben.

Das Übertragen des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger kann auch dadurch erfolgen, dass Monomerpartikel bzw. das Material eines Monomerfilms vom Ausgangsträger durch einen von Photonen übertragenen Impuls abgelöst und in Richtung des Zielträgers bewegt werden bzw. wird. Alternativ können durch den Impuls Teile des Ausgangsträgers und/oder zugemischte Zusätze beschleunigt werden, die wiederum ihren Impuls weitergeben. Die Fixierung des Materials auf dem Zielträger erfolgt wie vorstehend beschrieben.

Erfindungsgemäß kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch anhand des Prinzips der optischen Pinzette erfolgen. Das bedeutet beispielsweise, die Monomerpartikel sind für die verwendete Wellenlänge der Strahlenquelle transparent und werden durch den Impulsübertrag der Photonen bei Brechung an den Partikeln festgehalten oder bewegt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch dadurch erfolgen bzw. unterstützt werden, dass zwischen den beiden Trägern ein elektrisches Feld erzeugt wird. In diesem Fall muss das Matrixmaterial vorher durch ein geeignetes Verfahren beispielsweise triboelektrisch oder durch einen Coronadraht elektrisch aufgeladen werden, wodurch im Falle von Monomerpartikeln diese durch die elektrische Kraft in Richtung des Zielträgers gesteuert werden.

Ferner kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch dadurch erfolgen bzw. unterstützt werden, dass zwischen den beiden Trägern ein magnetisches Feld erzeugt wird. In diesem Fall muss das Matrixmaterial einen magnetischen Bestandteil, wie beispielsweise Magnetit, enthalten. In diesem Fall werden beispielsweise die Monomerpartikel durch die magnetische Kraft in Richtung des Magnetfeldgradienten gesteuert.

Um Adhäsionskräfte zwischen den Monomerpartikeln und/oder zwischen dem Matrixmaterial und Trägern zu verringern und den Übertrag zu erleichtern, ist es bevorzugt, dass der Raum zwischen den Trägern und/oder zwischen den Monomerpartikeln mit einer Flüssigkeit gefüllt ist.

Wie bereits vorstehend beschrieben, wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel mittels einer elektromagnetischen Strahlung an definierten Orten entfernt werden und somit den Zugang zu diesen Orten ermöglichen. Gemäß dieser Ausführungsform ist eine Vielzahl diskreter Spots des Zielträgers mit Partikeln belegt, die den Zugang zu diesen blockieren.

Gemäß dieser Ausführungsform, wobei die Vielzahl diskreter Spots des Zielträgers mit Blockadepartikeln belegt ist, die den Zugang zu diesen blockieren, umfasst der Schritt (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots das selektive Entfernen der in diesen Spots angeordneten Blockadepartikeln mittels elektromagnetischer Strahlung, wodurch der Zugang für das mindestens eine Monomer zu diesen ausgewählten Spots ermöglicht wird.

Vorzugsweise weisen die diskreten Spots des Zielträgers Vertiefungen auf. Insbesondere wird als Zielträger ein Träger verwendet, der so mit Partikeln belegt ist, dass diese den Zugang zu definierten Orten auf dem Träger blockieren, d.h. die Vertiefungen abdecken. Diese Partikel werden im Folgenden auch Blockadepartikel genannt. Als Träger eignen sich insbesondere vorstrukturierte Träger mit Vertiefungen, in die ein oder mehrere Blockadepartikel möglichst genau hineinpassen. Da die Partikel unter anderem mit Hilfe von Kapillarkräften in den Vertiefungen festge halten werden können, können die Vertiefungen von solchen vorstrukturierten Trägern besonders einfach und vollständig mit einem oder mehreren Partikel(n) befüllt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung, sollten diese Blockadepartikel einerseits den Zugang zu den genannten Vertiefungen möglichst effizient blockieren, damit sich dort keine weiteren Partikel bzw. Stoffe ablagern können und andererseits müssen sie selektiv aus ausgewählten Vertiefungen entfernt werden können. Erfindungsgemäß erfolgt das Entfernen der Blockadepartikel durch eine elektromagnetische Strahlung, die vorzugsweise ein kurzer Laserpuls ist. Dadurch können anschließend diese freien Vertiefungen selektiv mit dem mindestens einen Monomer in Kontakt gebracht werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Monomer in Form eines Monomerpartikels bereitgestellt werden. Beispielsweise können die Vertiefungen mit derartigen Monomerpartikeln gefüllt werden. Diese enthalten, wie bereits vorstehend definiert, geeignete Monomere oder Monomergemische für die kombinatorische Synthese der Zielmoleküle. Die Monomerpartikel umfassen das mindestens eine Monomer und gegebenenfalls weitere Substanzen in einer Polymermatrix. Sie bestehen dabei im Wesentlichen aus der Polymermatrix, in die geeignete chemische Bausteine bzw. Monomere für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder von Oligonukleotidarrays, eingebettet sind.

Werden nun nacheinander Vertiefungen mit Hilfe des Lasers von Blockadepartikeln befreit, können die freien Vertiefungen mit jeweils unterschiedlichen Arten von Monomerpartikeln gefüllt werden, die sich insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie unterschiedliche Arten von Monomeren für die kombinatorische Synthese enthalten.

