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1. WO2020135804 - HETERODIMERIC FUSION PROTEIN

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46  

附图

1A   1B   1C   1D   1E   1F   1G   1H   1I   1J   1K   1L   1M   1N   1O   1P   1Q   1R   1S   1T   1U   1V   1W   1X     2     3-1     3   4 (R26)   5 (R26)   6   7 (R26)   8 (R26)   9 (R26)   10 (R26)   10(续) (R26)   11 (R26)   12   13A   13B   13C   14 (R26)   15 (R26)   16   17   18  

说明书

发明名称 : 异源二聚体融合蛋白

技术领域

[0001]
本发明属于生物技术制药领域,具体基于免疫球蛋白片段的异源二聚体融合蛋白及其制备与应用。

背景技术

[0002]
自1986年美国FDA批准第一个治疗性抗体muromonab-CD3用于治疗器官移植相关的急性排斥反应以来,截止至2018年5月,FDA批准的治疗性单抗已经超过80个,平均每年2-3个单抗获批。近几年来,治疗性单抗的获批呈井喷之势。2015年批准的治疗性单抗10个、2016年10个,2017年FDA批准的治疗性单抗破纪录地达到了17个。据估计,2020年治疗性单抗的市场份额将超过1250亿美元(Expert Opin Ther Pat.2018;28(3):251-276)。尽管单抗市场获得了巨大的成功,但是,单抗治疗的缺陷却不容忽视。传统抗体仅结合单一靶点的单一表位,其疗效受到一定限制。药理学研究揭示,多数复杂疾病都涉及多种与疾病相关的信号通路,例如肿瘤坏死因子TNF、白介素6等多种促炎症细胞因子同时介导免疫炎性疾病,而肿瘤细胞的增殖往往是由多个生长因子受体的异常上调造成的。单一信号通路的阻断通常疗效有限,而且容易形成耐药性。
[0003]
因此,开发能够同时结合同一抗原或不同抗原的两个不同表位的双特异性抗体,长期以来成为新结构抗体研发的重要领域。截止至目前,已经有三个双特异性抗体被批准上市。最早的双抗是Frenesius和Trion公司利用小鼠和大鼠杂交瘤细胞杂交融合产生的Catumaxomab (anti-EpCAM×anti-CD3),于2009年被EMA(欧洲药品管理局)批准用于治疗EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)阳性肿瘤所引起的恶性腹水。2014年12月,Amgen公司研发的双特异性靶向(anti-CD3×anti-CD19)抗体药物Blinatumomab 获得FDA的批准,用于治疗费城染色体阴性(Ph-)的复发性或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)。Blinatumomab享受了FDA所有的审批优惠,包括优先评审、加速批准、突破性药物认定和孤儿药。2017年,Chugai和Roche的Emicizumab (anti-factor X×anti-factor IX)被FDA批准用于A型血友病的治疗。据统计,目前有超过60种双特异性抗体处于临床前研究阶 段,超过30种处于不同的临床试验阶段。根据2014年的双特异性抗体治疗市场估计(Bispecifc antibody therapeutics market(3 rd edition),2017–2030),至2024年双特异性抗体每年的市场份额将达到58亿美元,双特异性抗体市场巨大。
[0004]
根据其分子结构,目前正在进行临床前或临床研究的双特异性抗体可以分为两大类:以免疫球蛋白样(IgG-like)为基础的双抗和以抗体片段为基础的非免疫球蛋白样(non-IgG-like)的双抗。以BiTE技术平台为代表的non-IgG-like双抗分子量小,组织穿透性好,但是由于其缺少Fc片段,体内半衰期很短。例如,已被批准上市的Blincyto其官方公布的体内半衰期仅2h,临床上需连续注射给药,患者的依从性差;此外,其稳定性相对较差,容易产生无定形聚集;IgG-like的双抗含有IgG分子中的Fc片段,保留了Fc介导的如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)等效应功能;除此之外,Fc可用于IgG-like双抗的纯化,有助于改善溶解性,大大提高这类双抗的稳定性;由于分子量大且可通过FcRn介导的再循环机制,Ig-like的双抗通常具有较长的血浆半衰期。以Roche的CrossMab技术为代表的Ig-like双抗通过将其中一个抗体片段的VH与VL、CH1-CL或VH/CH1-VL/CL互换以及Fc骨架上的knobs-into-holes,有效地解决了分子内两个抗体片段各自的轻链-轻链配对、重链-重链配对以及重链轻链错配问题,目前已有多个抗体处于临床试验阶段的BsAbs采用了该技术。然而,其中一个抗体片段由于结构域互换而变为非常规的Fab类型,该抗体片段对抗原的亲和力受到一定的影响,药代动力学特性也不是特别佳。而以DVD-Ig为代表的同源2+2型双抗,其Fc的两臂分别可以结合两个抗原,大大提高了BsAb的亲和力,但是由于其为同源二聚体,容易激活T细胞,因此该类BsAbs不适合用于召集T细胞杀伤肿瘤细胞。因此,制备具有优良药代动力学特性、工艺相对简单而又保持分子内两个抗体的天然结合活性的BsAbs对于临床药物开发至关重要。
[0005]
本发明简述:
[0006]
本发明提供这样的异源二聚体融合蛋白,其中,将能够构成第一抗原结合结构域Fab的Fab重链(FabH)和Fab轻链(FabL)分别融合(直接或通过连接子)在两条单链Fc的N端,由此形成的结构具有类似抗体的稳定蛋白折叠。在此基础上,本发明还提供这样的异源二聚体融合蛋白,其中进一步将构成第二抗原结合结构域的scfv、Fab2、Fv、纳米抗体或生理活性肽与所述Fab重链和/或轻链的N端或任一所述单链Fc的C端融合。由此获得的异源二聚体融合蛋白的分子内的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域分别可以 形成并保持其功能性的构象,从而可以很好地发挥两个抗原结合结构域本身的活性和药学性质;其中至少一个抗原结合结构域可以单价结合抗原。此外,由于保留了Fc片段,本发明的异源二聚体融合蛋白具有较长的半衰期。
[0007]
据此,在一方面,本发明提供了基于免疫球蛋白片段的异源二聚体融合蛋白,所述异源二聚体融合蛋白包括:
[0008]
a)第一多肽链,其包含Fab重链和第一单链Fc,所述Fab重链直接或通过连接子与所述第一Fc单链的N端融合;
[0009]
b)第二多肽链,其包含Fab轻链和第二单链Fc,所述Fab轻链直接或通过连接子与所述第二Fc单链的N端融合;
[0010]
其中,所述第一多肽链的Fab重链和所述第二多肽链的Fab轻链形成第一抗原结合结构域Fab,所述第一单链Fc和所述第二单链Fc形成Fc二聚结构域(图1A)。
[0011]
在一些实施方案中,所述连接子为GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS。在一些实施方案中,所述连接子为GGGGSELAALEAELAALEAGGSG。在一些实施方案中,所述第一多肽链的Fab重链通过连接子GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS与所述第一Fc单链的N端融合,所述第二多肽链的Fab轻链通过连接子GGGGSELAALEAELAALEAGGSG与所述第二Fc单链的N端融合。在一些实施方案中,所述第一多肽链的Fab重链通过GGGGSELAALEAELAALEAGGSG与所述第一Fc单链的N端融合,所述第二多肽链的Fab轻链通过连接子GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS与所述第二Fc单链的N端融合。
[0012]
所述第一单链Fc和第二单链Fc优选源自相同的抗体同种型(isotypes)。但也可以来自不同的抗体同种型,只要二者能够配对形成二聚体即可。在一些实施方案中,第一单链Fc和第二单链Fc均源自IgG,更具体地,均源自IgG1。第一单链Fc和第二单链Fc通过链间二硫键以及分子间相互作用配对形成二聚体。在一些实施方案中,所述第一和第二单链Fc为野生型Fc。在一些实施方案中,所述野生型Fc具有如SEQ ID NO.147所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述第一和第二单链Fc为Fc变体。在一些实施方案中,所述Fc变体不含糖基化修饰位点。在一些实施方案中,所述Fc变体包含N297去糖基化修饰的氨基酸置换。在一些实施方案中,所述包含N294去糖基化修饰氨基酸修饰的Fc变体具有如SEQ ID NO.143所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述Fc变体包含一处或多处降低Fc对Fc受体的结合和/或效应功能的氨基酸置换。在一些实施方案中,所述Fc变体中的氨基酸置换包含E233P、L234V、L235A、delG236、A327G、A330S及 A331S中的一种或多种。在一些实施方案中,所述包含一处或多处降低Fc对Fc受体的结合和/或效应功能的氨基酸置换的Fc变体具有如SEQ ID.144所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述第一Fc变体和第二Fc变体之一进一步包含氨基酸置换S354C、T366W,且所述第一Fc和所述第二Fc中的另一个进一步包含氨基酸置换Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中,所述第一Fc变体具有如SEQ ID NO.145所示的氨基酸序列,所述第二Fc变体具有如SEQ ID NO.146所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述第一Fc变体具有如SEQ ID NO.146所示的氨基酸序列,所述第二Fc变体具有如SEQ ID NO.145所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述第一Fc变体具有如SEQ ID NO.147所示的氨基酸序列,所述第二Fc变体具有如SEQ ID NO.148所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述第一Fc变体具有如SEQ ID NO.148所示的氨基酸序列,所述第二Fc变体具有如SEQ ID NO.147所示的氨基酸序列。
[0013]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白进一步包含第二抗原结合结构域。
[0014]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为单链Fv(scfv)。
[0015]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的scfv直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合(图1B)。
[0016]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域scfv结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和如SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.18所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0017]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的scfv直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1C)。
[0018]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的FabH和SEQ ID NO.126所示的FabL。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域scfv结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列的第一多肽链和具有如SEQ ID NO.58所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0019]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的scfv直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合(图1D)。
[0020]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.129所示的Fab重链和SEQ ID NO.130所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.131所示的Fab重链和SEQ ID NO.132所示的Fab轻链。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的scfv结合CD19。在一些实施方案中,构成所述结合CD19的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的scfv结合EGFR。在一些实施方案中,构成所述结合EGFR的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和CD19。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第一多肽链和具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.129所示的Fab重链和SEQ ID NO.130所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融 合蛋白具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的第一多肽链和具有如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.131所示的Fab重链和SEQ ID NO.132所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有如SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的第一多肽链和具有如SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0021]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的scfv直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合(图1E)。
[0022]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.129所示的Fab重链和SEQ ID NO.130所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.131所示的Fab重链和SEQ ID NO.132所示的Fab轻链。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的scfv结合CD19。在一些实施方案中,构成所述结合CD19的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的scfv结合BCMA。在一些实施方案中,构成所述结合BCMA的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.140所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域scfv结合CLL-1。在一些实施方案中,构成所述结合CLL-1的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.141所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的scfv结合EGFR。在一些实施方案中,构成所述结合EGFR的第二抗原结合结构域的scfv具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和CD19。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.129所示的Fab重链和SEQ ID NO.130所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白具有如SEQ ID NO.20所示氨 基酸序列的第一多肽链和具有如SEQ ID NO.22所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.24所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.26所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和BCMA。在一些实施方案中,所述结合CD3和BCMA的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.140所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和BCMA的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.40所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和CLL-1。在一些实施方案中,所述结合CD3和CLL-1的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.141所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CLL-1的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.42所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.24所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.28所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.32所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.54所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.56所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.44所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.46所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.44所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.52所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.48所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.50所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.131所示的Fab重链和 SEQ ID NO.132所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.142所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.36所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.38所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0023]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为生理活性肽。
[0024]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合(图1B)。
[0025]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1C)。
[0026]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合(图1D)。
[0027]
在一些实施方案中,所述生理活性肽为EGF4。在一些实施方案中,所述生理活性肽EGF4具有如SEQ ID NO.150所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白其结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域生理活性肽具有如SEQ ID NO.150所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0028]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合(图1E)。
[0029]
在一些实施方案中,所述生理活性肽为EGF4。在一些实施方案中,所述生理活性肽EGF4具有如SEQ ID NO.150所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.150所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白具有 包含如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.34所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域由第一和第二生理活性肽组成。
[0030]
在一些实施方案中,所述第一和第二生理活性肽分别与所述第一多肽链和第二多肽链的N端直接或通过连接子融合。
[0031]
在一些实施方案中,所述第一和第二生理活性肽分别与所述第一多肽链和第二多肽链的C端直接或通过连接子融合(图1F)。
[0032]
在一些实施方案中,所述第一和第二生理活性肽不同。在一些实施方案中,所述第一和所述第二生理活性肽相同。
[0033]
在一些实施方案中,所述第一和第二生理活性肽为NKG2D。在一些实施方案中,所述生理活性肽NKG2D具有如SEQ ID NO.151所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和MIC-A。在一些实施方案中,所述结合CD3和MIC-A的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.151所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和MIC-A的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.122所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.124所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0034]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为Fv。
[0035]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合,构成所述第二抗原结合结构域的Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合(图1G)。
[0036]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二结合结构域的Fv结合EGFR。在一些实施方案中,构成所述结合EGFR的第二抗原结合结构域的Fv具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结 构域具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.60所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.62所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.64所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.66所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.68所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.70所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0037]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合(图1H)。
