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1. KR1020160002951 - 세포성 면역 유도능이 개선된 경구 백신

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[ KO ]
세포성 면역 유도능이 개선된 경구 백신{ORAL VACCINE HAVING IMPROVED CELLULAR IMMUNITY INDUCTION POTENCY}
기 술 분 야
 본  발명은  병원체  감염성  질환의  예방  또는  치료를  위한  경구  제제에  관한  것이다.    또,  본  발명은  표적  항원에  대한  세포성  면역을  유도하기  위한  경구  제제에  관한  것이다.
배경기술
 인유두종 바이러스(Human papilloma virus, HPV)는 세계적으로 성인의 50% 이상이 감염되고 있는 것으로 추정되고, 유두종 바이러스 중, 특히 HPV 16, 18, 31 및 45의 4개의 타입은 80% 이상의 자궁경암의 원인으로서 확인되고 있다(비특허문헌 1).
 세계적으로  자궁경암은  유방암  다음으로  여성에게  발생  빈도가  높은  암으로서,  세계보건기구에  따르면,  매년  세계에서  50만명  이상의  자궁경암  환자가  발생하고  있고,  매년  300,000명  이상이  자궁경암에  의해  사망하는  것으로  추정되고  있다.    특히,  개발도상국  및  저개발국에서는  여성  사망의  주원인이  되고  있다(비특허문헌  2).    IARC  통계에  따르면,  특히  만성  감염자가  선진국에  비해  매우  많은  개발도상국의  HPV  감염을  박멸하기  위해  장기적으로  가장  효과적인  방법은  HPV  예방  백신을  투여하는  것이라고  보고되고  있다.
 자궁경암에  관한  백신  개발의  방법으로는,  크게  예방  백신과  치료  백신  두  가지로  초점이  좁혀지고  있다.    예방  백신은  HPV  L1/L2  항원  단백질에  의해,  강한  중화  항체가  생성되도록  함으로써,  숙주가  HPV에  감염되는  것을  방지하는  목적이  있다.    한편,  치료  백신은  HPV  E6/E7을  대상으로  하는데,  특이적인  세포성  면역을  유도시켜,  HPV에의  감염은  확인되었지만  그  이상으로  질병이  진행되지  않게  하거나,  혹은  이미  형성된  병반이나  악성  종양을  퇴화시키는  것을  목적으로  하고  있다.
 HPV의  E6/E7  단백질은  HPV에  감염된  세포  등의  암화(癌化)에  관한  암특이항원이기  때문에,  자궁경암의  면역  치료의  타겟으로서  E6/E7  단백질을  이용한  치료  백신  연구가  계속되어  왔다.    실제,  미생물  시스템에서  합성된  HPV  E6/E7  단백질을,  종양  세포를  주입한  래트에게  투여한  경우,  종양  형성이  저해되거나  지연된다는  보고가  있다(비특허문헌  3,  4  및  5).
 HPV 감염자가 주로 저개발국에 집중하고 있는 점을 감안하면, 유두종 바이러스에 기인하는 자궁경암의 예방 및 치료를 위해, 보다 경제적이고 또한 안정적으로 HPV에 대한 백신을 제조하는 방법의 개발이 강하게 요구되고 있다.
 본  출원인들은  HPV의  E7  단백질을  표면  발현시킨  사균화  유산균을  유효  성분으로  하는  자궁경암  치료  백신을  개발하고  있다.    이  치료  백신은  경구  투여에  의해  장관(腸管)을  통해  E7  단백질을  환자에게  흡수시켜,  자궁경부에  있어서  E7  단백질에  대한  특이적인  세포성  면역을  유도하고,  HPV에  감염되어  버린  환자(예를  들면,  자궁경암  전암병변  CIN3를  갖는  환자)가  자궁경암으로  이행하지  않게  하기  위한  것으로,  임상시험에서  뛰어난  안전성  및  유효성이  나타나고  있다(비특허문헌  6).
 현재, 실시중인 탐색적 임상시험에 있어서, 이 경구 치료 백신의 유효 성분인 HPV의 E7 단백질을 표면 발현시킨 사균화 유산균의 제제의 제조 비용은 비교적 고가로, 당해 탐색적 임상시험에 있어서의 투여량(250mg 4캡슐을 1일 1회)을 줄여서 현재의 유효성과 동등한 약효를 나타낼 수 있다면, 제제 원가가 싸지고, 본 치료약의 실용화가 높아지는 동시에, 환자의 경제적 부담을 줄일 수 있다.
 한편,  경구에  의해  섭취된  미립자의  장관을  통한  체내로의  흡수는,  당해  미립자의  장간막  M세포  투과성에  의해  조절되고  있다.    입자의  크기가  10㎛를  넘으면  M세포에  의한  탐식은  현저하게  낮아지는  것이  알려져  있다(비특허문헌  7).