Nach einer so erfolgten Strukturierung des Trägers mit Monomerpartikeln, müssen die für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays geeigneten Monomere, mobilisiert werden, sodass sie zur Trägeroberfläche diffundieren können, wo sie mit geeigneten funktionellen Gruppen abreagieren. Diese Mobilisierung kann beispielsweise wie in EP 1 140 977 B1 beschrieben erfolgen. Als Beispiele, wie die Monomere auf der Trägeroberfläche abreagieren können, seien C-terminal mit OPfp-Estern oder über Säureanhydride aktivierte Aminosäurenderivate, die mit freien Aminogruppen des Trägers reagieren, wodurch Peptidarrays entstehen, oder Phosphoramidite genannt, die mit OHGruppen abreagieren, wodurch Oligonukleotidarrays entstehen. Die vorstehend beschriebene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.

Enthalten die Monomerpartikel Vorstufen von für eine kombinatorische Synthese geeigneten Monomeren, Dimeren oder Trimeren, so können durch ein oder mehrere weitere Zyklen von Kopplungsreaktionen die an den Träger gebundenen Moleküle um weitere Monomere, Dimere oder Trimere verlängert werden. Auch ist es möglich, durch ein oder mehrere weitere Zyklen von nicht notwendigerweise identischen Reaktionen die an den Träger gebundenen Moleküle zu modifizieren. Nach erfolgter Synthese können die Schutzgruppen von den synthetisierten Oligomeren abgespalten werden, wobei die synthetisierten Moleküle an dem Träger gebunden bleiben und gegebenenfalls für den nachfolgenden Kopplungsschritt zur Verfügung stehen.

Erfindungsgemäß kann auf im Stand der Technik bekannte Schutzgruppen-Techniken zurückgegriffen werden, die insbesondere im Bereich der Synthese von Biomolekülen wie Peptiden, Oligosacchariden oder Nukleotiden bzw. in der kombinatorischen Chemie im Allgemeinen etabliert sind. Das heißt gemäß der vorliegenden Erfindung können an geeigneter Stelle des Verfahrens eine oder mehrere Schutzgruppe(n), die gegebenenfalls in einem Monomer für die kombinatorische Synthese vorhanden sind, entfernt werden, um weitere Kopplungsschritte zu ermöglichen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können als Zielträger unterschiedliche Materialien verwendet werden, wie beispielsweise Polystyrolfolien, Papier, CDs, MODs, DVDs oder FMDs. Insbesondere eignen sich funktionalisierte Glasträger, wie z.B. Glaswafer, die auf einer Oberfläche beispielsweise mittels lithographischem Verfahren eine Strukturierung aufweisen. Auch poröse Glasträger können erfindungsgemäß verwendet werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Vertiefungen des Zielträgers von den Blockadepartikeln derart blockiert, dass dieser Spot für hinzugefügte Monomere nicht mehr zugänglich ist, d.h. dass das jeweilige Monomer zum Beispiel auch durch Diffusion nicht in diese Vertiefungen eindringen kann. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens müssen die von den Blockadepartikeln befreiten Spots nicht notwendigerweise mit Monomerpartikeln gefüllt werden, sondern stattdessen kann der Träger lokal oder vollständig mit einem geeigneten Monomer für die kombinatorische Synthese in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise werden diese Monomere in einem geeigneten Lösungsmittel auf den Träger aufgebracht, sodass sie über Konvektion, Diffusion oder über die Gasphase selektiv zu den von den Blockadepartikeln befreiten Vertiefungen gelangen können, wo sie mit geeigneten funktionellen Gruppen der dort immobilisierten Reaktanden abreagieren können. Als geeignete Lösungsmittel können beispielsweise Dimethylformamid, N-Methyl-2-pyrrolidon oder Dimethylsulfoxid für die Peptidsynthese oder Acetonitril für die Synthese von Oligonukleotiden genannt werden.

Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden höhere Anforderungen an die Blockadepartikel gestellt, da die Blockadepartikel hier verhindern müssen, dass die bereits mobilisierten Monomere (im Gegensatz zu den erwähnten Monomerpartikeln) in die Vertiefungen gelangen, zum Beispiel indem sie durch die Blockadepartikel hindurch diffundieren. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass die Blockadepartikel aus einem sehr dichten Material, wie etwa Siliziumdioxid, bestehen oder hinreichend stark quervernetzt sind, um eine Diffusion durch die Blockadepartikel hindurch zu unterbinden. Als Beispiel für Blockadepartikel aus quervernetztem Material können quervernetzte Polystyrolpartikel genannt werden.

Damit die Vertiefungen zuverlässig blockiert werden und keine Monomere an den Blockadepartikeln vorbei in die Vertiefungen gelangen, ist insbesondere eine enge Größenverteilung der Blockadepartikel notwendig. Weiterhin ist es möglich, den Durchmesser der Blockadepartikel nachträglich zu vergrößern, um die Vertiefungen dicht zu verschließen. Dies kann beispielsweise durch Aufquellen der Partikel in Lösungsmitteln oder durch Osmose erfolgen.

Besonderes bevorzugt sind Blockadepartikel mit einer sehr engen Größenverteilung, die zudem eine starke Oberflächenladung aufweisen. Diese starke Oberflächenladung bewirkt, dass die Partikel in polaren Lösungsmitteln eine große, weitgehend immobile Hülle aus polaren Molekülen tragen, wie beispielsweise eine Hydrathülle in Wasser, sodass sie im gequollenen Zustand den Zugang zu den genannten Vertiefungen wie ein Pfropfen sehr dicht verschließen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Blockadepartikel zusätzlich mit gegensätzlich geladenen Nanopartikeln weiter abgedichtet werden, bevor sie mit den genannten Monomeren für die kombinatorische Synthese in Kontakt gebracht werden.