[0038]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域结合EGFR。在一些实施方案中,构成所述结合EGFR的第二抗原结合结构域的Fv具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.72所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.74所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.76所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.78所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.80所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.82所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0039]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,构成所述第二抗原结合结构域的Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合(图1J)。
[0040]
在一些实施方案中,构成所述第二抗原结合结构域的Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1I)。
[0041]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域结合CD3。在一些实施方案中,构成所述结合CD3的第二抗原结合结构域的Fv具有如SEQ ID NO.133所示的重链可变区和SEQ ID NO.134所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.133所示的重链可变区和SEQ ID NO.134所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.104所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.106所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0042]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.125所示的Fab轻链。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域的Fv结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第二抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.125所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.135所示的重链可变区和SEQ ID NO.136所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.108所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.110所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0043]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为Fab2。
[0044]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合(图1K)。
[0045]
在一些实施方案中,所述异源二聚体的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,构成所述异源二聚体的第二抗原结合结构域的Fab2结合EGFR。在一些实施方案中,构成所述结合EGFR的第二抗原结合结构域的Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.84所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.86所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0046]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合(图1N)。
[0047]
在一些实施方案中,所述异源二聚体的第一抗原结合结构域结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体的第二抗原结合结构域Fab2结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.88所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.90所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0048]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合(图1M)。
[0049]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1L)。
[0050]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域Fab2结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体结合EGFR和CD3。在一些实施方案中,所述结合EGFR和CD3的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合EGFR和CD3的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.112所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.114所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0051]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域Fab2结合EGFR。在一些实施方案中,所述结合EGFR的第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和EGFR。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fab具有如SEQ ID NO.125所示的Fab重链和SEQ ID NO.126所示的Fab轻链,其第二抗原结合结构域Fab2具有如SEQ ID NO.127所示的Fab重链和SEQ ID NO.128所示的Fab轻链。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.116所示氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO.118所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0052]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为纳米抗体。
[0053]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0054]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第一多肽链的C端融合。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第二多肽链的C端融合。
[0055]
另一方面,本发明提供了基于免疫球蛋白片段的异源二聚体融合蛋白,所述异源二聚体包括:
[0056]
a)第一多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L1)n、CH1、L2、VH,
[0057]
b)第二多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L3)n、CL、L4、VL;
[0058]
其中,n为0或1,L1、L2、L3和L4为连接子,VH和VL形成第一抗原结合结构域Fv。
[0059]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白进一步包括第二抗原结合结构域。
[0060]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为生理活性肽。
[0061]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的N端融合(图1P和图1S)。
[0062]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的C端融合(图1T和图1U)。
[0063]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为Fab2。
[0064]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0065]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0066]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为Fv。
[0067]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0068]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合。
[0069]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为纳米抗体。
[0070]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0071]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为scfv。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的C端融合(图1T和图1U)。
[0072]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1S)。
[0073]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与第一多肽链的N端融合(图1P)。
[0074]
在一些实施方案中,所述异源二聚体的第一抗原结合结构域Fv结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.133所示的VH和SEQ ID NO.134所示的VL。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.137所示的VH和SEQ ID NO.138所示的VL。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv结合CD19。在一些实施方案中,所述结合CD19的第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和CD19。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.133所示的VH和SEQ ID NO.134所示的VL,其第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有如SEQ ID NO.96所示氨基酸序列的第一多肽链和SEQ ID NO.98所示氨基酸序列的第二多肽链。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白的第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.137所示的VH和SEQ ID NO.138所示的VL,其第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和EGFR的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.92所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.94所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0075]
一方面,本发明提供了基于免疫球蛋白片段的异源二聚体融合蛋白,所述异源二聚体包括:
[0076]
a)第一多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L1)n、CL、L2、VH,
[0077]
b)第二多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L3)n、CH1、L2、VL,
[0078]
其中,n为0或1,L1、L2、L3和L4为连接子,VH和VL形成第一抗原结合结构域Fv。
[0079]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白进一步包括第二抗原结合结构域。
[0080]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为生理活性肽。
[0081]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的N端融合(图1Q和图1R)。
[0082]
在一些实施方案中,所述生理活性肽直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的C端融合(图1V和图1W)。
[0083]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为Fab2。
[0084]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0085]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fab2的重链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0086]
在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白的第二抗原结合结构域为Fv。
[0087]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0088]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合,所述第二抗原结合结构域Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合。
[0089]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为纳米抗体。
[0090]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第一多肽链的N端融合。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域纳米抗体直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合。
[0091]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域为scfv。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与所述第一或第二多肽链的C端融合(图1V和图1W)。
[0092]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与所述第二多肽链的N端融合(图1Q)。
[0093]
在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv直接或通过连接子与第一多肽链的N端融合(图1R)。
[0094]
在一些实施方案中,所述异源二聚体的第一抗原结合结构域结合CD3。在一些实施方案中,所述结合CD3的第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.133所示的VH和SEQ ID NO.134所示的VL。在一些实施方案中,所述第二抗原结合结构域scfv结合CD19。在一些实施方案中,所述结合CD19的第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述异源二聚体融合蛋白结合CD3和CD19。在一些 实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白其第一抗原结合结构域Fv具有如SEQ ID NO.133所示的VH和SEQ ID NO.134所示的VL,其第二抗原结合结构域scfv具有如SEQ ID NO.139所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述结合CD3和CD19的异源二聚体融合蛋白具有包含如SEQ ID NO.100所示氨基酸序列的第一多肽链和包含如SEQ ID NO.102所示氨基酸序列的第二多肽链。
[0095]
本发明将第一抗原结合结构域Fab的重链和轻链分别融合(直接或通过连接子)在两条Fc的N端,在此基础上,进一步将第二抗原结合结构域scfv、Fab2、Fv、纳米抗体或生理活性肽与Fab的N端或Fc的C端融合,有效地解决了两个抗原结合结构域之间的重链与重链、轻链与轻链、重链与轻链的错配问题。
[0096]
本发明提供的异源二聚体融合蛋白包含至少一个连接子。在一些实施例中,所述连接子任选自以下的连接子:GGGGSGGGGSGGGGS、SGGGGSGGGGSGGGGS、GGSGGSGGGGSGGGG、GGSGGSGGGGSGGGGS、GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS、GGGGSELAALEAELAALEAGGSG、APATSLQSGQLGFQCGELCSASA、ASTKGP、TVAAPSVFIFPP、PNLLGGP、GGGGS、GGGEAAAKEAAAKEAAAKAGG。在一些实施方案中,所述连接子相同。在一些实施方案中,所述连接子不同。
[0097]
一方面,本发明还提供编码本发明所述的异源二聚体融合蛋白的多核苷酸。
[0098]
一方面、本发明还涉及一种表达载体,其包含本发明的多核苷酸。
[0099]
一方面,本发明还涉及一种宿主细胞,其包含本发明的表达载体。
[0100]
一方面,本发明还涉及一种药物组合物,其包含本发明的异源二聚体融合蛋白。
[0101]
另一方面,本发明还涉及治疗有需要的受试者的癌症和自身免疫性疾病的方法。在一些实施例中,所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的异源二聚体融合蛋白,或者本文提供的异源二聚体融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0102]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者的B细胞血癌的方法,所述方法包括向受试者施用本发明所述的异源二聚体融合蛋白,其中所述异源二聚体融合蛋白能够结合CD3和CD19。在一些实施例中,所述异源二聚体融合蛋白包含选自:SEQ ID No:2和SEQ ID No:4;SEQ ID No:6和SEQ ID No:8;SEQ ID No:20和SEQ ID No:22;SEQ ID No:24和SEQ ID No:26;SEQ ID No:92和SEQ ID No:94;SEQ ID No:96和SEQ ID No:98;SEQ ID No:100和SEQ ID No:102的氨基酸序列。在一些实施例中,所述B细胞血癌选自:霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞赘瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细 胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生病症、移瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)及间变性大细胞淋巴瘤。
[0103]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法,在一些实施例中,所述癌症选自以下组成的组:黑素瘤(例如,转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如,透明细胞癌)、前列腺癌(例如,激素难治性前列腺腺癌)、胰腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌(例如,非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其它赘生性恶性疾病。
[0104]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者体内EGFR高表达的肺癌、结肠癌等方法,所述方法包括向受试者施用本发明所述的异源二聚体融合蛋白,其中所述异源二聚体融合蛋白能够结合CD3和EGFR。在一些实施例中,所述异源二聚体融合蛋白包含如下氨基酸序列:SEQ ID No:10和SEQ ID No:12;SEQ ID No:14和SEQ ID No:16;SEQ ID No:18和SEQ ID No:12;SEQ ID No:24和SEQ ID No:28;SEQ ID No:30和SEQ ID No:32;SEQ ID No:30和SEQ ID No:34;SEQ ID No:36和SEQ ID No:38;SEQ ID No:44和SEQ ID No:46;SEQ ID No:48和SEQ ID No:50;SEQ ID No:44和SEQ ID No:52;SEQ ID No:54和SEQ ID No:56、SEQ ID No:30和SEQ ID No:58;SEQ ID No:60和SEQ ID No:62;SEQ ID No:64和SEQ ID No:66;SEQ ID No:68和SEQ ID No:70;SEQ ID No:72和SEQ ID No:74;SEQ ID No:76和SEQ ID No:78;SEQ ID No:80和SEQ ID No:82;SEQ ID No:84和SEQ ID No:86、SEQ ID No:88和SEQ ID No:90;SEQ ID No:104和SEQ ID No:106;SEQ ID No:108和SEQ ID No:110;SEQ ID No:112和SEQ ID No:114;SEQ ID No:116和SEQ ID No:118。
[0105]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者的多发性骨髓瘤的方法,所述方法包括向受试者施用本发明所述的异源二聚体融合蛋白,其中所述异源二聚体融合蛋白能够结合CD3和BCMA。在一些实施例中,所述异源二聚体融合蛋白具有SEQ ID No:30和SEQ ID No:40氨基酸序列。
[0106]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者的急性髓系白血病的方法,所述方法包括向受试者施用本发明所述的异源二聚体融合蛋白,其中所述异源二聚 体融合蛋白能够结合CD3和CLL-1。在一些实施例中,所述异源二聚体融合蛋白具有SEQ ID No:30和SEQ ID No:42所述的氨基酸序列。
[0107]
在一些实施例中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者病毒感染的方法,所述方法包括向受试者施用本发明所述的异源二聚体融合蛋白,其中所述异源二聚体融合蛋白能够结合CD3和MICA。在一些实施例中,所述异源二聚体融合蛋白具有SEQ ID No:122和SEQ ID No:124所述的氨基酸序列。

