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1. WO2021060897 - NOVEL POCT DIAGNOSTIC SYSTEM FOR TRAUMATIC BRAIN INJURIES AND INFECTIOUS DISEASES

Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4   5   6   7  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

8  

과제 해결 수단

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34  

발명의 효과

35   36  

도면의 간단한 설명

37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56  

발명의 실시를 위한 형태

57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140   141   142   143   144   145   146   147   148   149   150   151   152   153   154   155   156   157   158   159   160   161   162   163   164   165   166   167   168   169   170   171   172   173   174   175   176   177   178   179   180   181   182   183   184   185   186   187   188   189   190   191   192   193   194   195   196   197   198   199   200   201   202   203   204   205   206   207   208   209   210   211   212   213   214   215   216   217   218   219   220   221   222   223   224   225   226   227   228   229   230   231   232   233   234   235   236   237   238   239   240   241   242   243   244   245   246   247   248   249   250   251   252   253   254   255   256   257   258   259   260   261  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26  

도면

1 (R91)   2 (R91)   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21  

명세서

발명의 명칭 : 새로운 외상성 뇌손상 및 감염병 POCT 진단시스템

기술분야

[1]
본 발명은 새로운 외상성 뇌손상 및 감염병 POCT 진단시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외상성 뇌손상을 신속하게 판별할 수 있으며, 높은 감도를 가짐에 따라 정확하게 외상성 뇌손상을 판정할 수 있는 외상성 뇌손상 및 감염병 POCT 진단시스템에 관한 것이다.

배경기술

[2]
체외진단(IVD)은 인체로부터 채취된 혈액, 소변, 세포 등의 대상물을 분석하여 건강 상태를 진단할 수 있게 하는 기술로서, 면역 진단, 자가 혈당 측정, 분자 진단 기술이 있다. 이중 면역 진단 기술은 질병의 원인이 되는 특정 단백질의 유무를 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 기초로 하여 매우 다양한 질환의 진단과 추적에 활용될 수 있다. 다만 면역 진단 기술은 타겟 단백질이 감지한계 이상의 농도로 존재하여야 진단이 가능한 단점이 있어, 낮은 농도의 단백질 발생신호를 증폭하기 위해 다양한 기술이 개발되어 왔다.
[3]
특히 최근에는 합성화학과 생명과학의 발전으로 신약개발 및 진단 등의 분야에 있어 분석될 표적물질이 다양화되고, 극미량의 표적물질을 검출하기 위해 고감도의 신호발생을 보장하는 검출방법들 중 하나로서, 자성 입자들을 이용하는 여러 가지 방법들이 보고되어 왔다.(Modern magnetic immunoassay: Biophysical and biochemical aspects (2017) Regul. Mech. Biosyst., 9(1), 47-55)
[4]
종래의 자성 입자를 이용한 면역진단은 나노미터 단위 크기의 자성입자를 사용하고 실리카로 표면을 개질된 것을 이용하여 왔다. 그런데 이러한 실리카 개질 표면을 갖는 자성 입자들은 면역 반응을 수행하는 웰 내부에서 효과적으로 추출하거나 방출하는데 어려움이 있다. 즉 이러한 작은 크기의 자성 입자는 용액 상태에서 흔히 부유하는 상태로 존재하여 분리하기가 용이하지 않아, 정량분석보다는 정성분석에 사용되는 경우가 많았다. 또한, 종래의 분석방법들은 한 번에 하나의 자성입자만을 검사할 수 있어서 시간이 오래 걸리고 검사가 복잡해지는 문제점이 있다.
[5]
또한 외상성 뇌손상(TBI, traumatic brain injury)은 외부충격으로 인해 뇌 조직이 손상을 입은 것을 말하며, 의식여부 정도(GCS, glasgow coma scale), 기억상실 정도(PTA, post-traumatic amnesia), 무의식 지속기간(LOC, loss of consciousness)을 확인하여, 상해 정도에 따라"mild", "moderate", "severe"로 구분할 수 있다. 그 중에서도 mild TBI(mTBI)는 TBI유형 중 가장 큰 비중을 차지하고 있고 mTBI로 의심되는 환자는 대부분 중소병원을 찾고 있는 것이 현실이나, mTBI를 진단하는 기술은 비싼 가격과 운영 전문인력이 필요하기 때문에 중소병원에서 진단하기 힘든 CT나 MRI가 유일한 방법으로 제시되고 있다. 더군다나 CT 또는 MRI의 경우, mTBI 환자의 10% 이하 정도만 발견이 가능해 위음성이 높고 환자에 대한 명확한 결과를 제공하지 못한다. 또한 진단 시간이 많이 소요되고 높은 비용이 들며, 방사선 노출 위험성을 감수해야 하는 단점을 지니고 있다.
[6]
따라서 더 정확하고 안전한 새로운 TBI진단 시스템이 필요하다. mTBI 진단은 긴급 상황에서 적용이 가능하도록 검사시간이 1시간 이내로 빠르고 정확해야하며, 적은 샘플로도 결과 도출이 가능해야 하고 고감도로 두 가지 또는 그 이상의 바이오마커(biomarker)를 동시 다중 검사할 수 있어야 한다. 또한 응급실 또는 중소형병원에서도 적용이 가능하도록 소형의 장비로 검사가 간편해야 하고 유지관리 비용이 적게 들어야 한다.
[7]
미국의 'Banyan Biomarker'사에서는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기술을 기반으로 한 혈액 진단 제품인 Banyan BTITM을 세계 최초로 출시하였다. 기존의 혈액 진단보다 결과가 정확한 것으로 알려져 있기는 하나, 검사시간이 3~4시간으로 길고 숙련자 및 고가의 장비가 필요하여 CT나 MRI와 같이 중소 병원에서는 사용하기가 불가능하고 또한 다중검지가 어렵다는 한계가 있다.

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[8]
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 외상성 뇌손상을 신속하게 판별할 수 있으며, 높은 감도를 가짐에 따라 정확하게 외상성 뇌손상을 판정할 수 있는 외상성 뇌손상 진단을 위한 자성입자, 그 제조방법 및 자성입자를 포함하는 외상성 뇌손상 POCT 진단시스템을 제공하고자 한다.

과제 해결 수단

[9]
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 외상성 뇌손상 또는 감염병 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자를 제공한다.
[10]
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 검출한계가 1pg/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상일 수 있다.
[11]
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것일 수 있다.
[12]
일 실시예에 있어서, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기일 수 있다.
[13]
일 실시예에 있어서, 상기 쉘의 표면은 1~80개/nm 2의 친수성 작용기를 가질 수 있다.
[14]
일 실시예에 있어서, 상기 포획 프로브는 상기 쉘 층의 표면의 친수성 작용기와 연결된 것일 수 있다.
[15]
일 실시예에 있어서, 상기 코어가 상기 자성입자 총 부피의 60% 이상인 것일 수 있다.
[16]
일 실시예에 있어서, 상기 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하인 것일 수 있다.
[17]
일 실시예에 있어서, 상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛인 것일 수 있다.
[18]
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다.
[19]
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것일 수 있다.
[20]
일 실시예에 있어서, 상기 자성입자는 마이크로로드의 형태를 갖는 것일 수 있다.
[21]
일 실시예에 있어서, 상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛일 수 있다.
[22]
일 실시예에 있어서, 상기 마이크로로드의 종횡비가 2 이상일 수 있다.
[23]
일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 생명체로부터 유래된 시료액 내의 바이오마커일 수 있다.
[24]
본 발명은 또한 (i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계; (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 단계; (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계; (iv) 상기 실란화합물의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및 (v) 상기 실란 화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계를 포함하는 생체물질 검출을 위한 자성입자 제조방법을 제공한다.
[25]
일 실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계는 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 6~24시간 침지하여 수행될 수 있다.
[26]
일 실시예에 있어서, 상기 산성용액은 황산과 과산화수소의 혼합용액일 수 있다.
[27]
본 발명은 또한 (1) 제1웰에 상기 자성입자를 제공하는 단계; (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계; (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법을 제공한다.
[28]
일 실시예에 있어서, 상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함하는 것일 수 있다.
[29]
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 자성입자들을 이용하여 다중검출하는 것일 수 있다.
[30]
일 실시예에 있어서, 상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 자성입자들을 판독하는 과정을 포함할 수 있다.
[31]
일 실시예에 있어서, 상기 제2웰 및 제3웰 사이에 2~10개의 세척웰을 구비하며, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 상기 세척웰이 순차적으로 침지하여 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
[32]
일 실시예에 있어서, 상기 세척 단계는 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시키는 단계일 수 있다.
[33]
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 진단시간이 30분 이내인 것일 수 있다.
[34]
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행되는 것일 수 있다.

발명의 효과

[35]
본 발명에 의한 외상성 뇌손상 및 감염병 POCT 진단시스템은 기존의 자성입자(특히 자성 비드)에 비하여 높은 자성을 가지고 있어 높은 효율로 자석을 이용한 혼합 또는 이동이 가능하며, 저렴한 가격으로 제조 가능함에 따라 기존의 자성입자를 이용한 진단장비에 비하여 저렴한 가격으로 동일한 진단이 가능하다.
[36]
또한 본 발명에 의한 외상성 뇌손상 및 감염병 POCT 진단시스템은 길이에 따라 상이한 포획 프로브를 결합시키는 것으로 다양한 바이오마커를 동시에 진단 가능하므로 본 발명에 의한 POCT(Point-Of-Care Test)진단방법을 사용하는 경우 빠른 시간내에 원하는 질환의 진단이 가능하다.

도면의 간단한 설명

[37]
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성입자 진단 시스템 및 진단 방법을 나타낸 공정 흐름도이다.
[38]
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드 제조 방법을 나타낸 것이다.
[39]
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 직경, 길이 등에 대한 현미경 상의 이미지이다.
[40]
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 화학표면 처리과정을 나타낸 것이다.
[41]
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성입자의 표면 처리에 따른 형광의 변화를 측정한 것으로 (a)는 산성용액을 이용하여 표면 처리하지 않은 자성입자, (b)는 산성용액을 이용하여 표면 처리한 자성입자를 각각 타나낸 사진이다.
[42]
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 표면을 기존의 자성비드의 표면과 비교하여 나타낸 것으로 (a)는 본 발명의 자성 마이크로로드의 표면 (b)는 본 발명의 자성 마이크로로드의 발광 개요, (c)는 기존의 자성 비드의 표면, (d)는 기존의 자성비드의 발광 개요를 각각 나타낸 것이다.
[43]
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 최적화 결과를 나타낸 것으로 (a)는 실란화 시간에 따른 발광의 변화 사진, (b)는 실란화 시간에 따른 실험결과 그래프를 각각 나타낸 것이다.
[44]
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 다중 검지기능을 수행하는 자성 마이크로로드의 길이 코딩 시스템의 일 예를 나타낸 것이다.
[45]
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드와 마커(항원)의 항원-항체 반응의 모식도를 나타낸 것이다.
[46]
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 자석 봉과 히팅 블록을 이용한 면역반응의 혼합 가열 및 세척과정을 나타낸 것이다.
[47]
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 초고감도 형광이미지 분석기기에 의해 검출된 이미지 및 형광 신호를 검출한 결과를 나타낸 것으로 (a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 이미지, (b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광이미지, (c)는 본 발명의 분석시스템에 의한 자성 마이크로로드의 형광이미지, (d)는 기존의 분석 시스템에 의한 형광이미지를 각각 나타낸 것이다.
[48]
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 마이크로로드의 길이 코딩 시스템을 이용하여 세 개 이상의 바이오 마커를 형광 이미지 검출 및 다중 분석한 결과를 나타낸 것이다.
[49]
도 13은 본 발명의 일 실시예에 의한 GFAP 농도 0~500pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
[50]
도 14는 본 발명의 일 실시예에 의한 GFAP 농도 0~500pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
[51]
도 15는 본 발명의 일 실시예에 의한 UCHL-1 농도 0~500pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
[52]
도 16은 본 발명의 일 실시예에 의한 UCHL-1 농도 0~500pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
[53]
도 17은 본 발명의 일 실시예에 의한 GFAP 농도 0~2.5pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
[54]
도 18은 본 발명의 일 실시예에 의한 GFAP(on 300㎛ 자성입자), UCHL-1(on 400㎛ 자성입자)의 다중검출을 수행한 결과를 나타낸 사진으로 (a)는 GFAP결과 (b)는 UCHL-1의 결과를 각각 나타낸 것이다.
[55]
도 19, 20는 본 발명의 일 실시예에 의한 IFN-γ 농도 0~1000pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
[56]
도 21은 본 발명의 일 실시예에 의한 IFN-γ 농도 0~2.5pg/ml에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.