선행기술문헌
   특허문헌
  (비특허문헌 0001)     Lowy, D. R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 91:2436, 1994 (비특허문헌 0002)     Pisani, P. et al., Int. J. Cancer, 55:891, 1993 (비특허문헌 0003)     Gao, L. et al., J. Gen. Viol., 75:157, 1994 (비특허문헌 0004)     Meneguzzi, G. et al., Virology, 81:62, 1991 (비특허문헌 0005)     Sophie H. et al., Anticancer Res, Jul 2004; 24: 2265-2276 (비특허문헌 0006)     가와나 케이, Medical Tribune 2011년 11월 3일(VOL. 44 NO. 44) p.46 (비특허문헌 0007)     Tabata Y, Ikada Y. Adv Polym Sci 94:107-141, 1990
발명의 상세한 설명
   해결하려는 과제
 상기의 사정을 감안하여, 본 발명은 표적 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균을 유효 성분으로 하는 경구 치료 백신의 유효 투여량을 저감시키는 제제 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
   과제의 해결 수단
 본  발명자들은  표적  항원을  표면  발현하는  사균화  유산균을  파쇄하여,  입자지름을  작게  함으로써  장간막  M세포  투과성을  향상시킬  수  있다면,  체내로의  흡수  효율이  상승하고,  이에  수반하여  항원  특이적  세포성  면역  유도능이  상승하여,  치료  백신의  경구  투여에  의한  유효량을  저감시킬  수  있다고  생각했다.    예상대로,  사균화  유산균을  보다  작은  입자지름으로  분쇄할수록  장간막  M세포  투과성이  상승하고,  장간막  M세포를  투과하는  표적  항원의  양이  증대하는  것이  시험관내(in  vitro)  M세포  모델에  의해  확인되었다.    원체인  입자지름  174.2㎛의  사균화  유산균을,  입자지름  30㎛나  2.68㎛에까지  파쇄함으로써,  경구  투여한  경우의  항원  특이적  세포성  면역  유도능이  향상했다.    그러나,  예상  밖에도,  2.68㎛를  밑도는  크기에까지  사균화  유산균을  미립화하면,  시험관내  모델에  있어서의  장간막  M세포  투과성은  향상함에도  불구하고,  항원  특이적  세포성  면역  유도능이  반대로  저하해  버리는  것을  찾아냈다.    이러한  지견을  베이스로  더욱  검토를  더하여  본  발명을  완성하기에  이르렀다.
 즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
 [1]평균입자지름 2.68~30㎛의, 병원체 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물을 포함하는 당해 병원체 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 경구 제제.
 [2]병원체가 세포내 감염성 병원체인,[1]기재의 경구 제제.
 [3]세포내 감염성 병원체가 바이러스인,[2]기재의 경구 제제.
 [4]바이러스가 인유두종 바이러스인,[3]기재의 경구 제제.
 [5]병원체 항원이 당해 병원체의 내부 항원인,[1]기재의 경구 제제.
 [6]병원체 항원이 E7인,[5]기재의 경구 제제.
 [7]당해 병원체 항원에 대한 세포성 면역을 유도함으로써, 당해 병원체 감염성 질환을 예방 또는 치료하는,[1]기재의 경구 제제.
 [8]평균입자지름 2.68~30㎛의, 표적 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물을 포함하는 당해 표적 항원에 대한 세포성 면역을 유도하기 위한 경구 제제.
 [9]표적 항원이 병원체 항원인,[8]기재의 경구 제제.
 [10]병원체가 세포내 감염성 병원체인,[9]기재의 경구 제제.
 [11]세포내 감염성 병원체가 바이러스인,[10]기재의 경구 제제.
 [12]바이러스가 인유두종 바이러스인,[11]기재의 경구 제제.
 [13]병원체 항원이 당해 병원체의 내부 항원인,[9]기재의 경구 제제.
 [14]병원체 항원이 E7인,[9]기재의 경구 제제.
 [15]경구 투여에 의한, 병원체 감염성 질환의 예방 또는 치료에 있어서의 사용을 위한, 평균입자지름 2.68~30㎛의 당해 병원체 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [16]병원체가 세포내 감염성 병원체인,[15]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [17]세포내 감염성 병원체가 바이러스인,[16]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [18]바이러스가 인유두종 바이러스인,[17]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [19]병원체 항원이 당해 병원체의 내부 항원인,[15]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [20]병원체 항원이 E7인,[19]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [21]당해 병원체 항원에 대한 세포성 면역을 유도함으로써, 당해 병원체 감염성 질환을 예방 또는 치료하는,[15]기재의 사균화 유산균 또는 그 미립화물.
 [22]평균입자지름 2.68~30㎛의, 병원체 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물의 유효량을 환자에게 경구 투여함으로써, 당해 병원체 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
 [23]병원체가 세포내 감염성 병원체인,[22]기재의 방법.
 [24]세포내 감염성 병원체가 바이러스인,[23]기재의 방법.
 [25]바이러스가 인유두종 바이러스인,[24]기재의 방법.
 [26]병원체 항원이 당해 병원체의 내부 항원인,[22]기재의 방법.
 [27]병원체 항원이 E7인,[26]기재의 방법.
 [28]당해 병원체 항원에 대한 세포성 면역을 유도함으로써, 당해 병원체 감염성 질환을 예방 또는 치료하는,[22]기재의 방법.
   발명의 효과
 본 발명에 따르면, 표적 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물의 평균입자지름을 2.68~30㎛의 범위 내로 함으로써, 경구 투여시에 있어서의 당해 표적 항원에 대한 세포성 면역 유도능을 향상시킬 수 있으므로, 당해 사균화 유산균을 유효 성분으로 하는 경구 백신의 유효 투여량을 저감시킬 수 있다.
도면의 간단한 설명
 도  1은  비미립화  제제(평균입자지름  174.2㎛)와  미립화  제제(입자지름  0.12㎛)  중의  사균화  유산균의  입자지름  분포를  나타낸다.
도  2는  미립화  제제(입자지름  2.68㎛,  0.77㎛,  0.49㎛)  중의  사균화  유산균의  입자지름  분포를  나타낸다.
도  3은  시험관내  M세포  모델의  개념도를  나타낸다.
도  4는  여러  가지  입자지름의  마이크로스피어의  시험관내  M세포  투과성을  검토한  결과를  나타낸다.
