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1. CN111961750 - KASP primers for detecting tomato yellow leaf curl virus disease-resistant gene Ty-1 and application of KASP primers

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[ ZH ]
检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用


技术领域
本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域,特别是指检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄属的一种一年生或多年生草本植物,起源于南美洲,是一种世界性的蔬菜作物,也是我国的主要栽培蔬菜之一。随着番茄栽培面积的扩大、栽培方式的多样化和连作障碍等影响,番茄病虫害也在不断加剧。近几年,由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引起的番茄黄化曲叶病毒病已成为全世界番茄生产上危害最严重的病害之一。感病植株初期上部叶片首先表现黄化型花叶,生长缓慢或停滞,节间变短,植株明显矮化。后期发病严重时植株生长停滞、矮化,开花后坐果困难,果实不能正常转色,损失达到100%。
培育抗TYLCV的新品种是防治此病的根本途径,随着番茄育种技术的不断进步,番茄已经由传统育种转向现代分子标记辅助的育种研究,分子标记辅助选择是对目标性状在DNA水平上的选择,不受环境影响,不受等位基因显隐性关系干扰,选择结果准确可靠。目前国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中,已将构建DNA分子标记的方法确定为SSR(Simple sequence repeats)和SNP(Single nucleotide polymorphism)标记。SNP标记作为第3代分子标记,目前被公认是极具应用前景的分子标记技术,基于SNP标记开发了许多稳定、高效的SNP分型技术如基因芯片、竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR,KASP)标记,已成功替代传统的SNP电泳分析,其中KASP技术具有高通量、省时、便捷的特点,其特点是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型,可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断,具有高度稳定性与准确性,成为SNP基因分型的主流。其主要特征是引物采用3条特异性引物,其中上游引物2条,3’端为等位基因变异碱基,5’端添加通用荧光接头序列,通用的下游引物为普通引物,常规PCR扩增,终点法荧光信号检测。
目前,番茄抗黄化曲叶病毒病抗病基因主要有:Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5。几乎所有的抗病品种选育中Ty-1和Ty-3/Ty3a基因被认为是复等位基因,也是抗番茄黄化曲叶病毒病的最重要的基因,其抗病具有持久和稳定性,广泛应用于番茄抗黄化曲叶病毒育种中。因此利用KASP技术快速准确地鉴定番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1等可以大幅度提高新品种的选育效率,缩短育种年限。
KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一,基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物,其中上游引物2条,3’端为等位基因变异碱基,5’端添加通用荧光接头序列,下游引物为普通引物,常规PCR扩增,终点法荧光信号检测。
KASP的特异性引物通常采用24bp-26bp,会有更高的特异性,对比常规酶切电泳准确率高;只需常规PCR扩增,所需时间短;无需昂贵的双色标记探针,灵活性超强;最低的DNA样本需求,无需全基因组扩增;快速高效,可以高通量检测大量样本的少数几个标记。
其主要操作步骤如下:
1、含有SNP位点的等位基因-1和-2作为模板;
2、针对等位基因SNP位点设计特异性引物:两个正向引物和一个通用反向引物;
3、两条正向引物5’端分别连有特异性的检测引物序列,可与荧光标记结合;
4、提取待测样品的基因组DNA为模板;
5、PCR扩增,对扩增产物进行荧光信号扫描,数据分析。
KASP技术具有灵活、便宜、准确的特点,已被广泛应用于各个领域。目前,还未发现应用于番茄黄化曲叶病毒病检测上的KASP标记。
申请人未在国内专利数据库中检索到与本申请相关主题的专利文献。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用,可用于鉴定番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1及番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1,区分含有Ty-1的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄和不含有Ty-1的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄,区分纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/Ty-1)、纯合的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄(ty-1/ty-1)和杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/ty-1),进而选育出含有Ty-1基因的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种。
本发明的整体技术构思是:
检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物,所述KASP引物序列包含:
正向引物Ty-1-F1:5’-TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,其序列如SEQ No.1;
正向引物Ty-1-F2:5’-TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,其序列如SEQ No.2;
所述正向引物Ty-1-F1和正向引物Ty-1-F2分别连接有不同的标签序列。
用于鉴定检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的试剂盒,包含分别连接有不同的标签序列的正向引物Ty-1-F1和正向引物Ty-1-F2的KASP引物;或者5'端加上标签序列A的正向引物Ty-1-F1及5'端加上标签序列B的正向引物Ty-1-F2的KASP引物;或者正向引物1序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’以及正向引物2序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’的KASP引物;或者包含反向引物序列为5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’的KASP引物。