Diese verschiedenen Möglichkeiten der Abdichtung können gemäß der vorliegenden Erfindung reversibel gestaltet werden, um nach der chemischen Kupplung eines ersten Monomers an ausgewählte erste Orte bzw. Spots, weitere Blockadepartikel an ausgewählten zweiten Orten bzw. Spots selektiv zu entfernen. Dazu können zugegebene Nanopartikel zunächst weggewaschen oder in Flüssigkeiten gequollene Blockadepartikel in Flüssigkeiten mit anderen Quellungsparametern inkubiert werden, sodass der Durchmesser dieser Partikel soweit schrumpft, dass sie verlässlich, mit elektromagnetischer Strahlung wie zum Beispiel mit einem Laserpuls aus der Vertiefung entfernt werden können. Es ist auch möglich, dass die gequollenen Blockadepartikel einfach getrocknet werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das vorstehend definierte Verfahren weiter einen Schritt (iv) des Ablagerns von Blockadepartikeln, um die zuvor freigelegten Spots erneut mit Blockadepartikeln zu belegen (wie schematisch in Fig. 2 dargestellt).

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des vorstehend definierten Verfahrens werden die Schritte des Konditionierens der ausgewählten Spots (Schritt (ii)) und des Umsetzens des mindestens einen Monomers mit in den ausgewählten Spots

des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden (Schritt (iii)) sowie gegebenenfalls des weiteren Ablagerns von Blockadepartikeln auf zuvor freigelegten Spots (Schritt (iv)) iterativ unter Verwendung jeweils gleicher oder verschiedener Monomere durchgeführt. Dadurch ist es möglich, kostengünstig und effizient hochdichte Molekülarrays herzustellen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Prinzipien der kombinatorischen Strukturierung von Partikeln, bei welchen mittels elektromagnetischer Strahlung zunächst Blockadepartikel auf dem Zielträger selektiv entfernt werden, um den Zugang zu diesen Spots zu ermöglichen, oder das selektive Übertragen und Fixieren des Materials, das das mindestens eine Monomer enthält, von einem Ausgangsträger auf den Zielträger, zudem vorteilhaft kombiniert werden.

Als Quelle für die verwendete elektromagnetische Strahlung sind gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere Laser geeignet, wie zum Beispiel gepulste Laser oder Dauerstrichlaser. Um die Strahlung ortsgenau auf einen Punkt zu fokussieren ist ein geeignetes Linsensystem notwendig. Es können der Zielträger und/oder der Ausgangsträger gegenüber der Strahlenquelle mechanisch verfahren werden oder die elektromagnetische Strahlung wird über geeignete Spiegel positioniert. Dies hat den Vorteil, dass pro Zeiteinheit eine größere Anzahl von Punkten bearbeitet werden kann.

Um die Geschwindigkeit des Verfahrens zu erhöhen kann vorzugsweise parallel mit mehreren Strahlenquellen gearbeitet werden oder der Strahl einer Strahlenquelle wird über ein geeignetes System, wie beispielsweise einem Linsenarray oder einem Spiegelarray, in mindestens zwei Teilstrahlen aufgespaltet. Die Teilstrahlen können individuell in ihrer Intensität moduliert werden.

Erfindungsgemäß wird ferner ein hochdichter Molekülarray mit einem Rastermaß von≤ 300 μm bereitgestellt, der mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren er hältlich ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt das Rastermaß des Molekülarrays vorzugsweise≤ 200 μm, mehr bevorzugt≤ 150 μm und besonders bevorzugt≤ 100 μm.

Wie vorstehend erwähnt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Arrays vorzugsweise um Peptid- oder Oligonukleotidarrays, insbesondere um Peptidarrays.

Die vorliegende Erfindung basiert darauf, Partikel auf einem Träger mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung zu strukturieren, um die kombinatorische Synthese von hochdichten Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays zu ermöglichen. Die elektromagnetische Strahlung wirkt dabei direkt auf die Partikel ein und steuert somit die Kraft bei, mit der die Partikel bewegt werden. In einer Ausführungsform werden die Monomere als Monomerpartikel direkt strukturiert, indem Monomerpartikel direkt auf die Spots eines Trägers transferiert und dort selektiv fixiert werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform werden Partikel selektiv von einem Träger entfernt, sodass die freien Orte (Spots) nun zugänglich für Monomere zur Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays werden. Die Monomere können entweder in einer Flüssigkeit, in der Gasphase oder als Monomerpartikel an diese Orte gebracht werden.

Da das kleinste Rastermaß für die Partikelablagerung nur von der Partikelgröße, dem Fokusdurchmesser der elektromagnetischen Strahlung und der Größe etwaiger Strukturen auf dem Träger, wie zum Beispiel Vertiefungen, begrenzt ist, können vorteilhaft Partikelmuster mit einem Raster≤ 300 μm, insbesondere bis zu≤ 100 μm realisiert werden.

Zudem besteht erfindungsgemäß eine sehr hohe Flexibilität gegenüber der Anzahl der verwendeten chemischen Bausteine. Wird deren Anzahl erhöht, so lässt sich dies ohne zusätzlich Aufwand, beispielsweise bezüglich der Kalibrierung, in das bestehende Verfahren einbinden.

In der vorliegenden Erfindung werden keine Partikelreservoirs verwendet. Die Ablagerung von Blockadepartikeln auf einem Träger bzw. die Beschichtung mit Monomerpartikeln oder einem Monomerfilm erfolgt in einem separaten Prozessschritt. So können zum Beispiel ungenügend beschichtete Träger aussortiert oder erneut bearbeitet werden. Probleme und Verzögerungen im Prozess, hervorgerufen durch Schwankungen in der Beschichtungsqualität, wie sie insbesondere bei der selektiven Beschichtung der Hochspannungs-CMOS-Chips auftreten, können so vorteilhaft eliminiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird somit sehr robust.