도  5는  여러  가지  입자지름의  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  시험관내  M세포  투과성을  검토한  결과를  나타낸다.    Caco-2로  표시된  바는,  Caco-2  세포만을  단층  배양하고  있고,  M세포  양(樣)으로  변화하지  않은  시험계(=장간막의  모델)를  나타낸다.    Caco-2/Raji로  표시된  바는,  Caco-2  세포와  라지(Raji)  세포를  공배양함으로써  M세포  양(樣)으로  한  시험계(=M세포  모델)를  나타낸다.    P#02와  P#03은,  2회의  독립된  시험에  상당한다.
도  6은  여러  가지  입자지름의  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  시험관내  M세포  투과성을  검토한  결과를  나타낸다.    왼쪽의  바는  4℃에서의  투과성을,  오른쪽의  바는  37℃에서의  투과성을  각각  나타낸다.
도  7은  생체내(in  vivo)  면역  유도능  비교  시험의  군(群)  구성과  시험  스케줄을  나타낸다.
도  8은  생체내  세포성  면역  유도능(IEL)의  비교  결과를  나타낸다.    군  구성은  도  7과  동일하다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
 본  발명은  평균입자지름  2.68~30㎛의,  표적  항원을  표면  발현하는  사균화  유산균  또는  그  미립화물을  포함하는  경구  제제를  제공하는  것이다.    본  발명의  경구  제제는,  당해  표적  항원에  대한  세포성  면역을  유도하기  위해  사용할  수  있다.    표적  항원으로서  병원체  항원을  채용함으로써,  본  발명의  경구  제제는  당해  병원체  감염성  질환의  예방  또는  치료를  위해  사용할  수  있다.
 표적  항원으로는,  본  발명의  경구  제제의  투여  대상(예를  들면,  인간)의  면역계가  이물(異物)로서  인식하고,  획득  면역  반응을  유도하는  것이면  특별히  한정되지  않고,  모든  물질을  이용할  수  있다.    당해  물질로는,  폴리펩티드(펩티드,  단백질을  포함한다),  당지질,  당,  핵산  등을  들  수  있지만,  이들에  한정되지  않는다.    본  발명의  경구  제제는,  세포성  면역을  유도하는  활성이  뛰어나므로,  항원제시세포에  흡수되어,  프로세싱을  받은  후에  MHC  클래스  I  상에  제시됨으로써,  세포상해성  T세포(CD8  T세포)  상에  발현한  T세포  수용체(TCR)에  의해  인식되는  항원이,  적합하게  이용된다.    일반적으로,  세포상해성  T림프구는,  MHC  클래스  I  상에  제시된  폴리펩티드나  당지질을  TCR을  통해  인식한다.    따라서,  본  발명에  있어서  이용되는  표적  항원으로는,  투여  대상(예를  들면,  인간)의  MHC  클래스  I  상에  제시됨으로써,  투여  대상(예를  들면,  인간)의  세포상해성  T림프구상의  TCR이  인식  가능한  펩티드나  당지질;  투여  대상(예를  들면,  인간)의  세포내  프로테아좀에서의  분해에  의해  당해  펩티드나  당지질이  생기는  단백질,  병원체,  세포,  또는  병원체나  세포의  일부(추출물  등)  등이  바람직하다.    보다  바람직하게는,  본  발명에  있어서  이용되는  표적  항원은,  투여  대상(예를  들면,  인간)의  MHC  클래스  I  상에  제시됨으로써,  투여  대상(예를  들면,  인간)의  세포상해성  T림프구상의  TCR이  인식  가능한  펩티드;  또는  투여  대상(예를  들면,  인간)의  세포내  프로테아좀에서의  분해에  의해  당해  펩티드가  생기는  단백질이다.
 표적  항원의  종류로는,  병원체  항원,  종양  항원,  식품  항원,  알레르겐  등을  들  수  있고,  특별히  한정되지  않는다.    일양태에  있어서,  표적  항원은  병원체  항원이다.    표적  항원으로서  병원체  항원을  채용함으로써  당해  병원체  항원에  대한  세포성  면역을  효율적으로  유도하고,  당해  병원체  감염성  질환을  예방  또는  치료할  수  있다.    병원체로는,  세포외  또는  세포내에  감염되는  박테리아,  바이러스,  기생충,  곰팡이  등을  들  수  있지만,  특별히  한정되지  않는다.
 본  발명의  경구  제제는  세포성  면역을  유도하는  활성이  뛰어나고,  또,  세포내  감염성  병원체나  암은  세포성  면역에  의해  생체로부터  배제되는  것이  알려져  있으므로,  표적  항원으로는,  바람직하게는  세포내  감염성  병원체  항원  및  암화한  세포에  관련된  항원(종양  항원,  예를  들면  암화에  의한  변이를  포함하는  단백질),  보다  바람직하게는  세포내  감염성  병원체  항원이  이용된다.    세포내  감염성  병원체에  의한  감염증에서는,  주로,  세포성  면역이  유도되고,  당해  세포내  감염성  병원체에  감염되어,  당해  병원체  항원을  MHC  Class  I  상에  제시한  세포를,  세포상해성  T세포가  살상함으로써  당해  세포내  감염성  병원체를  생체  밖으로  배제한다.    따라서,  본  발명의  경구  제제에  이용하는  항원으로서  세포내  감염성  병원체  항원을  이용함으로써  당해  항원에  대한  세포성  면역이  효율적으로  유도되고,  이  유도된  세포성  면역에  의한  당해  세포내  감염성  병원체에  감염된  세포의  배제가  촉진되어  당해  세포내  감염성  병원체  감염성  질환을  예방  또는  치료할  수  있다.