발명의 실시를 위한 형태

[57]
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
[58]
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[59]
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
[60]
발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
[61]
한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
[62]
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
[63]
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
[64]
본 발명은 본 발명은 자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 외상성 뇌손상 또는 감염병 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자에 관한 것이다.
[65]
상기 코어부는 자석 반응 금속, 바람직하게는 자성금속 또는 자성금속과 합금이 된 금속을 포함할 수 있다. 상기 자성금속은 철 (Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn)을 포함한 합금일 수 있다. 상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트, 망간 등과 같은 전이금속을 주성분으로 하여 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 사마륨(Sm) 등과 같은 희토류 금속을 포함할 수 있고, 기타 붕소(B), 규소(Si), 탄소(C) 등을 포함할 수 있다. 상기 자석 반응 금속의 대표적인 예로서 철 합금 또는 코발트 합금을 들 수 있다. 구체적인 철 합금의 예로 Fe 70B 15Si 10C 5를 들 수 있고, 코발트 합금의 예로 Co 68Mn 7Si 10B 15를 들 수 있다. 또한 상기 자성금속은 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 철(Fe) 또는 백금(Pt)과 혼합되거나 합금되어 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 초상자성 금속을 포함할 수 있다. 상기 코어부는 자성을 직접 가지지는 않지만 자석이 접근함에 따라 자화되어 자석과 인력을 가질 수 있어 자석을 이용한 이동 및 혼합에 유용하게 사용될 수 있다. 다만 본 발명의 경우 강자성체가 아닌 상자성체를 사용하는 것이 바람직한데 이는 자석을 제거하는 경우 각 자성입자 사이의 자성인력이 발생하여 뭉치는 형상을 줄이기 위한 것으로 강자성체를 사용하는 경우 이러한 뭉침 현상으로 인하여 각 입자의 개별적인 형광관찰이 용이하지 않을 수 있다. 따라서 본원발명의 코어부는 강자성입자를 사용하는 것이 바람직하다. 아울러 상기 자성 입자는 영구자석이나 전자석과 같은 외부 자석에 의해 신속하게 수집되거나 분리될 수 있도록 수상에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것이 바람직하다.
[66]
상기 코어는 자성입자 총 부피의 60% 이상을 차지할 수 있다. 예를 들어 코어는 자성입자 총 부피의 60 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%일 수 있다. 또한 자성입자는 그 크기(예를 들어 직경 또는 길이)가 수십 내지 수백 ㎛ 정도일 수 있으며, 비중은 5 이상, 예를 들어 5이상 30이하인 것이 바람직하다. 자성입자(130)가 1 마이크로미터 미만의 크기를 갖는 나노입자일 경우 높은 비중을 가지는 입자(ex: 철의 경우 7.876)라 하더라도 수중에서 부유할 수 있다. 이 경우 자성입자를 이용하여 웰 내의 생체물질을 검출하는 바이오 어세이 과정에서 자장 인가 시 미세 입자의 낮은 자력으로 말미암아 상기 자성입자의 자성 제어가 원활하지 않아 분리에 어려움을 겪을 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 자석봉을 웰 내에서 상하 이동할 때 미세 입자들의 탈부착이 발생하는데, 자석봉이 상하 이동하는 과정에서 자석봉에 한번 부착된 자성입자들이 낮은 무게로 인하여 자기장을 제거하여도 웰 바닥으로 다시 떨어지지 않고 자석봉에 비특이적 결합으로 계속 잔존할 수 있다. 이 경우 웰 내 생체물질을 검출할 때 정량분석의 재현성이 저하될 수 있다.
[67]
한편, 본 자성입자는 중심부에 자석 반응 금속이 있고 그 주위를 둘러싼 쉘 층(shell layer)을 구비함으로써 코어-쉘 구조를 형성하는데, 쉘 층은 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유리(glass)이다.
[68]
상기 유리는 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 및 석영으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물이 주성분이 될 수 있다. 바람직하게는 내열성, 내산성, 내수성이 요구되는 실험용이며, 항체와 비특이적 결합이 최소화 될 수 있는 보로실리케이트일 수 있다.
[69]
상기 쉘 표면은 친수성 작용기를 포함할 수 있다.
[70]
상기 쉘 표면의 경우 여러 가지 작용기를 포함하여 후술할 포획 프로브와 결합될 수 있는데 상기 작용기는 친수성 작용기이며, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 작용기는 실라놀기 일 수 있다.
[71]
또한 상기 친수성 작용기는 상기 포획 프로브와 직접 결합할 수 있지만 바람직하게는 링커를 이용하여 결합될 수 있다. 상기 링커는 상기 친수성 작용기와 상기 포획 프로브 사이에 위치하여 포획 프로브가 상기 쉘 층에 용이하게 부착되도록 하는 것으로 바람직하게는 실란화합물, 더욱 바람직하게는 아미노-실란, 가장 바람직하게는 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, APTES)이 사용될 수 있다.
[72]
상기 실란화합물은 바람직하게는 H 2N-L-Si(OR) 3의 구조를 가질 수 있다. 이때 상기 L은 C 1 내지 C 12의 알킬렌 또는 C 6 내지 C 20의 아릴렌이거나 상기 알킬렌과 상기 아릴렌이 임의로 결합된 것이다. 또한 상기 L의 주쇄의 일부가 0 내지 4개의 -NH-로 치환될 수 있으며, 상기 R은 수소 또는 C 1 내지 C 8의 알킬이다.
[73]
상기 실란화합물은 바람직하게는 아미노-실란 일 수 있으며, 상기 아미노-실란의 구체적인 예로서, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane), 아미노실란 가수분해물(Aminosilane Hydrolysate), 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필트리에톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyltriethoxysilane), 2-아미노에틸-3-아미노프로필메틸다이메톡시실란(2-Aminoethyl-3-aminopropyl methyldimethoxysilane), 3-아미노프로필메틸다이에톡시실란(3-Aminopropylmethyldiethoxysilane), 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane), N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란(N-2-Aminoethyl-3-aminopropyltriethoxysilane), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(triethoxysilylpropyldiethylenetriamine), 비스(트리메톡시실리프로필)아민[Bis(trimethoxysilypropyl)amine], 및 비스(트리에톡시실리프로필)아민[Bis(triethoxysilypropyl)amine]으로이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 경제성을 고려하여 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTES)이 사용될 수 있다. 일 구현예에서 상기 아민 말단은 상기 포획 프로브와 용이하게 결합될 수 있도록 카복실기로 치환될 수 있다.
[74]
또한 상기 쉘 층은 자성입자를 실질적으로 완전히 둘러쌀 수도 있지만, 필요시 또는 제조 과정에서 미세 입자의 표면이 쉘 층으로 완전히 덮이지 않고 자성입자 표면의 일부 영역이 노출될 수도 있다.
[75]
상기 코어-쉘 구조는 코어 금속에 액상의 쉘 성분을 도포하여 형성되거나 중공형 틀에 코어 금속 성분을 충진하여 형성된 것일 수 있다.
[76]
쉘 층은 유기물 또는 무기물의 액상 코팅액으로부터 고화된 것 일 수 있다. 좀 더 구체적으로 쉘 층은 유기물 또는 무기물 형태의 쉘 성분을 고온에서 녹이거나 흐름성이 있게 만드는 방식 또는 용매 중에 녹이는 방식을 통해 액상 코팅액을 만든 후 코어 금속에 도포하여 형성될 수 있다. 상기 유기물은 주로 고분자일 수 있고, 상기 무기물은 금속 혹은 세라믹, 특히 유리일 수 있다. 예를 들어, 쉘 층을 형성하기 위해 플라스틱을 용매에 녹이거나 유리를 용융하여 얻은 코팅 액을 딥코팅, 스프레이코팅 등의 방식으로 자성입자에 도포할 수도 있다.
[77]
상기 자성입자는 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 포획 프로브는 외상성 뇌손상 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함할 수 있다.
[78]
중소병원에서 기존의 TBI 진단을 위한 ELISA 장비 또는 CT 장비를 구비하고 있는 경우가 많지 않다. 만약 이러한 장비를 구비하고 있다고 하더라도, ELISA를 이용한 TBI 진단 방법의 경우 평균 2 ~ 3일의 진단 시간이 소요되어 적절한 치료가 이루어지기 어렵다. CT 또는 MRI를 이용한 TBI 진단 방법의 경우 평균 5시간의 진단 시간이 소요되나, 정확도로 약 10%로 매우 낮아 TBI의 정확한 진단이 어렵다. 반면 본 발명의 TBI 진단 시스템의 경우, 중소병원에 적용 가능한 소형 장비로 인적, 공간적 비용이 적게 소요된다. 또한, 평균 20~30분의 진단 시간이 소요되고 약 98%로 매우 높은 정확도를 나타내고 있어 TBI의 신속하고 정확한 진단을 수행하는 데 매우 유용하다.
[79]
도 1은 본 발명의 TBI 진단 시스템 및 진단 방법을 나타낸 공정 흐름도이다. 본 발명에서 TBI 바이오마커와 특이적으로 결합될 수 있는 제 1 항체는 표면 개질된 자성입자에 고정된다. 상기 자성입자는 자성 금속을 유리로 코팅한 구조의 비구형/비대칭 미립자의 보다 개량된 형태로, 길이로 구별이 가능한 상태로 구성된다. 상기 자성입자의 제 1 항체와 TBI 바이오마커는 면역반응을 일으킬 수 있으며, 이러한 면역반응의 결합과정은 직접 관측될 수 없기 때문에 측정 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 표지물질로 제 2 항체-표지자 복합체를 사용할 수 있으며, 제 2 항체는 TBI 바이오마커에 특이적으로 결합될 수 있는 항체이고, 표지자는 일반적으로 형광물질이나 효소를 포함할 수 있다.
[80]
또한 본 발명의 자성입자의 경우 감염병 진단에도 적용할 수 있다. 감염병은 인세의 세포가 아닌 외래의 병원체에 의하여 발생하는 것으로 상기와 같은 감염병이 발생하게 되면 인체는 이에 대항하기 위한 항체를 생산하게 된다. 효율적인 항체 생산을 위해 IL-10, IFN-γ(인터페론 감마) 등의 사이토카인을 분비하게 된다. 따라서 이러한 사이토카인이나 병원체를 바이오마커로서 이용하며, 상기 병원체에 대한 항체를 포획 프로브로 사용하는 경우 상기 TBI와 동일한 방법을 통하여 진단할 수 있다. 특히 감염병의 경우 그 증상의 발현이 매우 빠르며 인체에 치명적인 증상을 가지는 경우가 있으며, 이때에는 빠른 진단 및 처치를 필요로 한다. 하지만 기존의 감염병 진단은 증상의 발현을 관찰하여 1차 진단을 수행하며, 이후 현미경 관찰이나 PCR과 작은 세포분석학적 진단을 통하여 최종 진단하고 있다. 하지만 이러한 진단방법은 진단완료까지 상당한 시간이 소요되어 환자에게 적절한 처치를 수행하지 못하는 경우도 발생하고 있다. 따라서 본 발명의 자성입자를 이용하는 경우 다종의 감염병을 동시에 높은 정확도로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 빠른 시간내에 정확한 감염병을 확인할 수 있어 환자에게 적절한 처치를 할 수 있다.
[81]
이때 상기 병원체는 세균, 스피로헤타, 리케차, 바이러스, 진균, 기생충 등을 포함할 수 있으며, 상기 병원체를 그대로 바이오마커로서 사용할 수도 있지만, 상기 병원체의 조직 추출물, 세포 용해물, 단백질, DNA, RNA 등을 바이오마커로서 사용할 수도 있다. 또한 상기 병원체가 침입하는 경우 인체에서는 항원-항체 반응을 수행하므로 상기 병원체에 대한 항체를 바이오마커로서 사용하는 것도 가능하다.
[82]