Darüber hinaus ist die Fläche der erzeugten Partikelmuster prinzipiell nicht begrenzt, da über die Ablenkung der elektromagnetischen Strahlung mit Spiegeln, sowie mechanisches Verfahren prinzipiell auch sehr große Träger bearbeitet werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert die Vorteile lithographischer Methoden (sehr kleine Strukturen, die zu sehr kleinen Peptid- oder Oligonukleotidspots führen) und der partikelbasierten Methoden (einfache Strukturierung über größere Flächen auf Grund von Selbstorganisation möglich; Robustheit; zeitliche und räumliche Trennung der Strukturierung und der Kupplungsreaktion an den Träger), vermeidet aber gleichzeitig deren Nachteile (Nebenreaktionen auf Grund der vielen se-quenziell durchgeführten Kupplungsreaktionen bei den lithographischen Techniken bzw. große Raster bei den bisherigen partikelbasierten Techniken).

Da die vorliegende Erfindung es ermöglicht, Partikelmuster mit einem sehr kleinen Rastermaß, das heißt mit sehr hoher Auflösung und auf einer sehr großen Fläche herzustellen, können die dadurch erzeugten Molekülarrays somit äußerst effizient in Hochdurchsatzscreenings eingesetzt werden. Bei den Hochdurchsatzscreenings kommt es maßgeblich darauf an, möglichst viele verschiedene Moleküle parallel und kostengünstig auf gewisse Eigenschaften zu untersuchen.

Durch die praktisch unbegrenzte Anzahl von Monomeren, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, kann die Vielfalt der erzeugten Molekülarrays erhöht werden, was diese wiederum interessanter für verschiedenste Hochdurchsatzscreenings macht.

Die vorliegende Erfindung sowie weitere sich daraus ergebende Vorteile werden in der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen näher erläutert.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 A) Ein Träger mit Vertiefungen, der für die kombinatorische Synthese von

Peptid- oder Oligonukleotidarrays geeignet ist, wird in Kontakt mit chemisch inerten Blockadepartikeln gebracht. B) Die Blockadepartikel werden in den Vertiefungen abgelagert. C) Mit einem Laser werden Blockadepartikel aus ausgewählten Vertiefungen entfernt, um dort im nächsten Schritt die Ablagerung von Monomerpartikeln zu ermöglichen.

Fig. 2 A) Die Vertiefungen eines Trägers besitzen funktionale Gruppen, die mit

Monomeren für die kombinatorische Synthese von Oligonukleotiden oder Peptiden abreagieren können. Ein Laser hat die grauen Blockadepartikel aus einigen Vertiefungen entfernt, sodass die dadurch freigelegten Orte mit den aktivierten Monomeren in Kontakt treten können. B) Die Monomere kuppeln an die freigelegten Vertiefungen. C) Anschließend werden die Vertiefungen wieder mit Blockadepartikeln befüllt. D) Dieser Vorgang wird für weitere Vertiefungen mit anderen Monomeren wiederholt. E) Wird die transiente Schutzgruppe (z.B. Fmoc oder tBoc im Falle von Peptidarrays oder Trityl im Falle von Oligonukleotidarrays) danach entfernt, so kann eine weitere Schicht von Monomeren an die bereits aufgebrachten Monomeren kuppeln (Merrifieldsynthese).

Fig. 3 Einbringen von Partikeln in die Vertiefungen eines strukturierten Trägers. A)

Blau gefärbte Partikel aus Polystyrol (wiedergegeben als dunkle Partikel), Durchmesser 4,2±0,1 1 μm (Micro Particles GmbH); B) Strukturierter Träger mit zylinderförmigen Vertiefungen, Durchmesser 6 μm, Pitch 10 μm ; C) Die Vertiefungen wurden vollständig mit Partikeln befüllt.

Fig. 4 A) SU-8-Vertiefungen, Durchmesser 20 μm, gefüllt mit roten Polystyrolpartikeln (wiedergegeben als dunkle Partikel), Durchmesser 10 μm; B) Vertiefungen wurden selektiv mit einem gepulsten Laser entleert, so dass sich der Schriftzug "KIT" ergibt (spiegelverkehrt, da Durchlichtaufnahme); C) Freie Vertiefungen wurden mit blauen Polystyrolpartikeln gefüllt, während die anderen Vertiefungen durch die roten Partikel blockiert waren; D) Detailaufnahme des kombinatorischen Musters aus roten und blauen Partikeln (Vertiefungen mit blauen Partikeln sind zur Verdeutlichung mit„*" gekennzeichnet).

Fig. 5 Übertrag von Material aus einer Partikelschicht von einem PDMS-Ausgangsträger auf einen Zielträger, A) Ausgangsträger und Zielträger befinden sich in Kontakt, Punktmuster wurde durch Erhitzen mit einem Laser erzeugt, B) Zielträger mit übertragenem Material, C) Zielträger befindet sich in Kontakt mit zweitem Ausgangsträger, ein zweites Punktmuster wurde durch Erhitzen mit einem Laser erzeugt, D) Zielträger mit Material aus dem erstem und dem zweitem Übertrag.

Fig. 6 Zielträger vor (links) und nach (rechts) dem Reinigen in einem Ultraschallbad. Kontaminationen in nicht bestrahlten Bereichen konnten so deutlich reduziert werden.