 세포내 감염성 병원체로는, 바이러스; 리케차, 클라미디아, 파이토플라스마, 마이코플라스마 등의 세포내 기생성 박테리아; 톡소플라스마, 리슈마니아, 말라리아원충, 주혈흡충, 피토믹사강(Phytomyxea) 등의 세포내 기생성 원충 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 바이러스이다.
 바이러스로는,  인유두종  바이러스(HPV),  HTLV-1,  EBV,  HCV,  HBV,  인플루엔자  바이러스,  폴리오  바이러스,  일본뇌염  바이러스,  홍역  바이러스,  멈프스  바이러스,  풍진  바이러스,  광견병  바이러스,  황열  바이러스,  수두  바이러스,  HAV,  뎅기열  바이러스,  로타  바이러스,  파보  바이러스,  HIV  등을  들  수  있고,  특별히  한정되지  않는다.    일양태에  있어서,  바이러스는  HPV,  HTLV-1,  EBV,  HCV,  HBV  등의  발암  바이러스이다.    일양태에  있어서,  바이러스는  HPV이다.
 본  발명에  있어서,  표적  항원으로서  병원체  항원을  이용하는  경우,  당해  병원체  항원으로서  병원체의  내부  항원  및  표면  항원을  이용할  수  있다.    본  발명의  경구  제제는  세포성  면역을  유도하는  활성이  뛰어나므로,  액성  면역의  유도만으로는  액세스할  수  없는  내부  항원을  병원체  항원으로서  이용한  경우라도  당해  내부  항원에  대한  세포성  면역을  유도하고,  당해  내부  항원을  제시하는  세포를  세포상해성  T세포가  살상함으로써,  당해  병원체를  생체로부터  배제하고,  당해  병원체  감염성  질환을  예방  또는  치료할  수  있다.
 일양태에  있어서,  본  발명의  경구  제제에  있어서  표적  항원으로  HPV  항원이  이용된다.    HPV  항원으로는,  E1,  E2,  E4,  E5,  E6,  E7,  L1  및  L2  등을  들  수  있다.    이들  HPV  항원  중,  E1,  E2,  E4,  E5,  E6  및  E7이  내부  항원에  상당한다.    상기  HPV  항원  중,  E6  및  E7이  세포성  면역  유도에  의한  HPV  감염성  질환의  치료  효과가  뛰어나다.
 본  발명에  있어서,  병원체  감염성  질환에는  병원체에의  감염,  및  당해  감염에  기인하는  질환이나  증상이  포함된다.    예를  들면,  HPV의  경우,  HPV의  감염;  및  HPV  감염에  기인하는  전암병변(자궁경부  상피내  종양(CIN)),  자궁경암,  항문,  외음부,  질암의  일부의  암과  음경암,  중인두암,  첨규콘딜로마  등이  HPV  감염성  질환에  포함된다.
 본  발명의  경구  제제에  있어서  이용되는  유산균에는,  락토바실러스속,  스트렙토코커스속,  락토코커스속,  엔테로코커스속  및  비피도박테리움속이  포함된다.    락토바실러스속으로는,  대표적으로,  락토바실러스  아시도필루스(L.  acidophilus),  락토바실러스  카제이(L.  casei),  락토바실러스  플란타룸(L.  plantarum),  락토바실러스  퍼멘툼(L.  ferementum),  락토바실러스  델부루키(L.  delbrueckii),  락토바실러스  존슨니(L.  johnsonii  LJI),  락토바실러스  루테리(L.  reuteri),  락토바실러스  가세리(L.  gasseri),  락토바실러스·말리(L.  mali),  락토바실러스·부크네리(L.  buchneri),  락토바실러스·갈리나룸(L.  gallinarum),  락토바실러스·아밀로보러스스(L.  amylovorus),  락토바실러스·브레비스(L.  brevis),  락토바실러스·람노서스(L.  rhamnosus),  락토바실러스·케피어(L.  kefir),  락토바실러스·파라카제이(L.  paracasei),  락토바실러스·크리스파투스(L.  crispatus)  및  락토바실러스  불가리쿠스(L.  bulgaricus)  등을  들  수  있다.    스트렙토코커스속으로는,  대표적으로,  스트렙토코커스  써모필러스(S.  thermophilus),  스트렙토코커스  고르도니(S.  gordonii)  등을  들  수  있다.    락토코커스속으로는,  대표적으로,  락토코커스  락티스(L.  lactis),  락토코커스  크레모리스(L.  cremoris)  등을  들  수  있다.    엔테로코커스속으로는,  대표적으로,  엔테로코커스  패칼리스(E.  faecalis),  엔테로코커스  패시움(E.  faecium)  등을  들  수  있다.    비피도박테리움속으로는,  대표적으로,  비피도박테리움  인펀티스(B.  infantis),  비피도박테리움  비피덤(B.  bifidum),  비피도박테리움  롱검(B.  longum),  비피도박테리움  슈도롱검(B.  psuedolongum),  비피도박테리움  브레베(B.  breve),  비피도박테리움  락티스  Bb-12(B.  lactis  Bb-12),  비피도박테리움·카테눌라텀(B.  catenulatum)  및  비피도박테리움  아돌레센티스(B.  adolescentis)  등을  들  수  있다.    보다  바람직하게는  락토바실러스속이  이용된다.
