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1. WO2020133126 - METHOD FOR PREPARING PHOSPHATIDYLSERINE BY ULTRASONIC ASSISTED ENZYMOLYSIS

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8  

附图

1   2   3  

说明书

发明名称 : 一种超声波辅助酶解制备磷脂酰丝氨酸的方法

技术领域

[0001]
本发明涉及一种制备磷脂酰丝氨酸的方法,尤其涉及一种超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术

[0002]
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS),又称复合神经酸,简称PS,1942年由Jordi Folch首次提取并定性。磷脂酰丝氨酸是一类普遍存在的磷脂,通常位于细胞膜的内层,尤其存在于人体的神经系统中,是大脑中细胞膜的重要组成之一,对大脑的各项生理功能起到重要的调节作用。
[0003]
磷脂酰丝氨酸被誉为继胆碱和DHA之后又一大新兴的“智能营养素”。并于2010年被中华人民共和国卫生部批准为新资源食品。磷脂酰丝氨酸能够调节神经脉冲传导,增强传送大脑信号的神经递质的效率,激发大脑的活化状态。具体来说,磷脂酰丝氨酸主要功效为提高脑活力,预防老年痴呆;提高大脑机能,集中注意力,提高学习成绩;减少压力激素的分泌,缓解压力;修复大脑损伤,促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪。
[0004]
目前磷脂酰丝氨酸的制备方法主要为生物酶转化法,底物磷脂酰胆碱与L-丝氨酸在磷脂酶D的作用下,发生转磷脂酰基反应生成磷脂酰丝氨酸。在反应过程中,磷脂酶D酶活的高低和反应基质的乳化混匀程度直接影响反应效果,如果乳化不充分转化率即会降低。
[0005]
超声波是一种纵波,具有波动与能量双重属性,作用于液体内部时会产生空化效应,产生强烈的冲击波和微射流,使液体微粒之间发生猛烈的撞击,微粒间这种剧烈的相互作用,可加速体系的传质、传热,起到了很好的搅拌作用,从而使两种不相溶的液体发生充分乳化,加速溶质的溶解。不同的酶分子有不同的立体构象,相同的酶分子在不同环境下也会有不同的构象。由于磷脂在低温溶液中难于乳化,不能与酶液充分接触,从而影响酶解转化率。但是当升高温度,酶活会大大降低,因此采用超声辅助技术促进酶解效率,同时常规实验条件下的超声辅助技术对于磷脂酶D并不具有提高酶解效率的效果。
[0006]
发明内容
[0007]
发明目的:本发明的目的是提供一种通过超声振动改变物质的结构,扩大底物与酶接触面积的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法。
[0008]
技术方案:本发明提供一种超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,包括以下步骤:在L-丝氨酸150-200份、无水氯化钙10-20份和纯水400-500份的混合物中,加入磷脂100-130份,加入磷脂酶D 20-25份进行酶解反应,酶解反应中施加超声进行处理。
[0009]
其中,所述超声频率为20-40kHz;超声强度为40-60W/m 2;超声功率为400-600W;超声时间为10-20min;超声温度为35-55℃;酶活为30-60U/ml。
[0010]
优选地,所述超声频率为20-30kHz;超声强度为40-50W/m 2;超声功率为400-500W;超声时间为15-20min;超声温度为35-45℃;酶活为30-50U/ml。
[0011]
超声功率过低时,导致磷脂与酶液混匀效果不佳,影响底物转化率;当超声频率过高时,损伤磷脂酶D活性,导致转化率大大降低;当超声处理强度过大时,可使水分子电离,产生自由基,这些自由基进入酶的活性中心,破坏酶的构象,损伤磷脂酶D活性,导致转化率大大降低;因此在适当的功率和强度下,增加超声介入,可以优化混匀效果,减少磷脂粘稠性,但是正交试验显示,即使在严格控制功率、强度和反应温度的情况下;若酶活、超声频率与时间不达标的情况下转化率仍然较低,无法发挥超声处理在酶解制备磷脂酰丝氨酸中的优势。因此以上条件必须同时满足。
[0012]
进一步地,所述酶解反应的时间为2-4小时。优选地,所述酶解反应的时间为2-3小时。
[0013]
优选地,所述酶解开始时,温度为35-45℃。酶解反应开始时,当温度小于35℃时,虽然酶活较高,但是磷脂很粘稠,混匀效果较差,导致转化率较低,而当温度在35-45℃时,酶活较高,同时料液混匀效果较好,导致转化率在93%,尤其,当温度为45℃时,转化率达到98%。
[0014]
进一步地,所述磷脂为大豆磷脂,其中磷脂酰胆碱含量为54~55%。
[0015]
优选地,所述施加超声的介入时间为酶解反应开始时0~0.5小时。
[0016]
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点,使用超声波处理技术,辅助磷脂酶D作用于磷脂酰胆碱和丝氨酸发生酶解反应制备磷脂酰丝氨酸,同 时控制超声波处理过程中的超声强度、超声频率、处理的温度与时间、酶活等参数协同作用,使得酶解转化率达到98%以上。