附图说明:

[0108]
图1A为异源二聚体融合蛋白的基本骨架示意图,其中FabH所在链为第一多肽链,FabL所在链为第二多肽链。图1B-图1F为第一抗原结合结构域为Fab,第二抗原结合结构域为scfv或活性肽的异源二聚体结构示意图。其中,第二抗原结合结构域融合在第一多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1B所示;第二抗原结合结构域融合在第二多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1C所示;第二抗原结合结构域融合在第一多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1D所示;第二抗原结合结构域融合在第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1E所示;第二抗原结合结构域分别融合在第一多肽链和第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1F所示。图1G-图1J为第一抗原结合结构域为Fab,第二抗原结合结构域为Fv的异源二聚体融合蛋白结构示意图。其中,第二抗原结合结构域Fv的VH和VL分别融合至第一多肽链和第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1G所示;第二抗原结合结构域Fv的VL和VH分别融合至第一多肽链和第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1H所示;第二抗原结合结构域Fv的VH和VL分别融合至第一多肽链和第二多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1I所示;第二抗原结合结构域Fv的VL和VH分别融合至第一多肽链和第二多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1J所示。
[0109]
图1K-图1N为第一抗原结合结构域为Fab,第二抗原结合结构域为Fab2的异源二聚体融合蛋白结构示意图。其中,第二抗原结合结构域Fab2的Fab2H和Fab2L分别融合至第一多肽链和第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1K所示;第二抗原结合结构域Fab2的Fab2L和Fab2H分别融合至第一多肽链和第二多肽链C端的异源二聚体融合蛋白如图1L所示;第二抗原结合结构域Fab2的Fab2H和Fab2L分别融合至第一多肽链和第二多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1M所示;第二抗原结合结构域Fab2的Fab2L和Fab2H分别融合至第一多肽链和第二多肽链N端的异源二聚体融合蛋白如图1N所示。图1O为第一抗 原结合结构域和第二抗原结合结构域中Fab的VH和VL在两条多肽链上互相交换位置的示意图。图1P-图1X为第一抗原结合结构域为Fv,第二抗原结合结构域为scfv或活性肽的异源二聚体融合蛋白结构示意图。其中,第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽与第一多肽的N端融合的异源二聚体融合蛋白如图1P和图1Q所示;第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽与第二多肽的N端融合的异源二聚体融合蛋白如图1R和图1S所示;第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽与第一多肽的C端融合的异源二聚体融合蛋白如图1T和图1U所示;第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽与第二多肽的C端融合的异源二聚体融合蛋白如图1V和图1W所示;图1X为生理活性肽分别与第一多肽和第二多肽链的N端融合的异源二聚体融合蛋白。
[0110]
图2展示了示例性异源二聚体融合蛋白用ProteinA或CH1 resin纯化后的SDS-PAGE凝胶图像。其中,“M”表示蛋白marker;“-”表示不加beta-巯基乙醇上样;“+”表示加beta-巯基乙醇后上样;1:IgFD-24;2:IgFD-11;3:IgFD-25;4:IgFD-26;5:IgFD-31;6:IgFD-27;7:IgFD-30;7(CH1):IgFD-30(CH1 resin纯化);8:IgFD-29;8(CH1):IgFD-29(CH1 resin纯化);9:IgFD-28;9(CH1):IgFD-28(CH1 resin纯化)。
[0111]
图3-1展示了示例性异源二聚体融合蛋白凝胶排阻层析色谱图。图3-2为示例性异源二聚体抗体离子交换层析色谱图。
[0112]
图4显示了使用流式细胞术检测不同浓度anti-CD3/CD19异源二聚体融合蛋白IgFD-6、IgFD-7与NALM-6细胞表面的结合。
[0113]
图5显示了使用流式细胞术检测anti-CD3/anti-CD19异源二聚体融合蛋白IgFD-6、IgFD-7促进PMBC对Nalm-6细胞的杀伤作用。
[0114]
图6显示了ELISA检测不同anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体融合蛋白与人EGFR抗原的结合强度。
[0115]
图7显示了使用流式细胞术检测不同anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体融合蛋白与F98-EGFR细胞表面的结合。ProA表示通过proteinA Resin纯化的融合蛋白;CH1表示通过CH1 resin纯化的融合蛋白。
[0116]
图8显示了使用流式细胞术检测anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体融合蛋白IgFD-8、IgFD-18和IgFD-19与PBMC-T细胞的结合。
[0117]
图9显示了使用流式细胞术检测不同anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体融合蛋白与Jurkat T细胞表面的结合,其中ProA表示通过proteinA Resin纯化的融合蛋白;CH1表示通过CH1 resin纯化的融合蛋白。
[0118]
图10显示了使用LDH方法检测不同anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体融合蛋白促进PBMC对F98-EGFR细胞的杀伤作用。Size表示凝胶层析后的蛋白;Monos表示离子交换层析后的蛋白。
[0119]
图11显示了使用LDH assay(a)和流式细胞术(b)检测anti-CD3/anti-BCMA异源二聚体融合蛋白IgFD-22促进PBMC对MM1.R细胞的杀伤作用。
[0120]
图12显示了用ELISA检测靶向CD3和MICA的异源二聚体融合蛋白IgFD-37与人MICA抗原的结合强度,其中IgFD-36为对照。
[0121]
图13显示了使用流式细胞数检测不同浓度的靶向CD3和MICA的异源二聚体融合蛋白IgFD37与细胞表面MICA的结合强度;(A)PANC-1细胞,(B)为BXPC-3细胞,(C)为K562细胞。
[0122]
图14显示了使用LDH assay检测靶向CD3和MICA的异源二聚体融合蛋白IgFD-37促进PBMC对K562细胞(A)和对PANC-1细胞(B)的杀伤作用。
[0123]
图15显示了使用流式细胞术检测anti-CD3/anti-CLL-1异源二聚体融合蛋白IgFD-23促进PBMC对HL-60细胞的杀伤作用。
[0124]
图16为IgFD-25和IgFD-33在大鼠中腹腔给药后的药代动力学曲线。
[0125]
图17为IgFD-33在A431肺癌小鼠模型中的肿瘤生长抑制曲线。
[0126]
本发明详述
[0127]
为了能更全面地了解本申请,下文阐述若干定义。此类定义旨在涵盖语法等效物。所有在本文中提及的专利和公开文献的内容,包括在这些专利和公开中披露的所有序列,明确地通过提述并入本文。
[0128]
如本文所用,“异源二聚体融合蛋白”意指由两条各自包含Fc的不同多肽链组成的抗体或基于抗体的融合蛋白,其中一条多肽链的Fc与另一条多肽链的Fc形成Fc二聚体,两条多肽链形成至少一个抗原结合结构域。
[0129]
如本文所用,“抗原结合结构域”意指抗原结合分子中特异性结合抗原决定簇的部分。更具体地,术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分,所述部分包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下,抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分,该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。抗原结合结构域可源自任何动物物种,如啮齿类(例如兔、大鼠或 仓鼠)和人。抗原结合结构域的非限制性实例包括:单链抗体、Fab、F(ab’)2、Fd片段、Fv、单链Fv(scFv)分子、dAb片段和由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。在本发明的一些具体实施例中,抗原结合结构域为Fab。在一些具体的实施例中,抗原结合结构域为Fv。在一些具体的实施例中,抗原结合结构域为scfv。在一些具体的实施例中,抗原结合结构域为生理活性肽。
[0130]
如本文所用,术语“抗原”与“抗原决定簇”和“表位”同义,意指多肽大分子上与抗原结合结构域结合,从而形成抗原结合结构域—抗原复合物的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)。“抗原”可以在例如肿瘤细胞表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明,否则本文中称为抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)等步入动物。当提及本文中的特定蛋白质时,该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质,以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体,例如剪接变体或等位基因变体。在一些实施例中,抗原是人蛋白。