 본  발명의  경구  제제에  있어서는,  표적  항원이  유산균의  표면에  발현되어  있다.    표적  항원을  유산균  등의  미생물의  표면에  발현시키는  기술은  세포  표면  디스플레이  기술이라  칭해지고,  당업자에게  널리  알려져  있다.    일반적으로는,  박테리아나  효모  등의  미생물의  표면  단백질을  표면  앵커링  모티프(surface  anchoring  motif)로서  이용하여  외래  단백질인  표적  항원을  미생물의  표면에  발현시킨다.    즉,  표면  앵커링  모티프와  표적  항원을  연결한  융합  단백질을  발현하는  발현  벡터로,  유산균을  형질  전환함으로써,  당해  표적  항원을  표면  발현하는  유산균을  얻을  수  있다.    표면  앵커링  모티프는,  세포외막  단백질,  리포  단백질,  분비  단백질  및  편모(鞭毛)  단백질과  같은  표면  기관(器官)  단백질의  4개로  크게  구별된다.    유산균에  있어서의  표면  발현을  위한  알맞은  표면  앵커링  모티프로는,  바실러스속  균주  유래의  폴리γ글루타민산의  합성  복합체  유전자(pgsB,  pgsC,  pgsA,  pgsBCA,  바람직하게는  pgsA)(WO03/014360)  등을  들  수  있다.    표적  항원을  유산균  등의  미생물의  표면에  발현시키는  방법에  대해서는  WO2004/035795,  WO2004/108937,  WO2005/075653,  WO2008/115019,  WO2010/079982,  WO2010/079991,  일본국  특개  2007-131610  등을  참조할  것.
 표적  항원이  표면  발현한  유산균의  배양은  공지의  조건  또는  그에  준하는  조건으로  실시할  수  있다.    예를  들면,  글루코스,  효모  엑기스,  및  펩톤  등을  포함하는  액체  배지속에서,  통상  약  25~45℃로,  약  4~72시간  정도  호기  또는  혐기  배양하고,  배양액으로부터  균체를  집균하여  세정함으로써  표적  항원이  표면  발현한  유산균의  습균체를  얻는다.
 본  발명의  경구  제제에  있어서는,  표적  항원이  표면  발현한  유산균의  사균이  이용된다.    유산균의  사균화  기술은  당해  기술  분야에  있어서  주지이며,  유산균의  생존성을  잃게  하는  방법이면  특별히  한정되지  않는다.    유산균의  사균화  방법으로는,  예를  들면  유산균을  에테르,  포르말린,  염소,  수은,  알코올,  β-프로피오락톤  등의  화학물질로  처리하여  사멸시키거나,  또는  열,  초음파,  자외선,  X선  등에  노출함으로써  사멸시키는  방법  등을  들  수  있다.    유산균의  사균화는,  유산균의  생존성을  잃게  하는  한편,  유산균  표면상에  발현된  표적  항원의  항원성을  극력(極力)  잃지  않고,  또한  형질  전환에  사용된  플라스미드가  제거되도록  실시하는  것이  바람직하다.    이러한  관점에서,  유산균의  사균화는  열처리에  의해  실시하는  것이  바람직하다.    일본특허  제4902845호에는  유산균의  기본  배지에  계면활성제  및  탄산염을  더하고,  배양  시에  배양액의  pH를  6.0~7.0으로  유지하면서  배양한  후,  열처리에  의해  사균화함으로써,  배양액에  존재하는  생균을  제거하고,  형질  전환  유산균의  세포  내에  존재하는  재조합  유전자  함유  플라스미드를  제거하며,  또한  면역  기능을  강화하는  것이  가능한,  뛰어난  사균화  유산균  제제의  제조  방법이  개시되어  있다.
 본  발명의  경구  제제는,  그  유효  성분인  표적  항원이  표면  발현한  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  평균입자지름을  2.68~30㎛로  하는  것을  특징으로  한다.    평균입자지름을  2.68~30㎛의  범위  내로  함으로써,  표적  항원을  표면  발현한  사균화  유산균  또는  그  미립화물을  경구  투여했을  때에  당해  표적  항원에  대한  세포성  면역을  강력하게  유도하는  것이  가능해진다.
 유산균은,  통상,  긴  지름이  약  7㎛인  간균이므로,  사균화  유산균의  미립화물의  평균입자지름은  통상  7㎛를  밑돈다.    일양태에  있어서,  본  발명의  경구  제제에  함유되는,  표적  항원이  표면  발현한  사균화  유산균의  미립화물의  평균입자지름은  2.68㎛  이상,  7㎛  미만이다.
 본  명세서에  있어서,  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  평균입자지름은,  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  건조  제제의  입자지름을,  레이저  회절  산란법에  의해  측정되는  체적기준  입도분포의  메디안  지름(d50)이며,  예를  들면  LA-920,  LA-950V2(양  기종  모두  호리바(HORIBA)사  제조)를  이용하여  측정할  수  있다.    성상(性狀)으로부터  레이저  회절  산란법에  의해  입자지름을  측정할  수  없는  경우에는,  SEM(주사형  전자현미경)에  의한  화상(畵像)으로부터  입자지름을  측정해도  되지만,  양쪽  방법에  의해  측정  가능한  경우에는  레이저  회절  산란법에  의한  측정  결과가  우선된다.
 본 명세서에 있어서 미립화물이란, 사균화 유산균을 파쇄 또는 분산함으로써 얻어지는 산물을 의미한다.
 사균화  유산균의  파쇄  또는  분산  방법은  특별히  한정되지  않고,  사균화  유산균의  건조물을  건식  분쇄·분산해도  되고,  사균화  유산균의  습균체를  습식  파쇄·분산해도  된다.    표면  발현시킨  표적  항원에의  데미지를  억제하는  관점에서,  건식  분쇄·분산이  바람직하다.