Fig. 7 A) Zielträger mit Partikelschicht, die mit Hilfe eines elektrischen Feldes vom Ausgangsträger übertragen wurde. Bestimmte Bereiche wurden selektiv mit dem Laser fixiert, B) nach Entfernen der Partikelschicht mit Druckluft.

Fig. 8 Fluoreszenzmarkierte Peptide (HA: hell, FLAG: dunkel), Synthetisiert mit

Hilfe der laserbasierten Partikelstrukturierung, links: KIT aus FLAG-Spots mit Rahmen aus HA-Spots, rechts: FLAG und HA im Schachbrettmuster.

Fig. 9 Übertrag von Aminosäurederivaten eingebettet in eine Copolymer Matrix, aus einem festen Monomerfilm auf einen Zielträger aus Glas, A) Ausgangsträger: Auflichtmikroskopaufnahme, Monomerfilm mit fehlendem Material, B) Zielträger: Durchlichtmikroskopaufnahme, Glasträger mit Muster aus übertragenem Material.

Fig. 10 Laserablation mit einem gepulstem Laser, A) Ausgangsträger mit Partikelschicht, B) Zielträger mit ortsgenau übertragenen Monomerpartikeln.

Fig. 1 1 Übertrag von Partikeln zwischen zwei strukturierten Trägern; A) Träger mit zylinderförmigen Vertiefungen, Durchmesser 70 μm, Pitch 100 μm, Tiefe ca. 40 μm; B) Vertiefungen gefüllt mit Partikeln; C) strukturierter Ausgangsträger nach Laserübertrag, 5x5 Vertiefungen sind teilweise entleert, D) strukturierter Zielträger nach Laserübertrag, 5x5 Strukturen sind mit Partikeln gefüllt.

Fig. 12 Schemazeichnung, a) Mit einem Laser (1 ) wird Material aus einem Monomerfilm (2) von einem Ausgangsträger (3) auf einen Zielträger (4) übertragen. Zwischen dem Monomerfilm und dem Ausgangsträger befindet sich eine Zwischenschicht (5). b) Nach mehreren Iterationen mit verschiedenen Ausgangsträgern entsteht auf dem Zielträger ein Muster aus verschiedenen Monomeren in Form diskreter Spots.

Fig. 13 Fluoreszenzaufnahmen eines Peptidarrays mit einem Rastermaß von 150 μm bestehend aus den Peptiden FLAG und HA. Das Array wurde mit fluoreszenzmarkiertem anti-HA (1 ) und fluoreszenzmarkiertem anti-FLAG (2) detektiert.

Fig. 14 Schemazeichnung, a) Mit einem Laser (1 ) wird Material in Form von Partikeln aus einer Partikelschicht (2) von einem Ausgangsträger mit mikrostrukturierte Oberfläche (3) auf einen Zielträger mit mikrostrukturierter Oberflä- che (4) übertragen, b) Nach mehreren Iterationen mit verschiedenen Ausgangsträgern entsteht auf dem Zielträger ein Muster aus verschiedenen Monomeren in Form diskreter Spots.

Fig. 15 Aufnahmen mit Rasterelektronenmikroskop, a) Ausgangsträger aus Glas mit mikrostrukturierter Oberfläche mit Vertiefungen (Tiefe 10 μm, Durchmesser 5 μm, Pitch 10 μm) belegt mit Partikeln. Die Partikel aus einigen der Vertiefungen wurden mit Hilfe von Laserstrahlung auf einen anderen Träger übertragen), b) Zielträger aus Glas mit mikrostrukturierter Oberfläche mit Vertiefungen (Tiefe 10 μm, Durchmesser 7 μm, Pitch 10 μm). In einige der Vertiefungen wurden Partikel mit Hilfe von Laserstrahlung von einem Ausgangsträger übertragen.

Fig. 16 Übertrag von Material in Form von Monomerpartikeln mit Cystein zwischen mikrostrukturierten Glassubstraten mit Pitch 10 μm. a) Ausgangsträger gefüllt mit Cysteinpartikeln, Durchmesser der Vertiefungen 5 μm. b) Zielträger mit übertragenen Partikeln, Durchmesser der Vertiefungen 7 μm.

Fig. 17 Fluoreszenzbild von Biotinspots auf einem Zielträger aus Glas mit mikrostrukturierter Oberfläche. Die Biotinspots wurden mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin detektiert. Spotgröße 7 μm, Pitch 10 μm, Spotdichte 1 .000.000 cm-2.

Fig. 18 Schemazeichnung, a) Mit einem Laser (1 ) wird Material von einem Ausgangsträger (2) in Form von Partikeln aus einer Partikelschicht (3) auf einen Zielträger (4) übertragen, b) Nach mehreren Iterationen mit verschiedenen Ausgangsträgern entsteht auf dem Zielträger ein Muster aus verschiedenen Monomeren in Form diskreter Spots.

Fig. 19 Synthese eines Peptidarrays ausgehend von einem Zielträger auf dem Material mit unterschiedlichen Aminosäurederivaten in einem kombinatorischen Muster platziert wurde, a) Der Träger wird erhitzt, so dass die Poly mermatrix des Materials schmilzt und die Aminosäurederivate zur Trägeroberfläche diffundieren können, um dort chemisch zu binden, b) In verschiedenen Waschschritten werden die Polymermatrix und überschüssige Monomere entfernt. Freie Aminogruppen werden blockiert und die N-terminale Schutzgruppe an den Aminosäuren wird entfernt, c) Durch mehrmaliges Durchlaufen des Prozesses entsteht ein Peptidarray.