可用作抗原的示例性人蛋白包括但不限于:BCMA、CLL-1、EpCAM、CD19、CCR5、EGFR、HER2、HER3、HER4、EGF4、PSMA、CEA、MUC-1(Mucin)、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5 AC、MUC-5 B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、CD16A、B7-H3、CD123、gpA33、P-Cadherin、GPC3、CLEC12A、CD32B、TROP-2、ganglioside GD3、9-O-Acetyl-GD3,GM2,Globo H、fucosyl GM1、Poly SA、GD2、Carboanhydrase IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、Plasma Cell Antigen、(membrane-bound)IgE、Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan(MCSP)、CCR8、TNF-alpha precursor、STEAP、mesothelin、A33、Prostate Stem Cell Antigen(PSCA)、Ly-6、desmoglein 4、E-cadherin neoepitope、Fetal Acetylcholine Receptor、CD25、CA19-9marker、CA-125marker and Muellerian Inhibitory Substance(MIS)Receptor type II、sTn(sialylated Tn antigen;TAG-72)、FAP(fibroblast activation antigen)、endosialin、EGFRvIII、LG、SAS、CD63、2B4(CD244)、α4β1整联蛋白、β2整联蛋白(例如CD11a-CD18、CD11b-CD18、CD11c-CD18)、CD2(LFA2、OX34)、CD16、CD27(TNFRSF7)、CD38、CD96、CD100、CD160、CD137、CEACAM1(CD66)、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、KIR的活化形式(例如KIR2DS1、KIR2DS4、KIR-S)、NKG2C、NKG2D、NKG2E、天然细胞毒性受体(例如NKp30、NKp44、NKp46、NKp80)、NTB-A和PEN-5、CD2(LFA2、OX34)、CD3、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、 CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ和TIM1(HAVCR、KIM1)等。美国专利号7235641提供的肿瘤细胞表面抗原实例、在Miller,Hematology,2013,2013(1):247-253;Mentlik等人,Frontiers in Immunology,2013,4:481(1-12);Stein等人,Antibodies,2012,1:88-123;Pegram等人,Immunology and Cell Biology,2011,89:216-224;和Vivier等人,Nature Immunology,2008,9:503-510中提供的NK细胞表面抗原更多信息、以及在Stein等人,Antibodies,2012,1:88-123;Chen和Flies,Nature Reviews Immunology,2013,13:227-242;和Pardoll,NatureReviews Cancer,2012,12:252-264中提供的T细胞表面抗原的更多信息,上述文献所述全部内容通过引用并入本文。
[0131]
如本文所用,“Fc”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端结构域。意指包含抗体的恒定区(不包含第一恒定区免疫球蛋白域)且在一些情况下包含铰链的多肽[Jones等.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等.,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.BIOL.2:529-596(1992)]。因此,Fc是指人IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域,以及这些域的柔性铰链N末端。对于IgA和IgM来说,Fc可以包括J链。对于IgG来说,Fc域包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及位于Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的较低铰链区。
[0132]
如本文所用,“Fc变体”意指由于至少一个氨基酸修饰,如取代、缺失或插入而不同于野生Fc序列,但仍保留与相应的Fc单链配对形成Fc二聚体的能力的Fc序列。在一些实施方案中,相对于亲本Fc区活性,“Fc变体”的氨基酸修饰改变了效应功能活性。举例来说,在一个实施方案中,变体Fc区可以具有改变的(即,增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在另外的实施方案中,相对于野生Fc,Fc氨基酸修饰可以改变(即,增加或降低)变体Fc区对FcγR的亲和力。举例来说,变体Fc可以改变对FcγRI、FcγRII、FcγRIII的亲和力。在一些实施方案中,变体Fc具有E233P、L234V、del235L、G236A、A327G、A330S、A331S、E356D、M358L氨基酸修饰。在一些实施方案中,“变体Fc”为去糖基化修饰的Fc,也即含有N297A氨基酸修饰的Fc。在另一些实施方案中,变体Fc进一步包含S354C,T366W氨基酸修饰,或者S354C、T366W、Y349C、T366S、L368A、Y407V氨基酸修饰。
[0133]
“野生型”或“WT”在本文中意指在自然界中见到的氨基酸序列或核苷酸序列,包括等位基因变异。WT蛋白具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0134]
本文中使用的“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。变体多肽可指多肽自身、包含该多肽的组合物或编码其的氨基序列。优选地,与亲本多肽相比该变体多肽具有至少一个氨基酸修饰,如与亲本多肽相比约1到约10个氨基酸修饰,以及优选约1到约5个氨基酸修饰。本文中该变体多肽序列与亲本多肽序列优选具有至少约80%的同源性,最优选至少约90%的同源性,更优选至少约95%的同源性。
[0135]
“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见,除非另外说明,否则氨基酸修饰通常是针对DNA编码的氨基酸,例如在DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。
[0136]
“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被不同氨基酸置换。确切地说,在一些实施例中,取代是针对特定位置处非天然存在的氨基酸,这些氨基酸不是生物体内天然存在的或是任何生物体中的。举例来说,取代E272Y是指272位的谷氨酸被酪氨酸置换的变异体多肽,在此情形中是Fc变体。为清楚起见,蛋白质被工程改造成改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如CGG(编码精氨酸)变为CGA(仍编码精氨酸),用以增加宿主生物体表达水平)不是“氨基酸取代”;也就是说,尽管产生了编码同一蛋白质的新基因,但如果该蛋白质在其起始的特定位置处具有相同氨基酸,就不是氨基酸取代。优选地,本发明的变体Fc相对于亲本或天然Fc具有保守取代,即以具有性质相同或相近的氨基酸侧链基团的氨基酸残基进行的取代。优选地,本发明的变体Fc相对于亲本或天然Fc具有不超过40,30,20,10,或5个保守取代,只要其仍保留与相应的Fc单链配对形成Fc二聚体的能力即可。
[0137]
“效应功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性,其随抗体同种型而不同。抗体效应功能的实例包括:C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC);Fc受体结合;依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC);细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调;及B细胞活化。
[0138]
“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”指细胞介导的反应,其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体,随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9(1991)457-492的464页上表3中。
[0139]
“依赖补体的细胞毒性(CDC)”指诱导细胞死亡的机制,其中结合靶标的抗体的Fc效应分子结构域(一个或多个)活化一系列酶促反应,造成孔洞在靶细胞膜中形成。典型地,抗原-抗体复合物,诸如抗体包被的靶细胞上的抗原-抗体复合物,结合并活化 补体成分C1q,其转而活化补体级联,从而导致靶细胞死亡。补体的活化还可以导致补体成分在靶细胞表面上的沉积,其通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)利于ADCC。
[0140]
如本文所用,“Fab重链”或“FabH”意指包含VH和CH1的免疫球蛋白域的多肽;“Fab轻链”或“FabL”意指包含VL和CL的免疫球蛋白域的多肽,也即免疫球蛋白轻链。在本发明的一些实施方案中,Fab中的CH1和CL可以交换位置,也即FabH包括VH和CL,FabL包括VL-CH1。
[0141]
如本文所用,“Fab”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指孤立的结构域,或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的情况下的此区。如本领域中的技术人员将了解,Fab通常由Fab重链和Fab轻链等两条链构成。在本发明的一些实施方案中,Fab中的CH1和CL可以互相交换位置,因此,CH1和CL互相交换位置的Fab也包括在本发明中。
[0142]
如本文所用,“Fv”意指包含一个VL和一个VH的非融合的二聚体。“单链Fv”或“scfv”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽,且VL和VH在同一多肽上。
[0143]
本文中使用的“连接子”包含了提供柔性/刚性的任何合理序列的一个或多个氨基酸。优选地,所述连接子选自但不限于由以下组成的组:GGGGSGGGGSGGGGS、SGGGGSGGGGSGGGGS、GGSGGSGGGGSGGGG、GGSGGSGGGGSGGGGS、GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS、GGGGSELAALEAELAALEAGGSG、APATSLQSGQLGFQCGELCSASA、ASTKGP、TVAAPSVFIFPP、PNLLGGP、GGGGS、GGGEAAAKEAAAKEAAAKAGG、G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTTP、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS及GHEAAAVMQVQYPAS。所述连接子也可以是在体内可裂解的肽连接子、蛋白酶(如MMP)敏感性连接子、如先前所描述的可以通过还原进行裂解的基于二硫键的连接子等(FusionProtein Technologies for Biopharmaceuticals:Applications and Challenges,由Stefan R.Schmidt编辑)或本领域中已知的任何可裂解的连接子。
[0144]
本发明的术语“生理活性肽”不仅包括与抗原结合结构域结合后呈现出体内生理学功能的蛋白,而且还包括仅仅参与抗原结合,但没有生理功能的多肽。可应用于本发明 的生理活性肽举例来说有受体、配体蛋白质、激素、细胞因子、白介素、白介素结合蛋白、酶、生长因子、转录调控因子、凝血因子、疫苗、结构蛋白质、细胞表面抗原、受体拮抗剂及它们的衍生物等。