본 발명의 자성입자는 표면 균일도가 매우 뛰어나다. 종래 바이오 어세이용 입자의 경우, 쉘 층을 형성하기 위해 TEOS와 같은 실리카 전구체를 이용하여 코어 입자 표면 위에 성장시키는데, 이 경우 쉘 층은 매우 거친 표면을 갖게 된다. 그리하여 검출대상 물질의 비특이적 결합이 많이 발생할 수 있다. 이는 불필요한 백그라운드 노이즈를 발생시키는 원인이 될 수 있다.
[83]
또한 상기와 같이 굴곡이나 돌기가 없는 쉘 층을 형성하기 위하여 상기 쉘 층은 산성물질, 바람직하게는 강산과 과산화수소의 혼합물로 표면 처리될 수 있다. 상기 강산과 과산화수소의 혼합물은 일명 피라냐 용액(Piranha solution)으로 명명되고 사용되는 것으로 일반적으로는 황산과 과산화수소를 3:1~7:1의 비율로 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 강산과 과산화수소의 혼합물은 강력한 산화력을 가지는 용액으로 상기 쉘 층 상에 존재하는 이물질을 산화시켜 제거함과 동시에 쉘 층의 표면에 형성된 돌기를 식각하여 제거함으로서 표면조도를 최소화하여 원하지 않은 형광물질의 부착을 막을 수 있다. 또한 상기 산성물질은 상기 쉘 층의 표면에 친수성 작용기를 형성하여 전술한 링커 또는 포획 프로브가 용이하게 결합될 수 있도록 할 수 있다.
[84]
이를 통하여, 상기 쉘의 표면에는 1~80개/nm 2의 친수성 작용기가 도입될 수 있다.
[85]
상기 링커 또는 포획 프로브의 경우 쉘 층의 친수성 작용기과 결합하여 상기 자성입자에 부착되므로, 상기 친수성 작용기의 수에 따라 결합 가능한 링커 또는 포획 프로브의 수가 정해질 수 있다. 따라서 상기 자성입자의 표면에 다수개의 친수성 작용기를 형성하는 경우 많은 양의 링커 또는 프로브를 상기 자성입자의 표면에 부착시키는 것이 가능하다(도 5). 이때 상기 친수성 작용기의 밀도가 1개/nm 2 미만인 경우 형광 측정시 낮은 형광을 보임에 따라 측정이 어려울 수 있으며, 상기 친수성 작용기의 밀도가 80개/nm 2를 초과하는 경우 프로브의 결합시 프로브 사이의 간섭으로 인하여 더 이상의 형광의 증대는 없을 수 있다.
[86]
또한 상기 포획 프로브는 상기 실라놀에 직접 결합되는 경우 1~80개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다. 다만 도 4에 나타난 바와 같이 상기 링커는 상기 실라놀 3개의 분자와 결합하고 있으므로 링커를 이용하여 상기 포획 프로브가 결합되는 경우 1~30개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다.
[87]
상기 쉘 층의 표면은 산성물질을 이용하여 표면 처리될 수 있다. 상기 쉘 층이 유리로 제작되는 경우 유리 표면에 존재하는 친수성 작용기인 실라놀기가 상기 프로브와 결합될 수 있다. 하지만 이 경우 소수의 포획 프로브만이 상기 쉘 층의 표면에 부착될 수 있어 형광 분석시 형광의 강도가 낮아질 수 있다. 따라서 본원 발명에서는 상기 산성물질로서 바람직하게는 황산과 과산화수소수의 혼합물인 피라냐 용액을 이용하여 쉘 층의 표면에 친수성 작용기를 형성할 수 있다. 이때 상기 산성물질에 의하여 형성된 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기, 또는 알데히드기 등일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 친수성 작용기는 실라놀기일 수 있다.
[88]
이때 상기 친수성 작용기를 형성하는 방법은 산소플라즈마 처리, 코로나 처리, UV오존처리와 같은 건식 방법을 이용할 수도 있지만, 자성 마이크로로드의 표면에 일정하게 친수성 작용기를 형성할 수 있으면서도 자성의 영향을 받지 않는 산성 물질을 이용한 습식처리를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 즉 본원 발명의 경우 산성물질 특히 피라냐 용액을 이용한 산화적 친수화처리를 하는 것으로 상기 프로브가 결합될 수 있는 반응점(친수성 작용기)을 크게 늘릴 수 있으며, 이에 따라 형광 분석이 형광의 강도를 더욱 강하게 할 수 있다(도 5 참조).
[89]
반면 본 발명의 쉘 층을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)이 거의 없다. 특히 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 자성입자는 액상의 성분으로부터 유래된 코팅 층을 쉘 층)으로 가지고 있으므로 매우 균일한 표면을 갖는다. 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하, 바람직하게는 10nm 이하, 더 바람직하게는 5nm이하, 더욱 바람직하게는 2nm 이하, 특히 1.5nm 이하일 수 있다. 또한 Ra는 예를 들어 3nm 이상, 2nm 이상, 1nm 이상일 수 있다. 상기 표면 거칠기가 15nm를 초과하는 경우 쉘 층의 표면에 형광물질의 비특이적 흡착이 늘어남에 따라 형광 관찰시 노이즈가 커질 수 있다.
[90]
상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛, 바람직하게는 1 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 1 내지 10㎛, 가장 바람직하게는 4 내지 8㎛일 수 있다. 쉘 층의 두께가 상기 범위 미만에서는 쉘 층의 표면이 부서지거나 크랙이 쉽게 발생 될 수 있고, 상기 범위 초과에서는 글라스 절단 가공시 레이저 특성 및 파장에 따른 문제가 발생할 수 있다.
[91]
상기 자성입자는 검출한계가 1pg/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상일 수 있다. 상기 자성입자를 이용하여 형광분석을 수행하는 경우 도 17에 나타난 바와 같이 0.625pg/ml의 농도에서도 분석이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 자성입자는 검출한계가 1pg/ml 이하, 바람직하게는 0.7pg/ml 이하, 가장 바람직하게는 0.625pg/ml 이하일 수 있다. 또한 상기 검출한계는 예를 들어 0.001pg/ml이상, 0.01pg/ml이상 또는 0.1pg/ml이상일 수 있다. 도 19, 20에 나타난 바와 같이 동적범위가 log3이상, 바람직하게는 log5 이상의 범위를 가질 수 있다. 예를 들어 상기 동적범위는 log3~10의 범위를 가질 수 있으며, 바람직하게는 log 5~7의 범위를 가질 수 있다. 또한 도 14 및 도 16에 나타난 바와 같이, 0~500pg/ml의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계를 가지는 것으로 나타났다(결정계수 R 2값 : 0.9895). 따라서 본원 발명의 자성입자를 시용하는 경우 기존의 자성입자에 비하여 감도가 약 40배로 증가하며, 최적화시 약 100배 이상의 감도를 가질 수 있다.
[92]
상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것일 수 있다. 이 경우 각 길이에 따라 상기 자성입자는 상이한 포획 프로브와 결합될 수 있다(도 8). 이를 이용하면 각 포획 프로브에 따라 상이한 길이의 형광을 발생하게 되므로 2종 이상의 바이오마커를 동시에 진단할 수 있다. 이를 위하여 상기 자성입자는 5~200㎛의 길이 차이를 가지는 2~20종의 자성입자를 혼합하여 사용할 수 있다. 다양한 길이를 가지는 자성입자를 사용하는 것으로 2~20종의 바이오마커를 동시에 검출가능하다. 이때 상기 각 자성입자의 길이 차이가 5㎛미만인 경우 광학장비를 이용하여 길이 차이를 식별하기 어려우며, 200㎛를 초과하는 경우 식별은 용이하지만 다종의 자성입자를 사용하는 것이 어려워 다종의 바이오마커를 동시에 식별하기 어렵다.
[93]
일예로서 300㎛의 길이를 가지는 자성입자의 표면에 GFAP과 항체-항원 반응을 하는 항체를 포획 프로브로 결합하고 400㎛의 길이를 가지는 자성입자의 표면에 UCHL-1과 항체-항원 반응을 하는 항체를 포획 프로브로 결합할 수 있다. 상기 두 가지의 자성물질을 혼합하여 사용하는 경우 상기 자성물질은 동일한 형광을 발생하지만 자성물질의 길이 차이로 인하여 상기 바이오마커가 GFAP인지(형광길이 300㎛), UCHL-1인지(형광길이 400㎛)를 판독할 수 있으며, 이는 PCR등 유전자확인을 통한 방법을 통하지 않고도 단순히 광학적인 관찰을 통하여 바이오마커의 종류를 정확하게 판정할 수 있다는 것이다.
[94]
이를 확장하여 각기 다른 길이를 가지는 10종의 자성입자에 각각의 포획 프로브를 결합하고 이를 혼합하여 사용하는 경우 10종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다는 것을 의미한다. 다만 상기 각각 다른 길이를 가지는 자성입자가 20종을 넘는 경우 각 자성입자의 수량이 부족하여 적절한 형광을 나타나지 못할 수 있으며, 충분한 형광을 나타내기 위해서는 많은 양의 자성입자를 투입해야 하므로 효율이 떨어질 수 있다.
[95]
상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다. 유리가 코팅된 금속 미세와이어를 레이저로 단순히 절단함으로써 다양한 길이를 갖는 자성입자를 용이하게 얻을 수 있다.
[96]
상기 자성입자는 막대형, 평판형, 구형 등과 같은 정형적인 형태나 비정형적인 형태를 포함한 다양한 형태를 가질 수 있다. 자성입자가 평판 형태를 가질 경우에도 단면은 별형, 다각형, 원형 등의 다양한 모양을 가질 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 자성입자는 제조의 편이성과 관찰의 용이성으로 마이크로로드(microrod), 마이크로디스크(microdisc), 또는 마이크로비드(microbead) 형태인 것이 바람직하며, 특히 마이크로로드의 형태를 갖는 것이 바람직하다. 자성입자가 마이크로로드의 형태를 가질 경우 자성입자들 간의 겹침에 의한 구분이 용이하고, 웰 내에 배치될 경우 포커싱이 쉬우며, 개별입자가 차지하는 면적이 적어 하나의 관찰화면에 다수의 미세 입자들을 관찰할 수 있다. 한편 자성입자가 별 모양과 같이 단면이 복잡한 구조를 갖는 형상을 가질 경우 웰 내부에서 움직이는 과정에서 서로 간 또는 벽과의 충돌에 의하여 모서리 부분의 깨짐이 발생할 수 있으므로 마이크로로드와 같이 단순한 형태를 갖는 것이 더욱 유리하다.
[97]
상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛일 수 있다. 상기 마이크로로드의 길이가 상기 범위 미만에서는 서로 다른 길이의 입자간의 구분이 쉽지 않고 입자의 크기가 작아짐에 따라 자성이 줄어들게 되어 자석에 의한 혼합, 세척 및 이동이 용이하지 않을 수 있다. 또한, 상기 범위 초과에서는 입자들의 겹침이 발생할 수 있어 관찰이 용이하지 않으며, 하나의 웰에 원하는 양의 자성입자를 넣기 어려워 원활한 진단이 어려울 수 있다. 또한, 상기 마이크로로드의 직경 대비 길이의 비(종횡비)는 2 이상, 5 이상 또는 10이상일 수 있으며 상기 종횡비는 바람직하게는 20이하일 수 있다. 종횡비가 2미만인 경우 구형의 미립자와 유사하여 서로 구별하기가 어려울 수 있으며 종횡비가 20을 초과하는 경우 자성입자의 직경이 줄어듦에 따라 상대적으로 자성을 가지는 코어부가 얇아지고 이에 따라 자성이 약해질 수 있다. 또한 종횡비가 20을 초과하는 경우에는 얇은 직경을 가짐에 따라 내구성이 저하되어 검사중 자성입자가 부러지는 현상이 발생할 수 있다.
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상술한 자성입자는 생명체로부터 유래된 특정 시료액 내의 생체물질을 검출하는 체외진단용으로 적합하게 사용될 수 있다. 상기 시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 신속 진단을 위해 상기 시료액의 전처리는 간소화되거나 경우에 따라서 생략될 수 있다.
[99]
상기 생체물질은 바이오마커, 혈액, 혈장, 혈청, 체액, 단백질, 펩타이드, 핵산, 박테리아, 바이러스, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 생체물질은 바이오마커일 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술은 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기 진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하다. 상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있다. 구체적으로 상기 바이오마커는 외상성 뇌손상이 있는 경우 그 혈중 농도가 증가하는 바이오마커라면 제한없이 사용할 수 있지만 바람직하게는 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein), UCHL-1(Ubiquitin C- terminal Hydrolase-1), S100, Tau protein 등을 포함할 수 있다. 상기 바이오마커는 일반적인 외상성 뇌손상(TBI, traumatic brain injury)뿐만 아니라 경미한 뇌손상인 mild TBI(mTBI)에도 증가하는 경향을 나타내는 것으로 알려져 있으므로 증상이 명확한 중증의 환자뿐만 아니라 경증의 환자까지도 본 발명의 자성입자를 이용하여 진단할 수 있다.
[100]