上述KASP引物或试剂盒在鉴定番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1中的应用。
上述KASP引物或试剂盒在鉴定番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1中的应用。
上述KASP引物或试剂盒在鉴定或区分含有Ty-1的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄和不含有Ty-1的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄中的应用。
上述KASP引物或试剂盒在区分纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/Ty-1)、纯合的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄(ty-1/ty-1)和杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/ty-1)中的应用。
上述KASP引物或试剂盒在Ty-1基因在番茄抗TYLCV育种中的应用。
本发明的具体技术构思还有:
所述KASP引物序列为:
正向引物1:5’–GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,其序列如SEQ No.3;
正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,其序列如SEQ No.4。
所述KASP引物序列还包含:
反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’,,其序列如SEQ No.5。
所述的试剂盒,其特征在于其中还包含:
标签序列A:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’,其序列如SEQ No.6;
标签序列B:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’,其序列如SEQ No.7;
所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接;所述两种标签序列的互补序列均与BHQ淬灭基因相连接;标签序列A与FAM荧光基因相连接,标签序列B与HEX荧光基因相连接。
所述的KASP引物或试剂盒在鉴定番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1中的应用,以及在鉴定番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1中的应用,是利用试剂盒扩增待检测的番茄样品,检测和分析扩增产物。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于:
利用本申请提供的KASP引物及试剂盒,相比现有技术可对番茄植株在苗期进行快速、准确、高通量的抗病性鉴定,大大降低育种者苗期人工接种和田间鉴定抗病性的工作量,其应用可提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。所述KASP引物及试剂盒可应用于番茄种植资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。
附图说明
图1为番茄黄化曲叶病毒病Ty-1基因标记的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值,其中横坐标表示HEX荧光信号值,纵坐标表示FAM荧光信号值;I处圆点为抗番茄黄化曲叶病毒病材料P808-1的扩增信号;II处圆点为杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病材料P808-1-P802-1-F1的扩增信号;III处圆点为感番茄黄化曲叶病毒病材料P802-1的扩增信号;靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
图2为鉴定抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄和感番茄黄化曲叶病毒病的番茄的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值,其中横坐标表示HEX荧光信号值,纵坐标表示FAM荧光信号值;I处圆点为抗番茄黄化曲叶病毒病材料的扩增信号;II处圆点为杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病材料的扩增信号;III处圆点为感番茄黄化曲叶病毒病材料的扩增信号;靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述,但不作为对本发明的限定,本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准,任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换,均不脱离本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂(武汉市景肽生物科技有限公司)等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的番茄材料:番茄抗病材料P808-1、番茄感病材料P802-1和杂合的番茄抗病材料P808-1-P802-1-F1,社会公众可向河北省农林科学院经济作物研究所生物技术室索取,以重复本实验。
KASP基因分型方法操作简单,只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR反应孔中,进行PCR扩增,最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。
本发明基于KASP技术,提供了可用于高通量鉴定番茄黄化曲叶病毒病抗病基因的KASP引物,包括两条特异性扩增引物和一条通用引物,结合应用条件严格的Touchdown PCR方法,建立了应用高通量分子标记检测平台鉴定番茄黄化曲叶病毒病抗病基因的方法。
具体地,申请人基于前人研究,即番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1在第3461碱基的位置存在一处SNP位点。经申请人验证,该处SNP位点满足KASP标记开发的要求(基因型在3461bp不同;邻近无其他SNP位点,位于非SNP密集区域;避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域)。针对番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1第3461位(T/C)SNP位点进行大量实验,筛选确定了两条特异性正向引物和一条通用反向引物。
具体实施方案中,针对SNP位点碱基的不同需要设计不同的正向或反向引物,例如,本申请提供的正向引物为两条,包括正向引物Ty-1-F1:5’TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物Ty-1-F2:5’-TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,两者仅3’端最后一个碱基不同,即对应的SNP位点;同时在两个正向引物的5’端分别与不同的标签序列相连接,如标签序列A:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT,和标签序列B:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