Beispiele

In den folgenden Beispielen werden Experimente zum Konzept der Blockadepartikel (siehe (1 ) und (2)), verschiedene Experimente zum Übertrag von Monomerpartikeln (siehe (3), (4), (7) und (9)) sowie zum Übertrag von Material aus einem Monomerfilm (siehe (6)) gezeigt. Zudem werden Beispiele für die Synthese von Molekülarrays gezeigt (siehe (5) und (8)).

(1 ) Ablagern von Partikeln in Vertiefungen

Kommerziell erworbene Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 4,2 ± 0,1 1 μm (siehe Fig. 3A) wurden in einer wässrigen Suspension auf einen strukturierten Träger (siehe Fig. 3B) aufgetragen. Bei dem Träger handelt es sich um einen Glaswafer auf dem in einem lithographischen Verfahren der Fotolack SU-8 strukturiert wurde. Es wurde ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen erzeugt. Der Durchmesser der Vertiefungen beträgt 6 μm und der Mittepunkt zu Mittelpunkt Abstand (auch Pitch genannt) beträgt 10 μm. Die Vertiefungen sind ca. 17 μm tief, dies entspricht der Dicke der SU-8-Schicht auf dem Glaswafer. Wie in Fig. 3D zu sehen, werden die Vertiefungen des Trägers zuverlässig mit den Polystyrolpartikeln befüllt. Ein selektives Entleeren der Strukturen mit einem gepulsten Laser ist nun möglich (siehe auch Abschnitt 2).

(2) Kombinatorisches Muster aus verschiedenen Partikeln

Kommerziell erworbene rot gefärbte Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 10 μm wurden in einer wässrigen Suspension auf einen strukturierten Träger aufgetragen (siehe Fig. 4A). Bei dem Träger handelt es sich um einen Glaswafer auf dem in einem lithographischen Verfahren der Fotolack SU-8 strukturiert wurde. Es wurde ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen mit Durchmesser 20 μm, Pitch 50 μm und Tiefe ca. 40 μm erzeugt. Da Durchmesser und Tiefe der Vertiefungen deutlich größer sind als der Durchmesser der Partikel, liegen in jeder Vertiefung mehrere Partikeln. Einzelne Vertiefungen wurden selektiv mit einem gepulsten Laser entleert, so dass sich, wie in Fig. 4B zu sehen, der Schriftzug "KIT" ergibt. Im nächsten Schritt wurden blau gefärbte Polystyrolpartikel (Durchmesser 10 μm) aus wässriger Suspension aufgebracht. Die roten Polystyrolpartikel fungierten als Blockadepartikel und verhinderten ein Ablagern der blauen Polystyrolpartikel, so dass sich diese nur in den freien Vertiefungen absetzen konnten (siehe Fig. 4C und D).

(3) Kombinatorischer Übertrag von Monomerpartikeln von einem PDMS Ausgangsträger auf einen Glasobjektträger nach dem in Fig. 18 dargestellten Schema

Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 8,8 μm) bestehend aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer und Graphitnanopartikeln wurden aus einem Aerosol auf einem Träger aus Polydimethylsiloxan (PDMS) abgelagert. Dieser Träger diente als Ausgangsträger und wurde mit leichtem mechanischem Druck in Kontakt mit einem Zielträger aus Glas gebracht. Mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung bis 100 mW, Fokusdurchmesser 7,5 μm) wurden bestimmte Bereiche selektiv für jeweils 10 ms erhitzt (siehe Fig. 5A). Wie in Fig. 5B zu erkennen ist, verbleiben nach Trennung der beiden Träger die geschmolzenen Bereiche auf dem Zielträger. Mit einem zweiten Ausgangsträger wurden diese Schritte erfolgreich wiederholt (Fig.5C und D). Insgesamt wurden so ca. 85 % der bestrahlten Spots übertragen.

Partikelkontaminationen in den nicht bestrahlten Bereichen des Zielträgers wurden zwischendurch mit Druckluft entfernt, was aber nicht vollständig gelang. Stattdessen kann dafür, wie in Fig. 6 gezeigt, auch ein Ultraschallbad eingesetzt werden, womit eine fast vollständige Entfernung der Kontaminationen erzielt wird.

(4) Übertrag von Mikropartikeln mit Hilfe eines elektrischen Feldes und selektives Fixieren mit Laserstrahlung

Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 8,8 μm) aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer und Graphitnanopartikeln wurden aus einem Aerosol auf einen Ausgangsträger aus Glas aufgetragen. Durch die auftretende Reibung im Aerosolgenerator wurden die Partikel elektrisch geladen. Anschließend wurde parallel zum Ausgangsträger im Abstand von ca. 160 μm der Zielträger aus Glas positioniert. Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes wurde ein Teil der Partikel auf den Zielträger übertragen, sodass sich auf diesem eine geschlossene Partikelschicht befand. Mit einem Laser wurden selektiv bestimmte Bereiche der Partikelschicht bestrahlt (siehe Fig. 7A). Anschließend wurde die Partikelschicht auf dem Zielträger mit Druckluft entfernt. Die erhitzten Bereiche der Partikelschicht verblieben auf dem Zielträger (siehe Fig. 7B). Dieses Prinzip konnte ein zweites Mal wiederholt werden, wobei andere Bereiche des Zielträgers bestrahlt wurden.

(5) Kombinatorische Synthese von Peptiden mit laserstrukturierten Monomerpartikeln

Es konnte experimentell gezeigt werden, dass es möglich ist, mit Hilfe von Aminosäurepartikeln, die mit einem Laser auf einem Substrat strukturiert wurden, Peptide zu synthetisieren.