 사균화 유산균의 건조 방법은 당업자에게 주지이며, 특별히 한정되지 않지만 예를 들면, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다.
 분무  건조의  경우,  예를  들면,  사균화  유산균을  용매에  분산하여  균체  분산액으로  한다.    용매는  당업계에서  이용되는  공지의  용매를  이용해도  되지만,  물이  바람직하다.    또,  원하는  바에  따라  에탄올을  더해도  된다.    상기  균체액에는,  추가로  과립화제,  현탁제,  보호제,  부형제,  결합제,  붕괴제,  정전기  방지제,  완충제,  분산제,  안정화제,  계면활성제  등  당업계에서  일반적으로  이용되고  있는  첨가제를  통상의  배합  비율로  첨가해도  된다.    이  균체  분산액을,  분무건조장치에  의한  건조  조작을  함으로써  사균화  유산균의  건조물을  얻을  수  있다.    건조물은,  건조된  개개의  사균화  유산균,  또는  건조된  사균화  유산균의  집합물일  수  있다.
 사균화  유산균의  건식  분쇄·분산은,  비드  밀,  볼  밀,  제트  밀  등의  당업자에게  공지의  방법에  의해  실시할  수  있다.    비드  밀이란,  용기(vessel)  안에  비드를  충전해  두고,  중앙의  회전축을  회전시킴으로써  비드에  움직임을  주어,  여기로  원료를  보내어  비드로  갈아서  으깸으로써,  원료의  파쇄,  분산을  실시하는  방법이다.    볼  밀이란,  포트  안에  볼  및  원료를  넣고  포트를  회전시킴으로써,  볼의  낙하  충격으로  원료의  파쇄,  분산을  실시하는  방법이다.    제트  밀이란,  원료를  고압으로  가압하고,  미세  노즐로부터  고속  분사시킴으로써,  분사  시의  입자끼리  또는  경질  부재에의  충돌이나,  노즐  통과  및  대향류에  의해  생기는  전단력,  또는  분류(噴流)  캐비테이션에  의한  충격력으로  원료의  파쇄,  분산을  실시하는  방법이다.    사균화  유산균의  미립화의  방법은  특별히  한정되지  않지만,  표면  발현시킨  표적  항원에의  데미지를  억제하는  관점에서  비드  밀이  바람직하다.    비드  밀에  의한  미립화는,  예를  들면,  스타  밀(아시자와·파인테크(Ashizawa  Finetech)사)  등의  시판의  장치에  의해  실시할  수  있다.
 본  발명의  경구  제제는,  관용  수단에  의해,  유효  성분인  입자지름  2.68~30㎛의,  병원체  항원을  표면  발현하는  사균화  유산균  또는  그  미립화물을,  부형제,  결합제,  붕괴제,  활택제  등의  의약으로서  허용되는  담체와  배합하고,  정제(설하정,  구강내  붕괴제를  포함한다),  캡슐제(소프트  캡슐,  마이크로  캡슐,  심리스  캡슐을  포함한다),  산제(散劑),  과립제,  환제,  현탁제,  트로키제,  시럽제,  유제  등으로  제제화함으로써  제조할  수  있다.    이들  제제는,  속방성  제제,  서방성  제제,  장용제  등의  방출  제어  제제여도  된다.    사용되는  의약으로서  허용되는  담체는  특별히  한정되는  것은  아니다.    부형제로는,  예를  들면  유당,  콘스타치,  백당,  포도당,  만니톨,  소르비톨,  결정셀룰로오스,  이산화규소  등을  들  수  있다.    결합제로는,  예를  들면  폴리비닐알코올,  폴리비닐에테르,  에틸셀룰로오스,  메틸셀룰로오스,  아라비아고무,  트래거캔스,  젤라틴,  셸락,  히드록시프로필셀룰로오스,  히드록시프로필메틸셀룰로오스,  히드록시프로필스타치,  폴리비닐피롤리돈  등을  들  수  있다.    붕괴제로는,  예를  들면  전분,  한천,  젤라틴분말,  결정셀룰로오스,  탄산칼슘,  탄산수소나트륨,  구연산칼슘,  덱스트린,  펙틴,  카르복시메틸셀룰로오스칼슘,  저치환도  히드록시프로필셀룰로오스,  크로스카멜로스나트륨,  부분  α화  전분  등을  들  수  있다.    활택제로는,  예를  들면  스테아린산마그네슘,  탈크,  폴리에틸렌글리콜,  실리카,  경화  식물유  등을  들  수  있다.
 본 발명의 경구 제제의 투여 대상은 포유동물이며, 예를 들면, 인간, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인간이다.