例如,本申请提供的正向引物1:5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’。其中下划线所示序列即为添加的标签序列。
具体实施方案中,KASP技术要求PCR扩增产物长度在80bp-150bp之间为宜,在此前提下序列可变。例如,本申请所提供的反向引物为:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’,扩增产物长度为110bp。
进一步地,在具体实施方案中,本申请所提供的试剂盒还包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B,其中,荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同,为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’,在其5’末端连接1个荧光基团FAM;荧光探针B的序列与标签序列B相同,为5’-GAAGGTCGGAGTCAAC、GGATT-3’,在其5’末端连接1个荧光基团HEX。淬灭探针A的序列与标签序列A的序列互补,为5’-CTTCCACTGGTTCAAGTACGA-3’,其序列如SEQ No.8;淬灭探针B的序列与标签序列B互补,为5’-CTTCCAGCCTCAGTTGCCTAA-3’,其序列如SEQ No.9;同时,在淬灭探针A和淬灭探针B的3’末端均连接上淬灭基因BHA。
例如,上述的荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B可来自武汉市景肽生物科技有限公司的PARMS(PRO2.0)试剂盒。
本申请所提供的检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物或用于检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的试剂盒,可用于鉴定番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1,同时作为共显性标记又可用于区分纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/Ty-1)、纯合的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄(ty-1/ty-1)和杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/ty-1),准确鉴定Ty-1的基因型进而指导番茄育种和番茄黄化曲叶病毒病的防控等工作。
在具体实施方案中,本申请提供鉴定番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1的方法,其包括利用本申请提供的KASP引物扩增待鉴定的番茄样品的DNA,并检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中,本申请提供的KASP引物:例如,正向引物1:5’- GAAGGTGACCAA GTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,及反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号,或同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品中含有番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1;扩增若只检测到HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品中不含番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1。
在具体实施方案中,本申请提供的KASP引物:例如,正向引物1:5’- GAAGGTGACCAA GTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,及反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号,则认定待检测的番茄样品含有纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1;扩增若同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号,则认定待检测的番茄样品含有杂合的番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1;扩增若只检测到HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品不含番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1。
在具体实施方案中,所述的待鉴定的番茄样品可取自番茄植株的叶片、根、茎、花、果实和种子种的任一种。
在另一具体实施方案中,本申请提供了区分含有Ty-1抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄和不含有Ty-1感番茄黄化曲叶病毒病的番茄,及区分纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/Ty-1)、纯合的感番茄黄化曲叶病毒病的番茄(ty-1/ty-1)和杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄(Ty-1/ty-1)的应用,其包括利用本申请提供的KASP引物或试剂盒扩增待鉴定的番茄样品的DNA,并检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中,本申请提供的KASP引物:例如,正向引物1:5’- GAAGGTGACCAA GTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,及反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号,或同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品为抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄;扩增若只检测到HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品为感番茄黄化曲叶病毒病的番茄。
在具体实施方案中,本申请提供的KASP引物:例如,正向引物1:5’- GAAGGTGACCAA GTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’,和正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’,及反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号,则认定待检测的番茄样品为纯合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄;扩增若同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号,则认定待检测的番茄样品为杂合的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄;扩增若只检测到HEX荧光信号,则认定待鉴定的番茄样品为感番茄黄化曲叶病毒病的番茄。