Für das Experiment wurden die beiden Peptide FLAG (Aminosäuresequenz: AspTyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) und HA (Aminosäuresequenz: Tyr-Pro-Tyr-AspVal-Pro-Asp-Tyr-Ala) ausgewählt. Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 5 μm) hergestellt aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer als Matrix, Aminosäurederivaten und Graphit als Absorber, wurden aus dem Aerosol auf einem funktionalisierten Glasträger abgelagert. Mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung bis 100 mW, Fokusdurchmesser 7,5 μm, Pulsdauer 10 ms) wurden die Partikel selektiv erhitzt und so auf dem Träger fixiert. Nicht fixierte Partikel wurden mit Druckluft entfernt.

Diese Laserstrukturierung wurde mit den entsprechenden Monomerpartikeln für die erste Aminosäure des FLAG-Peptids, sowie für die erste Aminosäure des HA-Peptids durchgeführt. Anschließend folgten die Prozessschritte, die in Abbildung 19 schematisch dargestellt sind. Der Träger wurde in Stickstoffatmosphäre für 90 min auf 90°C erhitzt. Die Aminosäurederivate in der Matrix diffundieren in dieser Zeit zum Substrat und kuppeln dort chemisch an die vorhandenen NH2-Gruppen.

Die Copolymermatrix, überschüssige Aminosäuren sowie alle anderen Bestandteile wurden anschließend durch Waschen mit Dimethylformamid (DMF) entfernt. Noch freie NH2-Gruppen wurden blockiert und anschließend die Fmoc-Schutzgruppen an den C-terminalen Enden der Aminosäuren entfernt.

Der Prozess wurde mehrmals, mit denen der Sequenz entsprechenden Aminosäuren, durchlaufen, bis die Peptide vollständig synthetisiert waren. Zur Kontrolle der Syntheseprodukte wurde der Träger anschließend mit fluoreszenzmarkierten Anti-HA-Antikörpern sowie mit fluoreszenzmarkierten Anit-FLAG-Antikörpern markiert (siehe Figur 8).

(6) Übertrag von Material aus einem zusammenhängenden Film

Es wurde nach dem in Fig. 12 dargestellten Schema vorgegangen, um Material aus einem Monomerfilm zu übertragen. Anders als in Fig. 12 dargestellt, war der Laser in diesem Experiment hinter dem Zielträger positioniert, so dass der Laserstrahl durch den Zielträger auf den Ausgangsträger einwirkte. Des Weiteren wurde in diesem Experiment auf die Verwendung einer Zwischenschicht verzichtet.

Zunächst wurde ein zusammenhängender Monomerfilm auf einem Ausgangsträger aus Glas erzeugt, indem ein Gemisch aus Styrol-Acrylat-Copolymer, Fmoc-Glycin-Opfp-Ester und Graphitnanopartikeln erhitzt und mit einer Rakel glatt gezogen wurde. Dieser Ausgangsträger wurde nach dem Abkühlen in Kontakt mit dem Zielglasträger gebracht und mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung 100 mW, Pulsdauer 10 ms, Laserfokusdurchmesser 7,5 μm) bestrahlt. Nach Trennung der

beiden Träger ist deutlich zu erkennen, dass erfolgreich Material aus dem Monomerfilm (siehe Fig. 9A) auf den Zielträger (siehe Fig. 9B) transferiert wurde.

(7) Übertrag zwischen zwei strukturierten Trägem nach dem in Fig. 14 dargestellten Schema

In diesem Experiment wurde gezeigt, dass es möglich ist mit einem Laser gezielt Partikel von einem strukturierten Ausgangsträger auf einen strukturierten Zielträ-ger zu übertragen. Bei den Trägern handelt es sich um Glaswafer auf denen in einem lithographischen Verfahren ein Fotolack (Fotolack SU-8) strukturiert wurde. Es wurde ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen erzeugt (siehe Fig. 1 1 A). Der Durchmesser der Vertiefungen beträgt 70 μm und der Mittepunkt zu Mittelpunkt Abstand (Pitch) beträgt 100 μm. Die Vertiefungen sind ca. 40 μm tief, dies entspricht der Dicke der Fotolack-Schicht auf dem Glaswafer. Die Vertiefungen des Ausgangsträgers wurden mit einer Rakel mit Partikeln aus einem Styrol-AcrylatCopolymer und 2 % Graphit befüllt (mittlerer Durchmesser 2,5 μm, Herstellung mittels Sprühtrocknung) und die Trägeroberfläche von überschüssigen Partikeln gereinigt (siehe Fig. 1 1 B). Der Ausgangsträger wurde auf einem Zielträger positioniert und beide Lochraster in Übereinstimmung gebracht. Anschließend wurden 5x5 Vertiefungen von oben mit einen gepulsten Laser bearbeitet (Wellenlänge 532 nm, Pulsenergie ca. 50 μJ, Pulsdauer ca. 10 ns). Dadurch wurden die Vertiefungen des Ausgangsträgers teilweise geleert (siehe Fig. 1 1 C) und die Vertiefungen des Zielträgers gefüllt (siehe Fig. 1 1 D).

In Fig. 15 sind Rasterlektronenmikroskopaufnahmen von mikrostrukturierten Glassubstraten dargestellt, die in einem Trockenätzverfahren hergestellt wurden. Die zylinderförmigen Vertiefungen haben eine Tiefe von ca. 8 μm und einen Pitch von 10 μm. In Fig. 15a ist ein Ausgangsträger abgebildet. Auf den Träger wurde mit einem Sputterprozess eine einige Nanometer dicke Schicht aus Gold aufgebracht. Die Vertiefungen wurden anschließend mit der bereits beschriebenen Rakeltechnik mit Partikeln gefüllt. Zusätzlich wurde Ausgangsträger kurz erhitzt, um die Partikel miteinander zu versintern. Einige der Vertiefungen sind leer, da die Partikel mit einem Laserpuls bereits auf ein anderes Substrat übertragen wurden. Fig. 15b zeigt einen Zielträger mit dem übertragenen Partikelmaterial. Die Partikel aus Fig. 15 bestehen aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer und enthalten Biotin als chemischen Baustein.