시료액 내의 상기 생체물질을 포획하기 위해 본 발명의 일 구현예에 따른 자성입자는 쉘 층 위에 포획 프로브가 도입될 수 있다. 포획 프로브는 상기 생체물질과 특이적으로 결합하여 상기 생체물질을 자성입자에 포획시키는 역할을 한다. 포획 프로브는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 포획항체일 수 있다. 포획 프로브는 자성입자의 표면에 흡착시키거나 화학적으로 연결시켜 고정시킬 수 있으며, 바람직하게는 쉘 층의 표면에 존재하는 친수성 작용기와 연결될 수 있다. 예를 들어 포획 프로브의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 자성입자에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 포획 프로브를 자성입자에 부착시킬 수 있다. 이때 자성입자 표면의 친수성 작용기를 이용하여 포획 프로브를 자성입자에 연결시킬 수 있다.
[101]
이때 상기 친수성 작용기는 상기 포획 프로브와 직접 결합될 수도 있지만 바람직하게는 링커를 이용하여 결합될 수 있다. 상기 링커는 실란화합물일 수 있으며 이는 위에서 살펴본 바와 같다(도 4 참조).
[102]
[103]
이하 본 발명을 자성입자의 제조방법을 통하여 상세하게 설명한다.
[104]
본 발명은 또한 (i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계; (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 표면 처리하는 단계; (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계; (iv) 상기 실란의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및 (v) 상기 실란화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계를 포함하는 생체물질 검출을 위한 자성입자 제조방법에 관한 것이다.
[105]
[106]
단계 (i)에서 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비한다.
[107]
상기 (i)단계는 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계로 상기 자성 마이크로로드는 금속 분말을 유리튜브에 충진한 다음, 이를 가열조건하에서 인발하여 유리가 코팅된 미세와이어를 제작하며 이를 일정한 길이로 절단하여 자성 마이크로로드를 제조하는 과정을 거칠 수 있다(도 2 참조). 이러한 과정은 Talyor-Ulitovsky 테크닉을 기반으로 하는 바, 예를 들면 WO1993/005904 A2 등에 기본적인 원리가 기재되어 있다. 상기 문헌은 본 발명의 참고자료로 사용될 수 있다.
[108]
상기 유리로 코팅된 미세와이어 제조방법을 상세히 살펴보면 유리 튜브 내에 금속(자성입자)을 충진하고 이를 가열수단에 의하여 가열되는 가열부에 위치하게 된다. 이때 상기 금속은 금속 분말이거나 용융되어 금속을 형성하는 화합물일 수 있으며, 용융된 금속을 직접 주입하는 것도 가능하다. 또한 상기 금속 분말을 사용하는 경우 상기 금속분말은 평균입경이 40~300㎛, 바람직하게는 50~200㎛, 더욱 바람직하게는 70~150㎛일 수 있다. 상기 금속분말의 평균입경이 40㎛미만인 경우 작업시 공기중으로 비산될 수 있음과 더불어 분말의 가격이 높아져 전체적인 제조비용이 증가할 수 있으며, 300㎛를 초과하는 금속 분말을 사용하는 경우 상기 유리 튜브로의 이송이 원활하지 않아 제작되는 미세와이어 내부에 금속이 존재하지 않는 빈공간이 생겨 불량이 발생할 수 있다(도 3).
[109]
또한 사용되는 유리 튜브는 내경이 0.2~2mm, 바람직하게는 0.3~1.5mm, 더욱 바람직하게는 0.5~1mm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유리튜브의 내경이 0.2mm미만인 경우 코어부를 구성하는 상기 금속의 주입이 원활하지 않을 수 있으며, 2mm를 초과하는 경우 코어부의 상대적인 직경이 증가하게 되어 인발시 유리 쉘 층의 두께가 얇아질 수 있으며 이에 따라 내구성이 떨어지거나 표면에 굴곡 또는 돌기가 발생할 수 있다(도 3).
[110]
상기 유리 튜브의 재질은, 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 또는 석영일 수 있으며 이와는 별도로 주성분으로 산화납, 이산화텔루륨 또는 실리카를 함유하는 유리를 튜브형으로 가공하여 사용할 수 있다. 또한 상기 유리의 연화점은 약 1,000 내지 1,900℃, 바람직하게는 약 1,100 내지 1,700℃ 범위일 수 있다. 상기 유리의 연화점이 1,000℃ 미만인 경우 상기 금속분말이 용융되기 이전에 유리 튜브가 연화되어 불량이 발생할 수 있으며, 1,900℃를 초과하는 연화온도를 가지는 경우 가열에 많은 시간과 비용이 필요하여 경제성이 떨어질 수 있다.
[111]
또한 쉘 층을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)이 거의 없어 노이즈를 최소화 할 수 있다.
[112]
또한 상기 금속의 경우 상기 유리튜브의 연화점보다 낮은 용융온도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 금속의 용융온도가 상기 유리의 연화점보다 높은 온도를 가지는 경우 인발과정에서 용융되지 못하고 금속 분말이 그대로 유리튜브 사이에 위치하게 되며, 이는 사용시 금속분말의 외부유출이 가능하여 자성입자의 수명을 떨어트릴 뿐만 아니라 이물질로 인한 오염을 발생시킬 수 있다.
[113]
한편 상기 가열수단은 상기 유리튜브의 하측부위 또는 이와 인접한 위치에 배치될 수 있으며, 상기 유리튜브를 인발할 수 있는 연화점까지 상기 유리튜브를 가열하게 된다.
[114]
상기와 같이 가열되는 동안 상기 금속 분말은 액적을 형성하게 되며, 상기 금속 분말에 인접해있는 유리 튜브는 연화되어 상기 금속분말이 형성한 액적을 둘러싸게 된다. 구체적으로는 상기 유리 튜브 내에 충진된 금속 분말은 용융됨과 동시에 상기 유리튜브가 연화되어 인발되므로, 상기 자성입자 코어부를 상기 유리가 코팅하는 형태로 인발되게 된다.
[115]
상기 가열수단은 예를 들면 당업계에서 알려진 인덕션 가열 장치, 구체적으로 인덕터일 수 있다. 예시적으로, 인덕터는 나선형의 코일(예를 들면, 구리 재질)이 감겨져 있는 바, 구체적으로 상기 코일 내부에 가열 영역을 형성할 수 있다. 코일의 수는 원하는 용융 금속의 높이 등을 고려하여 선택될 수 있다. 이때, 가열 영역은 요구 주파수에서 자기장에 의하여 생성된 에디-전류 손실에 의하여 가열된다. 또한, 가열수단은 고주파 인덕터일 수 있는 바, 이때 주파수는 예를 들면 약 0.5 내지 800 kHz, 구체적으로 약 10 내지 500 kHz 범위일 수 있으나, 이는 한정되는 것은 아니다.
[116]
상기 가열영역내의 온도는 상기 유리 튜브를 연화할 수 있는 온도인 1,000~2,000℃인 것이 바람직하며, 상기 유리 튜브의 재질, 자성입자 코어부를 구성하는 금속의 종류 등에 따라 변경하여 사용할 수 있다.
[117]
상기 유리튜브 내에 충진되는 자성입자는 위에서 살펴본 바와 같이, 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 철(Fe) 또는 백금(Pt)을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 초상자성 금속을 포함할 수 있다.
[118]
이와 관련하여, 자성 금속의 대표적인 예로서 코발트 합금 또는 철-풍부 합금을 들 수 있다. 특정 예에서는, 자성 금속 내에 구리를 소량(예를 들면, 약 5 원자%까지, 구체적으로 약 3 원자%까지) 첨가 또는 혼입하여 핵생성 중심의 개수를 증가시키고 나노결정화를 촉진할 수도 있다.
[119]
상기와 같이 가열과정이 끝나면, 유리 튜브 내부에 미세와이어의 코어를 구성하는 금속의 용융물이 유리 모세관을 충진하면서 인발된다.
[120]
또한 상기 인발과정 중 상기 유리 튜브 내부는 비활성 가스, 예를 들면 헬륜, 네온, 아르곤, 질소 가스 분위기일 수 있다. 상기와 같이 유리튜브를 불활성 가스 분위기로 치환하게되면 상기 자성입자의 용융에 의한 산화를 방지할 수 있다.
[121]
상기와 같은 인발 과정을 통하여 금속 코어가 글라스에 의하여 실질적으로 완전히 코팅되어 있는 미세와이어를 형성할 수 있으며, 인발된 미세와이어는 가열 수단 후단에 배치된 냉각 수단에 의하여 냉각되면서 고상화될 수 있다.
[122]
상기 냉각수단은 상기 미세와이어를 냉각할 수 있는 장치라면 제한없이 사용할 수 있지만, 냉각제에 상기 미세와이어를 침지하여 냉각하는 방식을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 냉각제는 물, 오일 또는 각종 냉매를 사용할 수 있지만 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.
[123]
상술한 바와 같이 고형화된 미세와이어는 시스템 내에 장착된 권취 장치에 의하여 회수된다. 이때 상기 권취 장치는 코일 형상, 구체적으로 와이어 보빈(wire bobbin) 타입일 수 있다.
[124]
글라스-코팅 금속 미세와이어에 있어서, 코어 금속의 직경은, 30~100㎛, 바람직하게는 40~80㎛, 더욱 바람직하게는 50~70㎛ 범위일 수 있다. 또한, 유리 코팅(쉘 층)의 두께는, 3~50㎛, 바람직하게는 5~20㎛, 더욱 바람직하게는 7~15㎛ 범위일 수 있다. 또한, 전체 미세와이어의 직경은, 예를 들면 약 30~120㎛, 바람직하게는 30~100㎛, 더욱 바람직하게는 40~80㎛ 범위 내에서 선택될 수 있다.
[125]
이와 같이 제조된 자성물질을 포함하는 미세와이어는 권취 장치 상에 1~15 km, 바람직하게는 5~10km의 길이로 연속 제조되어 권취된 형태로 패키징될 수 있으며, 후술하는 바와 같이 비구형 마이크로로드 제조에 사용될 수 있다.
[126]
상기와 같이 제조된 미세와이어는 이를 일정 길이로 절단하여 비구형의 자성 마이크로로드를 제작할 수 있다. 이를 상세히 살펴보면 복수 개의 미세와이어를 횡 방향으로(예를 들면, 평행하게) 배열하고, 소정의 길이로 절단하여 비구형/비대칭 미립자를 대량으로 제조할 수 있는 장점을 제공하는 바, 이를 위하여 비접촉식 레이저를 이용한 절단 방식을 채택한다.
[127]
이러한 절단 방법은 구체적으로 대한민국 공개특허 제2018-0130436호에 나타난 방법을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 복수 개의 그루브가 횡 방향으로 배열되어 있는 와이어 홀더의 그루브 내에 상기 글라스-코팅 금속 미세와이어의 적어도 하나를 위치시키는 단계; 및 상기 와이어 홀더에 위치하는 적어도 하나의 글라스-코팅 금속 미세와이어를 소정의 간격을 두고 가로지르는(traverse) 방향으로 상기 글라스-코팅 금속 미세와이어의 열 전파 시간보다 짧은 펄스 폭을 갖는 레이저를 이용한 비접촉 방식의 가공에 의하여 절단하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
[128]
상기와 같은 방법으로 제조된 자성 마이크로로드는 표면을 매끄럽게 만들기 위하여 강산 및 과산화수소의 혼합물로 구성된 혼합용액을 이용하여 표면 처리를 수행한다. 이 과정 이전 표면에 존재하는 이물질을 제거하기 위한 세척과정을 추가로 포함할 수 있다.
[129]
상기 세척과정은 다양한 유기용매를 이용하여 수행될 수 있으며 그 과정을 구체적으로 살펴보면 제작된 자성입자(자성 마이크로로드)를 유기용매를 이용하여 세척한 다음 에탄올을 이용하여 유기용매를 제거한다. 이때 사용되는 유기용매는 아세톤인 것이 바람직하다. 유기용매 처리가 끝난 다음, 상기 자성입자를 산처리 할 수 있다. 상기 산은 황산을 사용하는 것이 바람직하며, 산처리가 완료된 이후 물과 에탄올의 혼합물을 이용하여 세정한다. 산처리가 완료된 자성입자는 염기처리를 수행하게 되는데 이때 사용되는 염기는 수산화나트륨이며, 물과 에탄올의 혼합용매에 수산화나트륨을 용해하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 염기 처리가 완료된 이후에는 물과 에탄올을 이용하여 세척하는 것이 바람직하다.
[130]
[131]
단계 (ii)에서, 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성한다.
[132]
예를 들어, 상기와 같은 세척과정이 끝난 이후 상기 자성입자는 산성용액을 이용하여 표면 처리할 수 있다.
[133]
바람직하게는 상기 산성 용액은 강산과 과산화수소의 혼합물일 수 있으며, 예를 들어 피라냐(pyranha) 용액일 수 있다. 상기 피라냐 용액은 일반적으로 황산과 과산화수소의 혼합물을 의미하는 것으로 각기 다른 비율로 혼합되어 사용되고 있지만 모두 피라냐 용액으로 불리고 있다. 전형적인 피라냐 용액은 황산:과산화수소의 부피비가 3:1~7:1의 용액을 의미한다. 이와는 별도로 베이스 피라냐 용액이라 불리는 암모니아수와 과산화수소의 혼합물로 사용되고 있다.
[134]