 본  발명의  경구  제제를  병원체  감염성  질환(예,  HPV  감염에  기인하는  자궁경암)의  예방을  위해  이용하는  경우,  당해  병원체(예,  HPV)에  감염될  우려가  있는  포유동물(예,  인간)에  대하여  본  발명의  경구  제제가  투여된다.    본  발명의  경구  제제를  병원체  감염성  질환(예,  HPV  감염에  기인하는  자궁경암)의  치료를  위해  이용하는  경우,  당해  병원체에  감염된  환자나  당해  병원체에  감염되고,  또한  그것에  기인하는  질환이  발증한  환자에  대해  본  발명의  경구  제제가  투여된다.    본  발명의  경구  제제는,  세포성  면역을  효율적으로  유도하는  효과가  뛰어나기  때문에  특정의  병원체(예,  HPV)에  감염되어  있지만,  당해  감염에  기인하는  질환이나  증상(예,  자궁경암  전암병변이나  자궁경암)이  아직  발증하지  않은  환자에  대해  본  발명의  경구  제제를  투여함으로써,  당해  감염에  기인하는  질환이  발증하는  것을  효과적으로  막을  수  있다.    혹은,  특정의  병원체(예,  HPV)의  감염에  기인하는  질환의  초기  단계(예,  자궁경암  전암병변)의  환자에  대해  본  발명의  경구  제제를  투여함으로써,  당해  감염에  기인하는  질환의  진행(예,  자궁경암으로의  이행)을  효과적으로  막을  수  있다.    본  발명에  있어서,  특정의  병원체에  감염되어  있지만,  당해  감염에  기인하는  질환이  아직  발증하지  않은  상태로부터  당해  감염에  기인하는  질환이나  증상이  발증하는  것을  막는  것,  및  특정의  병원체의  감염에  기인하는  질환의  초기  단계로부터  그  이후의  단계로의  진행을  막는  것은  「병원체  감염성  질환의  치료」에  포함된다.    또,  본  발명의  경구  제제를  대상  포유동물(예,  인간)에  투여함으로써,  당해  대상  포유동물에  있어서,  당해  표적  항원에  대한  세포성  면역을  유도할  수  있다.
 일양태에  있어서,  본  발명의  경구  제제는,  HPV의  E7을  표면  발현하는  사균화  유산균  또는  그  미립화물을  포함하는,  HPV  감염성  질환의  예방  또는  치료를  위한  경구  제제를  제공한다.    본  양태의  경구  제제를,  HPV에  감염되어  있지만,  HPV  감염에  기인하는  자궁경암  전암병변  또는  자궁경암이  아직  발증하지  않은  환자에  대해  투여함으로써,  자궁경암  전암병변  또는  자궁경암의  발증을  효율적으로  막을  수  있다.    또,  본  태양의  경구  제제를,  HPV  감염에  기인하는  자궁경암  전암병변을  갖는  환자에게  투여함으로써,  자궁경암  전암병변으로부터  자궁경암으로의  이행을  효과적으로  막을  수  있다.
 본  발명의  경구  제제의  투여량은,  표적  항원의  종류,  표적으로  하는  병원체의  종류,  대상  질환,  환자의  연령이나  상태  등의  조건에  따라  적절히  선택  가능하지만,  예를  들면,  인유두종  바이러스  감염성  질환(즉,  자궁경암)의  치료를  목적으로  하여,  인유두종  바이러스  항원(예를  들면  E7)을  표면  발현하는  사균화  유산균  또는  그  미립화물을  유효  성분으로서  포함하는  본  발명의  경구  제제를  투여하는  경우,  인간  1명에  대해,  1회당  투여량은,  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  건조  중량으로서  예를  들면  10mg~10g  이지만,  인유두종  바이러스  감염성  질환의  치료가  가능한  한,  이  범위에  한정되지  않는다.    입자지름이  약  174.2㎛의  사균화  유산균을  유효  성분으로  하는  경구  제제는,  1회당  투여량  1g으로  뛰어난  자궁경암  치료  효과를  발휘하고  있는  바,  본  발명의  경구  제제에  있어서는,  사균화  유산균  또는  그  미립화물의  입자지름을  2.68~30㎛로  함으로써,  세포성  면역의  유도능이  향상하고  있으므로,  1g을  밑도는  투여량(예를  들면,  그  1/2~1/10의  투여량)으로  동등한  자궁경암  치료  효과를  발휘하는  것을  기대할  수  있다.    본  발명의  경구  제제는,  반복  면역에  의한  표적  항원에  대한  세포성  면역의  증강을  위해  1~3일에  1회의  빈도로  1~4주간에  걸쳐  복수회  투여하는  것이  바람직하다.
  실시예
 이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 단순한 예시로서, 본 발명의 범위를 조금도 한정하는 것은 아니다.
 [참고예 1]
 이하의  실시예에서  사용한  사균화  유산균  제제의  제조  방법은  이하와  같다.    즉,  약학잡지(YAKUGAKU  ZASSHI)  129(11)  1327-1332  (2009)에  기재된  방법에  의해  HPV의  E7을  표면  발현한  유산균(락토바실러스  카제이)을  조제했다.    이  유산균을  일본특허  제4902845호에  기재한  방법을  이용하여  사균화함으로써  E7을  표면  발현하는  사균화  유산균을  얻었다.    당해  사균화  유산균을  동결  건조했다.    이  동결  건조한  사균화  유산균의  입자지름을  SEM에  의해  계측한  바,  입자지름이  30㎛였다.    이  동결  건조한  사균화  유산균에  과립화제로서  히프로멜로스  및  스테아린산마그네슘을  첨가하고,  과립화함으로써,  메디안  입자지름  174.2㎛의  과립제를  얻었다.
 [실시예 1]
  유산균 백신의 미립자화 1
 현행의 제제는 메디안 입자지름 174.2㎛의 과립제이지만, 이것을 미립화하기 위한 조건 검토를 실시했다.
 아시자와·파인테크사의  스타  밀(일반적으로는  비드  밀이라고  불린다)을  이용하여  분쇄  조건의  검토를  실시했다.    경시적으로  샘플링하여  입자지름을  측정한  바,  14.4~2.5㎛(메디안  지름)의  입자가  얻어지고,  최종적으로는  메디안  입자지름  0.12㎛의  미립자를  얻을  수  있었다(도  1).    미립자화  전후에서의  항원(E7)  단백량을,  샌드위치  ELISA로  측정한  바,  각각  4.0mg/파우더의  g  및  3.6mg/파우더의  g  이며,  미립화  공정에  의한  항원  단백에의  데미지는  거의  인지되지  않았다.