附图说明

[0017]
图1为实施例1的反应结果图;
[0018]
图2为实施例2的反应结果图;
[0019]
图3为实施例3的反应结果图。

具体实施方式

[0020]
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。
[0021]
实施例1
[0022]
向容器中加入以下重量的物质:L-丝氨酸150g,无水氯化钙10g,纯水450ml,温度为35℃,加入磷脂100g,所选为大豆磷脂,磷脂酰胆碱含量为55%,搅拌10分钟,加入磷脂酶D 20ml,酶活为20U/ml,在酶解过程中施加超声,超声功率400W,超声强度为40W/cm 2,超声频率为40kHz,超声处理时间为5分钟,酶解时间为2小时。酶解结束磷脂酰胆碱转化率90%,反应结果如附图1所示。
[0023]
实施例2
[0024]
向容器中加入以下重量的物质:L-丝氨酸200g,无水氯化钙20g,纯水500ml,温度为45℃,加入磷脂酰胆碱130g,所选为大豆磷脂,磷脂酰胆碱含量为54%,搅拌5分钟,加入磷脂酶D 25ml,酶活为60U/ml,在酶解过程中施加超声,超声功率600W,超声强度为60W/cm 2,超声频率为20kHz,超声处理时间为30分钟,酶解时间为4小时。酶解结束磷脂酰胆碱转化率93%,反应结果如附图2所示。
[0025]
实施例3
[0026]
向容器中加入以下重量的物质:L-丝氨酸180g,无水氯化钙15g,纯水450ml,搅拌8分钟,温度为40℃,加入磷脂酰胆碱120g,所选为大豆磷脂,磷脂酰胆碱含量为54.23%,搅拌5分钟,加入磷脂酶D 25ml,酶活为50U/ml,在酶解过程中施加超声,超声功率500W,超声强度为50W/cm 2,超声频率为30kHz,超声处理时间为15分钟,酶解时间为3小时。酶解结束磷脂酰胆碱转化率98%,反应结果如附图3所示。
[0027]
对比例1
[0028]
设计5组平行实验,设计施加超声的介入时间分别为酶解反应开始时的0、0.5、1、1.5、2小时,其余原料和制备步骤与实施例3相同,酶解结束磷脂酰胆碱转化率见表3:
[0029]
表1-超声介入时间对磷脂酰胆碱转化率的影响
[0030]
[0031]
由上表可知,磷脂酰胆碱酶解反应中,施加超声的介入时间为酶解反应开始时0~0.5小时,转化率在95%以上。而当等待超过0.5小时再介入超声,转化率下降到90%及以下。
[0032]
对比例2
[0033]
设计7组平行实验,设计酶解反应时间分别为1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5小时,其余原料和制备步骤与实施例3相同,酶解结束磷脂酰胆碱转化率见表3:
[0034]
表2-酶解反应时间对磷脂酰胆碱转化率的影响
[0035]
[0036]
由上表可知,磷脂酰胆碱酶解反应中,超声处理时间为2-4小时时,转化率在92%以上,而当超声处理时间为2-3小时时,转化率达到95%以上。而当媒介时间小于2小时和大于4小时时,转化率大大降低。
[0037]
对比例3
[0038]
本实验采用L 25(5 6)正交表,以超声频率(A)、超声强度(B)、超声功率(C)、超声时间(D)、酶解温度(E)、酶活(F)做为6个考察因素,分别选取五个水平进行实验。通过计算6个因素5个水平条件的实验数据平均值,进行结果的极差分析,挑选出最优水平,比较最适实验范围,以磷脂酰胆碱转化率为评价指标,对正交实验进行评价,实验结果如表3所示。
[0039]
表3-正交L 25(5 6)实验结果及极差分析
[0040]
[0041]
[0042]
由该正交实验的极差分析得出6个因素对转化率的影响主次顺序分别为F>A>D>B>C>E,基于方差分析得出最优实验条件为:A 1B 2C 2D 4E 2F 5,即超声频率20kHz、超生强度40W/m 2、超声功率400W、超声时间20min、酶解温度35℃、酶活50U/ml。根据因素A(超声频率)的同一水平实验之和可以看出,K 1>K 2>K 3>K 5>K 4,优选的超声频率范围为20-40kHz,更优选的超声频率范围为20-30kHz;根据因素B(超声强度)的同一水平实验之和可以看出,K 2>K 3>K 4>K 1>K 5,优选的超声强度范围为40-60W/m 2,更优选的超声强度范围为40-50W/m 2;根据因素C(超声功率)的同一水平实验之和可以看出,K 2>K 3>K 4>K 1>K 5,优选的超声功率范围为400-600W,更优选的超声功率范围为400-500W;根据因素D(超声时间)的同一水平实验之和可以看出,K 4>K 3>K 2>K 1>K 5,优选的超声时间范围为10-20min,更优选的超声时间范围为15-20min;根据因素E(温度)的同一水平实验之和可以看出,K 2>K 3>K 4>K 1>K 5,优选的超声温度范围为35-55℃,更优选的超声温度范围为35-45℃;根据因素F(酶活)的同一水平实验之和可以看出,K 4>K 3>K 2>K 5>K 1,优选的酶活范围为30-60U/ml,更优选的酶活范围为30-50U/ml。

权利要求书

[权利要求 1]
一种超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:在L-丝氨酸150-200份、无水氯化钙10-20份和纯水400-500份的混合物中,加入磷脂100-130份,加入磷脂酶D 20-25份进行酶解反应,酶解反应中施加超声进行处理。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述超声频率为20-40kHz;超声强度为40-60W/m 2;超声功率为400-600W;超声时间为10-20min;超声温度为35-55℃;酶活为30-60U/ml。
[权利要求 3]
根据权利要求2所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述超声频率为20-30kHz;超声强度为40-50W/m 2;超声功率为400-500W;超声时间为15-20min;超声温度为35-45℃;酶活为30-50U/ml。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述酶解反应的时间为2-4小时。
[权利要求 5]
根据权利要求1所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述酶解反应的时间为2-3小时。
[权利要求 6]
根据权利要求1-5任一所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述酶解开始时,温度为35-45℃。
[权利要求 7]
根据权利要求1-5任一所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述磷脂为大豆磷脂,其中磷脂酰胆碱含量为54~55%。
[权利要求 8]
根据权利要求1-5任一所述的超声波辅助制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:所述施加超声的介入时间为酶解反应开始时0~0.5小时。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]