본 발명에서 상기 산성용액은 상기 강산과 상기 과산화수소를 1:1~7:1의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2:1~5:1, 가장 바람직하게는 3:1의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비율이 1:1미만 즉 과산화수소의 함량이 상기 강산보다 많은 경우 산성용액의 제조시 많은 발열 및 가스가 발생하여 폭발할 가능성이 높으며, 7:1을 초과하는 비율에서는 피라냐 용액에 의한 산화가 원활하지 못하여 실라놀기의 형성이 용이하지 않을 수 있다. 또한 이때 사용되는 과산화수소는 10~50부피%의 용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20~40부피%, 더욱 바람직하게는 30부피%의 과산화수소용액을 사용할 수 있다. 상기 10부피% 미만의 과산화수소용액을 사용하는 경우 피라냐 용액을 이용한 산화가 원활하지 못하여 실라놀기의 형성이 용이하지 않을 수 있으며, 50부피%를 초과하는 용액을 사용하는 경우 산성용액의 제조시 많은 발열 및 가스가 발생하여 폭발할 가능성이 있다.
[135]
상기 피라냐 용액은 부식성이 매우 높고 강력한 산화제이므로 취급에 주의를 해야 한다. 상기 피라냐 용액을 사용하기 이전 대상물의 표면의 이물질은 완전히 세척되어야 하며, 세척에 사용된 용매 역시 제거되어야 한다. 상기 피라냐 용액은 유기오염물을 용해하여 제거할 수 있지만 다량의 오염물 또는 세척용 용매는 격렬하게 거품을 발생시키거나 폭발적인 반응을 일으켜 다량의 가스를 방출할 수 있다.
[136]
이러한 피라냐 용액을 제조시 황산에 과산화수소를 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 과산화수소에 황산을 첨가하는 경우 다량의 가스가 발생하며, 폭발할 가능성이 있기 때문에 황산에 과산화수소를 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 또한 황성에 과산화수소를 첨가하는 경우에도 격렬한 발열반응이 수행되므로 적절한 냉각을 수행하여 온도를 낮추는 것이 바람직하다. 또한 이러한 격렬한 반응을 제어하기 위하여 상기 과산화수소는 50부피%이하의 함량을 가지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30부피%의 함량을 가질 수 있다.
[137]
이렇게 제조된 피라냐 용액은 금속 표면 또는 유리 표면을 산화시킬 수 있으며, 특히 유리의 경우 표면의 이물질과 원하지 않게 생성된 돌기를 산화시켜 제거함과 동시에 유리표면을 친수화하여 다량의 실라놀기를 형성할 수 있다.
[138]
이때 상기 산성 용액은 상기 자성 마이크로로드 유리표면 분자의 1~90%를 실라놀로 전환할 수 있으며, 상기 자성 마이크로로드의 표면에 다수개의 실라놀을 형성하는 경우 많은 양의 프로브를 상기 자성입자의 표면에 부착시키는 것이 가능하다. 즉 상기 산성용액을 이용하여 표면에 실라놀기가 형성된 경우 상기 실라놀기에 다량의 친수성 작용기 또는 실란과 결합한 작용기(링커)가 결합될 수 있다(도 5). 상기 실라놀의 밀도가 1개/nm 2 미만인 경우 형광 측정시 낮은 형광을 보임에 따라 측정이 어려울 수 있으며, 상기 실라놀의 밀도가 80개/nm 2를 초과하는 경우 프로브의 결합시 프로브 사이의 간섭으로 인하여 더 이상의 형광의 증대는 없을 수 있다.
[139]
또한 상기 포획 프로브는 상기 실라놀에 직접 결합되는 경우 1~80개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다. 다만 도 4에 나타난 바와 같이 상기 링커는 상기 실라놀 3개의 분자와 결합하고 있으므로 링커를 이용하여 상기 포획 프로브가 결합되는 경우 1~30개/nm 2의 밀도를 가지는 것이 가능하다.
[140]
[141]
단계(iii)에서 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시킬 수 있다.
[142]
상기와 (ii)단계와 같이 표면 처리가 완료된 이후 상기 자성입자의 쉘 층에 실란화합물을 반응시키게 된다. 위에서 살펴본 바와 같이 APTES(3-aminopropyltriethoxy silane)를 이용하여 쉘 층 표면에 형성된 실라놀기에 실란화합물을 부착할 수 있으며, 이때 상기 APTES는 아세톤 또는 톨루엔 용액에 용해하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 APTES는 상기 실라놀기와 결합하여 아미노-실란을 형성할 수 있으며, 바람직하게는 6~24시간 동안 반응시키는 것으로 차후에 있을 형광 분석에서 최적의 형광을 나타낼 수 있다. 상기 반응시간이 6시간 미만인 경우 실라놀에 결합하는 APTES의 양이 줄어들어 형광의 세기가 약해질 수 있으며, 24시간을 초과하는 경우에는 형광의 세기에 변화는 없으면서 제작시간만 많이 소모하게 되어 제작비용이 증가할 수 있다(도 7 참조).
[143]
[144]
단계 (iv)에서 상기 실란의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환할 수 있다.
[145]
상기 아미노-실란이 형성된 상기 자성입자의 쉘층은 표면이 카복실기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기로 치환되어 사용되는 것이 바람직하다. 상기 포획 프로브의 경우 그 종류에 따라 결합이 용이한 말단이 상이하므로 상기 아미노 실란의 말단(아민기)을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하여 사용할 수 있다. 또한 상기 포획 프로브가 상기 아미노-실란(링커)의 아미노기와 결합이 용이한 경우에는 치환 없이 그대로 사용하는 것도 무방하다.
[146]
상기 아미노-실란의 말단은 더욱 바람직하게는 감마-부티로락톤(γ-butyrolactone) 또는 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 아민기를 카르복실기로 치환시킬 수도 있다.
[147]
[148]
단계(v)에서 상기 실란화합물의 말단에 프로브를 부착할 수 있다.
[149]
상기와 같이 제조된 자성 마이크로로드는 이후 프로브가 부착되어 사용될 수 있다. 이때 상기 프로브는 포획 프로브인 것이 바람직하다. 상기 포획 프로브는 바이오마커와 항원-항체 반응을 수행하는 프로브로서 상기 자성 마이크로로드에 바이오마커를 부착시키는 역할을 한다. 또한 이와는 별도로 검출 프로브가 상기 바이오마커에 부착될 수 있으며, 상기 검출 프로브에 위치하는 형광물질 또는 효소의 작용에 의하여 상기 바이오마커를 탐지할 수 있다.
[150]
[151]
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 상술한 자성입자를 이용한 생체물질의 검출방법이 제공된다. 본 검출방법은 (1) 제1웰에 상기 자성입자를 제공하는 단계; (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계; (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법에 관한 것이다.
[152]
[153]
단계 (1)에서 제1웰에 상기 자성입자를 제공할 수 있다.
[154]
상기 자성입자는 상기 제조방법에서 제조된 자성 마이크로로드 일 수 있으며 상기 자성 마이크로로드는 상기 제1웰에 침지되어 보관될 수 있다.
[155]
[156]
단계 (2)에서 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시킬 수 있다.
[157]
상기 자성입자는 자성을 가지고 있는 입자이므로 자력을 이용하여 상기 제2웰로 이동될 수 있다. 상기 자력은 자석봉에 의하여 형성되는 것이 바람직하며, 상기 자석봉은 캡이 씌워져 있으므로 상기 자석봉을 이용하여 상기 자성입자를 이동시킨 다음 캡을 고정한 상태로 자석봉을 제거하면 상기 자성입자는 상기 제2웰 내부에 침지되거나 제2웰에 포함된 용매에 부유될 수 있다. 이하 자성을 이용한 자성입자의 이동 방법은 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
[158]
[159]
단계 (3)에서 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성할 수 있다.
[160]
상기 검출 프로브는 상기 포획 프로브와 마찬가지로 상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하며 발광물질을 구비한 검출항체일 수 있다.
[161]
상기 검출항체 및 상기 포획 프로브의 포획항체는 외상성 뇌손상 바이오마커를 항원으로 하는 항체일 수 있다. 예를 상기 항원은 외상성 뇌손상이 있는 경우 그 혈중 농도가 증가하는 바이오마커라면 제한없이 사용할 수 있지만 바람직하게는 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein), UCH-L1(Ubiquitin C- terminal Hydrolase-L1), S100, Tau protein 등을 포함할 수 있다. 상기 바이오마커는 일반적인 외상성 뇌손상(TBI, traumatic brain injury)뿐만 아니라 경미한 뇌손상인 mild TBI(mTBI)에도 증가하는 경향을 나타내고 있으므로 증상이 명확한 중증의 환자뿐만 아니라 경증의 환자까지도 본 발명의 자성입자를 이용하여 진단할 수 있다.
[162]
상기 발광물질은 상기 검출 프로브에 연결되어 자외선, 전자선, 화학반응, 효소-기질 반응 등과 같은 외부 자극에 의해 빛을 생성함으로써 상기 생체물질의 존재를 검출할 수 있게 한다. 상기 발광물질의 예로서, 형광분자, 양자점, 금속 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질 등을 들 수 있다. 이들 중 입수용이성 및 적용의 편이성 면에서 상기 발광물질로서, FITC(fluorescein isothiocyanate), 플루오레세인(fluorescein), FAM(fluorescein amidite), PE(phycoerythrin), TRITC(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate), Cy3(Cyanine 3), Cy5(Cyanine 5), Cy7(Cyanine 7), 알렉사(Alexa) 플루오르 염료, 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 형광분자가 흔히 사용될 수 있다.
[163]
상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체는 예를 들어 상기 포획항체가 고정화된 자성입자 및 상기 생체물질에 특이적으로 결합하는 검출항체 및 상기 생체물질을 포함하는 시료액을 반응 튜브에서 혼합하여 만들 수 있다. 이때 상기 반응튜브에서 상기 생체물질과 상기 자성입자 사이의 제1 면역반응 및 상기 생체물질과 상기 검출항체 사이의 제2 면역반응을 동시에 유도함으로써 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체가 얻어질 수 있다.
[164]
상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 면역반응의 촉진을 위해 상기 반응 튜브는 히팅 블록(heating block)에 올려져 적절한 온도로 가열되고, 상기 반응 튜브의 내부에 자석봉을 상하로 연속적으로 이동시킴으로써 면역반응 물질들을 빠르게 혼합시킬 수 있다.
[165]
[166]
또한 상기 생체물질의 검출방법은 외부 자력을 이용한 상기 복합체의 세척 과정이 포함될 수 있다. 즉 상기 제1 및 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체와 자석봉을 2개 이상의 세척 튜브에서 연속적으로 세척시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 세척 후에 상기 복합체로부터의 발광 신호를 검출하여 상기 생체물질의 종류 및 양을 정확히 확인할 수 있다.
[167]
상기 검출방법은 상술한 바와 같이 독립적인 반응튜브를 이용하여 수행될 수도 있지만 바람직하게는 멀티 웰 플레이트를 사용할 수 있다. 이때 상기 웰 플레이트의 제1웰에는 상기 자성입자가 주입될 수 있으며, 상기 자성입자는 검사시 제2웰로 이동되며 제2웰에는 검출프로브 및 생체입자가 주입될 수 있다. 따라서 제2웰에서는 상기 자성입자, 검출 프로브 및 생체입자의 반응이 수행되어 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성할 수 있으며 이는 제3웰로 이동되어 형광 측정될 수 있다.
[168]
또한 상기 제2웰과 제3웰의 사이에는 2~10개의 세척웰을 구비할 수 있다. 상기 세척웰은 단순히 세척액을 주입한 웰로서 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체가 침지되어 세척될 수 있다. 이 세척 과정에서 자성입자에 결합되지 않은 생체물질 및 검출프로브를 제거할 수 있으며, 상술한 바와 같이 본 발명의 자성입자는 비특이적으로 결합되는 형광분자(검출 프로브)를 최소화 할 수 있으므로 정확한 형광 측정을 수행할 수 있다. 이때 상기 세척과정은 상기 복합체 형성과정과 동일하게 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시킬 수 있다.
[169]
[170]
단계 (4)에서 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출할 수 있다.
[171]
[172]
상기 검출방법은 면역진단 방법으로 수행될 수 있다. 특히 상기 발광 신호의 검출은 예를 들어 ELISA 방법 또는 형광측정 방법으로 수행될 수 있다.
[173]