在具体实施方案中,所述的待鉴定的番茄样品可取自番茄植株的叶片、根、茎、花、果实和种子种的任一种。
以下实施例仅用于说明而非限制本发明范围的目的。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
实施例1
KASP标记的开发
比较分析Ty-1的抗病和感病两个等位基因的序列,将Ty-1抗病的等位基因命名为Ty-1/Ty-1,Ty-1感病的等位基因命名为ty-1/ty-1;并且二者在第3461bp的位置存在一处SNP位点。该处SNP位点满足KASP标记开发的要求:基因型在3461bp不同;邻近无其他SNP位点,位于非SNP密集区域;避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域。
因此在第3461位T/C位点作为唯一选择目标;此位点处Ty-1+的基因型位T,Ty-1的基因型位C。
根据上述SNP位点设计KASP引物,引物序列为:
第3461位T/C:
正向引物1:5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TCAATGAACCTCATCTCCATGT-3’;
正向引物2:5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TCAATGAACCTCATCTCCATGC-3’;
其中下划线所示序列为添加的标签序列;
反向引物:5’-TGTTCCCATAAGATAAAAACTGTCA-3’。
引物测试结果如图1。
实施例2
分子标记的扩增
本实施例中使用材料为申请人所选育的高世代纯合抗病材料P808-1(Ty-1/Ty-1),感病材料P802-1(ty-1/ty-1)这些材料田间鉴定分别表现为抗病和感病(以下同),和将两者作为亲本杂交制备的P808-1-P802-1-F1杂合抗病材料(Ty-1/ty-1)。采集植株的叶片组织用于基因组DNA提取。
按照Plant DNA Isolation Kit(成都福际生物技术有限公司)试剂盒说明要求提取上述材料叶片中的基因组DNA,并将所提取的DNA溶液的浓度稀释至50-100ng/μl,于-20℃保存。
按照KASP-PARMS试剂盒(武汉市景肽生物科技有限公司)要求配置PCR反应体系,反应总体积为10μl,包括:2X PARMS PCR Mix:5μl;DNA提取液(50-100ng/μl):1μl;正向引物1:0.15μl(10pmol/μl);正向引物2:0.15μl(10pmol/μl);反向引物:0.4μl(10pmol/μl);以及ddH2O:3.3μl。设置三个技术重复。
PCR反应程序为:94℃:15分钟;94℃:20秒,65℃(每循环下降0.8℃):1分钟,10个循环;94℃:20秒,57℃:1分钟,28个循环。PCR反应使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System进行。
实施例3
扩增产物的检测和分析
使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析,其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值,横坐标数值表示HEX荧光信号值。
基因分型结果见图1。其中I处圆点为抗病材料P808-1的扩增信号,仅检测到FAM荧光信号;II处圆点为杂合抗病材料P808-1-P802-1-F1的扩增信号,同时检测到FAM荧光和HEX荧光;III处圆点为感病材料P802-1的扩增信号,仅检测到HEX荧光信号;靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。两种纯合基因型的扩增信号,即纯合抗病和纯合感病的扩增信号分别与原点连线,所形成的夹角越接近于直角说明分型效果越好。
结果表明,所述KASP引物对P808-1的扩增信号按预期靠近纵轴,对P802-1的扩增信号按预期靠近横轴,对P808-1-P802-1-F1的扩增信号按预期处于中间位置,
三种基因型可以明显被区分和聚类,该组引物可以使用,设计成功。
实施例4
利用所述Ty-1基因KASP引物或试剂盒鉴定和区分抗番茄黄化曲叶病毒病番茄和感番茄黄化曲叶病毒病番茄
本实施例中使用材料为申请人所选育的高世代纯合抗病材料P808-1,感病材料P802-1,和将两者作为亲本杂交制备的P808-1-P802-1-F1杂合抗病材料。广泛搜集番茄种植资源253份(具体分型结果见表1),采集植株的叶片组织用于基因组DNA提取。
采用实施例2中所述的方法,分别提取253份材料的基因组DNA样本作为PCR扩增模板;使用所述KASP引物进行PCR扩增;使用Applied Biosystems7500Real-Time PCR System进行PCR反应;使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析,其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值,横坐标数值表示HEX荧光信号值。
检测分型结果显示,检测带型同图2中I的单株数为84(仅检测到FAM荧光信号,为纯合的抗病材料)、检测带型同图2中II的单株数为73(同时检测到FAM和HEX荧光信号,为杂合的抗病材料)、检测带型同图2中III的单株数为96(仅检测到HEX荧光信号,为感病材料)、检测带型同图2中IV靠近原点处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
上述结果表明,所设计的引物对抗病番茄和感病番茄均能够准确的进行鉴定。
表1鉴定抗番茄黄化曲叶病毒病番茄材料的分型结果
序列表
<110> 河北省农林科学院经济作物研究所
<120> 检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用
<130> none
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 1
tcaatgaacc tcatctccat gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
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<400> 2
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<212> DNA
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<400> 3
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<211> 43
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 5
tgttcccata agataaaaac tgtca 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
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<400> 7
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<212> DNA
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<400> 9
cttccagcct cagttgccta a 21