实施例

[0145]
尽管处于清楚理解的目的,下面通过举例说明和实施例相当详细地描述了前述发明,但是根据本发明的教义,本领域的普通技术人员将显而易见的是,在不背离所附权利要求的精神和范围情况下,可以对本发明进行某些改变和修改。以下实施例仅以说明方式提供,而并不起限制作用。本领域的技术人员将易于认识到多种非关键性参数,这些参数可以改变或修改得到基本上类似的结果。
[0146]
对于在本发明中讨论的所有恒定区位置,编号规则依照如Kabat中的EU索引(Kabat等人,1991,Sequences of proteins of Immunological Interest,5 th Ed.,United Stetes Public Health Servic,National Institutes of Health,Bethesda,通过引用整体地并入)。抗体领域中的技术人员会理解由在免疫球蛋白序列的特定区域中的非顺序性编号构成的这种惯例能够标准化地参照免疫球蛋白家族中的保守位置。因此,如有EU索引定义的任何给定的免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序性序列。
[0147]
实施例1异源二聚体融合蛋白真核表达载体的构建
[0148]
1.1基因合成
[0149]
合成anti-CD19 VH、anti-CD19 VL、anti-CD3 VH-1、anti-CD3 VL-1、anti-CD3 VH-3、anti-CD3 VL-3、anti-EGFR VH、anti-EGFR VL、活性肽EGF4、活性肽NKG2D、anti-CD3 VH-4、anti-CD3 VL-4、anti-BCMA VH、anti-BCMA VL、anti-CLL-1 VH、anti-CLL-1 VL、抗体轻链CL及抗体重链CH1基因(IDT公司合成)。
[0150]
1.2 scfv的构建
[0151]
PCR分别扩增上述基因片段,overlap PCR将扩增获得的anti-CD3 VH-1与anti-CD3 VL-1、anti-EGFR VH与anti-EGFR VL、anti-CD3 VL-3与anti-CD3 VH-3、anti-CD19 VH与anti-CD19 VL、anti-BCMA VH与anti-BCMA VL、anti-CLL-1 VH与anti-CLL-1 VL分别通过linker连接获得scfv1(anti-CD3 scfv-1)、scfv2(anti-EGFR scfv)、scfv3(anti-CD3 scfv-3)、scfv5(anti-CD19 scfv)、scfv6(anti-BCMA scfv)、scfv7(anti-CLL-1 scfv)片段,测序验证。
[0152]
1.3 Fab片段的构建
[0153]
PCR分别扩增1.1合成的基因片段,将扩增获得的PCR产物anti-CD3 VL-1、anti-EGFR VL、anti-CD3 VL-3和anti-CD3 VL-4分别与CL`连接获得anti-CD3 VL-1-CL(Fab1L)、anti-EGFR VL-CL(Fab2L)、anti-CD3 VL-3-CL(Fab3L)、anti-CD3 VL-4-CL(Fab4L),测序验证。
[0154]
PCR分别扩增1.1合成的基因片段,通过overlap PCR将扩增获得的anti-CD3 VH-1、anti-EGFR VH、anti-CD3 VH-3、anti-CD3 VH-4分别与CH1连接获得anti-CD3 VH-1-CH1(Fab1H)、anti-EGFR VH-CH1(Fab2H)、anti-CD3 VH-3-CH1(Fab3H)、anti-CD3 VH-4-CH1(Fab4H),测序验证。
[0155]
将上述测序验证的FabH和FabL,进一步通过in-frame连接分别克隆至pFuse-hIgG1-Fc2载体上(InvivoGen,CA),载体上的Fc片段具有如下突变:N297A或E233P,L234V,L235A,delG236,A327G,A330S,A331S。在某些实施例中,Fc进一步包含S354C,T366W突变或Y349C,T366S,L368A,Y407V突变。根据需要,将或scfv或活性肽或VH或VL或Fab通过连接子与上述载体连接,所有构建的序列均测序验证。每个构建体的核苷酸及氨基酸序列见序列表:Seq No.1-Seq.No.142。
[0156]
表1构建体及序列编号
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
实施例2示例性异源二聚体融合蛋白的表达、纯化和凝胶排阻层析
[0162]
将实施例1构建好的异源二聚体融合蛋白真核表达载体的两条链瞬时共转染FreeStyle HEK293细胞(ThermoFisher):将28ml FreeStyle HEK 293(3×10 7细胞/ml)接 种至125ml细胞培养瓶,质粒用1ml Opti-MEM(Invitrogen)稀释后加至1ml含60μl 293 Fectin(Invitrogen,Inc)的Opti-MEM中,室温静置30min,将质粒-293fectin mixture加至细胞培养液中125rpm,37℃,5%CO2培养。分别于转染后48h和96h收集细胞培养上清,并根据制造商的说明书,使用CH1 Select resin(Thermo Fisher Scientific,IL)、ProteinG和/或Protein A Resin(Genscript)纯化异源二聚体融合蛋白。通过SDS-PAGE,在还原条件和非还原条件下分析纯化的异源二聚体融合蛋白的组成和纯度。并通过A280和BCA(Pierce,Rockford,IL)测定其浓度。
[0163]
将获得的CH1 resin、ProteinG和/或Protein A resin纯化后的异源二聚体融合蛋白用GE的AKTA chromatography过柱分析,所用的层析柱为:Superdex 200 Increase 10/300GL凝胶排阻层析柱和/或Mono S 5/50GL离子交换层析柱。凝胶排阻层析所用的溶液为PBS缓冲液(0.010M phosphate buffer,0.0027M KCl,0.14M NaCl,pH7.4),离子交换层析所用的溶液为Buffer A:20mM NaOAc,pH=5和Buffer B:20mM NaOAc,1M NaCl,pH=5。从图2的SDS胶图、图3的色谱图及表2的蛋白表达结果看,不同的异源二聚体融合蛋白表达具有相当的纯度,而且其表达水平与常规mAb的表达水平相当,表明这些异源二聚体抗体可以在哺乳动物细胞中高效地表达。
[0164]
表2蛋白表达分析
[0165]
[表0001]
蛋白 表达水平(mg/L)
IgFD-6 10.7
IgFD-21 3.75
IgFD-22 4.58
IgFD-23 8.3
IgFD-9 30
IgFD-10 25.3
IgFD-33 18