 이상으로부터, 항원 단백을 줄이는 일 없이, E7을 표면 발현하는 사균화 유산균을 미립화하는 것에 성공했다.
 또한, 메디안 입자지름은, LA950V2(호리바(HORIBA)사 제조)를 이용하고, 에탄올을 분산매로 하여 레이저 회절 산란법에 의해 측정했다.
 [실시예 2]
  유산균 백신의 미립자화 2
 실시예  1의  미립화에서는,  입자지름  174.2㎛의  과립제를  개시  시료로  했는데,  이것에는  과립화제로서  히프로멜로스  및  스테아린산마그네슘이  첨가되어  있다.    그래서,  첨가제를  포함하지  않는  유산균의  동결  건조품을  개시  시료로  하여  스타  밀에  의한  미립자화를  실시했다.    개시  시료의  메디안  입자지름은  30㎛  이고,  이것을  분쇄함으로써  9.17~0.49㎛(메디안  지름)의  여러  가지  사이즈의  사균화  유산균의  미립자를  얻을  수  있었다(도  2).    미립화물의  메디안  지름은  실시예  1과  마찬가지로  LA920(호리바사  제조)를  이용하여,  레이저  회절  산란법에  의해  측정했다.    또,  개시  시료의  메디안  지름은  SEM(주사형  전자현미경)에  의한  화상에  근거하여  계측했다.
 [실시예 3]
  M세포 투과성의 검토
 소장  페이에르판(Peyer's  patch)  M세포로부터의  흡수는  입자지름이  작아지면  현저하게  증가하는  것이  알려져  있다.    이것을  확인하기  위해,  Eur  J  Pharm  Sci  25:  455-465,  2005에  준하여  시험관내  M세포  모델을  이용한  투과성  시험을  실시했다(도  3).
 M세포  모델  구축의  확인,  및  입자지름에  의한  투과성  비교를  위해,  형광  표지한  마이크로스피어(입자지름  0.2,  0.5  및  1.0㎛)를  이용한  검토를  실시했다.    Caco-2  세포  단층  배양과  비교하여,  Caco-2  세포/Raji  세포의  공배양(M세포  모델)에서는  마이크로스피어의  투과성이  높아지는  것이  나타났고,  37℃에서의  투과성이  높아짐으로써  M세포의  트랜스사이토시스(transcytosis)에  의한  흡수가  나타난  것으로부터  M세포  양(樣)의  모델을  구축할  수  있었던  것이  확인되었다.    또,  이  모델을  이용한  입자지름에  의한  투과성  비교의  결과,  1㎛  미만의  입자지름에서는  투과성이  높아지는  경향이  시사되었다(도  4).
 마이크로스피어에  의한  검토  결과를  참고로  하여,  미립자화한  유산균을  이용하여  마찬가지의  실험을  실시했다.    우선,  과립제(메디안  입자지름  174.2㎛)와,  과립제로부터  미립자화한  시료(메디안  입자지름  0.12㎛)의  투과성  검토에서는,  0.12㎛의  미립자화한  시료의  투과성이  유의하게  높아지는  것이  확인되었다(도  5).
 다음으로,  과립제를  포함하지  않는  동결  건조  시료(30㎛)와  그것을  미립자화한  시료(2.68㎛,  0.77㎛,  0.49㎛)의  투과성  검토에서는,  174.2㎛,  30㎛의  큰  유산균  입자는  M세포  모델의  투과성은  낮고,  한편,  2.68㎛,  0.77㎛의  입자에  대해서는  M세포의  트랜스사이토시스에  의한  흡수에  의해  투과성이  높아지는  것이  확인되었다.    또한  0.49㎛  까지  미립자화하면,  현저한  투과성의  항진이  인지되었다(도  6).
 [실시예 4]
  생체내 면역 유도능 시험
 유산균  백신의  입자지름  및  투여  용량에  의한  면역  유도능에  대한  영향을  검증했다(도  7).    마우스에,  1,  2,  4,  8주째에  각  5회/주로,  E7을  표면  발현하는  사균화  유산균을  경구  투여했다.    9주째에  해부하여,  소장으로부터  IEL(장관  상피세포간림프구),  비장으로부터  비장  세포를  분리했다.    엘리스팟법(ELISpot  Assay)에  의해,  E7  자극시의  IFNγ  산생(産生)  세포수를  측정했다(도  8).    현행  제제(메디안  입자지름  174.2㎛)와  비교하여,  메디안  입자지름  30㎛  및  2.68㎛의  사균화  유산균(또는  그  미립화물)에  있어서  세포성  면역의  지표인  IFNγ  산생  세포수는  높은  값을  나타냈다.    한편,  메디안  입자지름  0.77  및  0.49㎛의  사균화  유산균의  미립화물에서는,  산생    세포수의  증가는  인지되지  않았다.
 M세포로부터의 흡수는 서브미크론 레벨에서 높아지는 것이 실증되어 있지만, 생체내에서의 면역 유도 시험에서 서브미크론 레벨로 미립자화한 유산균 백신에서 충분한 면역 유도가 확인되지 않았다.
  산업상의 이용가능성
 본 발명에 따르면, 표적 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균 또는 그 미립화물의 입자지름을 2.68~30㎛의 범위 내로 함으로써, 경구 투여시에 있어서의 당해 표적 항원에 대한 세포성 면역 유도능을 향상시킬 수 있으므로, 표적 항원을 표면 발현하는 사균화 유산균을 유효 성분으로 하는 경구 백신의 유효 투여량을 저감시킬 수 있다.
 본원은 일본에서 출원된 특원 2013-088800(출원일: 2013년 4월 19일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.