좀더 구체적으로 설명하면, ELISA 방법은 시료 안에 있는 검출대상물질을 거대자성입자에 고정되어 있는 포획 항체에 바인딩되도록 하고 그 후 검출항체를 처리한다. 이 검출항체는 포획항체가 바인딩한 검출대상 물질의 반대편 쪽에 바인딩한다. 검출항체에는 호스 래디시 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase, HRP)라는 효소가 콘쥬게이션(conjugation)되어 있어 TMB 기질을 과산화수소를 이용하여 분해하여 색깔을 내게 한다. 이 색깔의 정도를 OD 값으로 측정한다. 즉 이 방법은 시료에 검출대상 물질이 많아짐에 따라 비례하여 포획항체 및 검출항체가 정량적으로 많이 붙고, 그 결과 검출항체에 콘쥬게이션되어 있는 HRP가 많아져 효소반응이 상대적으로 빠르게 진행되어 TMB 기질의 색깔이 빠르게 변하는 원리를 이용한 것이다. 사전에 미리 검출대상 물질을 임의로 여러 농도를 처리하여 얻은 OD값을 가지고 표준곡선(standard curve)를 그린 다음, 실제 시료를 처리한 후에 얻은 OD값을 표준곡선과 대비함으로써 시료 내의 검출대상 물질의 양을 측정할 수 있다. 이때 모든 OD값 산출 및 농도계산은 분석기기에 설치되어있는 자동 분석 프로그램으로 실시할 수 있다.
[174]
형광측정 방법은 포획항체 및 검출항체를 사용하여 샌드위치 어세이를 하는 원리는 ELISA 방법과 동일하나 검출항체에 HRP 효소 대신 비오틴(biotin)물질을 컨쥬게이션시킨 후 스트렙타비딘(streptavidin)과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질을 처리해서 형광값을 측정한다. 포획항체에 먼저 TBI 단백질을 반응시켜 붙이고 그 후에 비오틴(biotin) 물질이 콘쥬게이션되어 있는 검출항체를 처리하여 검출항체를 포획항체가 TBI와 붙은 곳이 아닌 다른 쪽의 TBI에 붙인다. 그 후 스트렙타비딘과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질 e-flour를 처리해서 자성입자들 각각의 형광 신호를 측정한다. 검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리에 따라 명시야 현미경(bright field microscope)으로 반응 웰 안에서의 자성입자들의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 픽셀 단위로 측정하며, 10개 내외의 자성입자들로부터 나오는 형광 신호를 자동 이미지 분석을 한다. 검출하고자 하는 대상물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값을 이용하여 그래프를 그린 표준 곡선(standard curve)에 시험 검출에서 나온 형광값을 적용시켜 최종 시료 안에 들어 있는 해당 검출대상 단백질의 검출 농도값을 산출한다. 모든 이미지 분석 및 형광값의 산출은 분석기기내에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시한다.
[175]
상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 POCT란 현장검사(Point-Of-Care Test)를 위미하는 것으로 환자가 있는 곳에서 직접 검사를 수행하는 것을 의미한다. 다시 말해서 임상병리검사가 병원의 중앙검사실과 같은 독립적인 공간에서 수행되는 것이 아닌 병실, 응급실, 수술실 또는 중환자실과 같은 환자의 주변에서 의사, 간호사 또는 임상병리사에 의하여 수행되는 것을 의미한다. 기존의 외상성 뇌손상 진단의 경우 Ct나 MRI와 같은 대형장비를 필요로 함에따라 현장검사가 불가능하였으며, 면역진단의 경우에도 자동화된 CLIA 기기와 같은 대형진단 장비가 필요로 하여 현장진담에는 제한적으로만 사용되었다. 하지만 본원 발명의 경우 소형화된 진단장비를 사용할 수 있으므로 POCT방법을 이용하여 형장에서 진단이 가능하다.
[176]
[177]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
[178]
[179]
[실시예]
[180]
제 1 단계: 자성 마이크로로드의 제조 및 표면 처리
[181]
본 발명에서 제조되는 자성 마이크로로드는 대한민국 특허출원 10-2018-0130436에 기재된 내용에 따라 유리-코팅 미세와이어를 제조하였다. 그리고 상기 미세와이어를 적절한 크기로 절단하였다. 바람직하게는 길이는 400㎛이고, 금속 자성 코어의 직경은 50㎛, 글라스 코팅의 두께는 10㎛이다. 따라서, 직경 60㎛, 길이가 400㎛인 최종 자성 마이크로로드를 제조하였다.
[182]
상기 제조된 자성 마이크로로드의 표면 이물질을 제거하기 위하여 세척 단계를 수행하였다. 제작된 자성 마이크로로드를 바이알에 담고 아세톤을 점가하여 침전시키고 에탄올을 이용하여 세척한 다음 자성 마이크로로드를 건조하였다. 건조된 자성 마이크로로드를 황산에 침적한 다음, 물과 에탄올을 이용하여 세척하고 건조하였다. 황산처리가 끝난 자성 마이크로로드는 수산화나트륨 용액(NaOH 1g, 물 4ml 및 에탄올 6ml의 혼합물)을 이용하여 처리한 다음, 에탄올을 이용하여 세척하였다.
[183]
다음 단계로 검체의 항원과 결합하는 제 1 항체를 상기 자성 마이크로로드에 결합시켰다. 이를 위하여 자성 마이크로로드의 유리 표면을 적절히 개질하였다. 우선 상기 세척된 자성 마이크로로드를 피라냐 용액(부피비로서 H 2SO 4 : 30부피% H 2O 2 = 3 : 1의 혼합용액)에 침지하여 표면유리를 실라놀(Si-OH, silanol)로 개질시키고 물과 에탄올을 이용하여 세척한 다음 건조하였다. 이후 실란화를 위하여 표면 개질된 자성 마이크로로드를 2부피% APTES용액에 침지한 다음, 올루엔 에탄올 및 물을 이용하여 제작하고 110℃의 온도에서 큐어링을 수행하였다.
[184]
상기 아미노-실란으로 표면 개질된 마이크로로드를 이용하여 제 1 항체를 고정화시킬 수도 있으나, 바람직하게는 상기 아미노기를 카르복실기로 치환하였다. 이와 같이, 상기 표면을 아민기부터 COOH로 치환하는 것을 통칭 카르복실비드(Carboxyl bead) 제조 방법이라 명명하였다. 1.5 ㎖ E-튜브에 대략 상기 마이크로로드 (500 × 75㎛) 1만개가 처리될 수 있었다. 이를 위해 γ-부티롤락톤(Butyrolactone)을 사용하거나 숙신산무수물(Succinic anhydride)을 트리에틸아민(Triethylamine)과 혼합하여 사용하는 2가지 방법이 이용될 수 있었다. 숙신산무수물과 트리에틸아민을 이용하는 것이 보다 효과적인 것으로 판단되었다.
[185]
최종적으로 FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer)으로 아미노-실란을 코팅하여 형광을 측정함으로써 개질의 균일도와 개질정도를 확인할 수 있는데, 본 발명에서 제조되는 상기 표면 개질된 마이크로로드는 기존에 알려진 Silica(TEOS) 처리된 자성 비드에 비해 표면이 매우 균일한 표면을 가지는 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서 원하지 않는 물질의 비특이적 결합이 줄어들어 노이즈 발생이 매우 감소될 수 있었다. 또한 항원으로 하는 TBI 바이오마커의 매우 낮은 농도(<~1 pg/ml)에서도 검출 및 분석이 가능하며, 신호증폭 효과를 나타낼 수 있었다.
[186]
아울러 본 발명의 자성입자는 표면을 상기 피라냐 용액을 이용하여 개질함에 따라 많은 아미노-실란이 결합될 수 있어 기존의 자성입자에 비하여 높은 형광을 나타내는 것이 가능한 것으로 확인되었다(도 5의 (b) 참조).
[187]
[188]
제 2 단계: 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체의 제조
[189]
상기 1 단계에서 제조한 (바람직하게는 카르복실기로) 표면 개질된 자성 마이크로로드를 사용하여 시료액내에 목표로 하는 마커의 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체(Rod bead)를 제조하였다. 이를 상세히 살펴보면 다음과 같다.
[190]
1) 자성 마이크로로드를 1vial(약 2,500개 정도)를 새로운 E-tube에 옮겨 담았다.
[191]
2) 자성 마이크로로드를 MES buffer(pH 5.0) 500μl씩 1회 washing 하였다.
[192]
3) 아래 조성대로 자성 마이크로로드가 있는 E-tube에 넣은 후 실온(25℃)에서 30분동안 천천히 혼합(shaking) 시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[193]
① MES buffer(pH 5.0) 400μl ②EDC 50mg/ml ③NHS 50mg/ml (총 500μl 반응)
[194]
4) 3번 과정이 끝난 후 MES buffer 500μl을 이용하여 2회 세척(washing) 하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
[195]
5) 세척 과정을 마친 E-tube에서 MES buffer를 완전히 제거하였다.
[196]
6) 5번 tub에 MES buffer(pH 6.0)을 이용하여 제 1 항체 농도가 0.1mg/ml이 되도록 넣은 후 실온에서 2시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[197]
7) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2회 세척하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
[198]
8) 세척 과정을 마친 E-tube에서 Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)를 완전히 제거하였다.
[199]
9) Blocking buffer(1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 넣은 후 실온에서 1시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[200]
10) 2차 blocking buffer(10mM Tris-Cl(pH8), 1% BSA, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3, 0.1M NaCl) 500μl를 이용하여 2회 세척하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
[201]
11) 2차 blocking buffer(10mM Tris-Cl(pH8), 1% BSA, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3, 0.1M NaCl) 500μl를 넣은 후 실온에서 2시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[202]
12) 2차 blocking buffer(10mM Tris-Cl(pH8), 1% BSA, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3, 0.1M NaCl) 500μl를 이용하여 2회 세척한 후 2차 blocking buffer에 보관하였다.(이렇게 제조된 자성 마이크로로드를 RSMP라 한다)
[203]
상기 자성 마이크로로드의 유리 코팅에 원하는 항체를 비특이적 반응으로 결합시킬 수 있다. 상기 거대 마이크로로드 자성 결합체는 매트릭스(matrix) 다중 코드를 인식하고, 가능한 고역가의 항체를 결합시킨다. 제 1 항체는 시료액 등에 함유된 검체에 해당하는 항원(TBI 바이오마커)과 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
[204]
이때 자성 마이크로로드의 길이에 따라 서로 다른 제 1 항체가 결합될 수 있으며, 이는 길이 코딩 시스템을 형성해 다중 검출 분석에 이용될 수 있다.
[205]
[206]
제 3 단계: 제 1 항체가 고정화된 거대 마이크로로드의 QC
[207]
1) 새로운 1.5ml E-tube에 상기 2단계에서 제조된 RSMP를 약 30개정도 넣고 상층액을 제거하였다.
[208]
2) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 넣어 1% BSA/PBS buffer를 완전히 제거하였다. (2회 반복)
[209]
3) Sample buffer (0.1% BSA, 1x PBS. 0.1% T-20)를 이용하여 2μg/ml의 비오틴과 결합된 제 2 항체(Biotin-conjugated secondary antibody)를 준비하였다.
[210]
4) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)를 제거한 tube에 3번에서 제조한 제 2 항체(secondary antibody) 용액을 500μl씩 넣고 실온에서 1시간동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[211]
5) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2회 세척하였다. (탭핑(tapping) 30회 수행)
[212]
6) Sample buffer (0.1% BSA, 1x PBS. 0.1% T-20)로 SAPE(Streptavidin-Phycoerytherin)를 2μg/ml의 농도로 맞춰 준비하여 500μl 넣고 30분동안 천천히 혼합시켰다. (회전식 혼합기(Rotation 기계)에서 30rpm으로 진행)
[213]
7) Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3) 500μl를 이용하여 2번 세척한 후 형광현미경을 이용하여 측정하였다. [Exposure time: 200ms/ gain 5.1x]