[0166]
实施例3异源二聚体抗体质谱分析
[0167]
将凝胶排阻层析纯化的样品与PNGase F(NEB)37℃孵育8h后,加10mM DTT处理后,将样品注射进HPLC-Q-TOF-MS(Agilent,USA)的300SB-C8,2.1x 50mm柱,进行MS分析。结果见表3,不同异源二聚体融合蛋白的两条链的分子量理论预测值与利用质谱检测得到的分子量基本一致。
[0168]
表3蛋白质谱分析
[0169]
[0170]
[0171]
实施例4体外活性研究
[0172]
4.1 anti-CD3/CD19异源二聚体融合蛋白体外活性检测
[0173]
(1)流式细胞术检测anti-CD3/CD19异源二聚体融合蛋白与NALM-6细胞的结合
[0174]
培养NALM6细胞(RPMI1640培养基含10%FBS)。取2x10 5细胞用预冷的PBS清洗3次,2%FBS(溶于PBS)封闭后分别与分子筛纯化的不同浓度(200nM,40nM,8nM,1.6nM)IgFD-6或IgFD-7 4℃孵育2h(孵育过程中轻轻混匀,2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体,用FITC anti-human IgG Fc(KPL,Inc.,MD)4℃染色1h,2%FBS(溶于PBS)洗脱后进行FACS分析.
[0175]
结果见图4。与对照FITC anti-human IgG Fc相比,不同浓度的IgFD-6和IgFD-7与CD19+NALM6细胞均具有较强的结合,浓度越高,结合强度越大。
[0176]
(2)anti-CD3/anti-CD19异源二聚体抗体促进PBMC对NALM-6的细胞特异性杀伤
[0177]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3(Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增10天。
[0178]
培养NALM6细胞(RPMI1640培养基含10%FBS),Green fluorescent cell linker mini kit(Sigma)标记后,取10 4绿色荧光标记的NALM6细胞,与上述刺激活化的T细胞以1:5(NALM6细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例孵育,加入凝胶排阻层析纯化的梯度稀释的IgFD-6或IgFD-7,37℃孵育24h后,加入1%7-AAD,上流式细胞仪进行分析。绿色荧光阳性/7-AAD阴性的细胞即为活的NALM6细胞。
[0179]
结果如图5所示。IgFD-6和IgFD-7都能够有效促进PBMC中的T细胞对Nalm6细胞的杀伤作用。
[0180]
4.2 anti-CD3/EGFR异源二聚体体外活性检测
[0181]
(1)anti-CD3/EGFR异源二聚体结合人EGFR ELISA检测
[0182]
包被hEGFR-6-his(SinoBiological)(100ng/孔)于96孔板,4℃孵育过夜;含2%脱脂奶粉的PBST(0.5%Tween-20in PBS)室温封闭1小时,分别加入梯度稀释的异源二聚体抗体IgFD-11、IgFD-24、IgFD-25、IgFD-26、IgFD-31、anti-EGFR室温孵育2h,含2%脱脂奶粉的PBST洗4-5次后,加入Anti-Human IgG(FC)Antibody-HRP(KPL)二抗室温孵育1h,含2%脱脂奶粉的PBST洗4-5次后,TMB显色试剂(BioLegend,Cat.421101)显色后于650nm处读数。如图6显示,不同融合形式的anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体与人EGFR抗原均有较强的结合能力。
[0183]
(2)流式细胞术检测anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体与F98-EGFR细胞结合
[0184]
培养F98-EGFR细胞(DMEM培养基含10%FBS,200μg/ml G418)。取2x10 5细胞用预冷的PBS清洗3次,2%FBS(溶于PBS)封闭后分别与凝胶排阻层析纯化的IgFD-8、IgFD-9、IgFD-10、IgFD-11、IgFD-18、IgFD-19、IgFD-25、IgFD-26或IgFD-31(实验室表达的aEGFR为对照)4℃孵育2h(孵育过程中轻轻混匀),2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体,用FITC anti-human IgG Fc(KPL,Inc.,MD)4℃染色1h,2%FBS(溶于PBS)洗脱后进行FACS分析。如图7和表4所示,不同融合形式的anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体可与F98-EGFR细胞表面的EGFR结合,不同异源二聚体与F98-EGFR的结合力无显著差异。
[0185]
(3)流式细胞术检测anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体与PBMC-T细胞结合
[0186]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3 (Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增。
[0187]
取2x10 5细胞,用预冷的PBS洗3次,2%FBS(溶于PBS)封闭后,与凝胶排阻层析纯化的不同浓度(25nM,7.5nM,2.5nM,0.75nM or 0.25nM)IgFD-8、IgFD-18或IgFD-19 4℃孵育1h(孵育过程中轻轻混匀),2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体。细胞与FITC anti-human IgG Fc(KPL,Inc.,MD)4℃孵育1h(孵育过程中轻轻混匀),2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体后进行FACS分析。
[0188]
结果见图8。不同融合形式的异源二聚体与PBMC-T细胞结合的强弱依次是IgFD-8>IgFD-19>IgFD-18,与F98-EGFR细胞结合的强弱为IgFD-18>IgFD-19>IgFD-8(图6),提示scfv(anti-EGFR scfv和anti-CD3 scfv)与抗原的亲和力比Fab(anti-EGFR Fab和anti-CD3Fab)与抗原的结合力强。
[0189]
(4)流式细胞术检测anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体与Jurkat细胞结合
[0190]
培养Jurkat细胞(DMEM培养基含10%FBS)。取2x10 5细胞用预冷的PBS清洗3次,2%FBS(溶于PBS)封闭后分别与凝胶排阻层析纯化的IgFD-11、IgFD-8、IgFD-25、IgFD-26、IgFD-31或IgFD-36(实验室表达的aEGFR为对照)4℃孵育2h(孵育过程中轻轻混匀),2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体,用FITC anti-human IgG Fc(KPL,Inc.,MD)4℃染色1h,2%FBS(溶于PBS)洗脱后进行FACS分析。
[0191]
结果见图9。不同融合形式的anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体均能与Jurkat T细胞很好第结合
[0192]
(5)anti-CD3/anti-EGFR异源二聚体促进PBMC对F98-EGFR的细胞特异性杀伤LDH检测
[0193]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3(Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增10天。
[0194]
培养F98-EGFR细胞(DMEM培养基含10%FBS,200μg/ml G418),取10 4与上述刺激活化的T细胞以1:5(F98-EGFR细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例孵育,加入梯度稀释的IgFD-8、IgFD-18、IgFD-19、IgFD-21、IgFD-20、IgFD-25、IgFD-26、IgFD-28、IgFD-29或IgFD-30 37℃孵育24h。Cytotox-96nonradioactive cytotoxicity assay kit(Promega)检测培养上清中LDH含量。SpectraMax 250读取490nm处OD值。细胞毒性(%表示)计算如下:
[0195]
%Cytotoxicity=(Experimental–Effector Spontaneous–Target Spontaneous)/(Target Maximum–Target Spontaneous)x100
[0196]
其中,Target Maximum为仅有F98-EGFR细胞裂解后的上清中LDH含量
[0197]
Target Spontaneous为仅有F98-EGFR细胞的上清中LDH含量
[0198]
Effector Spontaneous为仅有效应细胞(T细胞)的上清中LDH含量。
[0199]
结果见图10。不同融合形式的anti-EGFR&anti-CD3均能有效召集PBMC中的T细胞对F98-EGFR细胞产生相应的杀伤作用。
[0200]
4.3 anti-CD3/BCMA异源二聚体促进PBMC对MM1.R细胞的杀伤作用