Fig. 16 zeigt Lichtmikroskopaufnahmen vom Übertrag eines komplexen Musters aus Partikeln, die die Aminosäure Cystein enthalten, zwischen zwei mikrostrukturierten Glassubstraten mit zylinderförmingen Vertiefungen mit einem Pitch von 10 μm (dunkel: mit Material gefüllte Vertiefungen, hell: leere Vertiefungen). Fig. 16a zeit den Ausgangsträger (Durchmesser der Vertiefungen ca. 5 μm) und Fig. 16b den Zielträger (Durchmesser der Vertiefungen ca. 7 μm).

Fig. 17 zeigt eine Fluoreszenzaufnahme von Biotinspots mit einem Pitch von 10 μm auf einem Zielträger (links: Schachbrettmuster, rechts: Buchstaben KIT). Zur Erzeugung des Musters wurden Partikel aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer mit BiotinOPfp-Ester gemäß dem in Fig. 14 dargestellten Schema zwischen zwei mikrostrukturierten Glassubstraten übertragen. Der Ausgangsträger wurde in einem Sputterprozess mit einer einige Nanometer dicken Goldschicht versehen, bevor die Mikrovertiefungen in einem Rakelprozess mit Partikelmaterial gefüllt wurden.

Für den Übertrag wurde ein gepulster Laser mit Wellenlänge 532 nm verwendet. Der Zielträger war mit einer Aminofunktionalisierung versehen. Um nach dem Übertrag die chemische Kupplung des Biotin-OPfp-Esters an den Zielträger zu erreichen, wurde der Träger unter einer Schutzgasatmosphäre bis über die Glastemperatur des Styrol-Acrylat-Copolymers erhitzt. Anschließend wurde überschüssiges Material in verschiedenen Waschschritten mit Dimethylformamid und Aceton entfernt und der Träger mit einer Lösung aus fluoreszenzmarkiertem Streptavidin in Kontakt gebracht.

(8) Synthese von Molekülarrays

Es wurde nach dem in Fig. 12 dargestellten Schema vorgegangen, um einen Peptidarray mit den Aminosäuresequenzen Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala (Hämagglutinin oder HA) und Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (FLAG) mit einem Rastermaß von 150 μm zu synthetisieren.

Als Ausgangsträger wurden Glasobjektträger verwendet, die mit einer Zwischenschicht aus Polyimid in Form einer selbstklebenden Kapton-Folie der Firma DuPont versehen wurden. Anschließend wurden die entsprechenden Aminosäurederivate und ein Styrol-Acrylat-Copolymer (SLEC PLT-7552, Sekisui Chemical GmbH) in Dichlormethan gelöst und per Rotationsbeschichtung aufgetragen. Die fertig präparierten Ausgangsträger wurden, wie in Fig. 12 dargestellt, direkt auf den amino-funk-tionalisierten Zielträger gelegt und von oben durch den Ausgangsträger hindurch mit einem Laser bestrahlt (Wellenlänge 532 nm, Laserleistung 300-400 mW, Laserpulsdauer ca. 5 ms, Laserfokusdurchmesser ca. 20 μm). Dadurch wurde Material mit Aminosäurederivaten auf den Zielträger übertragen. Der Übertrag wurde mit verschiedenen Ausgangsträgern mit Aminosäuren gemäß den oben genannten Sequenzen der Peptide FLAG und HA wiederholt.

Nach dem Übertrag jeder Lage des Arrays wurde der Zielträger unter Argonatmosphäre für 90 min auf 90 °C erhitzt, um die Aminosäuren an den Zielträger zu kuppeln. Der Zielträger wurde mit einer Mischung aus N,N-Dimethylformamid, Diisopropylethylamin und Essigsäureanhydrid gewaschen, um überschüssige Aminosäuren und die Polymermatrix zu entfernen und um freie Aminogruppen auf dem Träger zu blockieren. Anschließend wurden die Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutz-gruppen mit einer Lösung aus Piperidin in Ν,Ν-Dimethylformamid von den Aminosäuren entfernt. Nach Fertigstellung der Peptidsequenzen wurden die Seitenschutz-gruppen mit Trifluoressigsäure entfernt.

Fig. 13 zeigt eine Fluoreszenzaufnahme des Peptidarrays nach der Detektion der Peptide mit fluoreszenzmarkierten spezifischen Antikörpern (anti-FLAG Cy3 und anti-HA Cy5).

(9) Ablation und Transfer von Monomerpartikeln mit Laserpulsen nach dem in Fig. 18 dargestellten Schema

Ein Ausgangsträger aus Glas bedeckt mit einer Schicht aus Monomerpartikeln wurde Laserpulsen (Wellenlänge 532 nm, Pulsenergie ca. 50 μJ, Pulsdauer ca. 10

ns) ausgesetzt. Monomerpartikel aus der Schicht konnten so abgetragen werden (siehe Fig. 10A). Ein zweiter Glasobjektträger, der im Abstand von etwa 170 μm positioniert wurde, diente als Zielträger, auf dem sich die Partikel wieder absetzen (siehe Fig. 10B).