[214]
[215]
제 4 단계: 면역반응 물질의 준비 단계
[216]
시료액, 검체에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체-형광 복합체(conjugate)를 준비하였다.
[217]
시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등을 사용할 수 있다.
[218]
이때, 만일 상기 시료액에는 복수 개의 마커 항원을 검출하고자 한다면, 각기 다른 형상(예를 들면, 다른 길이)의 자성 마이크로로드를 준비한다. 각 자성 마이크로로드는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 마커 중에서 각각 특정 마커만을 포획할 수 있는 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 상태로 구성시킨다.
[219]
아울러, 시료액내의 마커의 상기 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체-형광 복합체(conjugate)를 준비한다. 상기 형광물질 대신에 효소 등으로 대신할 수도 있다.
[220]
[221]
제 5 단계: 검체 투하 단계
[222]
제1웰에 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 거대 마이크로로드 자성 결합체(RSMP)를 약 30개 투입하였다(도 10 참조).
[223]
자석 봉(Magnetic bar)를 이용하여 상기 RSMP를 제2웰이 옮긴 다음. 항원은 sample diluent(1x PBS, 1% BSA(Fatty acid free), 10mM EDTA (pH8), 1% T-20, 0.2mg/mL Tru-Block, 1% human Pooling serum)을 이용하여 1:1로 희석하여 넣고 제 2 항체는 1μg/ml, SAPE는 4μg/ml의 농도가 되도록 2번 well에 투입하였다. (총 반응 volume: 250μl)
[224]
이때 시료액(검체)에는 마커에 해당하는 항원이 상기 RSMP상에 존재하므로 이들 간에 제 1 면역반응 및 제 2 면역반응을 유도하였다. 본 발명에서는 동일한 반응기 내에서 상기 제 1 면역반응 및 제 2 면역반응이 동시에 진행됨으로써 반응시간을 단축시킬 수 있었다. 이때 상기 웰은 기존에 사용되는 일정간격으로 배열된 웰플레이트를 사용하는 것이 바람직하지만 튜브형 반응기를 사용하는 것도 가능하다.
[225]
[226]
제 6 단계: 혼합/가열 단계
[227]
제 5 단계가 진행된 웰을 히팅 블록(heating block)에 올려져 적절한 온도로 가열하여 조절시켰다. 통상 면역반응은 35℃ 정도에서 활발하게 이루어진다.
[228]
아울러, 상기 웰의 상부에 위치하는 자석 봉을 상하로 연속적으로 이동시켜 상기 면역반응 물질을 빠르게 혼합시켜 면역반응 시간을 단축시킬 수 있었다.
[229]
[230]
제 7 단계: 세척 단계
[231]
반응이 완료된 후 자석봉을 이용하여 상기 제2웰에 있는 반응이 완료된 RSMP를 제3웰에서 제5웰까지 순차적으로 이동시키며 세척하였다. 제3웰에서 제5웰에는 Wash buffer(0.1% BSA, 1x PBS, 0.1% T-20, 0.05% NaN 3)가 각각 250μl씩 주입되어 있으며, 각 웰마다 2분씩 RSMP를 자석봉을 이용하여 비특이적으로 붙은 형광물질을 제거하였다. 이때 상기 6단계와 동일하게 상기 웰의 상부에 위치하는 자석 봉을 상하로 연속적으로 이동시켜 상기 면역반응 물질을 빠르게 혼합시켜 세척하였다.
[232]
이러한 세척과정에서 비특이적 물질이 제거되고, 거대 마이크로로드 자성 결합체의 세척/회수가 이루어지며, 혈청, 혈장뿐만 아니라 저혈 검체도 가능하게 된다.
[233]
[234]
제 8 단계: 검출신호 측정 단계
[235]
반응이 완료된 후, 자성입자에 특화된 초고감도 형광 이미지 분석기기를 이용하여 검출 신호를 측정하는데(도 11 참조) 이미지 분석을 통한 코드 인식을 수행하며, 1개의 형광물질로도 다중검지(multi-detection)를 구현하는 것이 가능하였다. 형광신호뿐 아니라 단일 마커의 항원인 경우 ELISA에 의한 효소반응에 의해서도 탐지가능하다. 상기 단계를 모두 수행하는데 대략 30분이 소요되며, 검출한계는 대략 수 pg/ml 내지 10,000pg/ml이다. 또한 도 11의 (c) 및 (d)에 나타난 바와 같이 동일한 농도의 바이오마커를 사용하는 경우 본 발명의 형광이 더욱 강하게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
[236]
ELISA 방법은 시료 안에 있는 마커 물질을 거대 마이크로로드 자성 결합체에 고정되어 있는 캡처(Capture) 프로브에 결합하도록 하고 그 후 탐지 프로브를 처리하였다. 이 탐지 프로브는 캡처 프로브가 결합한 마커 물질의 반대편 쪽에 결합되었다. 탐지 프로브에는 HRP(Horse Radish Peroxidase)라는 효소가 컨쥬케이션(Conjugation)되어 있어 TMB 기질을 과산화수소를 이용 분해하여 색깔을 내게하였다. 이 색깔 정도를 OD 값으로 측정하였다. 결론적으로 시료 안에 마커 물질이 많으면 캡처 및 탐지 항체가 정량적으로 많이 붙게 되고 탐지 항체에 컨쥬케이션되어 있는 HRP가 많게 되어 효소반응이 상대적으로 빠르게 진행되어 TMB 기질이 색깔이 빠르게 변하는 원리를 이용한 것이다. 이미 마커 물질을 임의로 여러 농도를 처리하여 얻은 OD값을 가지고 표준곡선을 그린 값에 시료를 처리한 OD값을 적용시켜 시료 안에 마커 물질의 양을 측정하는 원리이다 (ata의 농도계산을 위해 추세선을 그리고 추세선을 이용 농도 계산). 이때 모든 OD값 산출 및 농도계산은 분석기기에 설치되어있는 자동분석 프로그램으로 실시하였다.
[237]
형광 측정방법은 ELISA 방법에서 캡처 및 탐지 항체를 쓰는 원리는 동일하나 탐지 항체에 HRP 효소 대신 바이오틴(biotin) 물질을 컨쥬케이션을 하고 나중에 스트렙트아비딘(Streptavidin)과 컨쥬케이션 되어 있는 형광물질을 처리해서 형광값을 측정하였다. 캡처 항체에 먼저 TBI 바이오마커 단백질을 반응시켜 붙이고 그 후에 바이오틴 물질이 컨쥬케이션 되어 있는 탐지 항체를 처리하여 탐지 항체를 캡처 항체가 TBI 바이오마커 단백질과 붙은 곳이 아닌 다른 쪽 TBI 바이오마커 단백질에 붙였다. 그후 스트렙트아비딘과 컨쥬케이션 되어 있는 형광물질 e-flour을 처리해서 자성 비드의 각각의 형광 값을 자동으로 측정하였다. 검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리로 반응 웰 안에서 명시야(Bright Field)로 거대자성입자의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 픽셀(Pixel) 단위로 측정하여 평균을 구하였다. 10개 내외 자성입자의 평균을 구하고 여기서 형광값의 평균값을 구하였다.
[238]
검출하고자 하는 마커 물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값 이용 그래프를 그린 Standard Curve에 시험 검출에서 나온 형광 값을 적용시켜 최종 시료 안에 들어 있는 해당 마커 단백질의 검출 농도 값을 산출하였다. (이때 데이터의 농도 계산을 위해 추세선을 그리고 이 추세선을 이용 농도계산 한다.) 모든 이미지 분석 및 형광 값의 산출은 분석기기내에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시하였다.
[239]
하기와 같은 종류의 항원의 검사에 본 발명의 자성 마이크로로드를 사용하여, 본 발명의 자성 마이크로로드가 신속한 반응에 따른 빠른 검사가 가능하면서도 높은 정확도를 가지며, 다중 탐지가 가능함을 확인할 수 있었다.
[240]
[241]
<실험예 1> GFAP 검사
[242]
상기의 방법으로 제작된 RSMP에 coupling된 캡처 항체 (GFAP_cAb_09)와 biotinylation된 detection Ab (GFAP_dAb_03)를 적용하였다. Hytest 사의 항원 GFAP를 Serum에 0, 20, 50, 100, 500 pg/ml되게 첨가한 다음 앞에 쓰인 방법과 동일한 방법으로 적용하였다.
[243]
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 GFAP 농도 0~500pg/mL에서 시험한 결과를 보면, 기존 TBI 진단 검사법과 동등한 동적범위(dynamic range, log3이상)를 가지면서, 0 ~ 500pg/mL의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계(correlation) 결과 값을 보이는 것으로 나타났다(결정계수 R 2값 : 0.9895)(도 13 및 도 14 참조).
[244]
또한, 본 발명의 진단 시스템을 이용한 GFAP 초 저농도 1pg/mL 이하 시험에서 블랙 웰 플레이트(black well plate)를 사용할 경우, 기존 검사법의 검출한계인 20pg/ml에서 0.625pg/ml로 검출한계가 좋아지는 것으로 나타났다. 이는 감도가 약 40배 증가된 것이며, 최적화시 약 100배 이상의 높은 감도를 지닐 수 있는 가능성을 확인하였다(도 17).
[245]
또한 제1단계에서 실란화 시간에 따른 형광 크기의 변화를 관찰하기 위하여 실란화 시간을 각각 1시간, 3시간, 9시간, 24시간으로 하여 동일한 실험을 실시하였다. 그 결과 실란화시간이 9시간이 경과한 이후부터 높은 형광수치를 가지는 것으로 나타났으며, 24시간 이후의 증가폭은 매우 미미한 것으로 나타났다(도 7 참조).
[246]
[247]
<실험예 2> UCHL-1 검사
[248]
상기의 방법으로 제작된 RSMP에 coupling된 캡처 항체 (UCHL-1_cAb_02)와 biotinylation된 detection Ab (UCHL-1_dAb_07)를 적용하였다. 이지다이아텍에서 제조된 항원(UCHL-1_Ag-08)를 Serum에 0, 100, 300, 500, 1000pg/ml되게 첨가한 다음 앞에 쓰인 방법과 동일한 방법으로 항원-항체반응을 진행하였다
[249]
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 UCHL-1 농도 0~500pg/mL에서 시험한 결과를 보면, 기존 TBI 진단 검사법과 동등한 동적범위(dynamic range, log3이상)를 가지면서, 0 ~ 500pg/mL의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계(correlation) 결과 값을 보이는 것으로 나타났다(결정계수 R 2값 : 0.9894)(도 15 및 도 16 참조).
[250]
[251]
<실험예 3> GFAP, UCHL-1의 다중 검출
[252]
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 GFAP(on 300μm 자성입자), UCHL-1 (on 400μm 자성입자)의 다중 검출(multiplex assay)을 수행한 결과를 살펴보면(도 12 참조), 면역반응시 넣어준 특정 항원에 해당하는 자성입자만 농도별 형광신호가 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 즉 본원 발명의 경우 입자 이미지(Bright field)를 통해 길이에 따라 원하는 자성 마이크로로드를 확인 및 검출할 수 있으며, 형광 이미지(fluorescent images)를 통해 상기 자성 마이크로로드 중 원하는 바이오마커의 형광 신호를 검출 및 분석할 수 있는 것으로 나타났다.(도 18)
[253]
[254]
<실험예 4> IFN-γ(인터페론 감마) 검사
[255]
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 IFN-γ(인터페론 감마) 농도 0~1000 pg/mL에서 시험한 결과를 보면, 기존 TBI 진단 검사법과 동등한 3~5logs의 동적범위(dynamic range)를 가지면서, 0 ~ 1000pg/mL의 범위에서 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하여 매우 높은 상관관계(correlation) 결과 값을 보이는 것으로 나타났다(도 19, 20 참조).
[256]
또한, 본 발명의 진단 시스템을 이용한 IFN-γ(인터페론 감마) 초 저농도 1pg/mL 이하 시험에서 블랙 웰 플레이트(black well plate)를 사용할 경우, 기존 검사법의 검출한계인 20pg/ml에서 0.625pg/ml로 검출한계가 좋아지는 것으로 나타났다. 이는 감도가 약 40배 증가된 것이며, 최적화시 약 100배 이상의 높은 감도를 지닐 수 있는 가능성을 확인하였다(도 21 참조).
[257]
[258]
<실험예 5> IL-10, IFN-γ(인터페론 감마)의 다중 검출
[259]
본 발명의 진단 시스템을 이용하여 IL-10(on 400μm 자성입자), IFN-γ (on 300μm 자성입자)의 다중 검출(multiplex assay)을 수행한 결과를 살펴보면, 실험예 3과 동일하게 입자 이미지(Bright field)를 통해 길이에 따라 원하는 자성 마이크로로드를 확인 및 검출할 수 있으며, 형광 이미지(fluorescent images)를 통해 상기 자성 마이크로로드 중 원하는 바이오마커의 형광 신호를 검출 및 분석할 수 있는 것으로 나타났다.
[260]
[261]
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