[0201]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3(Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增10天。
[0202]
(1)LDH释放实验检测:
[0203]
培养MM1.R细胞(RPMI1640培养基含10%FBS),取10 4与上述刺激活化的T细胞以1:5(MM1.R细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例孵育,加入梯度稀释的凝胶排阻层析纯化的IgFD-22 37℃孵育24h。
[0204]
用Cytotox-96 nonradioactive cytotoxicity assay kit(Promega)检测上述培养上清中LDH含量。SpectraMax 250读取490nm处OD值。细胞毒性(%表示)计算如下:
[0205]
%Cytotoxicity=(experimental–Effector Spontaneous–Target Spontaneous)/(Target Maximum–Target Spontaneous)x100
[0206]
其中,Target Maximum为仅有MM1.R细胞裂解后的上清中LDH含量
[0207]
Target Spontaneous为仅有MM1.R细胞的上清中LDH含量。
[0208]
Effector Spontaneous为仅有效应细胞(T细胞)的上清中LDH含量。
[0209]
(2)FACS检测
[0210]
培养MM1.R细胞(RPMI1640培养基含10%FBS),用Green fluorescent cell linker mini kit(Sigma)标记后,取10 4绿色荧光标记的MM1.R细胞,与上述刺激活化的T细胞以1:5(MM1.R细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例孵育,加入凝胶排阻层析纯化的梯度稀释的IgFD-22 37℃孵育24h,加入1%7-AAD后,上流式细胞仪进行分析。绿色荧光阳性/7-AAD阴性的细胞即为活的MM1.R细胞。
[0211]
LDH释放和FACS检测结果见图11(A)和图10(B)。IgFD-22能有效促进PMBC对MM1.R细胞的杀伤作用。
[0212]
4.4靶向CD3和MICA异源二聚体体外活性检测
[0213]
(1)靶向CD3和MICA的异源二聚体结合人MICA ELISA检测
[0214]
包被MICA(北京义翘神州)(100ng/孔)于96孔板,4℃孵育过夜;含2%脱脂奶粉的PBST(0.5%Tween-20in PBS)室温封闭1小时,分别加入梯度稀释的异源二聚体抗体IgFD-36、IgFD-37于37℃孵育1h,含2%脱脂奶粉的PBST洗3次后,加入anti-human Fc-HRP二抗(KPL 5200-0279,1:1000)室温孵育1h,含2%脱脂奶粉的PBST洗5次后,TMB显色试剂(BioLegend,Cat.421101)显色后于652nm处读数。如图12显示,IgFD-37异源二聚体与人MICA抗原有较强的结合能力。
[0215]
(2)流式细胞术检测靶向CD3和MICA异源多聚体抗体与PANC-1、BXPC-3、K562细胞结合
[0216]
分别培养PANC-1(DMEM培养基含10%FBS)、BXPC-3(RPMI1640培养基含10%FBS)、K562细胞(RPMI1640培养基含10%FBS)。取2x10 5细胞用预冷的PBS清洗3次,2%FBS(溶于PBS)封闭后分别与凝胶排阻层析纯化的IgFD-36、IgFD-37 4℃孵育2h(孵育过程中轻轻混匀),2%FBS(溶于PBS)洗去未结合的抗体,用anti-human kappa light chain-FITC(Biolegend,316506)4℃染色1h,2%FBS(溶于PBS)洗脱后进行FACS分析。如图13和表4所示,靶向CD3和MICA的异源二聚体可与PANC-1、BXPC-3或K562细胞表面的NKG2DL亚基MICA结合。
[0217]
(3)靶向CD3和MICA的异源二聚体促进PBMC对表达MICA的细胞特异性杀伤
[0218]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3(Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增10天。
[0219]
培养K562、PANC-1细胞,取10 4与上述刺激活化的T细胞以1:5(K562或PANC-1细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例,加入梯度稀释的IgFD-36和IgFD-37于37℃孵育24h。Cytotox-96 nonradioactive cytotoxicity assay kit(Promega)检测培养上清中LDH含量。SpectraMax 250读取490nm处OD值。细胞毒性(%表示)计算如下:
[0220]
%Cytotoxicity=(Experimental–Effector Spontaneous–Target Spontaneous)/(Target Maximum–Target Spontaneous)x100
[0221]
其中,Target Maximum为仅有K562或PANC-1细胞裂解后的上清中LDH含量
[0222]
Target Spontaneous为仅有K562或PANC-1细胞的上清中LDH含量。
[0223]
Effector Spontaneous为仅有效应细胞(T细胞)的上清中LDH含量。
[0224]
结果见图14。靶向CD3和MICA的异源二聚体能有效召集PBMC中的T细胞对MICA阳性的细胞产生相应的杀伤作用。
[0225]
4.5 anti-CD3/anti-CLL-1异源二聚体促进PBMC对HL-60细胞的杀伤作用
[0226]
收集健康志愿者外周血,Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞(PBMCs),RPMI 1640/10%FBS完全培养基重悬。将PBMCs与固相结合的anti-CD3(Clone OKT3,eBiosciences)、2μg/mL anti-CD28(Clone CD28.2,eBiosciences)37℃孵育,48h后加入20U/ml IL2(R&D Systems)刺激活化的T细胞扩增10天。
[0227]
培养HL-60细胞(RPMI1640培养基含10%FBS),用Green fluorescent cell linker mini kit(Sigma)标记后,取10 4绿色荧光标记的HL-60细胞,与上述刺激活化的T细胞以1:5(HL-60细胞为10 4,T细胞为5*10 4)的比例孵育,加入凝胶排阻层析纯化的梯度稀释的IgFD-23 37℃孵育24h,加入1%7-AAD后,上流式细胞仪进行分析。绿色荧光阳性/7-AAD阴性的细胞即为活的NALM6细胞。
[0228]
结果见图15。IgFD-23能够有效召集PBMC中的T细胞,进而对HL-60产生特异性杀伤作用。
[0229]
表4不同异源二聚体与细胞的结合及促进PBMC对靶细胞的特异杀伤
[0230]
[0231]
[0232]
实施例5,热力学稳定性测试
[0233]
将样品IgFD-6、IgFD-7与新鲜配制的thermal shift dye、shift buffer(Protein Thermal Shift TM Dye Kit,ThermoFisher Scientific,Cat.4461146)按厂家推荐的比例混合,利用ViiA TM 7 Real-Time PCR System以0.05℃/s的加热速率在25-99℃进行热扫描。用GraphPad Prism7软件的“Area under curve(AUC)”分析模型计算Tm值。每组数据均重复2次试验以保证结果的重复性。
[0234]
结果如表5所示,IgFD-6和IgFD-7具有类似的Tm值。
[0235]
表5蛋白Tm值
[0236]
[0237]
实施例6异源二聚体大鼠体内PK研究
[0238]
将IgFD-33腹腔注射(I.P.)SD雄性大鼠(3只)。尾静脉采集肝素抗凝血,采血时间如下:2h、4h、8h、24h、36h、4d、7d、11d和14d。离心后取血浆,-80℃保存备用。血浆中IgFD-33的含量检测参照实施例4.2(1)进行。结果如图16所示,IgFD-33在大鼠体内半衰期可达2.5天。
[0239]
实施例7异源二聚体小鼠体内活性研究
[0240]
IgFD-33抑制荷瘤小鼠肿瘤块能力的检测在6-8周雌性NCG小鼠上进行。将5×10 6A431细胞和2.5×10 6新鲜的PBMC重悬于200ul无血清培养基后皮下注射小鼠右胁腹(Day0),用卡钳测量实验小鼠肿瘤块大小。按下式计算肿瘤体积:肿瘤体积=宽度*宽度*长度/2。待肿瘤大小为50-100mm3时(Day7),分别于Day8和Day11注射1.0×10 7体外活化的T细胞(用固相结合的anti-CD3 antibody(clone OKT3,eBioscience)、2μg/mL anti-CD28抗体(clone CD28.2,eBioscience)、50IU/mL重组人IL-2(R&D Systems)体外刺激PBMCs),同时于Day7-Day13每天注射异源二聚体抗体IgFD-33(其中空白组:A431 without PBMC without activate T cells+生理盐水;对照组:A431&新鲜的PBMC+活化的T细胞+生理盐水),每隔一天称量小鼠体重并用卡钳测量肿瘤块大小。
[0241]
结果如图17所示,与空白组或对照组相比,A431接种的大鼠其肿瘤块在IgFD-33给药后持续消退,在A431接种后的35天未见肿瘤复发,提示IgFD-33具有较高的体内活性。