청구범위

[청구항 1]
자석 반응 금속을 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하되, 상기 포획 프로브는 외상성 뇌손상 또는 감염병 진단을 위한 바이오마커를 항원으로 하는 항체를 포함하는 것인 자성입자.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 자성입자는 검출한계가 1pg/ml 이하이며, 동적범위(Dynamic Range)가 log3 이상인 자성입자.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 자성입자는 2종 이상의 상이한 길이를 가지는 자성입자가 혼합되어 있으며, 2종 이상의 상기 바이오마커를 동시에 진단할 수 있는 것인 자성입자.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 쉘의 표면은 1~80개/nm 2의 친수성 작용기를 가지는 자성입자.
[청구항 5]
제4항에 있어서, 상기 친수성 작용기는 실라놀기 또는 실라놀기로부터 유래된 카복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올기 또는 알데히드기인 자성입자.
[청구항 6]
제4항에 있어서, 상기 포획 프로브는 상기 쉘 층의 표면의 친수성 작용기와 연결된 것인 자성입자.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 코어가 상기 자성입자 총 부피의 60% 이상인 것인 자성입자.
[청구항 8]
제1항에 있어서, 상기 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하인 것인 자성입자.
[청구항 9]
제1항에 있어서, 상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛인 것인 자성입자.
[청구항 10]
제1항에 있어서, 상기 자성입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물인 것인 자성입자.
[청구항 11]
제1항에 있어서, 상기 자성입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것인 자성입자.
[청구항 12]
제1항에 있어서, 상기 자성입자는 마이크로로드의 형태를 갖는 것인 자성입자.
[청구항 13]
제12항에 있어서, 상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛인 것인 자성입자.
[청구항 14]
제12항에 있어서, 상기 마이크로로드의 종횡비가 2 이상인 것인 자성입자.
[청구항 15]
제1항에 있어서, 상기 바이오마커는 생명체로부터 유래된 시료액 내의 바이오마커인 것인 자성입자.
[청구항 16]
(i) 유리로 제작된 쉘 및 자성물질을 포함하는 코어로 구성되는 자성 마이크로로드를 준비하는 단계; (ii) 상기 자성 마이크로로드의 표면을 산성 용액으로 표면 처리하여 실라놀을 형성하는 단계; (iii) 표면 처리된 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 침지하여 상기 실라놀에 실란화합물을 결합시키는 단계; (iv) 상기 실란화합물의 말단을 프로브와 결합할 수 있는 말단으로 치환하는 단계; 및 (v) 상기 실란 화합물의 말단에 프로브를 부착하는 단계; 를 포함하는 자성입자 제조방법.
[청구항 17]
제16항에 있어서, 상기 (iv) 단계는 상기 자성 마이크로로드를 실란계 용액에 6~24시간 침지하여 수행되는 자성입자 제조방법.
[청구항 18]
제16항에 있어서, 상기 산성용액은 황산과 과산화수소의 혼합용액인 자성입자 제조방법.
[청구항 19]
(1) 제1웰에 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 자성입자를 제공하는 단계; (2) 상기 제1웰의 상기 자성입자를 자력을 이용하여 제2웰로 이동시키는 단계; (3) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제2웰에 제공하고, 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (4) 자력을 이용하여 제3웰에 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 이동시키며, 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법.
[청구항 20]
제19항에 있어서, 상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
[청구항 21]
제19항에 있어서, 상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 자성입자들을 이용하여 다중검출하는 것인 생체물질의 검출방법.
[청구항 22]
제21항에 있어서, 상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 자성입자들을 판독하는 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
[청구항 23]
제19항에 있어서, 상기 제2웰 및 제3웰 사이에 2~10개의 세척웰을 구비하며, 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 상기 세척웰이 순차적으로 침지하여 세척하는 단계를 추가로 포함하는 생체물질의 검출방법.
[청구항 24]
제23항에 있어서, 상기 세척 단계는 외부 자력을 이용하여 상기 자성입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 침지 및 이동시키는 단계인 생체물질의 검출방법.
[청구항 25]
제19항에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 진단시간이 30분 이내인 것인 생체물질의 검출방법.
[청구항 26]
제 19항에 있어서, 상기 생체물질 검출방법은 POCT방법을 통하여 수행되는 것인 생체물질의 검출방법.

도면

[도1]   [규칙 제91조에 의한 정정22.10.2020] 

[도2]   [규칙 제91조에 의한 정정22.10.2020] 

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]

[도11]

[도12]

[도13]

[도14]

[도15]

[도16]

[도17]

[도18]

[도19]

[도20]

[도21]