权利要求书

[权利要求 1]
异源二聚体融合蛋白,其包括: a)第一多肽链,其包含Fab重链和第一单链Fc,所述Fab重链直接或通过连接子与所述第一Fc单链的N端融合; b)第二多肽链,其包含Fab轻链和第二单链Fc,所述Fab轻链直接或通过连接子与所述第二Fc单链的N端融合; 其中,所述第一多肽链的Fab重链和所述第二多肽链的Fab轻链形成第一抗原结合结构域Fab,所述第一Fc单链和所述第二Fc单链形成Fc二聚结构域。
[权利要求 2]
权利要求1的异源二聚体融合蛋白,其进一步包含第二抗原结合结构域。
[权利要求 3]
权利要求2的异源二聚体融合蛋白,其中,所述第二抗原结合结构域由scfv或生理活性肽构成。
[权利要求 4]
权利要求3的异源二聚体融合蛋白,其中,所述构成第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽直接或通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的N端融合。
[权利要求 5]
权利要求3的异源二聚体融合蛋白,其中,所述构成第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽直接或通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的C端融合。
[权利要求 6]
权利要求3的异源二聚体融合蛋白,其中,所述第二抗原结合结构域由第一和第二生理活性肽构成,所述第一和第二生理活性肽分别与所述第一多肽链和第二多肽链的N端直接或通过连接子融合。
[权利要求 7]
权利要求3的异源二聚体融合蛋白,其中所述第二抗原结合结构域由第一和第二生理活性肽构成,所述第一和第二生理活性肽分别与所述第一多肽链和第二多肽链的C端直接或通过连接子融合。
[权利要求 8]
权利要求2的异源二聚体融合蛋白,其中所述第二抗原结合结构域由Fv构成。
[权利要求 9]
权利要求8的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的C端融合,相应地,所述Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链或第一多肽链的C端融合。
[权利要求 10]
权利要求9的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fv的重链可变区直接或通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的N端融合,相应地,所述Fv的轻链可变区直接或通过连接子与所述第二多肽链或第一多肽链的N端融合。
[权利要求 11]
权利要求2的异源二聚体融合蛋白,其中所述第二抗原结合结构域由Fab2构成。
[权利要求 12]
权利要求11的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fab2的重链直接或通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的C端融合,相应地,所述Fab2的轻链直接或通过连接子与所述第二多肽链或第一多肽链的C端融合。
[权利要求 13]
权利要求11的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fab2的重链直接或者通过连接子与所述第一多肽链或第二多肽链的N端融合,相应地,所述Fab2的轻链直接或者通过连接子与所述第二多肽链或第一多肽链的N端融合。
[权利要求 14]
权利要求1至13任一项的异源二聚体融合蛋白,其中进一步地,其分子内Fab的恒定结构域CH1和CL在两条链上互相交换位置。
[权利要求 15]
权利要求1至14任一项的异源二聚体融合蛋白,其中所述连接子独立地选自但不限于以下氨基酸序列组成的组:GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS、GGGGSELAALEAELAALEAGGSG、GGGGSGGGGSGGGGS、SGGGGSGGGGSGGGGS、GGSGGSGGGGSGGGG、GGSGGSGGGGSGGGGS、GGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS、GGGGSELAALEAELAALEAGGSG、APATSLQSGQLGFQCGELCSASA、ASTKGP、TVAAPSVFIFPP、PNLLGGP、GGGGS、GGGEAAAKEAAAKEAAAKAGG。
[权利要求 16]
异源二聚体融合蛋白,其包含: a)第一多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L1)n、CH1、L2、VH, b)第二多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L3)n、CL、L4、VL;或者 a)第一多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L1)n、CL、L2、VH, b)第二多肽链,其按从N端到C端的顺序依次包含:Fc、(L3)n、CH1、L4、VL,其中,n为0或1,L1、L2、L3和L4为连接子,VH和VL形成第一抗原结合结构域。
[权利要求 17]
权利要求16的异源二聚体融合蛋白,其进一步包括第二抗原结合结构域。
[权利要求 18]
权利要求17的异源二聚体融合蛋白,其中,所述第二抗原结合结构域由scfv或生理活性肽构成。
[权利要求 19]
权利要求18的异源二聚体融合蛋白,其中,所述构成第二抗原结合结构域的scfv或生理活性肽直接或通过连接子与第一多肽链或第二多肽链的N端融合。
[权利要求 20]
权利要求18的异源二聚体融合蛋白,其中,所述第二抗原结合结构域由第一和第二生理活性肽构成,所述第一和第二生理活性肽分别与所述第一多肽链和第二多肽链的N端直接或通过连接子融合。
[权利要求 21]
权利要求16-20中任一项的异源二聚体融合蛋白,其中,L1、L2、L3和L4连接子独立地选自:G、GS、SG、SS、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTTP、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS及GHEAAAVMQVQYPAS;其中L1、L2、L3和L4可以相同,也可以不同。
[权利要求 22]
权利要求1至21任一项的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc为人IgG1的Fc。
[权利要求 23]
权利要求22的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc为Fc变体。
[权利要求 24]
权利要求23的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc变体不含糖基化修饰。
[权利要求 25]
权利要求24的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc变体包含N297去糖基化修饰的氨基酸置换。
[权利要求 26]
权利要求22的异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc变体包含一处或多处降低Fc对Fc受体的结合和/或效应功能的氨基酸置换。
[权利要求 27]
权利要求26异源二聚体融合蛋白,其中所述Fc变体中的氨基酸置换包含E233P、L234V、L235A、delG236、A327G、A330S及A331S中的一种或多种。
[权利要求 28]
权利要求22-27的异源二聚体融合蛋白,其中所述第一Fc和所述第二Fc之一进一步包含氨基酸置换S354C、T366W,且所述第一Fc和所述第二Fc中的另一个进一步包含氨基酸置换Y349C、T366S、L368A和Y407V。
[权利要求 29]
前述权利要求中任一项的异源二聚体融合蛋白,其可结合抗原CD3、CD16、CD2、CD28、CD25、NKG2D、NKp46、BCMA、CLL-1、EpCAM、CD19、CCR5、EGFR、HER2、HER3、HER4、EGF4、PSMA、CEA、MUC-1(Mucin)、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5 AC、MUC-5 B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、CD16A、 B7-H3、CD123、gpA33、P-Cadherin、GPC3、CLEC12A、CD32B、TROP-2、ganglioside GD3、9-O-Acetyl-GD3,GM2,Globo H、fucosyl GM1、Poly SA、GD2、Carboanhydrase IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、Plasma Cell Antigen、(membrane-bound)IgE、Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan(MCSP)、CCR8、TNF-alpha precursor、STEAP、mesothelin、A33Antigen、Prostate Stem Cell Antigen(PSCA)、Ly-6、desmoglein 4、E-cadherin neoepitope、Fetal Acetylcholine Receptor、CD25、CA19-9marker、CA-125marker and Muellerian Inhibitory Substance(MIS)Receptor type II、sTn(sialylated Tn antigen;TAG-72)、FAP(fibroblast activation antigen)、endosialin、EGFRvIII、LG、SAS、CD63中的一种或其组合。
[权利要求 30]
前述权利要求中任一项的异源二聚体融合蛋白,其可结合由下列抗原对组成的抗原:CD3和CD19;CD3和CD20;CD3和BCMA;CD3和CLL-1;CD3和EGFR;CD3和HER2;CD3和MIC-A;CD3和CEA;CD3和PSMA;CD3和EpCAM。
[权利要求 31]
权利要求30的异源二聚体融合蛋白,其可同时结合CD3和CD19。
[权利要求 32]
权利要求31的异源二聚体融合蛋白,其包括可结合CD3和CD19的两条多肽链组成的组:SEQ ID No:2和SEQ ID No:4;SEQ ID No:6和SEQ ID No:8;SEQ ID No:20和SEQ ID No:22;SEQ ID No:24和SEQ ID No:26;SEQ ID No:92和SEQ ID No:94;SEQ ID No:96和SEQ ID No:98;SEQ ID No:100和SEQ ID No:102。
[权利要求 33]
权利要求30的异源二聚体融合蛋白,其可同时结合CD3和EGFR。
[权利要求 34]
权利要求33的异源二聚体融合蛋白,其包括可结合CD3和EGFR的两条多肽链组成的组:SEQ ID No:10和SEQ ID No:12;SEQ ID No:14和SEQ ID No:16;SEQ ID No:18和SEQ ID No:12;SEQ ID No:24和SEQ ID No:28;SEQ ID No:30和SEQ ID No:32;SEQ ID No:30和SEQ ID No:34;SEQ ID No:36和SEQ ID No:38;SEQ ID No:44和SEQ ID No:46;SEQ ID No:48和SEQ ID No:50;SEQ ID No:44和SEQ ID No:52;SEQ ID No:54和SEQ ID No:56、SEQ ID No:30和SEQ ID No:58;SEQ ID No:60和SEQ ID No:62;SEQ ID No:64和SEQ ID No:66;SEQ ID No:68和SEQ ID No:70;SEQ ID No:72和SEQ ID No:74;SEQ ID No:76和SEQ ID No:78;SEQ ID No:80和SEQ ID No:82;SEQ ID No:84和SEQ ID No:86、SEQ ID No:88和SEQ ID No:90;SEQ ID No:104和SEQ ID No:106;SEQ ID No:108和SEQ ID No:110;SEQ ID No:112和SEQ ID No:114;SEQ ID No:116和SEQ ID No:118。
[权利要求 35]
权利要求30的异源二聚体融合蛋白,其可同时结合CD3和BCMA。
[权利要求 36]
权利要求35的异源二聚体融合蛋白,其包括可结合CD3和BCMA的两条多肽链组成的组:SEQ ID No:30和SEQ ID No:40。
[权利要求 37]
权利要求30的异源二聚体融合蛋白,其可同时结合CD3和CLL-1。
[权利要求 38]
权利要求37的异源二聚体融合蛋白,其包括可结合CD3和CLL-1的两条多肽链组成的组:SEQ ID No:30和SEQ ID No:42。
[权利要求 39]
权利要求30的异源二聚体融合蛋白,其可同时结合CD3和MIC-A。
[权利要求 40]
权利要求39的异源二聚体融合蛋白,其包括可结合CD3和MIC-A的两条多肽链组成的组:SEQ ID No:122和SEQ ID No:124。
[权利要求 41]
一种多核苷酸,其编码如权利要求1-40任一项所述的异源二聚体融合蛋白。
[权利要求 42]
一种载体,特别是表达载体,其包括权利要求41的多核苷酸。
[权利要求 43]
一种宿主细胞,其包括: ---表达载体,其包括编码所述第一多肽链的多核苷酸,和 ---表达载体,其包括编码所述第二多肽链的多核苷酸。
[权利要求 44]
制备权利要求1-40中任一项的异源二聚体融合蛋白,其包括下列步骤: 1)用以下各项瞬时转染哺乳动物宿主细胞: ---表达载体,其包括编码所述第一多肽链的多核苷酸,和 ---表达载体,其包括编码所述第二多肽链的多核苷酸; 在容许所述异源二聚体融合蛋白表达的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞;和 从培养上清中收集分泌的异源二聚体融合蛋白。
[权利要求 45]
一种药物组合物,其包含权利要求1-40的异源二聚体融合蛋白。
[权利要求 46]
一种治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫性疾病或病毒感染的方法,所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的组合物,所述组合物包含药学可接受形式的权利要求1-40任一项的异源二聚体融合蛋白。

附图

[ 图 1A]
[ 图 1B]
[ 图 1C]
[ 图 1D]
[ 图 1E]
[ 图 1F]
[ 图 1G]
[ 图 1H]
[ 图 1I]
[ 图 1J]
[ 图 1K]
[ 图 1L]
[ 图 1M]
[ 图 1N]
[ 图 1O]
[ 图 1P]
[ 图 1Q]
[ 图 1R]
[ 图 1S]
[ 图 1T]
[ 图 1U]
[ 图 1V]
[ 图 1W]
[ 图 1X]
[ 图 ]
[ 图 2]
[ 图 ]
[ 图 3-1]
[ 图 ]
[ 图 3]
[ 图 4]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 5]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 6]
[ 图 7]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 8]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 9]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 10]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 10(续)]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 11]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 12]
[ 图 13A]
[ 图 13B]
[ 图 13C]
[ 图 14]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 15]   [根据细则26改正 23.03.2020] 
[ 图 16]
[ 图 17]
[ 图 18]